JP5907993B2 - 新規o−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼまたはその変異タンパク質およびこれを用いたメチオニン転換方法 - Google Patents
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Description
スルフィド(HS−)+O−スクシニルホモセリン⇒コハク酸+ホモシステイン
メチルメルカプタン+O−スクシニルホモセリン⇒コハク酸+L−メチオニン
前記の別の前駆体であるO−アセチルホモセリンを用いてL−メチオニンを生成することが可能な酵素の例には、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼがある。通常、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする遺伝子を通称metYと表記する。この酵素が有する活性は次の3つである。
スルフィド(HS−)+O−アセチルホモセリン⇒酢酸+ホモシステイン
メチルメルカプタン+O−アセチルホモセリン⇒酢酸+L−メチオニン
2種のL−メチオニン前駆体を生産するに際して、ブドウ糖や原糖などの炭素源をより少なく必要とするO−アセチルホモセリンを用いてL−メチオニンを生産することが費用の面で有利である。ところが、O−スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼであるmetZ酵素は、産物であるL−メチオニンによってフィードバック阻害を受けないが、これに対し、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼであるmetY酵素は、産物であるL−メチオニンによる活性が阻害されるという現象があり、酵素反応的面での利用は難しい。
本発明において、用語「形質転換」とは、遺伝子を宿主細胞内に導入した後、発現させることができるようにすることを意味する。前記細胞内に本発明のベクターを形質転換させる方法は、塩基を細胞内に導入するいずれの方法も含まれ、当分野で公知されているように適切な標準技術を選択して行うことができる。エレクトロポレーション (electroporation)、リン酸カルシウム共同沈殿(calcium phosphate co-precipitation)、レトロウィルス感染(retroviral infection)、微量注入法(microinjection)、DEAE−デキストラン(DEAE-dextran)、陽イオンリポソーム法(cationic liposome)などがあり、これに制限されない。
1−1.ハイフォモナス属由来のO−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ
メチオニン前駆体であるO−アセチルホモセリンをメチオニンに転換するハイフォモナス・ネプチュニウム(Hyphomonas neptunium)由来のO−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ遺伝子配列は、KEGG wbsite(www.kegg.com)から収得してプライマーを製作し、ハイフォモナス・ネプチュニウムのクロモソームはATCC(米国)から購買して使用した。前記のクロモソームを鋳型とし、配列番号1と配列番号2のプライマーを用いて変性(denaturation)段階は94℃30秒、アニーリング(annealing)段階は55℃で30秒、伸長(extension)段階は72℃で2分間行い、これを30サイクル行うPCR反応を行った。PCR反応はバイオニア(韓国)社製のHL PCR premix kitを用いた。
メチオニン前駆体であるO−アセチルホモセリンをメチオニンに転換するロードバクター・スフェロイデス由来のO−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードするmetZ遺伝子をクローニングした。
実施例1−1および1−2の方法で収得したそれぞれの細胞破砕液を用いてハイフォモナス属由来のO−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼおよびロードバクター属由来のO−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼの発現量および活性を比較した。
高濃度のO−アセチルホモセリンにおけるMetZ−hneおよびMetZ−rsp酵素の転換率特性を比較するために、80g/LのO−アセチルホモセリン濃度でメチオニン転換実験を行った。1mLのチューブスケールでO−アセチルホモセリン80g/Lの酵素転換の際にハイフォモナス・ネプチュニウム由来のO−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ(MetZ−hne)とロードバクター・スフェロイデス由来のO−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ(MetZ−rsp)によるメチオニン生成を時間経過に伴って相対的に比較した。O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼの反応速度は、反応生成物であるメチオニンの濃度で比較することができる。より具体的に、酵素転換反応の条件は80g/LのO−アセチルホモセリン1mLにメチオニンを生成するために必要なもう一つの基質であるメチルメルカプタンナトリウム(15%、w/v)0.01mL、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ0.01mL、酵素補助因子であるリン酸ピリドキサール(pyridoxal 5’-phosphate)を0.1mMの濃度で投入して800rpmにて攪拌しながら33℃で反応を行った。酵素抽出液はそれぞれ5mg/mLのタンパク質濃度となるように調節して投入した。メチオニンおよびO−アセチルホモセリンの濃度分析はHPLCを用いた。メチオニン転換率は反応に投入したメチルメルカプタン1モルで生成されたメチオニンのモル数で計算した。
2段階工法で酵素反応が行われると、L−メチオニンと酢酸が生成されるが、高濃度のL−メチオニンは酵素反応速度を低下させ、酢酸はタンパク質の変形により酵素の活性を阻害するものと知られている。
産業的に酵素を用いた転換工程では、33〜37℃の温度で1〜6時間内外に反応が行われる。反応産物による阻害現象だけでなく、熱安定性が低い酵素は、転換反応が行われるにつれて酵素の活性も低くなる。酵素の熱安定性は、産業的、経済的な面で重要な事項である。このような酵素の熱安定性の比較のために、実施例1−1および1−2の方法で獲得したそれぞれの細胞破砕液を50℃で10、30、60、120、240分間熱処理した後、実施例2のDTNB方法を用いて酵素残存活性を比較した。
本実施例では、チューブスケールで確認したmetZ−rspのO−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼの転換活性を反応器システムで評価する目的で、最適が1Lの回分式反応器を用いた。酵素転換反応の際に必要な基質であるO−アセチルホモセリンは、既存の特許に明記された微生物菌株を発酵して生産し、培養した発酵液から遠心分離機を用いて細胞を除去し、約70g/L濃度の培養液を500mL使用した(特許文献1)。メチルメルカプタンは常温で気体として存在するため、苛性ソーダ液にメチルメルカプタンを添加して液体として存在するメチルメルカプタンナトリウム(sodium methyl mercaptan、CH3S−Na、4.7M、33%、フランスArkema)溶液を用いて実験を行った。メチルメルカプタンナトリウムは、酵素転換反応の際に約50mLが使用された。酵素液の場合、実施例1で説明した方法で生産されたmetZ−rsp破砕液50mLを投入し、補助因子であるリン酸ピリドキサール(pridoxal 5’-phosphate)(米国Sigma)は、0.1mMの濃度で投入した。酵素転換反応はpH7.0、33℃に設定し、攪拌は700rpmに設定した。反応時間はメチルメルカプタンナトリウムを供給しながら3時間行った。O−アセチルホモセリンとL−メチオニンの時間別濃度は表6のとおりであり、分析はHPLCを用いて行った。
本実施例では、1Lの回分式反応器で確認したmetZ−rspのO−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼの転換活性を用いたメチオニン酵素転換反応器システムをスケールアップ(scale-up)して評価する目的で30Lの回分式反応器(韓国発酵器、韓国)を用いてメチオニン転換反応を行った。酵素転換反応の際に必要な基質であるO−アセチルホモセリンは、実施例6で行ったように既存の特許(特許文献1)に明記された微生物菌株を発酵して生産し、培養した発酵液から遠心分離機を用いて微生物菌体を除去した。上澄み液はO−アセチルホモセリン濃度が66g/Lの濃度となるように水を添加して希釈し、反応に使用した。
本実施例は、野生型metZ−rspにランダム突然変異誘発システム(random mutagenesis)のためにエラー誘発PCR(error-prone PCR)を行い、エラー誘発PCRの際にdiversify PCRランダム突然変異誘発キット(米国CLONTECH)を使用した。変異発生比率(mutation rate)の条件選定のためにMnSO4とdGTPの濃度によって下記のとおり2つの条件でエラー誘発PCRを行った。変異を導入するDNA鋳型(template)は実施例1〜2でクローニングされたpCL−PCJ1:metZ−rspを対象として行った。
Claims (9)
- 配列番号13のアミノ酸配列で表記されるタンパク質のN末端から3番目のアミノ酸がアスパラギン、アルギニンもしくはセリンで、65番目のアミノ酸がチロシンで、104番目のアミノ酸がトレオニンもしくはアラニンでそれぞれ置換された変異、またはこれら3種のアミノ酸変異のうち1種以上の変異が起こった、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼの活性が野生型より強化された変異型タンパク質。
- 前記変異が、N末端から3番目のアミノ酸がアスパラギン、104番目のアミノ酸がアラニンでそれぞれ置換された変異である、請求項1に記載の変異型タンパク質。
- 前記タンパク質が配列番号15〜18よりなる群から選ばれたアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の変異型タンパク質。
- 請求項1のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが配列番号19〜22よりなる群から選ばれた塩基配列を有する、請求項4に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項4または請求項5に記載のポリヌクレオチドを含む、組み換えベクター。
- 請求項6の組み換えベクターで形質転換された、O−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼを生産するための微生物。
- 前記微生物が大腸菌である、請求項7に記載の微生物。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のタンパク質、またはこれを生産する微生物を、O−アセチルホモセリンおよびメチルメルカプタンの混合物に添加して反応させる段階を含む、メチオニンまたは酢酸を生産する方法。
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