BR112013015992A2

BR112013015992A2 - novel de o-acetilomoserina sulfidrilase ou variante do mesmo e método para transformar metionina usando o mesmo

Info

Publication number: BR112013015992A2
Application number: BR112013015992-8A
Authority: BR
Inventors: So Young Kim; Kwang Ho NA; Yong Uk Shin; Chang II Seo; Sung Kwang Son; In Kyung HEO; Ju Eun Kim; Han Jin Lee; Hyun Ah Kim; Jee Yeon Bae
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2010-12-21
Filing date: 2011-12-21
Publication date: 2020-07-07
Also published as: RU2013133636A; EP2657249A2; EP2657249B1; DK2657249T3; US20130273614A1; EP2657249A4; PL2657249T3; BR112013015992B1; JP5907993B2; KR101250651B1; WO2012087038A3; ES2627792T3; US9080155B2; WO2012087038A2; RU2573928C2; CN103328498B; JP2014506129A; KR20120070411A; CN103328498A

Abstract

SULFIDRILASE DE O-ACETILHOMOSERINA NOVO OU PROTEÍNA MUTANTE DO MESMO, E MÉTODO PARA CONVERTER EM METIONINA UTILIZANDO O MESMO A presente invenção refere-se a uma proteína nova tendo atividade de sulfidrilase de O-acetilhomoserina, uma proteína mutante da mesma, um polinucleotídeo codificando a mesma, um vetor recombinante compreendendo o polinucleotídeo, um micro-organismo transformado com o vetor recombinante, e um método para produzir metionina ou ácido acético utilizando a proteína. O método de produção da presente invenção tem a vantagem de produzir L-metionina e ácido acético de modo eficaz em termos de custo por ter a taxa de conversão mais elevada e tempo de reação reduzido em comparação com os métodos existentes, e pode minimizar a quantidade de homogeneizado de enzima adicionado ao utilizar a proteína mutante, desse modo facilmente produzindo L-metionina e acido acético em rendimento elevado.

Description

SULFIDRILASE DE O-ACETILHOMOSERINA NOVO OU PROTEÍNA MUTANTE DO MESMO, E MÉTODO PARA CONVERTER EM METIONINA UTILIZANDO O MESMO

DESCRIÇÃO Campo Técnico A presente invenção refere-se a uma proteína nova tendo atividade de sulfidrilase de O-acetilhomoserina, uma proteína mutante da mesma, um polinucleotídeo codificando a mesma, um vetor recombinante compreendendo o polinucleotídeo, um micro-organismo transformado com o vetor recombinante, e um método para produzir metionina ou ácido acético utilizando a proteína. Técnica antecedente L-metionina que é um dos aminoácidos essenciais in vivo está contido na maioria das proteínas e está presente em um estado livre em molho de soja que é um de tempero. É amplamente utilizado como aditivos de ração e alimentos, e também é utilizado como solução de infusão para uso médico ou matéria prima para sintetizar remédios. Metionina é um aminoácido importante envolvido em reação de transferência de metila in vivo. Primeiramente, por reagir com ATP, metionina é convertido em -adenosil metionina, que então doa grupo de metila em vários aceptores; e então é convertido em cisteína através de homocisteína e cistationina. Um bolor de pão vermelho sintetiza metionina a partir de cisteína. Um cheiro de alimentos fermentados como molho de soja ou queijo é frequentemente devido a aldeído, álcool, e/ou éster derivado de metionina. Além disso, metionina atua como um precursor dos compostos como colina, lecitina e creatina, e é utilizado como matéria prima para sintetizar cisteína e taurina, e serve como um doador de enxofre.

Além disso, metionina é associado à síntese de vários neurotransmissores no cérebro.

Metionina e/ou S-adenosil-L-metionina (SAM) inibem acúmulo de gordura em fígado e artérias in vivo, e assume vários papeis como aliviar depressão, inflamação, doença de fígado e dor muscular.

Além disso, metionina e/ou S- adenosil-L-metionina provêem várias funções como inibir depósito de gordura em um fígado, que promove metabolismo de gordura, e artérias, aumentar circulação de corrente sanguínea em um cérebro, coração, e rim, estimular digestão, promover detoxificação e excreção de substâncias tóxicas, e promover a excreção de metais pesados como chumbo.

Foi reportado que a ingestão diária de 800 a 1.600 mg de metionina apresenta efeito antidepressante superior, melhora de função de fígado em pacientes com doenças de fígado, particularmente doenças de fígado causadas por álcool, excelente efeito antiinflamatório em doença de articulação de osso, e estimulação de recuperação de articulação no mesmo.

Também, como nutriente essencial para os cabelos, metionina é conhecida como fornecendo nutrição para os cabelos quebradiços, evitando perda de cabelos.

Para uma síntese química de metionina, mais comumente L-metionina é produzido através de hidrólise de 5-(-metil mercaptoetil)-hidantoína.

Entretanto, quando metionina é produzido por tal processo de síntese química, há desvantagem de produzir formas misturadas de tipo L e tipo L. a esse respeito, há uma patente revelando a técnica que permite uma produção seletiva de L-metionina utilizando uma abordagem biológica (WO2008/013432). Esse método, citado simplesmente como um método de duas etapas, compreende um processo de produzir precursor de L-metionina por fermentação e um processo de converter o precursor de L- metionina em L-metionina utilizando enzimas.

O tipo de precursor de L-metionina compreende preferivelmente O- acetilhomoserina e O-succinilhomoserina.

O desenvolvimento do método de duas etapas resolve todos os problemas existentes como toxicidade de um substrato específico a sulfeto, controle de realimentação em uma cepa por metionina e SAM, e decomposição de produto intermediário específico para cistationina gama sintase, O- succinilhomoserina sulfidrilase e O-acetilhomoserina sulfidrilase.

Além disso, esse método, que produz somente L-metionina seletivamente, é superior ao processo de síntese química convencional que produz tanto D-metionina como L-metionina simultaneamente, e esse método pode produzir adicionalmente ácido orgânico, mais especificamente, ácido succínico e ácido acético, como subproduto através da mesma reação.

O processo de conversão enzimática no método de duas etapas emprega as enzimas tendo atividade de cistationina gama sintase, atividade de O-succinilhomoserina sulfidrilase ou atividade de O-acetilhomoserina sulfidrilase, e produz L-metionina e ácidos orgânicos através da ração de enzima de O-acetilhomoserina ou O- succinilhomoserina, que é um precursor de L-metionina, com mercaptano de metila.

Na reação de conversão enzimática para produzir L- metionina a partir de O-acetilhomoserina, que é um precursor de L-metionina, várias sulfidrilases de O-

acetilhomoserina derivadas microbianas podem ser utilizadas. Entretanto, para ser utilizada como convertase industrial, a enzima necessita atender a várias exigências para maximizar a eficácia em termos de custo. Em primeiro lugar, a enzima deve ter as características de atividade elevada e taxa de conversão elevada, e a superexpressão da mesma deve ser possível em E. coli. Em geral, para as reações que utilizam uma enzima purificada, a atividade de enzima, taxa de reação, e alta afinidade para um substrato são essenciais. Porém, se homogeneizado de enzima for adicionado diretamente na reação, a superexpressão de enzima por célula unitária deve ser possível além de ter uma atividade elevada, para prosseguir a reação com uma quantidade mínima de homogeneizado. Em segundo lugar, a enzima necessita manter uma taxa elevada de reação com O- acetilhomoserina em concentração elevada, e a inibição de sua atividade deve ser baixa mesmo com acúmulo de produtos finais L-metionina e acido acético em concentração elevada. Por último, a enzima deve ter uma estabilidade térmica para manter sua atividade durante a reação com duração de 1 a 5 horas. Considerando as exigências acima, uma sulfidrilase de O-acetilhomoserina anteriormente revelada derivada de Hyphomonas neptúnio é uma enzima excelente, entretanto para maximizar o valor comercial do método de duas etapas para produzir metionina, uma procura pelas enzimas com aumento das três características é necessária.

REVELAÇÃO Problema técnico Os presentes inventores obtiveram genes de sulfidrilase de O-acetilhomoserina a partir de várias fontes microbianas e finalmente selecionaram gene de sulfidrilase de O-acetilhomoserina a partir de Rhodobacter sphaeroides através de experimentos.

A seguir, após utilizar a enzima em uma reação de conversão, os inventores verificaram que sulfidrilase de O-acetilhomoserina a partir de Rhodobacter sphaeroides é uma convertase economicamente viável a ser aplicada no método de duas etapas para produzir metionina, e também confirmaram que a viabilidade econômica da convertase pode ser aumentada por aperfeiçoar a enzima através da introdução de mutações, desse modo completando a presente invenção.

Solução técnica Um objetivo da presente invenção é fornecer uma proteína nova tendo atividade de sulfidrilase de O- acetilhomoserina.

Outro objetivo da presente invenção é fornecer um polinucleotídeo codificando a proteína nova.

Outro objetivo da presente invenção é fornecer uma proteína mutante tendo atividade de sulfidrilase O- acetilhomoserina aumentada.

Outro objetivo da presente invenção é fornecer um polinucleotídeo codificando a proteína mutante.

Outro objetivo da presente invenção é fornecer um vetor recombinante que compreende o polinucleotídeo.

Outro objetivo da presente invenção é fornecer um micro-organismo transformado com o vetor recombinante.

Outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para produzir metionina ou ácido acético a partir dos precursores O-acetilhomoserina e mercaptano de metila, utilizando a proteína, ou micro-organismo produzindo o mesmo.

Efeitos vantajosos A presente invenção provê uma proteína tendo a atividade de sulfidrilase de O-acetilhomoserina derivada de Rhodobacter sphaeroides, que é exigida para produzir L- metionina e ácido acético a partir de um substrato de mercaptano de metila (CH3SH). Se a proteína for utilizada, tem a vantagem de produzir L-metionina e ácido acético economicamente através de taxa de conversão mais elevada e tempo de reação reduzido em comparação com os métodos existentes que utilizam uma proteína tendo a atividade de sulfidrilase de O-acetilhomoserina a partir de Hyphomonas neptúnio.

Além disso, se a proteína mutante com atividade aumentada de sulfidrilase de O-acetilhomoserina da presente invenção for utilizada, isso pode minimizar a quantidade de homogeneizado de enzima adicionado, desse modo produzindo facilmente L-metionina e ácido acético em rendimento elevado.

Descrição dos desenhos A figura 1 representa o diagrama esquemático de vetor pCL-PCJ1-MetZhne.

As figuras 2a e 2b mostram os resultados de HPLC, demonstrando a produção de metionina.

Primeiramente, 5 a 10% de homogeneizado de micro-organismo (de um volume de reação total) compreendendo a proteína foram adicionados ao caldo de fermentação de O-acetilhomoserina, e a reação foi iniciada por adicionar 15% de Na-mercaptano de metila em um pH de 6 a 8. Após 2 horas, o caldo de fermentação foi coletado e as células foram removidas a partir daí para analisar produção de metionina.

A figura 3 mostra a comparação do nível de expressão de convertase em 2,5 ℓ, 5 ℓ, 10 ℓ do homogeneizado de célula de sulfidrilase de O-acetilhomoserina a partir de espécie de hyphomonas (MetZ-hne) e sulfidrilase de O- acetilhomoserina a partir da espécie rhodobacter (MetZ- rsp). A figura 4 demonstra as alterações de pH durante uma reação de conversão em um reator de batelada de 30L.

A figura 5 mostra as alterações de concentração de O- acetilhomoserina (OAHS) e L-metionina (Met) durante uma reação de conversão em um reator de batelada de 30 L, uma razão de mercaptano de metila (MeSH) adicionado em cada vez ajustando uma quantidade total de mercaptano de metila exigida como 100%, e uma taxa de conversão de metionina em cada vez.

A taxa de conversão de metionina é (g/g)% calculada por dividir uma quantidade total de metionina produzida até cada ponto de tempo por uma quantidade total de O-acetilhomoserina adicionada (* taxa de conversão de metionina, 92,59% = taxa de conversão de metionina em mol, 100%). Melhor modo Como um aspecto, a presente invenção provê uma proteína nova tendo atividade de sulfidrilase de O- acetilhomoserina.

Na presente invenção, a proteína tendo atividade de sulfidrilase de O-acetilhomoserina se refere a uma proteína nova capaz de sintetizar L-metionina utilizando O- acetilhomoserina, que é um precursor de L-metionina, e mercaptano de metila.

A proteína nova é preferivelmente uma proteína tendo atividade de sulfidrilase de O-

acetilhomoserina a partir de Rhodobacter sphaeroides.

Para fins da presente invenção, a proteína nova inclui qualquer proteína tendo atividade de sulfidrilase de O- acetilhomoserina sem limitação, porém pode ser preferivelmente a proteína de SEQ ID NO. 13. Como utilizado aqui, o termo “O-acetilhomoserina” é uma substância com um peso molecular de 161.16 e é o primeiro intermediário específico em biossíntese de metionina em micro-organismos.

Em bactérias intestinais O- succinilhomoserina é utilizado como um intermediário em vez de O-acetilhomoserina, e em plantas superiores O- fosfohomoserina é utilizado como intermediário.

O- acetilhomoserina é gerado de L-homoserina e acetil-CoA por catálise de acetil transferase de homoserina na bifurcação com biossíntese de treonina.

A publicação de patente WO2008/013432 revela um processo de produzir L-metionina utilizando um método de duas etapas, e nesse processo, O-succinilhomoserina e O- acetilhomoserina são os dois tipos de O-acil homoserina que é um precursor utilizado para produzir L-metionina.

Como utilizado aqui, o termo “precursor” se refere a uma substância produzida na etapa precedente de um produto final em um metabolismo ou reação biossintética.

Para fins da presente invenção, o precursor se refere a um metabólito produzido por cepa que produz precursor de L-metionina como uma parte da via metabólica específica de metionina, ou derivados do mesmo.

Especificamente, o precursor de L- metionina da presente invenção se refere a O- succinilhomoserina ou O-acetilhomoserina.

As enzimas capazes de produzir metionina de O-

succinilhomoserina entre os precursores de L-metionina através da conversão de enzima incluem cistationina gama sintase e O-succinilhomoserina sulfidrilase.

Em geral, o gene que codifica cistationina gama sintase é comumente mencionado como metB, e o gene codificando sulfidrilase de O-succinilhomoserina é comumente mencionado como metZ.

Essas enzimas têm as três atividades a seguir.

L-cisteína + O-succinilhomoserina => ácido succínico +cistationina Sulfeto (HS-) + O-succinilhomoserina => ácido succínico + homocisteína Mercaptano de metila + O-succinilhomoserina => ácido succínico + L-metionina Sulfidrilase de O-acetilhomoserina é uma enzima capaz de produzir L-metionina utilizando O-acetilhomoserina que é outro precursor de L-metionina.

Em geral, o gene codificando sulfidrilase de O-acetilhomoserina é comumente mencionado como metY.

Essa enzima tem as três atividades a seguir.

L-cisteína + O-acetilhomoserina => ácido acético + cistationina Sulfeto (HS-) + O-acetilhomoserina => ácido acético + homocisteína Mercaptano de metila + O-acetilhomoserina => ácido acético + L-metionina O uso de O-acetilhomoserina que requer menos fontes de carbono como glicose e açúcar bruto para produzir dois precursores de L-metionina é mais eficaz em termos de custo em produção de L-metionina.

Entretanto, embora enzima MetZ que é sulfidrilase de O-succinilhomoserina não obtenha uma inibição de realimentação a partir de seu produto final L- metionina, a enzima metY que é sulfidrilase de O- acetilhomoserina é inibida por seu produto L-metionina, e, portanto metY é difícil de utilizar em reação enzimática.

Em um exemplo da presente invenção, através do teste de vários genes metZ em relação a suas atividades, o gene metZ derivado de Rhodobacter sphaeroides tendo atividade de sulfidrilase O-acetilhomoserina foi identificado embora fosse previamente esperado ser um sulfidrilase de O- succinilhomoserina.

Além disso, foi confirmado que metZ derivado de Rhodobacter sphaeroides não obtém uma inibição de alimentação por L-metionina.

A proteína selecionada tendo atividade de sulfidrilase de O-acetilhomoserina pode ter uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO. 13. Em um exemplo da presente invenção, especificidade de substrato, nível de expressão de convertase, e atividade de convertase foram comparados entre as proteínas tendo a atividade de sulfidrilase de O-acetilhomoserina derivada de espécie Hyphomonas e sulfidrilase de O-acetilhomoserina derivada da espécie de Rhodobacter.

Como resultado, verificou-se que quando L-metionina é produzida utilizando uma proteína mutante de sulfidrilase de O-acetilhomoserina derivada de espécie de Rhodobacter, a proteína mutante mostrou especificidade de substrato mais elevada em direção a O-acetilhomoserina do que O-succinilhomoserina (tabela 1), e também demonstrou uma atividade enzimática aperfeiçoada durante fase de reação inicial, taxa de reação aperfeiçoada e taxa de conversão de L-metionina (tabela 2). Além disso, quando os níveis de inibição por produtos finais foram comparados entre as proteínas mutantes recombinantes derivadas das duas cepas, sulfidrilase de O- acetilhomoserina derivada de espécie Rhodobacter manteve uma atividade elevada em produção de L-metionina mesmo com inibição de realimentação pelo produto final do mesmo (tabela 3). Além disso, quando uma estabilidade térmica da enzima em relação à temperatura de reação foi comparada, a proteína mutante de sulfidrilase de O-acetilhomoserina derivada de espécie Rhodobacter mostrou uma estabilidade térmica superior em comparação com a proteína mutante de sulfidrilase de O-acetilhomoserina derivada de espécie de Hyphomonas (tabela 4). Portanto, a proteína tendo atividade de atividade de sulfidrilase de O-acetilhomoserina da presente invenção atende todas as exigências a serem utilizadas como convertase industrial incluindo atividade elevada, taxa de conversão elevada, superexpressão em E. coli, baixa inibição de atividade de enzima por produto final e capacidade para manter estabilidade térmica no momento de acúmulo de produto final, e desse modo por utilizar a enzima da presente invenção, L-metionina e ácido acético podem ser produzidos em taxa elevada e eficiência elevada.

Como outro aspecto, a presente invenção provê uma proteína mutante tendo atividade de sulfidrilase de O- acetilhomoserina aumentada do que um tipo selvagem.

Como utilizado aqui, o termo “mutação” ou “proteína mutante” se refere a uma cultura ou indivíduo demonstrando uma alteração fenotípica genética ou não genética estável, única.

Na presente invenção, uma proteína mutante se refere preferivelmente a uma proteína cuja atividade é aumentada em comparação como tipo selvagem devido a uma mutação em um ou mais dos genes codificando sulfidrilase de O- acetilhomoserina derivada de Rhodobacter sphaeroides.

A sequência da proteína mutante pode compreender a sequência de proteína tendo uma homologia de pelo menos 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% à sequência do tipo selvagem.

Preferivelmente, a proteína pode ser uma proteína mutante tendo uma atividade de sulfidrilase de O-acetilhomoserina aumentada através de uma mutação em que o 3º aminoácido do N-terminal da proteína representada pela sequência de aminoácido da SEQ ID NO. 13 é substituída com um aminoácido diferente de isoleucina, o 65º aminoácido a partir do mesmo é substituído com um aminoácido diferente de fenil alanina, e o 104º aminoácido do mesmo é substituído com um aminoácido diferente de valina, ou uma combinação de um ou mais dos três tipos de mutações de aminoácido é feita.

Mais preferivelmente, dois ou mais e mesmo mais preferivelmente três tipos de mutações podem ser combinadas.

Ainda mais preferivelmente, a proteína pode ser uma proteína mutante em que o 3º aminoácido do N-terminal, isoleucina, é substituído com asparagina, e o 65º aminoácido, fenil alanina, é substituído com tirosina, e o 104º aminoácido, valina é substituído com alanina.

A sequência de aminoácido da proteína mutante pode ser preferivelmente uma proteína mutante tendo a sequência de aminoácido de SEQ IDN O. 15, 16, 17 ou 18. Especificamente, uma proteína mutante representada pela sequência de aminoácido da SEQ ID NO. 15 é uma forma variante da proteína representada pela sequência de aminoácido da SEQ ID NO. 13 em que o 3º aminoácido do N- terminal do mesmo, isoleucina, é substituído com asparagina.

A proteína mutante representada pela sequência de aminoácido da SEQ ID NO. 16 tem uma substituição de fenil alanina, que é o 65º aminoácido a partir do N-terminal da proteína representada pela sequência de aminoácido da SEQ ID NO. 13, por tirosina.

A proteína mutante representada pela sequência de aminoácido da SEQ ID NO. 17 tem uma substituição de valina, que é o 104º aminoácido do N-terminal da proteína representada pela sequência de aminoácido da SEQ ID NO. 13, por alanina.

Além disso, a proteína mutante representada pela sequência de aminoácido da SEQ ID NO. 18 tem uma substituição de isoleucina, que é o 3º aminoácido do N- terminal da proteína representada pela sequência de aminoácido da SEQ ID NO. 13, por asparagina, uma substituição de fenil alanina, o 65º aminoácido, por tirosina, e uma substituição de valina, o 104º aminoácido, por alanina.

Em um exemplo da presente invenção, com base nas descobertas acima quatro proteínas mutantes como I3N, F65Y, V104A e E182G com atividade enzimática aperfeiçoada de proteína mutante de sulfidrilase de O-acetilhomoserina derivada de espécie Rhodobacter foram geradas.

A seguir, três proteínas mutantes válidas como I3N, F65Y e V104A foram selecionadas por medir a atividade das proteínas mutantes (tabela 9). Um vetor compreendendo a combinação das três proteínas mutantes válidas foi preparado, e transfectado em E. coli.

Após medir a atividade de cada proteína mutante, verificou-se que as proteínas mutantes tinham 1,75 vezes de atividade aumentada do que aquele da atividade de sulfidrilase de O-acetilhomoserina do tipo selvagem (tabela 10). Como outro aspecto, a presente invenção provê um polinucleotídeo que codifica uma proteína nova tendo atividade de sulfidrilase de O-acetilhomoserina ou uma proteína mutante tendo atividade de sulfidrilase de O- acetilhomoserina aumentada do que um tipo selvagem.

Como utilizado aqui, o termo “polinucleotídeo” se refere a um polímero de nucleotídeos tendo monômeros de nucleotídeo ligados em uma cadeia longa por ligação covalente, e genericamente significa uma fita de ácido desoxirribonucléico (DNA) ou ácido ribonucléico (RNA) mais longa do que certo comprimento.

Para fins da presente invenção, o polinucleotídeo pode ser um fragmento de polinucleotídeo que codifica a proteína.

Esse fragmento de polinucleotídeo compreende fragmentos de polinucleotídeo tendo uma homologia de pelo menos 90%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% à sequência de fragmento de polinucleotídeo tendo atividade de sulfidrilase de O-acetilhomoserina.

Preferivelmente, o polinucleotídeo pode ser o polinucleotídeo representado pela sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO. 14. O polinucleotídeo representado pela sequência de nucleotídeo da SE ID NO. 14 é o polinucleotídeo codificando a proteína do tipo selvagem tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID no. 13. Além disso, o polinucleotídeo codificando a proteína mutante pode ter a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO. 19, 20, 21 ou 22. Os polinucleotídeos tendo a sequência de nucleotídeo das SEQ ID Nos. 19, 20, 21 e 22 são os polinucleotídeos codificando as proteínas tendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS. 15, 16,17 e 18, respectivamente.

Como utilizado aqui, o termo “homologia” se refere a uma percentagem de identidade entre duas frações de polinucleotídeo.

A correspondência de sequência de uma fração para outra pode ser determinada pela técnica conhecida na técnica.

Por exemplo, homologia pode ser determinada por alinhar as informações de sequência de duas moléculas de polinucleotídeo diretamente por utilizar um programa de computador que é prontamente disponível e capaz de alinhar informações de sequência.

Além disso, a homologia pode ser determinada por hibridizar os polinucleotídeos sob a condição para formar uma fita dupla estável nas regiões homólogas e digerir a fita hibridizada por uma nuclease específica de fita única para determinar um tamanho de fragmento digerido.

Como utilizado aqui, o termo “homólogo” se refere à correlação entre proteínas onde todas as formas gramaticais e variações de soletrar incluem proteínas derivadas de superfamília (por exemplo, superfamília de imunoglobulina) e outras proteínas homólogas derivadas de espécie (por exemplo, cadeia leve de miosina, etc.) tendo uma ‘origem de evolução comum’. Tais proteínas (e genes de codificação das mesmas) têm uma homologia de sequência refletida por um alto grau de similaridade de sequência.

Entretanto, em um uso geral e na presente invenção, quando o termo ‘homogêneo’ é modificado por um adjetivo como ‘muito elevado’, se refere a uma similaridade de sequência, porém não uma origem de evolução comum.

Como utilizado aqui, o termo ‘similaridade de sequência’ se refere ao grau de identidade ou homologia entre as sequências de nucleotídeo ou sequências de aminoácido das proteínas que podem ou não compartilhar uma origem de evolução comum.

Em um exemplo específico, quando um casamento de polipeptídio entre duas sequências de aminoácidos é pelo menos 21% para um comprimento fixo de sequência de aminoácidos (preferivelmente pelo menos aproximadamente 50% e mais preferivelmente aproximadamente 75%, 90%, 95%, 96%, 97% ou 99%), essas duas sequências são ‘substancialmente homólogas’ ou ‘substancialmente similares’. Sequências substancialmente homólogas podem ser identificadas por comparar as sequências utilizando software padrão utilizado no banco de dados ou, por exemplo, por realizar experimento de hibridização do Sul sob as condições rigorosas definidas para certo sistema.

Uma condição definida apropriada para hibridização está compreendida no escopo de técnicas convencionais na técnica (por exemplo, Sambrook e outros, 1989, vide infra). Como outro aspecto, a presente invenção provê um vetor recombinante compreendendo um polinucleotídeo codificando a sulfidrilase de O-acetilhomoserina do tipo selvagem ou proteína mutante da mesma.

Como utilizado aqui, o termo ‘vetor’ se refere a qualquer veículo para clonar e/ou transferir nucleotídeos para uma célula hospedeira.

Um vetor pode ser um replicon para permitir a replicação dos fragmentos combinados com outros fragmentos de DNA. “Replicon” se refere a qualquer unidade genética que atua como uma unidade de autorreplicação para replicação de DNA in vivo, isto é,

replicável pela autorregulação (por exemplo, plasmídeo, fago, cosmídeo, cromossomo e vírus). O vetor pode incluir veículo viral e não viral para introduzir nucleotídeos em uma célula hospedeira in vitro, ex vivo ou in vivo, e também pode incluir um DNA mini-esférico.

Por exemplo, o vetor pode ser um plasmídeo sem uma sequência de DNA bacteriana.

A remoção de sequências de DNA bacterianas que são ricas em área CpG foi conduzida para reduzir um silêncio da expressão de transgene e promover expressão mais contínua de um vetor de DNA de plasmídeo (Ehrhardt, A. e outros (2003) Hum Gene Ther 10: 215-25; Yet, N.S. (2002) MoI Ther 5: 731-38; Chen, Z.Y. e outros (2004) Gene Ther 11: 856-64). Além disso, o vetor pode compreender um transposon como Sleeping Beauty (Izsvak e outros, J.

MoI.

Biol. 302: 93-102 (2000)), ou um cromossomo artificial.

Preferivelmente, vetores como pACYC177, pACY184, pCL1920, pECCG117, pUC19, pBR322 e pMW118 podem ser utilizados, e mais preferivelmente pCL_PCJ1 que é vetor pCL1920 inserido com promotor CJ1 (KR20060068505) pode ser utilizado.

Na presente invenção, o polinucleotídeo pode ser operativamente ligado a um vetor recombinante.

O termo “operativamente ligado” se refere à ligação operável de uma sequência reguladora para expressão de nucleotídeo com uma sequência de nucleotídeo codificando uma proteína alvo para executar sua função geral, desse modo afetando a expressão de uma sequência de nucleotídeo de codificação.

A ligação operável com um vetor recombinante pode ser feita utilizando uma técnica de recombinação de gene conhecida na técnica, e uma clivagem de DNA específico de sítio e ligação podem ser feitas utilizando uma enzima de restrição e ligase conhecida na técnica.

Além disso, o vetor recombinante pode compreender ainda um ou mais genes de resistência a antibiótico selecionados do grupo que consiste em gene de resistência a ampicilina, gene de resistência a canamicina, e gene de transferase de acetil cloramfenicol.

Como utilizado aqui, o termo ‘gene de resistência a antibiótico’ se refere a um gene tendo resistência a antibióticos, e as células compreendendo esse gene sobrevivem mesmo no ambiente tratado com o antibiótico correspondente.

Portanto, o gene de resistência a antibiótico é eficazmente utilizado como um marcador de seleção para uma produção em grande escala de plasmídeos em E. coli.

Na presente invenção, como o gene de resistência a antibiótico não é um fator que afete significativamente a eficiência de expressão que é obtida por uma combinação ótima de componentes do vetor que é a característica principal da presente invenção, qualquer gene de resistência a antibiótico comum pode ser utilizado como um marcador de seleção sem limitação.

Especificamente, os genes de resistência contra ampicilina, tetraciclina, canamicina, cloranfenicol, estreptomicina, ou neomicina podem ser utilizados, e preferivelmente gene de resistência a espectinomicina pode ser utilizado.

Como outro aspecto, a presente invenção provê um micro-organismo transformado com o vetor recombinante, para produzir sulfidrilase de O-acetilhomoserina.

Como utilizado aqui, o termo ‘transformação’ se refere à introdução de genes em uma célula hospedeira para a expressão da mesma.

O método para transformar o vetor da presente invenção nas células pode incluir qualquer método para introduzir os nucleotídeos nas células, e pode ser realizado por selecionar uma técnica padrão apropriada conhecida na técnica.

Método como eletroporação, co- precipitação de fosfato de cálcio, infecção retroviral, microinjeção, DEAE-dextrano e lipossoma catiônico pode ser utilizado, porém não é limitado aos mesmos.

O gene transformado pode ser inserido no cromossomo de uma célula hospedeira e localizado fora do cromossomo, desde que possa ser expresso na célula hospedeira.

Além disso, o gene compreende DNA e RNA como um polipeptídio codificando polinucleotídeo, e qualquer gene que pode ser introduzido e expresso na célula hospedeira pode ser utilizado sem limitação.

Por exemplo, o gene pode ser introduzido em uma célula hospedeira na forma de cassete de expressão que é uma construção de polinucleotídeo, compreendendo todos os elementos exigidos para autoexpressão.

O cassete de expressão compreende normalmente um promotor operativamente ligado ao gene, sinal de terminação de transcrição, sítios de ligação de ribossomo, e sinal de terminação de translação.

O cassete de expressão pode estar em uma forma de vetor de expressão autorreplicável.

Além disso, o gene pode ser um introduzido em uma célula hospedeira por si próprio ou em uma forma de construção de polinucleotídeo e operativamente ligado às sequências exigidas para a expressão na célula hospedeira.

Como utilizado aqui, o termo “micro-organismo transformado com vetor recombinante” se refere à célula transfectada com um vetor compreendendo o gene que codifica pelo menos uma proteína alvo.

Na presente invenção, se o micro-organismo compreende um tipo selvagem ou proteína mutante capaz de produzir sulfidrilase de O- acetilhomoserina através da transformação do vetor recombinante, quaisquer dos micro-organismos procarióticos e eucarióticos podem ser utilizados.

Por exemplo, cepas microbianas que pertencem a Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp., Corynebacteria sp., Pseudomonas sp., Leptospira sp., Salmonellar sp., Brevibacteria sp., Hypomononas sp., Chromobacterium sp.

E Norcardia sp.

Ou fungos ou levedura podem ser utilizados.

Preferivelmente, cepa microbiana que pertence a Escherichia sp., Corynebacteria sp., e leptospira sp., e levedura, e mais preferivelmente cepa microbiana de Escherichia sp., e mais preferivelmente E. coli podem ser utilizadas.

Como outro aspecto, a presente invenção provê um método para produzir metionina ou ácido acético, compreendendo a adição da proteína do tipo selvagem, proteína mutante, ou micro-organismo produzindo o mesmo para a mistura de O-acetilhomoserina e mercaptano de metila para desse modo reagir à mistura resultante.

O O-acetilhomoserina se refere à forma purificada de O-acetilhomoserina ou caldo de fermentação contendo O- acetilhomoserina.

Além disso, o mercaptano de metila se refere a todas as seguintes formas, uma forma de mercaptano de metila de sódio liquefeito (CH3S-Na), e forma de mercaptano de metila gasoso ou liquefeito (CH3SH), bem como um mercaptano de metila compreendendo sulfeto de dimetila (DMS) que é revelado na publicação de patente WO 2010/098629. Em um exemplo da presente invenção, para reação de conversão de L-metionina, 5 a 10% de homogeneizado de micro-organismos (de um volume de reação total) compreendendo o polipeptídio foi adicionado ao caldo de fermentação de O-acetilhomoserina, e a reação foi iniciada por adicionar 15% de Na-mercaptano de metila à mistura em um pH de 6 a 8. A seguir, após 2 horas o caldo de fermentação foi coletado e as células foram removidas a partir daí, que foi então analisado por HPLC para identificar produção de metionina.

Como mostrado na figura 2b, quando a proteína mutante da presente invenção foi utilizada para produzir metionina, a reação de conversão enzimática e atividade eram superiores àquelas nas cepas de produção existentes.

Além disso, a inibição de reação pelo produto de reação foi minimizada, e a estabilidade térmica da proteína mutante era excelente, desse modo sugerindo que a proteína mutante da presente invenção pode ser eficazmente utilizada para a finalidade industrial.

Como outro aspecto, a presente invenção provê um uso da proteína como sulfidrilase de O-acetilhomoserina.

Como descrito acima, a proteína da presente invenção pode ser uma proteína do tipo selvagem tendo a atividade de sulfidrilase de O-acetilhomoserina derivada de Rhodobacter sphaeroides e uma proteína mutante da mesma, e preferivelmente pode ser a proteína tendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOS. 13 e 15 a 18. A proteína da presente invenção tem elevada especificidade de substrato em direção a O-acetilhomoserina, desse modo tendo a atividade de sulfidrilase de O-acetilhomoserina ou atividade aumentada da mesma, e, portanto pode ser utilizado para produzir metionina ou ácido acético.

Modo para invenção

A seguir, a constituição e efeito da presente invenção são descritos em mais detalhe através da provisão de exemplos como abaixo.

Entretanto, esses exemplos pretendem meramente ilustrar a presente invenção, porém de modo algum limitar o escopo da presente invenção.

Exemplo 1: produção de convertase de metionina 1-1 sulfidrilase de O-acetilhomoserina de espécie Hyphomonas Iniciadores foram gerados por obter a sequência de gene de sulfidrilase de O-acetilhomoserina de Hyphomonas neptúnio que converte O-acetilhomoserina em metionina do web site KEGG (WWW.kegg.com). O cromossomo de Hyphomonas neptúnio foi adquirido de ATCC (EUA). A reação PCR foi realizada com 30 ciclos de etapa de desnaturação a 94ºC por 30 segundos, etapa de anelamento a 55ºC por 30 segundos, e etapa de extensão a 72ºC por 2 minutos, utilizando o cromossomo como gabarito e os iniciadores das SEQ ID NOS. 1 e 2. O kit de pré-mistura HL PCR (Bioneer, Coréia) foi utilizado para a reação PCR.

Fragmentos de DNA obtidos pela reação PCR foram clivados por Nco1/HindIII e clonados em vetor pCL-PCJ1 digerido com as mesmas enzimas.

O vetor finalmente preparado foi nomeado como pCL-PCJ1-MetZhne e o diagrama esquemático do mesmo foi mostrado na figura 1. Os vetores clonados foram transformados em células K12 de Escherichia coli, e cultivados na placa de meio LB adicionada com 50 ug/L de espectinomicina, e a colônia foi selecionada.

A colônia selecionada foi inoculada em 3 mL de meio LB contendo 50 ug/L de espectinomicina, e cultivado a 37ºC, 200 rpm por 16 horas.

A cultura de célula foi inoculada novamente em 25 mL de meio líquido LB novo (em frasco de 250 mL), e cultivado até O.D.600 atingir 0.5 a 0.6 (por 2 a 3 horas) sob a mesma condição de cultura, e imediatamente após foi cultivado em 500 mL de meio LB (em jarro de 1 L) adicionado com glicose a 4% até esgotamento de glicose. 1 mL de meio de cultura de enzima foi coletado, o sobrenadante foi removido por centrifugação, e as células peletizadas foram lavadas com 0.1M de tampão de fosfato de potássio (pH 7,5). As células foram suspensas novamente em 1 mL de tampão de fosfato de potássio e trituradas cinco vezes em intervalos de 30 segundos utilizando ultra-som.

O homogeneizado de célula triturada foi coletado e uma quantidade total de proteína foi quantificada utilizando o ensaio de quantificação de proteína BIO-Rad (BIO-Rad, EUA). Além disso, a expressão de proteína foi confirmada por SDS- PAGE.

Subsequentemente, o homogeneizado de célula coletada foi utilizado na reação de conversão enzimática. 1-2. sulfidrilase de O-acetilhomoserina da espécie Rhodobacter O gene metZ que codifica sulfidrilase de O- acetilhomoserina de Rhodobacter sphaeroides que converter O-acetilhomoserina em metionina foi clonado nesse experimento.

A reação PCR foi realizada com 30 ciclos de etapa de desnaturação a 94ºC por 30 segundos, etapa de anelamento a 55ºC por 30 segundos, e etapa de extensão a 72ºC por 2 minutos, utilizando o cromossomo de Rhodobacter sphaeroides como gabarito e os iniciadores de SEQ ID NOS. 3 e 4. Fragmentos de DNA obtidos da reação de PCR foram clivados por Nco1/HindIII e clonados em vetor pCL-PCJ1

(Korea, CJ) digerido com as mesmas enzimas.

O homogeneizado de células foi obtido utilizando os vetores clonados do mesmo modo como descrito no exemplo 1-1 e foi utilizado na reação de conversão enzimática.

Exemplo 2: comparação de nível de expressão de convertase, especificidade de substrato e atividade de convertase O nível de expressão e atividade enzimática foram comparados entre sulfidrilase de O-acetilhomoserina derivado de espécie Hyphomonas e sulfidrilase de O- acetilhomoserina derivado de espécie Rhodobacter utilizando cada dos homogeneizados de célula obtidos pelos métodos dos exemplos 1-1 e 1-2. Em geral, a quantidade de proteína é quantificada utilizando um ensaio de quantificação de proteína da BIO- Rad, como mencionado no exemplo 1-1, entretanto, ao analisar a mistura de proteína com proteínas E.coli como homogeneizado de enzimas, é difícil comparar o nível de expressão de certas enzimas utilizando o método de quantificação de proteína.

Portanto, nesse experimento SDS- PAGE foi utilizado para comparar o nível de expressão da convertase no homogeneizado de célula obtido dos exemplos 1-1 e 1-2. Como resultado de comparar sulfidrilase de O- acetilhomoserina derivada de espécie Hyphomonas (Metz-hne) e sulfidrilase de O-acetilhomoserina derivada da espécie Rhodobacter (MetZ-rsp) utilizando 10 ℓ, 5 ℓ e 2,5 ℓ de dois homogeneizados de células, foi observado que MetZ-rsp mostrou aproximadamente nível de expressão 4 vezes mais elevado do que MetZ-hne (figura 3). Para determinar especificidade do substrato de duas enzimas, O-acil homoserina foi dissolvido em 0.1M de tampão de fosfato de potássio (pH 7,5) a uma concentração final de 3mM. além disso, piridoxal 5’-fosfato (Sigma, EUA), que é utilizado como um co-fator, foi adicionado à mistura de reação a uma concentração final de 10 uM.

Outro substrato mercaptano de metila (Japan Tokyo Chemical Industry Ltd.) foi adicionado à mistura de reação a uma concentração final de 2 mM. 1 mL da mistura de ração foi colocado a 37ºC, e então 10 ℓ de cada extrato de enzima foi adicionado para fazer uma concentração de proteína final de 5 mg/mL.

O progresso da reação foi confirmado por medir a absorvência a 415 nm por coletar 100 ℓ da mistura de reação após início da reação e adicionar o mesmo a 900 ℓ de solução de 4 mg/mL DTNB (5,5-ditiobis (2-nitro-ácido benzóico), Sigma, EUA). DTNB reage com grupo –SH de mercaptano de metila que resta na mistura de reação e sintetiza uma substância amarela.

Portanto, o progresso da reação pode ser monitorado por observar o desaparecimento da cor amarela na mistura de reação à medida que o mercaptano de metila na mistura de reação é convertido em metionina.

Além disso, se a diferença em absorvência de DTNB antes e após a reação (O.D.415) for elevada, sugere que a atividade de enzima é forte.

Como resultado da reação da mistura de reação de O- acil homoserina e solução de enzima, foi observado que tanto sulfidrilase de O-acetilhomoserina derivado de Hyphomonas neptúnio como sulfidrilase de O-acetilhomoserina derivada de Rhodobacter sphaeroides mostrou especificidade de substrato mais elevada em direção a O-acetilhomoserina do que O-succinilhomoserina.

A especificidade de substrato de cada enzima é mostrada simplesmente como o número de ‘+’ na tabela 1. Em geral, foi identificado que as duas cepas têm especificidade de substrato mais elevada em direção a O-acetilhomoserina do que O-succinilhomoserina.

Tabela 1 Cepa Nome de Especificidade de substrato gene O-succinil homose O-acetil homose rina (OSH) rina (OAH)

Hyphomonas Ne metZ + +++ ptúnio

Rhodobacter metZ + +++++ sphaeroides

Exemplo 3: comparação das reações de MetZ-hne e MetZ- rsp durante fase inicial em um meio de O-acetilhomoserina em concentração elevada Para comparar as taxas de conversão de enzimas MetZ- hne e MetZ-rsp em concentração elevada de O- acetilhomoserina, experimento de conversão de metionina foi realizado em concentração de O-acetilhomoserina de 80 g/L. as taxas de produção de metionina relativas foram comparadas entre sulfidrilase de O-acetilhomoserina derivada de Hyphomonas neptúnio e sulfidrilase de O- acetilhomoserina derivada de Rhodobacter sphaeroides a partir da conversão enzimática de 80 g/L de O- acetilhomoserina em escala de tubo de 1 mL com o passar do tempo.

Taxas de reação de sulfidrilase de O-

acetilhomoserina podem ser comparadas por medir a concentração de metionina produzida a partir da reação.

Mais especificamente, a reação de conversão enzimática foi realizada a 33ºC por adicionar 0,01 mL de mercaptano de metila de sódio (15%, peso/v) que é outro substrato exigido para produzir metionina, 0,01 mL de sulfidrilase de O- acetilhomoserina, e 0.1 mM piridoxal 5-‘fosfato o co-fator de enzima para 1 mL de 80 g/L O-acetilhomoserina, e agitando a 800 rpm.

Cada dos extratos de enzima foi adicionado a uma concentração de proteína final de 5 mg/mL.

A concentração de metionina e O-acetilhomoserina foi analisada por HPLC.

A taxa de conversão de metionina foi calculada como o número de mols de metionina produzida de 1 mol de mercaptano de metila adicionado na reação.

Como mostrado na tabela 2, sulfidrilase de O- acetilhomoserina derivado de Rhodobacter sphaeroides mostrou taxa de reação mais elevada durante fase inicial e taxa de conversão mais elevada do que sulfidrilase de O- acetilhomoserina derivado de Hyphomonas neptúnio mesmo em concentração elevada de O-acetilhomoserina.

Tabela 2 tempo (em minutos) 2 4 6 8 10

MetZ - Metionina(g/L ) 1.8 2.6 3.4 4.1 4.6 hne

Conversão (%) 25.71 37.14 48.57 58.57 65.71

MetZ – Metionina(g/L ) 3.7 5.0 5.2 5.5 5.8 rsp Conversão (%) 52.4 71.0 73.3 78.1 81.9 Exemplo 4: comparação do grau de inibição de reação pelos produtos de reação metionina e ácido acético No método de duas etapas, L-metionina e ácido acético são produzidos na reação enzimática. Entretanto, é sabido que uma concentração elevada de L-metionina reduz a taxa de reação enzimática e ácido acético inibe a atividade de enzima através da alteração de proteína. Para a conversão enzimática de O-acetilhomoserina em L-metionina e ácido acético para fins industriais, a enzima deve manter atividade elevada mesmo com a inibição de atividade de enzima, acima descrita. As atividades de metZ- hne e MetZ-rsp na presença de L-metionina e acido acético em concentração elevada foram comparadas. Especificamente, na presença de 0.3M L-metionina (aproximadamente 45 g/L) e

0.3M de ácido acético, as atividades foram comparadas utilizando um método DTNB descrito no exemplo 2. 25 l de 5 mg/mL de homogeneizado de célula foram utilizados nessa reação. Os resultados mostraram que a atividade residual de MetZ-hne e MetZ-rsp foram 42% e 50% respectivamente, e desse modo foi confirmado que Metz-rsp tem um grau inferior de inibição de atividade de enzima mesmo na presença de L- metionina e ácido acético em concentração elevada (tabela 3).

Tabela 3 Tempo (minutos) OD415 0 1 Met/Acetato MetZ-hne 0.69 0.46 0.23 MetZ-rsp 0.69 0.48 0.21 0 M Met/Acetato MetZ-hne 0.69 0.58 0.11

0.3 M MetZ-rsp 0.69 0.60 0.09 Além disso, as reações de conversão por duas enzimas na presença de 0.3M L-metionina e 0.3M de ácido acético foram analisadas, e os resultados são mostrados na tabela

4. Tabela 4 Tempo (minutos) 0 5 10 15 OD415 MetZ-h ne 0.69 0.55 0.39 0.25 MetZ-r sp 0.69 0.49 0.31 0.12 Exemplo 5: comparação de estabilidade térmica de enzimas de MetZ-hne e MetZ-rsp No processo de conversão enzimática em uma escala industrial, a reação continua por aproximadamente 1 a 6 horas em uma temperatura de 33 a 37ºC. além de uma inibição de realimentação por produtos de reação, a enzima com baixa estabilidade térmica tem atividade de enzima inferior à medida que a reação de conversão progride.

Desse modo, a estabilidade térmica de enzima é um fator importante em aplicabilidade industrial e eficácia em termos de custo.

Para comparar a estabilidade térmica das enzimas, cada dos homogeneizados de célula obtidos pelos métodos dos exemplos 1-1 e 1-2 foi tratado a calor a 50ºC por 10, 30, 60, 120 e 240 minutos, e então a atividade residual de enzimas foi comparada utilizando um método DTNB do exemplo 2. Como mostrado na tabela 5, sulfidrilase de O- acetilhomoserina derivada de Rhodobacter sphaeroides mostrou a atividade residual de 95% após tratamento térmico de 240 minutos a 45ºC em comparação com sua atividade antes do tratamento térmico.

Por outro lado, MetZ-hne mostrou a atividade residual de 75%, desse modo sugerindo que MetZ- rsp tem uma estabilidade térmica superior.

Tabela 5 Tempo (minutos)

45℃ tratamento 0 10 30 60 120 240 térmico

Atividade MetZ-hne 100 98 95 91 84 75 relativa (%)

MetZ- 100 100 100 99 97 95 rsp

Exemplo 6: conversão enzimática de meio de O- acetilhomoserina em L-metionina utilizando MetZ-rsp em um reator de batelada No presente exemplo, para avaliar a atividade de conversão de sulfidrilase de O-acetilhomoserina (metZ-rsp) identificado em uma escala de tubo agora em um sistema de reator, um reator de batelada tendo um volume ótimo de 1L foi utilizado.

O-acetilhomoserina que é um substrato exigido para reação de conversão enzimática foi produzido por fermentar uma cepa microbiana revelada na técnica anterior, e as células foram removidas do caldo de fermentação cultivado utilizando uma centrífuga. 500 mL de aproximadamente 70 g/L de meio de cultura foram utilizados (WO2008/013432). Uma vez que mercaptano de metila existe em uma forma gasosa em temperatura ambiente, o experimento foi realizado utilizando uma solução de mercaptano de metila de sódio em uma forma líquida (CH3S-Na, 4.7M, 33%, Arkema França) que foi gerada por adição de mercaptano de metila em solução de soda caustica.

Aproximadamente 50 mL de mercaptano de metila de sódio foram utilizados na reação de conversão enzimática.

Como solução de enzima, 50 mL de homogeneizado de célula MetZ-rsp produzido pelo método do exemplo 1 foram adicionados à reação juntamente com 0.1mM piridoxal 5’-fosfato (Sigma, EUA). A reação de conversão enzimática foi realizada em um pH de 7.0 e a 33ºC com agitação a 700 rpm.

A reação foi realizada por 3 horas enquanto adiciona mercaptano de metila de sódio.

Concentrações de O-acetilhomoserina e L-metionina produzidas com o passar do tempo foram analisadas por HPLC e esses resultados são mostrados na tabela 6. Tabela 6

Tempo (minutos) O-Acetilhomoserina L-Metionina (g/L) (g/L)

0 66.1 0

30 20.6 34.1

90 9.5 42.0

120 3.1 47.2

180 0 49.5

Em geral, foi observado que a reação de conversão enzimática de meio de O-acetilhomoserina em L-metionina utilizando uma solução de enzima de MetZ-rsp em um reator de batelada de 1L foi rápida e mostrou taxa de conversão elevada (97% mol de taxa de conversão). Exemplo 7: aumento da reação de conversão enzimática de meio de O-acetilhomoserina em L-metionina utilizando MetZ-rsp em um reator de batelada No presente exemplo, para avaliar o aumento do sistema de reação de conversão enzimática de metionina através da atividade de conversão de sulfidrilase de O- acetilhomoserina (metZ-rsp) identificado no reator de batelada de 1L, a reação de conversão de metionina foi realizada utilizando um reator de batelada de 30L (fermentador Korea, Coréia). O-acetilhomoserina que é um substrato exigido em reação de conversão enzimática foi produzido, como no exemplo 6, por fermentar as cepas microbianas reveladas na técnica anterior (WO2008/013432), e a cepa microbiana foi removida do caldo de fermentação cultivado utilizando uma centrífuga.

O sobrenadante foi diluído por adicionar água para fazer a concentração de O-

acetilhomoserina 66 g/L, e utilizado na reação.

Após 23L de sobrenadante de fermentação diluído ser colocado no fermentador, 500 mL de homogeneizado de enzima metZ-rsp gerado pelo método descrito no exemplo 1 foram adicionados ao mesmo, e então um co-fator piridoxal 5’- fosfato (Sigma, EUA) foi adicionado a uma concentração final de 0.1 mM. subsequentemente, um pH da mistura de reação foi ajustada a 6.5 por adicionar gás amônia e a temperatura e agitação foram ajustadas em 37ºC e em 300 rpm, respectivamente.

Mercaptano de metila (CH3SH, 99,5%, UK, Intergas) em forma gasosa foi utilizado, e foi colocado diretamente na mistura de reação enquanto controla a quantidade de gás adicionada utilizando um controlador de fluxo de massa.

Uma vez um pouco de mercaptano de metila foi evaporado na mistura de ração e aumentou a pressão dentro do reator, a velocidade de fornecer mercaptano de metila foi ajustada para manter a pressão em menos do que 0.5 bar.

Aproximadamente 220 L (470 g) de mercaptano de metila aforam adicionados à reação para um total de 120 minutos enquanto controla a velocidade de fornecimento em 3 a 5 L/min. pelos 30 primeiros minutos do período de reação rápida e então em 1 a 2 L/min. pelos 90 minutos restantes do período de reação lenta.

A quantidade total de mercaptano de metila adicionado é a mesma quantidade molar que O-acetilhomoserina presente na mistura de reação durante a reação de conversão enzimática, todo o qual foi consumido durante síntese de metionina.

Após conclusão da reação, a quantidade residual de mercaptano de metila foi menor do que 0,1 g/L.

Uma vez que durante a reação, toda vez que 1 mL de metionina é produzido 1 mol de ácido acético é produzido reduzindo o pH, um pH da reação foi mantido em 6,5 por adicionar gás amônia para elevar o pH sempre que cair para 6,48. A taxa de reação pode ser determinada por medir a inclinação de diminuição de pH, e a conclusão de reação pode ser determinada quando a diminuição de pH é lenta.

A reação foi realizada por 6 horas enquanto adiciona mercaptano de metila à reação.

As alterações nas concentrações de O-acetilhomoserina e L-metionina com o passar do tempo foram analisadas por HPLC e os resultados são mostrados na figura 5. O perfil de alteração de pH durante a reação é mostrado na figura 4 e o gráfico de conversão de metionina pela reação é demonstrado na figura 5. Em geral, foi confirmado que mesmo quando mercaptano de metila gasoso foi utilizado na reação de conversão enzimática de meio de O-acetilhomoserina em L-metionina utilizando uma solução de enzima de metZ-rsp em um reator de batelada de 30 L, a conversão de metionina com taxa de conversão molar de 98% por 6 horas poderia ser obtida.

Exemplo 8: aperfeiçoamento de atividade enzimática de metZ-rsp através de aplicação de mutação No presente exemplo, PCR propenso a erro foi realizado para induzir mutagênese aleatória em um metZ-rsp do tipo selvagem, e para esse experimento um kit de mutagênese aleatório PCR de diversificação (CLONTECH, EUA) foi utilizado.

Para encontrar as condições ótimas para estabelecer uma taxa de mutação alvo, PCR propenso a erro foi realizado sob as duas condições a seguir em várias concentrações de MnSO4 e dGTP.

O pCL-PCJ1:metZ-rsp clonado no exemplo 1-1 foi utilizado como um gabarito de DNA onde mutações devem ser introduzidas.

Tabela 7 Condição 1 (ℓ) Condição 2 (ℓ)

10x tampão taq de titânio 5 5

MnSO4 (8mM) 2 4 dGTP (2mM) 1 2

50x dNTP Mistura 1 1

Polimerase taq de titânio 1 1

Iniciador avançado 2 2

Iniciador inverso 2 2

DNA gabarito 1 1 dH20 35 32

Total 50 50

Condição PCR propensa a 94 °C: 30 segundos erro Condição PCR propensa a 25 ciclos 94℃: 30 segundos 55℃: 30 erro segundos 68℃: 60 segundos

Condição PCR propensa a 68℃: 60 segundos erro

Os produtos de PCR propenso a erro realizado sob as condições da tabela 7 foram clivados com Nco1/HindIII, e clonados em vetor pCL-Pcj1 que foi digerido com as mesmas enzimas.

A biblioteca de mutante clonado foi transformada em células Escherichia coli K12, que foram então cultivadas em uma placa de meio LB contendo 50 g/L de pectinomicina. Após cultura, 50 colônias foram selecionadas, e então a análise de sequenciamento foi realizada para determinar a taxa de mutação e verificar a ocorrência de mutação em vários locais. Os resultados de análise de sequenciamento demonstram que a taxa de mutação era 2.4 kb-1 sob a condição 1, e 2.9 kb-1 sob a condição 2. Com base nesses resultados, foi determinado que as condições 1 e 2 poderiam fornecer uma taxa de mutação apropriada para gerar uma biblioteca de mutante, e desse modo a seleção de mutações válidas foi realizada utilizando as bibliotecas produzidas sob as condições acima. As células resultantes foram cultivadas em uma primeira placa de 96 cavidades profundas, e tratadas com solução BugBuster em razão de 1:1 (MERCK, EUA) para obter homogeneizado de células. A seguir, 50 l do homogeneizado de células foram coletados e misturados com 50 l da mistura de reação compreendendo 300 mM de O- acetilhomoserina e 1 mM de substrato de L-cisteína. A mistura de reação resultante foi reagida por 60 minutos em uma temperatura ambiente enquanto adiciona 50 ul de solução DTNB em tempos designados. Os valores de O.D. foram medidos a 425 nm após formação de cor e os resultados são mostrados na tabela 8. Tabela 8 Tempo (minutos) 0 5 10 15 30 60

2.17 1.19 0.65 0.50 0.37 0.30 OD415

2.01 1.00 0.40 0.23 0.05 0.00 OD compensado

Sinal 0.16 0.19 0.25 0.27 0.32 0.30 antecedente, 415nm

No gráfico de nível de cor DTNB com o passar do tempo, os valores O.D. de L-cisteína residual são 1,19 e 0,65 em 5 minutos e 10 minutos após a reação, respectivamente.

Na seleção efetiva, os mutantes com menos de 1.0 de nível de cor DTNB de cisteína residual após 5 minutos de reação enzimática foram selecionados.

Mutantes candidatos que mostraram atividade significativamente aumentada foram selecionados utilizando o método de seleção acima.

Subsequentemente, o alinhamento de sequência de nucleotídeos foi realizado para selecionar a mutação válida nos mutantes candidatos.

A seguir, finalmente os mutantes compreendendo 4 tipos de mutações como 13N (SEQ ID NO: 15), F65Y (SEQ ID NO: 16), V104A (SEQ ID NO: 17) e E182G foram selecionados.

Finalmente mutações selecionadas eram para ser introduzidas como uma mutação candidata, e por introduzir cada tipo de mutações candidatas individualmente em um vetor padrão pCL-PCJ1:metZ- rsp, a atividade aumentada foi validada.

Para gerar os vetores introduzidos com cada tipo de mutações candidatas, o vetor de expressão metZ-rsp introduzido com cada mutação candidata foi produzido utilizando os iniciadores das SEQ ID Nos. 5 e 6 para mutação 13N, os iniciadores das SEQ ID NOS. 7 e 8 para mutação F65Y, os iniciadores de SEQ ID Nos. 9 e 10 para mutação 104A, e os iniciadores das SEQ ID NOS. 11 e 12 para mutação E182G. a introdução bem sucedida de mutação foi confirmada por análise de sequenciamento (Macrogen, Coréia). O vetor mutante gerado foi transformado em E. coli K12, e cultivado em um frasco de meio LB a 33ºC e 200 rpm por 15 horas. A seguir as amostras cultivadas foram analisadas para validar cada mutação candidata. Os resultados são mostrados na tabela 9. Tabela 9 Mutação OD56 2nm Atividade Unidade Atividade Unidade espec. espec.

tipo 9.18 1.63 32.67 0.18 3.56 selvagem I3N 8.93 1.89 0.21 4.22

37.73 F65Y 8.83 2.00 0.23 4.52

39.93 V104A 8.60 1.88 0.22 4.38

37.67 E182G 9.53 1.43 0.15 3.00

28.60 A avaliação de frasco após introduzir cada mutação candidata demonstrou que 13N (SEQ ID NO. 15), F65Y (SEQ ID NO. 16) e V104A (SEQ ID NO. 17) é a mutação válida que mostra atividade aumentada em comparação com o grupo de controle existente de metZ-rsp. Por outro lado, mutação E182G foi determinada como sendo inválido para ter atividade aumentada, e desse modo foi excluído para o experimento subsequente.

Todos os três tipos de mutações válidas incluindo I3N, F65Y e V104A que foram confirmadas como tendo atividade aumentada foram introduzidos no vetor pCL-PCJ1:metZ-rsp (nomeado como pCL-PCJ1:metZ-rspM3) para gerar um vetor com atividade ainda mais aumentada. Três tipos de mutações foram introduzidas uma a uma no vetor utilizando os iniciadores acima listados. O vetor de expressão preparado com três tipos de mutações foi transformado em E. coli K12 e cultivado em um frasco. A seguir, a cultura de célula foi analisada para avaliar a atividade do vetor de expressão e os resultados são mostrados na tabela 10. Tabela 10 Mutação Atividade Atividade espec.

pCL-PCJ1:metZ-rsp 1.00 1.00 pCL-PCJ1:metZ-rsp M3 1.75 1.73 Como mostrado na tabela 10, foi confirmado que pCL- PCJ1:metZ-rsp M3 com três tipos de mutações válidas introduzidas tem 1,75 vezes de atividade aumentada do que o pCL-PCJ1:metZ-rsp.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Proteína recombinante tendo atividade de sulfidrilase de O-acetilhomoserina, caracterizada por ser representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO.

13.

2. Polinucleotídeo recombinante, caracterizado pelo fato de que codifica a proteína conforme definida na reivindicação 1.

3. Polinucleotídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por ser representado pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO. 14.

4. Proteína mutante tendo atividade de sulfidrilase de O-acetilhomoserina, caracterizada pelo fato de que um 3º aminoácido do N-terminal da proteína representada pela sequência de aminoácido da SEQ ID NO. 13 é substituído com um aminoácido diferente de isoleucina, um 65º aminoácido do mesmo é substituído com um aminoácido diferente de fenil alanina, um 104º aminoácido do mesmo é substituído com um aminoácido diferente de valina, ou um ou mais dos três tipos de mutações de aminoácido são feitas.

5. Proteína mutante, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a mutação é feita por substituição do 3º aminoácido do N-terminal com asparagina, o 65º aminoácido com tirosina, e o 104º aminoácido com alanina.

6. Proteína mutante, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de ter a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS. 15 a 18.

7. Polinucleotídeo recombinante, caracterizado pelo fato de que codifica a proteína mutante conforme definida na reivindicação 4.

8. Polinucleotídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de ter a sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS. 19 a 22.

9. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 2, 3, 7 e 8.

10. Micro-organismo recombinante, caracterizado pelo fato de ser transformado com o vetor recombinante, conforme definido na reivindicação 9, para produzir sulfidrilase de O-acetilhomoserina.

11. Micro-organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser Escherichia coli (E. coli).

12. Método para produzir metionina ou ácido acético, caracterizado pelo fato de compreender adicionar a proteína recombinante conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1, 4, 5 e 6, ou o micro-organismo recombinante produzindo o mesmo para a mistura de O- acetilhomoserina e mercaptano de metila para desse modo reagir a mistura resultante.