KR101660060B1

KR101660060B1 - Ｎ-아실-메티오닌을 제외한 메티오닌의 생성 방법

Info

Publication number: KR101660060B1
Application number: KR1020117006419A
Authority: KR
Inventors: 그웨나엘르 베스텔-코레; 필리페 수카이으; 라이너 피게
Original assignee: 메타볼릭 익스플로러
Priority date: 2008-08-22
Filing date: 2009-08-21
Publication date: 2016-09-26
Also published as: PL2326724T3; US8748136B2; EP2326724A1; BRPI0917192A2; CN102203270A; CN104293845A; US20100047879A1; AR073113A1; JP2012500622A; KR20110046542A; WO2010020290A1; MX2011001962A; RU2011108705A; ES2739466T3; JP5805533B2; EP2326724B1; WO2010020681A1; MY174404A

Abstract

본 발명은 탄소 공급원 및 황 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지에서 미생물을 배양하는 것에 의한 메티오닌 또는 그의 유도체의 생산 방법에 관한 것이다. 미생물 및/또는 배양 배지 및/또는 공정 파라미터는 부산물인 N-아실-메티오닌 (NAM)의 축적이 감소되도록 변형되었다. 발효 배지로부터 메티오닌 또는 그의 유도체를 단리하는 방법도 또한 청구한다.

Description

Ｎ-아실-메티오닌을 제외한 메티오닌의 생성 방법 {PRODUCING METHIONINE WITHOUT N-ACYL-METHIONINE}

시스테인, 호모시스테인, 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌과 같은 황-함유 화합물은 세포 대사에 중요하고, 식품 또는 사료 첨가물 및 약품으로서 사용하기 위하여 산업상 생산된다. 특히, 동물들이 합성할 수 없는 필수 아미노산인 메티오닌은 수많은 신체 기능에서 중요한 역할을 한다. 현재 D,L-메티오닌은 아크롤레인, 메틸 메르캅탄 및 시안화수소로부터 화학적 합성에 의해 제조된다. 가솔린-유래 전구체인 아크롤레인 및 메틸 메르캅탄의 가격 상승에 더불어 메티오닌에 대한 요구의 증가는 메티오닌의 미생물에 의한 생산을 매력적이게 한다.

L-메티오닌 합성 경로는 많은 미생물에서 널리 알려져 있다 (문헌 [Figge RM (2006), ed Wendisch VF, Microbiol Monogr (5) Amino acid biosynthesis p164-185]을 검토하기 바람). 이. 콜라이(E. coli) 및 C. 글루타미쿰(C. glutamicum) 메티오닌 생산 균주가 특허 출원 WO2005/111202, WO2007/077041, WO2007/012078 및 WO2007/135188에 기술되어 있다.

발효에 의해 생산된 메티오닌은 발효 브로쓰로부터 정제될 필요가 있다. 메티오닌의 비용-효과적인 정제는 발효 브로쓰에서의 부산물의 양을 최소화하는 생산 균주 및 생산 공정에 좌우된다. "부산물"은 메티오닌 변환 및/또는 분해 경로에서 발생한다. 특히, 이러한 생성물로는 S-아데노실-메티오닌 (SAM), 티오-메틸-리보스 및 N-아실-메티오닌 (NAM), 예컨대 N-아세틸-메티오닌 및 N-프로피오닐-메티오닌이 있다. 특허 출원 PCT/EP2007/060433에 개시된 바와 같이, 이. 콜라이 메티오닌 생산 균주는 N-아세틸-메티오닌을 생산한다. 이. 콜라이는 또한 N-프로피오닐-메티오닌도 생산한다.

NAM의 생산은 메티오닌 수율을 감소시키고 메티오닌의 정제를 보다 어렵게 만들기 때문에 바람직하지 않다. NAM은 발효 과정의 마지막에 NAM 아실라제를 첨가하는 것에 의해 메티오닌 및 아세테이트로 변환될 수 있지만, 이는 생산 비용을 대폭 증가시킨다. 따라서, 발효 과정 동안 NAM의 축적을 감소시키거나 제거하는 것이 필요하다. 이를 위해 NAM의 축적에 관한 반응을 잘 이해하는 것이 요구된다.

공-번역 프로세스로서 메티오닌의 N-말단 아세틸화는 진핵생물에서의 가장 흔한 단백질 변형 중 하나이다. 그럼에도 불구하고, N-아세틸-메티오닌이 N-말단 아세틸라제에 의해 생산되는 것으로 보이지는 않는데 (검토를 위해 문헌 [Polevoda & Sherman 2000 JBC 275, 47, pp 36479-36482] 참조), 이는 메티오닌은 메티오닌 생산 박테리아에서 유리 아미노산으로서 아세틸화되는 것으로 보이고, 원핵생물에서는 공-번역 프로세스로서 메티오닌 아세틸화가 드물기 때문이다 (문헌 [Driessen et al., 1985, CRC Crit. Rev. Biochem. 18, 281-325]). N-아세틸-메티오닌은 거의 유리 L-메티오닌의 아세틸화에 의해 수득되는 것으로 보인다. 메티오닌을 아세틸화할 수 있는 N-아세틸화 효소가 기술되어 있다. 예를 들어, ArgA는 이. 콜라이에서 N-아세틸-글루타메이트 신타제를 코딩한다 (문헌 [Marvil & Leisinger 1977 JBC 252, 10 pp. 3295-3303]).

지금까지, 보다 긴 아실 사슬을 갖는 N-아세틸-메티오닌, N-프로피오닐-메티오닌 또는 그 밖의 메티오닌 유도체의 생합성에 의한 생산을 촉매할 수 있는 효소는 알려져 있지 않았다. 따라서, 메티오닌 생산 미생물에서 주요 메티오닌-N-아실 트랜스퍼라제 활성 및 그의 감쇠를 확인하는 것은 NAM 생산을 감소시키는데 중요하다.

NAM 축적은 또한 축적된 NAM을 탈아세틸화하여 메티오닌을 수득하는 것에 의해 감소시킬 수 있다. 아미노산으로부터 N-아실기의 탈아세틸화는 박테리아에서 보여진 바 있다. 예를 들어, N-아세틸오르니틴 데아세틸라제를 코딩하는 ArgE는 넓은 기질 범위를 가지고, N-아세틸메티오닌을 효과적으로 탈아세틸화한다 (문헌 [Javid-Majd & Blanchard 2000 Biochemistry 39, 1285-93]). 따라서, argE 또는 그 밖의 아미노산 데아세틸라제, 예컨대 래트 신장 아실라제 I (문헌 [Giardina et al., 2000 Eur. J. Biochem. 267, 6249-55]), 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) 또는 돼지 신장으로부터의 아미노산 아실라제 (문헌 [Gentzen et al., 1980 Z. Naturforsch 35 c, 544-50])의 과다발현은 NAM의 축적을 감소시킬 수 있다.

NAM이 세포외 공간으로 배출되기 때문에, NAM 아실라제를 주변세포질 또는 세포외 공간으로 배출시키는 것이 유익할 수 있다. 주변세포질로 배출시키는 몇몇 배출 시스템이 이. 콜라이에서 공지되어 있으며, 예를 들어 시스템 TAT 및 Sec가 있다 (문헌 [Manting & Driessen 2000 Mol Microbiol 37, 226-38], [Choi & Lee 2004 Appl. Microbiol. Biotechnol. 64, 625-635]을 검토하기 바람). TAT 또는 Sec 경로를 통한 배출을 위해 특정한 신호 펩티드의 존재가 요구된다. 세포외 공간으로의 배출이 선호되는 경우, 관심 단백질을 정상적으로 배지, 예컨대 OmpF 또는 용혈소로 배출되게 하는 담체 단백질에 융합시킬 수 있다 (문헌 [Choi & Lee 2004 Appl. Microbiol. Biotechnol. 64, 625-635]). 또한, 단백질을 자동수송 단백질의 배출에 필요한 단백질 도메인, 예컨대 N. 고노레아에(N. gonorrhoeae)의 IgA1 또는 이. 콜라이의 AIDA-I에 융합시켜 배지로 배출시키거나 세포 표면 상에 디스플레이할 수 있다. 또한, 단백질을 2-파트너 경로 또는 파지 디스플레이를 통해 배출시킬 수 있다 (문헌 [Jacob-Dubuisson et al., 2004 Biochim et Biophys Act 1694 235-257], [Jose & Meyer 2007 Microbiol and Molecul Biol Rev 71, 600-19]). 또한, 공정 설계가 특정 단백질의 배출에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Shokri et al., 2003 Appl Microbiol Biotechnol 60, 654-64]).

본 발명의 간단한 설명

본 출원인들은 메티오닌 생산 균주에서 부산물인 N-아실-메티오닌 (NAM)의 축적을 감소시키는 문제를 해결하였다.

본 발명자들은 메티오닌의 NAM으로의 전환을 촉매하는, 이. 콜라이에서 유전자 yncA에 의해 코딩되는 주요 메티오닌 N-아실트랜스퍼라제 활성 (MNAT)을 확인하였다.

유전자 yncA의 발현이 감쇠되어 NAM의 생산이 감소된 변형된 미생물을 본원에서 개시한다.

본 발명자들은 또한 NAM을 메티오닌으로 전환시키는 탈아실화 효소, 예컨대 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae) 아미노산 아실라제 또는 돼지 신장 아미노산 아실라제의 과다발현이 NAM의 양을 감소시킨다는 것을 밝혀내었다. 바람직하게는, 상기 탈아실화 효소를 주변세포질 또는 세포외 공간으로 배출시킨다.

또 다른 측면에서, 배양 조건을 NAM의 생산 및/또는 축적이 감소되도록 조정하였다.

NAM의 축적을 감소시키기 위한 이들 세 가지 수단을 개별적으로 또는 조합하여 적용하여 NAM의 축적을 감소시켰다.

글루코스를 모델 기질로 사용하고, 재조합 이. 콜라이를 모델 유기체로 사용하였지만, 본 발명이 이러한 특성으로 제한되는 것은 아니다.

따라서, 본 발명의 목적은 주요 MNAT (메티오닌 N-아실-트랜스퍼라제) 코딩 유전자의 발현이 감쇠되고/되거나, 바람직하게는 상응하는 유전자가 제거되고/되거나, 동종 또는 이종 NAM 탈아실화 효소가 과다발현되어 NAM의 축적이 감소된 미생물을 제공하는 것이다.

NAM 생산 및/또는 축적이 감소된 미생물은 개선된 메티오닌 생산/탄소원 수율을 나타낸다.

본 발명의 상세한 설명

본 발명은

- 탄소 공급원, 황 공급원 및 질소 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지에서 변형된 미생물을 배양하는 단계, 및

- 상기 배양 배지로부터 메티오닌 및/또는 그의 유도체를 회수하는 단계

를 포함하는, 발효 공정에서 메티오닌, 그의 유도체, 또는 전구체를 생산하는 방법에 관한 것으로, 비-변형된 미생물 또는 방법에 비해 상기 미생물 또는 방법은 부산물인 N-아실 메티오닌의 축적이 감소되도록 변형되었다.

본 발명의 특정 측면에서, 축적이 감소되는 N-아실 메티오닌은 N-아세틸-메티오닌, N-프로피오닐-메티오닌, N-부티릴-메티오닌 및 이들의 조합의 군 중에서 선택된다.

부산물인 N-아실 메티오닌의 축적은 하기 변형 중 적어도 하나에 의해 수득될 수 있다:

- 미생물에서 적어도 하나의 메티오닌 N-아실 트랜스퍼라제 (즉, 트랜스아실라제)의 발현을 감쇠시키는 것, 및/또는

- 미생물에서 적어도 하나의 메티오닌 특정 아미노 아실라제를 발현시키는 것 (또는 발현을 증진시키는 것); 및/또는

- pH, 산소투여, 온도, 및/또는 배양 배지로의 NAM 아실라제의 첨가와 같은 배양 조건을 변화시키는 것,

및 이들의 조합.

본 발명에 따르면 용어 '배양', '발효' 또는 '발효 공정'는 단순한 탄소 공급원을 함유하는 적절한 성장 배지에서 박테리아를 성장시키는 것을 나타내기 위하여 교환가능하게 사용된다.

"적절한 배양 배지"는 미생물의 배양 및 성장에 적절한 배지이다. 그러한 배지는 배양되는 미생물에 따라 미생물 발효 업계에 널리 알려져 있다.

어구 "배양 배지로부터 메티오닌 및/또는 그의 유도체를 회수하는" 것은 메티오닌, 및 가능하게는 SAM 및 NAM 및 유용할 수 있는 다른 모든 유도체들을 회수하는 행위를 말한다.

용어 "미생물"은 박테리아, 효모 또는 진균류를 말한다. 바람직하게는, 미생물은 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 바실라세아에(Bacillaceae), 스트렙토미세타세아에(Streptomycetaceae) 및 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae) 중에서 선택된다. 보다 바람직하게는, 미생물은 에스케리키아(Escherichia), 클레브시엘라(Klebsiella), 판토에아(Pantoea), 살모넬라(Salmonella) 또는 코리네박테륨(Corynebacterium) 종이다. 보다 더 바람직하게는 이러한 미생물은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 코리네박테륨 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 종이다.

용어 "변형된 미생물"은 발효 브로쓰에서 NAM의 축적을 감소시키기 위한 목적으로 유전적으로 변형된 미생물을 나타낸다. 당업자는 특정한 유전자의 발현을 조절하는 법을 알고 있다. 통상적인 변형은 유전자 제거, 유전자 대체, 프로모터의 변형, 및 이종 유전자의 발현을 위한 벡터의 도입을 비롯한 유전적 요소에 의한 미생물의 형질전환을 포함한다.

본 발명자들은 NAM이 메티오닌의 아실화에 의해 형성된다는 것을 밝혀내었고, 주요 NAM 생산 효소로서 유전자 yncA를 확인하였다. 이. 콜라이 유전자 b1448로서도 알려져 있는 yncA는 특허 출원 WO2001070776에 언급되어 있다. 이는 다중약물 내성에 관련된 조절제 Mar에 의해 유도되는 유전자 군의 일부이다.

데아세틸라제라고도 불리는 아미노산 아실라제 효소 (EC 3.5.1.14)는 아실 아미노산의 가수분해성 절단을 촉매하여 유리 아미노산 및 아실 나머지에 해당하는 탄산을 생성한다. 보다 구체적으로, N-아실 메티오닌 아실라제는 NAM의 메티오닌 및 상응하는 카르복시산으로의 반응을 촉매한다.

용어 "N-아실 메티오닌"은 N-포르밀-메티오닌, N-아세틸-메티오닌, N-프로피오닐-메티오닌, N-부티릴 메티오닌 및 일반적으로, 히드록실 관능이 결여된 임의의 카르복실산으로부터 유래된 관능기를 포함하는 임의의 메티오닌 유도체를 말한다.

N-아세틸-메티오닌의 축적을 측정하기 위해, 표준물질로서 N-아세틸-메티오닌을 사용하는 굴절 HPLC (시그마(Sigma), Ref 01310)를 사용하여 발효 브로쓰에서 N-아세틸-메티오닌의 양을 판단한다. N-프로피오닐-메티오닌은 표준물질로서 N-아세틸-메티오닌을 사용하는 GC-MS에 의해 발효 브로쓰에서 판단한다.

NAM의 축적은 비-변형된 유기체를 이용한 공정 또는 비-변형된 공정에서 축적된 양보다 적어도 20％, 바람직하게는 50％, 보다 바람직하게는 80％ 및 보다 더 바람직하게는 95％ 만큼 감소될 것이다.

본 발명에 따른 용어 '탄소 공급원'은 미생물의 정상적인 성장을 지원하기 위해 당업자가 사용할 수 있는 임의의 탄소 공급원을 말하며, 헥소스 (예컨대 글루코스, 갈락토스 또는 락토스), 펜토스, 모노사카라이드, 디사카라이드 (예컨대 수크로스, 셀로비오스 또는 말토스), 올리고사카라이드, 당밀, 전분 또는 그의 유도체, 헤미셀룰로스, 글리세롤 및 이들의 조합일 수 있다. 특히 바람직한 탄소 공급원은 글루코스이다. 또 다른 바람직한 탄소 공급원은 수크로스이다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 탄소 공급원은 재생가능한 공급-원료(feed-stock)로부터 유래된다. 재생가능한 공급-원료는 잠깐 지체되는 동안 목적하는 생성물로 변형되는데 충분한 양으로 재생될 수 있는 특정의 산업 공정상 요구되는 원재료로 정의된다.

용어 질소 공급원은 암모늄 염 또는 암모니아 기체에 해당된다. 질소 공급원은 암모늄 또는 암모니아 형태로 공급된다.

L-메티오닌, 그의 전구체 또는 그의 유도된 화합물을 발효 생산하는데 사용되는 황 공급원은 술페이트, 티오술페이트, 황화수소, 디티오네이트, 디티오나이트, 술파이트, 메틸메르캅탄, 디메틸디술피드 또는 이들의 조합 중 임의의 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 황 공급원은 술페이트 및/또는 티오술페이트이다.

발효는 일반적으로 사용되는 미생물에 맞춰진, 적어도 하나의 단순한 탄소 공급원, 및 필요에 따라 대사물의 생산을 위한 공동-기질을 함유하는 적절한 배양 배지와 함께 발효기 내에서 행해진다.

당업자는 본 발명에 따른 미생물에 대한 배양 조건을 규정할 수 있다. 특히, 박테리아는 20℃ 내지 55℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 발효시키고, 보다 구체적으로 C. 글루타미쿰에 대해서는 약 30℃의 온도에서, 이. 콜라이에 대해서는 약 37℃의 온도에서 발효시킨다.

이. 콜라이에 대해 공지된 배양 배지의 예로서, 배양 배지는 M9 배지 (문헌 [Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128]), M63 배지 (문헌 [Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]) 또는 문헌 [Schaefer et al., 1999, Anal. Biochem. 270: 88-96]에서 정의된 배지와 동일 또는 유사한 조성일 수 있다.

C. 글루타미쿰에 대해 공지된 배양 배지의 예로서, 배양 배지는 BMCG 배지 (문헌 [Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210]) 또는 문헌 [Riedel et al., 2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583]에 기재된 배지와 동일 또는 유사한 조성일 수 있다.

본 발명의 특정 실시양태에서, N-아실-메티오닌의 생산은 적어도 하나의 메티오닌 트랜스아실라제를 감쇠시키는 것에 의해 감소된다. 메티오닌 트랜스아실라제는 또한 메티오닌 N-아실트랜스퍼라제 (MNAT)로도 불린다. argA는 추정 메티오닌 트랜스아세틸라제 활성을 갖는 효소를 코딩한다. 본 발명자들은 argA가 결실된 이. 콜라이 균주에서 MNAT 활성을 정제하고, 정제된 단백질을 서열분석하고, 정제된 단백질인 YncA가 MNAT 활성을 가짐을 밝혀내었다 (특허 출원 PCT/EP2008/060999). 유전자 yncA의 발현의 감쇠는 잔여 MNAT 활성을 대량으로 제거하여, NAM, 특히 화합물 N-아세틸-메티오닌 및 N-프로피오닐-메티오닌의 생산을 극적으로 감소시켰다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, YncA를 이. 콜라이 게놈으로부터 전부 결실시킨다.

감쇠된 경우에 NAM 생산을 감소시키는, 보다 낮은 활성을 갖는 그 밖의 N-아실트랜스퍼라제가 확인되었고; 이들 효소는 다음과 같은 유전자로 코딩된다: yjdJ, yfaP, yedL, yjhQ. 기재된 임의의 메티오닌 N-아실 트랜스퍼라제를 개별적으로 또는 다른 것과 조합하여 감쇠시킬 수 있다.

본 발명에 따른 용어 "유전자를 감쇠" 또는 '유전자의 발현의 감쇠'는 유전자의 발현을 부분적으로 또는 완전히 억제하여 '감쇠되게' 하는 것을 나타낸다. 이러한 발현의 억제는 유전자 발현의 저지, 유전자 발현에 필요한 프로모터 영역의 전부 또는 일부에의 삽입 또는 그의 결실, 유전자 코딩 영역의 결실 또는 그에의 삽입, 또는 야생형 프로모터의 보다 약한 자연 또는 합성 프로모터로의 교환일 수 있다. 바람직하게는, 유전자의 감쇠는 본질적으로 해당 유전자의 완전한 결실이며, 이는 본 발명에 따른 균주의 확인, 단리 및 정제를 용이하게 하는 선택 마커 유전자로 대체될 수 있다. 유전자는 바람직하게는 상동 재조합 기술에 의해 불활성화된다 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000) "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645]).

본 발명의 또 다른 특정 실시양태에서, N-아실-메티오닌의 축적은 미생물의 천연 또는 이종 메티오닌 특정 아미노 아실라제 효소, 예컨대:

ㆍ 아스페르길루스 N-아실아미노산 아실라제

ㆍ 돼지 N-아실아미노산 아실라제

ㆍ N-아세틸메티오닌에 대해서도 작용하는 아세틸오르니틴 데아세틸라제를 코딩하는 이. 콜라이 argE

를 발현시키는 것에 의해 감소될 수 있다.

메티오닌 특정 아미노 아실라제의 증가된 발현은 NAM의 메티오닌으로의 전환 비율을 증가시킨다 (상응하는 카르복시산, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트 또는 부티레이트 중 하나의 분자의 생산이 수반됨). 또한, 유전자 acs, pta-ackA 또는 글리옥실레이트 션트(glyoxylate shunt)를 코딩하는 유전자를 과다발현시켜 아세테이트가 소모되도록 하는 것도 본 발명의 일부를 이룬다.

이와 관련하여 용어 "증진된" 또는 "과다발현된"은, 예를 들어 보다 강력한 프로모터를 사용하거나 증가된 활성을 갖는 대립 유전자를 사용하고, 가능하다면 이들 수단을 조합하여 유전자의 카피 수를 증가시키는 것에 의해, 상응하는 DNA에 의해 코딩된 효소 활성의 세포내 활성을 증가시키는 것을 기재한다.

용어 "증가된 발현" "증진된 발현" 또는 "과다발현"은 본 명세서에서 교환가능하게 사용되고, 유사한 의미를 갖는다.

유전자의 발현을 증가시키기 위하여 염색체적으로 또는 염색체외적으로 코딩될 수 있다. 염색체적으로 당 분야내 전문가에게 공지된 재조합 방법으로 도입될 수 있는 게놈에 대한 카피는 하나 또는 수 개가 있을 수 있다. 염색체외적으로 유전자는 복제 개시점이 상이하고 이에 따라 세포내 카피 수가 상이한 다양한 유형의 플라스미드에 의해 운반될 수 있다. 그들은 치밀한 복제를 갖는 저 카피수 플라스미드 (pSC101, RK2), 저 카피수 플라스미드 (pACYC, pRSF1010) 또는 고 카피수 플라스미드 (pSK 블루스크립트 II)에 상응하여 1 내지 5 카피, 약 20 또는 500 이하의 카피로 존재할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 유전자는 유도가능할 수 있는, 다양한 강도를 갖는 프로모터를 사용하여 발현될 수 있다. 이러한 프로모터는 동종성 또는 이종성일 수 있다. 당업자는 어느 프로모터가 가장 편리한지 알고 있으며, 예를 들어 프로모터 Ptrc, Ptac, Plac 또는 람다 프로모터 cI가 널리 사용된다.

효소의 발현은 상응하는 메신저 RNA (문헌 [Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64]) 또는 단백질 (예를 들어, GST 태그(GST tag), 아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences))을 안정화 또는 불안정화하는 요소에 의해 상승되거나 감소될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따라 증진되는 유전자의 하나 또는 수개의 대립유전자를 함유하는 미생물에 관한 것이다.

미생물을 형질전환시키는 모든 기술, 및 본 발명의 단백질의 생산을 증진시키는데 사용되는 조절 요소는 당업계에 널리 알려져 있으며, 다양한 미생물에서의 생합성 경로의 변형에 대한 본 출원인의 특허 출원, 예컨대 WO2008/052973, WO2008/052595, WO2008/040387, WO2007/144346, WO2007/141316, WO2007/077041, WO2007/017710, WO2006/082254, WO2006/082252, WO2005/111202, WO2005/073364, WO2005/047498, WO2004/076659를 비롯한 문헌에서 이용가능하며, 이들은 그 내용이 본원에 참고로 포함된다.

N-아실-메티오닌 아실라제 효소는 세포내 공간에서 발현될 것이고, 세포내 공간에 남아있거나 또는 주변세포질로 배출되거나 세포외 공간으로 배출될 수 있다. 당 분야내 전문가는 주변세포질에 단백질을 표적화하는 수단을 확인할 수 있을 것이다. 배출은 또한 파지 디스플레이에 의해 또는 단백질 배출 시스템, 예컨대 2-파트너 경로 또는 자동수송을 이용하는 것에 의해 N-아세틸-메티오닌 아실라제를 OmpF와 같은 단백질에 융합시키는 것을 기초로 할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, NAM 아실라제 효소는 주변세포질 또는 세포외 구획으로 배출되어 NAM과 메티오닌 사이에 불필요한 순환이 방지된다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명자들은 발효 공정의 파라미터, 즉 배양 조건을 조정하여 NAM의 생산을 감소시킨다. 이는 발효 브로쓰의 pH를 변화시키거나, 산소투여 또는 기질 공급 파라미터를 변형하는 것에 의해 달성된다. 또 다른 옵션은 NAM 특정 아실라제를 배양 배지에 첨가하는 것이다.

한 실시양태에서, 발효 파라미터의 변화에는 미생물에게 무기 기질, 예컨대 포스페이트, 칼륨, 마그네슘을 결핍시키는 것은 포함되지 않는다.

NAM 축적을 조정하기 위한 이들 3가지 수단은 단독으로, 또는 1 또는 2개의 다른 수단과 조합되어 사용될 수 있다.

따라서, MNAT 활성의 감쇠는 하기 유전자의 발현을 감쇠시키는 것에 의해 수득되며: yncA 및/또는 argA 및/또는, yjdJ, yfaP, yedL, yjhQ, 이들 유전자는 메티오닌-N-아실트랜스퍼라제 활성을 갖는 효소를 코딩한다. 이러한 감쇠는 N-아실-메티오닌 데아실라제 효소, 예컨대 아스페르길루스 N-아미노산 아실라제, 돼지 N-아미노산 아실라제 또는 argE 유전자에 의해 코딩된 아세틸오르니틴 데아세틸라제의 증가된 발현과 조합될 수 있다.

유사하게, 상기에서 기재한 바와 같은 적어도 하나의 MNAT 효소의 감쇠는 공정 파라미터, 예컨대 pH, 산소투여, 온도를 조절하는 것 및/또는 NAM의 축적을 함께 감소시키는 NAM 아실라제를 발효 브로쓰에 첨가하는 것과 조합될 수 있다.

유사하게, NAM 아실라제 효소의 발현은 공정의 조절과 조합될 수 있다. 양 수단의 상세한 사항은 상기에서 기술하였다.

마지막으로, 모든 세가지 수단: MNAT 활성의 감쇠, NAM 아실라제 효소의 발현 증가 및 공정 조건의 조절을 조합할 수 있다.

본 발명의 명세서에서, 유전자 및 단백질은 이. 콜라이 내의 상응하는 유전자의 명칭을 사용하여 식별한다. 그러나, 달리 명시하지 않는 한, 이러한 명칭의 사용은 본 발명에 따라 더욱 일반적인 의미를 갖고, 다른 유기체, 보다 특히 미생물 내의 모든 상응하는 유전자 및 단백질을 포괄한다.

PFAM (얼라인먼트 및 히든 마르코프(hidden Markov) 모델의 단백질 패밀리 데이터베이스; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)은 대규모 단백질 서열 얼라인먼트를 나타낸다. 각각의 PFAM은 다중 얼라인먼트의 가시화, 단백질 도메인의 확인, 유기체간 분포의 평가, 다른 데이터베이스에의 접근 및 공지된 단백질 구조의 가시화를 가능하게 한다.

COG (단백질의 동등(orthologous) 군의 클러스터; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)는 주요 계통발생학적 세포주를 나타내는 완전히 서열화된 게놈으로부터 단백질 서열을 비교하여 수득하였다. 각각의 COG는 적어도 3개의 세포주로부터 규정되며, 이전에 보존된 도메인의 식별을 가능하게 한다.

상동 서열 및 그의 상동성 백분율을 식별하는 수단은 당업자에게 널리 알려져 있고, 특히 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 및 상기 웹사이트에 표시된 디폴트 파라미터로부터 사용할 수 있는 BLAST 프로그램을 포함한다. 수득된 서열을 이어서, 예를 들어 프로그램 CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) 또는 MULTALIN (http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html) 및 이들 웹사이트에 표시된 디폴트 파라미터를 사용하여 활용 (예를 들어, 정렬)할 수 있다.

당업자들은 진뱅크(GenBank)에서 제공하는 공지의 유전자를 참고하여, 다른 유기체, 박테리아 균주, 효모, 진균, 포유동물, 식물 등에서의 동등한 유전자를 결정할 수 있다. 이러한 일상적인 작업은 다른 미생물로부터 유래된 유전자와 함께 서열을 정렬하고, 다른 유기체의 상응하는 유전자를 클로닝하기 위한 퇴보 프로브를 설계하여 판단할 수 있는 컨센서스 서열을 이용하여 유익하게 행해진다. 이러한 분자 생물학적 일상적인 방법은 당업자에게 널리 알려져 있고, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2^nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.]에서 주장되었다.

본 발명은 또한, 상기 기술한 바와 같은 미생물에 관한 것이다. N-아실 메티오닌의 축적 및/또는 생산이 감소된 미생물은 메티오닌을 높은 수율로 생산하는데 특히 유용하다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 미생물은 본 발명에 따른 공정에서 사용하기 이전에, 이미 메티오닌의 고등-생산자이다.

메티오닌의 효율적인 생산을 위해서는 메티오닌 특정 경로 및 몇몇 전구체-제공 경로를 최적화하는 것이 요구된다. 메티오닌 생산 균주는 특허 출원 WO 2005/111202, WO2007/077041 및 PCT/EP2007/060433에 기술되어 있고, 이들은 본 출원에 참고로 포함된다.

억제자 SAM 및 메티오닌에 대한 피드백 감도가 감소된 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제 대립유전자를 과다발현하는 메티오닌 생산 균주가 특허 출원 WO 2005/111202에 기재되어 있다. 본 출원은 또한, 특허 출원 JP 2000/157267에서 제시된 바와 같은 메티오닌 레귤론을 하향-조절하는 메티오닌 억제자 MetJ (진뱅크 1790373)의 결실과 상기 대립 유전자의 조합을 기술한다. 또한, 아스파르토키나제/호모세린 데히드로게나제가 과다발현되는 2개의 변형의 조합이 특허 출원 WO 2005/111202에 기재되어 있다.

유전자 cysE, metH 및 metF의 과다발현은 WO 2007/077041에서 제안되었다.

메티오닌의 생산은 추가로, 바람직하게는 또는 오직 H₂S 만을 이용하는 변경된 metB 대립 유전자를 사용하는 것에 의해 증가될 수 있고, 따라서 특허 출원 WO 2004/076659 (이는 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이 O-숙시닐-호모세린으로부터 호모시스테인이 생성될 수 있다.

메티오닌 생산에 있어서의 추가적 증가는 특허 출원 PCT/EP2007/060433에 기재되어 있는 바와 같이 유전자 pykA, pykF 및/또는 purU를 결실시키는 것에 의해 수득할 수 있다. 상기 출원은 또한 오페론 cysPUWAM, cysJIH 및 gcvTHP 및 유전자 serA, serB, serC, lpd 및 glyA를 과다발현하는 메티오닌-생산 균주를 기재하고 있다.

이. 콜라이에서, 메티오닌의 생산을 증가시키기 위해 다른 효소의 활성을 증가시킬 수 있다 (등록 번호 및 상응하는 폴리펩티드의 기능을 하기에 기술함):

황 동화에 관련된 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다:

하기를 발현시키는 것에 의해 보전 반응을 상승시킬 수 있다:

하기를 과다발현시키는 것에 의해 아세테이트 소모 반응을 상승시킬 수 있다:

추가로, 메티오닌 분해 경로의 유전자 (하기 목록 참조) 또는 메티오닌 생산 경로로부터 이탈하게 하는 유전자의 발현을 감쇠시킬 수 있거나 그러한 유전자를 결실시킬 수 있다.

이와 관련하여 감쇠는, 예컨대 그의 발현을 감소시키고/거나, 효소의 안정성을 감소시키고/거나, 그의 분해를 증가시키고/거나 그 밖에 당 분야의 전문가에게 공지된 해법에 의해 효소의 세포내 활성을 감소시키는 것을 기재한다.

본 발명은 또한, 상기의 메티오닌 생산 미생물을 발효시키고, 메티오닌, 그의 전구체 또는 유도체를 농축시키고, 발효 브로쓰로부터 목적하는 생성물(들)을 단리하는 것을 포함하는, L-메티오닌, 그의 전구체 또는 그의 유래된 화합물을 생산하기 위한 공정에 관한 것이다.

발효는 일반적으로 사용되는 박테리아에 적합한, 적어도 하나의 단순한 탄소 공급원, 및 필요에 따라 대사물의 생산에 필요한 공동-기질을 함유하는 공지의 규정된 조성의 무기 배양 배지와 함께 발효기 내에서 행해진다.

특히, 이. 콜라이에 대한 무기 배양 배지는 M9 배지 (문헌 [Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128]), M63 배지 (문헌 [Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]) 또는 문헌 [Schaefer et al., 1999, Anal. Biochem. 270: 88-96]에서 정의된 배지와 동일 또는 유사한 조성일 수 있다.

유사하게, C. 글루타미쿰에 대한 무기 배양 배지는 BMCG 배지 (문헌 [Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210]) 또는 문헌 [Riedel et al., 2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583]에 기재된 배지와 동일 또는 유사한 조성일 수 있다. 상기 배지는 돌연변이에 의해 도입되는 영양요구성(auxotrophy)을 보완하기 위하여 보충될 수 있다.

발효 후, L-메티오닌, 그의 전구체 또는 그의 유도된 화합물은 회수되고 필요에 따라 정제된다. 배양 배지에서 메티오닌과 같은 생성된 화합물을 회수 및 정제하는 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다.

임의로, 바이오매스의 0 내지 100％, 바람직하게는 적어도 90％, 보다 바람직하게는 95％, 보다 더 바람직하게는 적어도 99％가 발효 생성물의 정제 동안 제거될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 메티오닌 생산 방법은, 임의로는 최종 생성물 내에 일부 또는 총량 (0 내지 100％)으로 존재하는 발효 브로쓰 및/또는 바이오매스의 목적하는 아미노산/구성성분을 단리하는 단계를 포함한다.

NAM의 양을 감소시키는 수단은 포스페이트 및/또는 칼륨을 제한 또는 고갈시키는 것과 조합될 수 있다. 당 분야의 전문가는 선택한 유기체의 성장에 필요한 포스페이트 또는 칼륨의 양을 판단할 수 있을 것이다.

"유기체가 무기 기질의 제한을 받게한다는 것"은 여전히 약한 성장은 가능하게 하는 공급된 무기 화학물질의 양으로 미생물의 성장이 지배되는 조건을 정의한다. 이러한 기질들의 예로는 포스페이트, 칼륨, 마그네슘 또는 이들의 조합이 있다.

미생물에 무기 기질을 고갈시킨다는 것은 무기 기질의 부재로 인하여 미생물의 성장이 완전하게 멈추는 조건을 정의한다. 이러한 기질들의 예로는 포스페이트, 칼륨, 마그네슘 또는 이들의 조합이 있다.

본 발명은 또한, NAM의 축적이 감소된, 즉 비-변형된 미생물에 비해 NAM이 보다 적은 양으로 축적되는, 메티오닌 발효 조건이 최적화된 상기 기술한 바와 같은 미생물, 및 상기한 유전적 변형을 포함하는 미생물에 관한 것이다.

실시예:

실시예 1

균주 MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔpykA ΔpykF Ptrc09-gcvTHP ΔpurU ΔyncA::Km (pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11) (pCC1BAC-serB-serA-serC)의 구축

메티오닌 생산 균주에서 추정 아실트랜스퍼라제 yncA 유전자를 결실시키기 위해, 본 발명자들은 케이오(Keio) 돌연변이 집합 (문헌 [Baba et al., 2006])의 에스케리키아 콜라이 BW25113 ΔyncA::Km 균주를 사용하였다. ΔyncA::Km 결실체를 P1 파지 형질도입에 의해 (이하 참조) BW25113 ΔyncA::Km 균주로부터 균주 MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ΔpykA ΔpykF ΔpurU (PCT/EP2007/060433에 기술됨)로 옮겼다. 카나마이신 내성 형질전환체를 선별하고, 아래에서 규정하는 올리고뉴클레오티드 YncAF 및 YncAR (웹사이트 http://ecogene.org/의 참고 서열)을 이용한 PCR 분석에 의해 내성 카세트의 삽입을 확인하였다. 보유 균주를 MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ΔpykA ΔpykF ΔpurU ΔyncA::Km으로 명명하였다.

이어서, 플라스미드 pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 및 pCC1BAC-serB-serA-serC를 균주 MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ΔpykA ΔpykF ΔpurU ΔyncA::Km에 도입하여, MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ΔpykA ΔpykF ΔpurU ΔyncA::Km (pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11) (pCC1BAC-serB-serA-serC)를 생성하였다.

파지 용해물 P1의 제조:

- 카나마이신 (50 ㎍/mL), 글루코스 (0.2％) 및 CaCl₂ (5 mM)가 보충된 10 mL LB를 균주 BW25113 ΔyncA::Km의 밤샘 배양물 100 ㎕로 접종하고, 진탕하면서 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션

- 제조된 파지 용해물 P1 100 ㎕를 균주 BW25113 ΔyncA::Km에 첨가 (약 1.10⁹ 파지/mL)

- 모든 세포가 용해될 때까지 37℃에서 3시간 동안 진탕

- 클로로포름 200 ㎕ 첨가 및 볼텍싱

- 10 분 동안 4500 g에서 원심분리하여 세포 잔해물 제거

- 상청액을 멸균 튜브로 옮기고 클로로포름 200 ㎕ 첨가

- 4℃에서 용해물을 저장

형질도입:

- LB 배지 내의 균주 MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ΔpykA ΔpykF ΔpurU의 밤샘 배양물 5 mL를 1500 g에서 10 분 동안 원심분리

- 2.5 mL의 10 mM MgSO₄, 5 mM CaCl₂에 세포 펠릿을 현탁

- 대조군 튜브: 세포 100 ㎕

균주 BW25113 ΔyncA::Km의 파지 P1 100 ㎕

- 시험 튜브: 세포 100 ㎕ + 균주 BW25113 ΔyncA::Km의 파지 P1 100 ㎕

- 진탕하지 않고 30℃에서 30 분 동안 인큐베이션

- 각 튜브에 1 M 시트르산나트륨 100 ㎕를 첨가하고 볼텍싱

- 1 mL LB 첨가

- 진탕하면서 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션

- 튜브를 7000 rpm에서 3 분 동안 원심분리한 후 카나마이신 (50 ㎍/mL)이 보충된 LB 페트리 디쉬에 확산배양

- 37℃에서 밤새 인큐베이션

균주의 확인:

카나마이신 내성 형질전환체를 선별하고, 상기에서 규정한 올리고뉴클레오티드 YncAF 및 YncAR를 이용한 PCR 분석에 의해 ΔyncA::Km 변형의 존재를 확인하였다.

균주 MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔpykA ΔpykF Ptrc09-gcvTHP ΔpurU ΔyncA::Km ΔargA::Cm의 구축

아미노산 아세틸트랜스페라제 argA 유전자를 불활성화시키기 위해, 문헌 [Datsenko & Wanner (2000)]에 기술된 상동 재조합 전략을 사용하였다. 이 전략은 대부분의 관련 유전자를 결실시키는 한편 클로람페니콜 내성 카세트의 삽입을 가능하게 한다. 이 목적을 위해, 2 개의 올리고뉴클레오티드 DargAF 및 DargAR을 사용하였다 (웹사이트 http://ecogene.org/에서 서열 참고):

DargAF

- 2947264 내지 2947344의 argA 영역에 상동성인 영역 (소문자),

- 클로람페니콜 내성 카세트의 증폭을 위한 영역 (대문자) (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645]에서 서열 참고)을 함유함.

DargAR

- 2948592 내지 2948511의 argA 영역에 상동성인 영역 (소문자),

올리고뉴클레오티드 DargAF 및 DargAR은 플라스미드 pKD3으로부터 클로람페니콜 내성 카세트를 증폭시키기 위해 사용하였다. 수득된 PCR 산물을 전기천공에 의해 균주 MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ΔpykA ΔpykF ΔpurU ΔyncA::Km (pKD46)에 도입하였고, 상기 균주에서 발현되는 Red 리콤비나제 효소는 상동 재조합을 가능하게 하였다. 클로람페니콜 내성 형질전환체를 선별하고, 아래에서 규정하는 올리고뉴클레오티드 ArgAF 및 ArgAR (웹사이트 http://ecogene.org/에서 서열 참고)을 이용한 PCR 분석에 의해 내성 카세트의 삽입을 확인하였다. 보유 균주를 MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ΔpykA ΔpykF ΔpurU ΔyncA::Km ΔargA::Cm으로 명명하였다.

균주 MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔpykA ΔpykF Ptrc09-gcvTHP ΔpurU ΔyncA ΔargA의 구축

클로람페니콜 및 카나마이신 내성 카세트를 제거하기 위해, 클로람페니콜 및 카나마이신 내성 카세트의 FRT 부위에 작용하는 리콤비나제 FLP을 운반하는 pCP20 플라스미드를 전기천공에 의해 재조합 균주 MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ΔpykA ΔpykF ΔpurU ΔyncA::Km ΔargA::Cm에 도입하였다. 42℃에서의 일련의 배양 이후에, 상기 올리고뉴클레오티드 YncAF/YncAR 및 ArgAF/ArgAR를 이용한 PCR 분석에 의해 클로람페니콜 및 카나마이신 내성 카세트의 결실을 확인하였다. 보유 균주를 MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔpykA ΔpykF Ptrc09-gcvTHP ΔpurU ΔyncA ΔargA로 명명하였다.

균주 MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔpykA ΔpykF Ptrc09-gcvTHP ΔpurU ΔyncA ΔargA (pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11) (pCC1BAC-serB-serA-serC)의 구축

플라스미드 pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 및 pCC1BAC-serB-serA-serC를 균주 MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ΔpykA ΔpykF ΔpurU ΔyncA ΔargA에 도입하여, MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ΔpykA ΔpykF ΔpurU ΔyncA ΔargA (pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11) (pCC1BAC-serB-serA-serC)을 생성하였다.

아미노산 아실라제 활성을 발현하는 합성 유전자의 구축

NAM을 메티오닌으로 변환시키기 위해, NAM 아실라제 (아미노산 아실라제)를 메티오닌 생산 미생물에서 발현시켰다.

이 목적을 위해, 돼지 및 아스페르길루스 acy1 아미노산 아실라제 유전자의 합성 유전자를 회사 코돈 디바이시스(Codon Devices) (www.codondevices.com/)에 의해 제조하였다. 유전자의 코돈 사용빈도 및 GC 함량을 공급자 매트릭스에 따라 이. 콜라이에 맞췄다. 최적화된 코돈 사용빈도를 갖는 전체 서열을 하기에 나타낸다. 합성 유전자의 발현은 오퍼레이터 서열에 의해 제어되는 Ptrc 프로모터로 이끌어내었다. 유전자의 하류에 전사 종결자를 첨가하였다. 구축물을 pUC19 벡터에서 클로닝하고, 서열분석에 의해 확인한 후, 이것으로 메티오닌 생산 균주를 형질전환시켰다.

아스페르길루스 acy1 아미노아실라제

프로모터 및 오퍼레이터 서열

아스페르길루스 acy1 아미노아실라제 서열 (XP_001827519.1) (서열 8)

전사 종결자 서열: (참고: 문헌 [Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.])

돼지 acy1 아미노아실라제

프로모터 및 오퍼레이터 서열

돼지 acy1 아미노아실라제 서열 (NP_999061.1) (서열 12)

실시예 2

발효 조건하에서의 메티오닌 생산

상당량의 관심 대사물을 생산하는 균주를 포스페이트 고갈 유가 배치 전략을 사용하여 2.5 L 발효기 (피에르 구에린(Pierre Guerin)) 내 생산 조건하에서 시험하였다

30 g/L의 세포 농도에서 성장이 멈추도록, 무기물 배지 B1b에 포스페이트를 28.7 mM 첨가하였다. 유가배치 배지 F1은 포스페이트를 함유하지 않았다.

잠시동안, 글루코스를 2.5 g/L 함유하는 10 mL LB 배지에서 성장시킨 8 시간 배양물을 사용하여 최소 배지 B1a에서의 24 시간 사전배양물에 접종시켰다. 이들 배양물을 50 mL의 최소 배지 (B1a)를 함유하는 500 mL 배플드(baffled) 플라스크에서 로터리 진탕기 (200 RPM) 내에서 37℃에서 성장시켰다.

이어서, 2.5 L 발효기 (피에르 구에린)를 최소 배지 (B1b) 600 mL로 채우고, 0.1 g/L의 바이오매스 농도 (사전배양물 용량은 25 내지 45 mL 범위임)로 접종하였다.

배양 온도를 37℃에서 일정하게 유지시키고, NH₄OH 용액을 자동 첨가하여 (10 시간 동안은 NH₄OH 10％ 및 배양이 끝날 때까지는 24％) pH를 작업 수준 (6.8)으로 유지시켰다. 초기 교반 속도는 배치 단계 동안에는 200 rpm으로 설정하고, 유가 배치 단계 동안에는 1200 rpm까지 증가시켰다. 초기 공기흐름 속도는 배치 단계 동안에는 40 NL/h로 설정하고, 유가 배치 단계의 시작 지점에 100 NL/h로 증가시켰다. 용존 산소 농도는 교반을 증가시키는 것에 의해 20 내지 40％, 바람직하게는 30％ 포화도로 유지시켰다.

세포량이 5 g/L에 근접한 농도에 도달했을 때, 유가 배치를 5 mL/h의 초기 유속으로 개시하였다. 공급 용액(feeding solution)을 21시간 후에 21 mL/h에 도달하는 증가형 유속으로 S자형 프로파일로 주입하였다. 정확한 공급 조건은 하기의 방정식으로 계산하였고:

상기 식에서, Q(t)는 p1 = 1.15, p2 = 18.32, p3 = 0.270, p4 = 5인 600 mL의 배치 용량을 위한 mL/h 단위의 공급 유속이다.

21 시간 유가배치 후 세포 농도가 30 g/L에 달하였고, 포스페이트를 배지로부터 고갈시켜 세포들을 포스페이트 고갈 상태에 진입시켰다. 이 시점에서, 공급 용액의 주입은 4 시간 동안 37 mL/h의 일정한 값으로 증가시켰다. 이어서, 상기 일정한 유속을 10 mL/h로 감소시켰고, 이러한 유속을 유가배치의 종료시까지 (50 시간) 유지시켰다.

메티오닌/글루코스 수율 (Y _met )의 판단

세포외 메티오닌 농도를 OPA/FMOC 유도체화 이후에 HPLC에 의해 측량하였다. N-아세틸-메티오닌 및 잔류 글루코스 농도를 굴절계 검출에 의한 HPLC를 사용하여 분석하였다. N-프로피오닐 메티오닌 농도는 실릴화 이후에 GC-MS에 의해 판단하였고, 이를 N-아세틸-메티오닌 당량으로 표현하였다.

발효조 용량은 초기 용량에 pH를 조절하고 배양물을 공급하기 위하여 첨가된 용액의 양을 더하고 샘플링을 위하여 사용되고 증발로 인해 손실된 용량을 빼서 계산하였다.

유가배치 용량은 공급 원료를 칭량하여 계속적으로 추적하였다. 이어서, 주입된 글루코스의 양을 주입된 중량, 용액의 밀도 및 브릭스 방법에 의해 제어된 글루코스 농도 ([글루코스])에 기초하여 계산하였다. 메티오닌 수율은 하기와 같이 나타내었다:

상기 식에서 메티오닌₀ 및 메티오닌_t는 각각 초기 및 시점 (t)에서의 메티오닌 농도를 나타내고, V₀ 및 V_t는 초기 및 t 순간의 용량을 나타낸다.

Y_{N-아세틸-메티오닌}은 다음과 같이 계산하였고:

, 여기서 N-아세틸-메티오닌_t는 t 순간의 리터 당 mmol 농도를 나타낸다.

Y_{N-프로피오닐 메티오닌}은 다음과 같이 계산하였고:

, 여기서 N-프로피오닐 메티오닌_t는 t 순간의 리터 당 mmol 농도를 나타낸다.

Y_{Met + N-아세틸-메티오닌 + N-프로피오닐-메티오닌} (Y_{Met + NAM})은 다음과 같이 계산하였다:

상기 식에서 메티오닌_t는 t 순간의 리터 당 g 단위의 메티오닌 농도를 나타내고, N-아세틸-메티오닌_t 및 N-프로피오닐-메티오닌_t는 t 순간의 리터 당 mmol 단위의 각 농도를 나타낸다.

소모된 글루코스는 다음과 같이 계산하였다:

주입된 글루코스_t = 공급된 용량_t * [글루코스]

소모된 글루코스_t = [글루코스]₀ * V₀ + 주입된 글루코스 - [글루코스]_잔류 * V_t

여기서 [글루코스]₀, [글루코스], [글루코스]_잔류는 각각 초기 글루코스 농도, 공급된 글루코스 농도 및 잔류 글루코스 농도이다.

실시예 3

발효 배지에 아미노산 아실라제를 첨가하는 것에 의한 배양 조건의 조정

N-아세틸-메티오닌을 메티오닌 및 아세테이트로 변환시키기 위해, 160 U의 N-아미노산 아실라제 (돼지 신장, 시그마)를 균주 1의 발효 과정 이후의 (상기한 바와 같이 행함) 발효 브로쓰 200 ㎕에 첨가하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 메티오닌 및 N-아세틸-메티오닌 농도를 상기한 바와 같이 판단하였다. N-아세틸-메티오닌의 75 내지 95％는 이러한 효소적 처리에 의해 메티오닌으로 변환되었다.

SEQUENCE LISTING <110> METABOLIC EXPLORER FIGGE, RAINER SOUCAILLE, PHILIPPE BESTEL-CORRE, GWENAELLE <120> PRODUCING METHIONINE WITHOUT N-ACYL-METHIONINE <130> D26313 <150> US 12/370,422 <151> 2009-02-12 <150> PCT/EP2008/061005 <151> 2008-08-22 <160> 13 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 1 gtttgccgat ttgccccacc g 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 2 cgcccatcac ggtcgcaagc 20 <210> 3 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 3 gtggtaaagg aacgtaaaac cgagttggtc gagggattcc gccattcggt tccctatatc 60 aatacccacc ggggaaaaac gtgtaggctg gagctgcttc g 101 <210> 4 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 4 ccctaaatcc gccatcaaca ctttggattt acgctggtag ttgtacaact gctttttgct 60 ctcgggcagt aaatcaatat cccatatgaa tatcctcctt ag 102 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 5 cagctgacga tttgattcc 19 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 6 gggttgttta atggcgatat cgg 23 <210> 7 <211> 83 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 7 gagctgttga caattaatca tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa 60 tttcatgaca caggaaacag acc 83 <210> 8 <211> 331 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 8 Met Thr Thr Ser Thr Val Val Ser Leu Leu Ser Ser Leu Met Gln Thr 1 5 10 15 Gln Ser Thr Ser Glu His Glu Gln Glu Leu Ala His Phe Leu Asp Asp 20 25 30 His Leu Thr Asn Leu Gly Tyr Thr Val Glu Arg Leu Pro Ile Ala Glu 35 40 45 Gly Ser Thr Arg Glu Asn Val Tyr Ala Tyr Leu Gly Thr Gln Arg Lys 50 55 60 Thr Arg Val Cys Leu Thr Ser His Leu Asp Thr Val Pro Pro Tyr Ile 65 70 75 80 Pro Leu Arg Ile Glu Gly Ser Thr Ile Tyr Gly Arg Gly Ala Cys Asp 85 90 95 Asp Lys Gly Pro Met Ala Ala Gln Ile Cys Ala Leu Glu Glu Leu Arg 100 105 110 Ala Glu Gly Ala Val Lys Glu Gly Asp Val Gly Leu Leu Phe Val Val 115 120 125 Gly Glu Glu Lys Gly Gly Pro Gly Met Ile Ala Ala Asn His Gln Asp 130 135 140 Leu Ser Phe Glu Gly Val Ile Phe Gly Glu Pro Thr Glu Gly Lys Leu 145 150 155 160 Val Val Gly His Lys Gly His Leu Val Phe Glu Leu Ile Gly Glu Gly 165 170 175 Lys Ala Cys His Ser Gly Tyr Pro Gln His Gly Val Asn Ala Asn Phe 180 185 190 Ala Leu Ile Glu Thr Leu Ser Asp Phe Val Gln Thr Glu Phe Pro Ser 195 200 205 Ser Ser Leu Leu Gly Pro Ser Thr Phe Asn Val Gly Lys Ile Glu Gly 210 215 220 Gly Val Ser Tyr Asn Ile Val Pro Glu Thr Ser Lys Ala Leu Cys Ala 225 230 235 240 Val Arg Val Ala Thr Asp Met Ala Gly Ile Lys Lys Ile Val Ser Asp 245 250 255 Thr Val Ala Arg His Ser Asn Val Arg Leu Glu Phe Lys Phe Glu Tyr 260 265 270 Pro Glu Thr Leu Leu Asp His Asp Val Glu Gly Ser Phe Asn Val Arg 275 280 285 Ser Cys Cys Tyr Met Asn Arg Ser Ile Leu Val Ala His Gly Asp Asn 290 295 300 Glu Gln Ile Glu Ile Asp Glu Leu Met Glu Gly Val Arg Ala Tyr Lys 305 310 315 320 Lys Leu Thr Met His Ala Leu Asn Ser Ala Arg 325 330 <210> 9 <211> 996 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 9 atgaccacgt cgactgtcgt ttctctgctg agttcactga tgcagacaca atccacctcg 60 gaacacgagc aggaactggc gcactttctg gatgaccatc tgacaaacct gggatatact 120 gtcgagcgtc tgccgattgc agaagggtcc actcgcgaga acgtctacgc atatctgggg 180 acccaacgta aaacgcgtgt atgtctgacc tctcacctgg atactgttcc gccgtacatc 240 ccgctgcgta ttgagggcag tacaatctat ggtcgcgggg cttgtgacga taagggcccg 300 atggctgcac agatctgcgc tctggaagag ctgcgtgctg aaggtgcggt caaagaaggc 360 gacgtaggtc tgctgttcgt cgttggggag gaaaaaggcg gtccgggcat gatcgcagcg 420 aaccaccagg atctgtcttt tgaaggggtt atttttgggg aaccgacgga aggcaagctg 480 gtagtaggtc acaaagggca cctggttttt gagctgatcg gtgagggaaa ggcttgtcac 540 tccggctacc cgcaacacgg tgtgaacgcg aatttcgccc tgattgagac actgtcggat 600 tttgtccaga cggagtttcc tagctctagt ctgctggggc cgtcaacatt taacgttggc 660 aagatcgaag gtggcgtatc ctataatatt gtgccggaaa cgtcgaaagc cctgtgtgca 720 gtgcgcgttg cgacggacat ggccggtatc aaaaagattg tgagcgatac cgtagcacgt 780 cactctaacg tccgcctgga gttcaagttt gaatatccag agacactgct ggaccatgat 840 gttgaaggga gttttaatgt gcgttcctgc tgttatatga accgctccat cctggttgcc 900 cacggagaca atgagcaaat tgaaatcgat gaactgatgg agggagtacg cgcctataaa 960 aagctgacaa tgcacgccct gaactcagcc cgctaa 996 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Transcriptional terminator sequence <400> 10 tcacactggc tcaccttcgg gtgggccttt ctgc 34 <210> 11 <211> 83 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 11 gagctgttga caattaatca tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa 60 tttcatgaca caggaaacag aac 83 <210> 12 <211> 407 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 12 Met Ala Ser Lys Gly Arg Glu Gly Glu His Pro Ser Val Thr Leu Phe 1 5 10 15 Arg Gln Tyr Leu Arg Ile Arg Thr Val Gln Pro Glu Pro Asp Tyr Gly 20 25 30 Ala Ala Val Ala Phe Leu Glu Glu Arg Ala Arg Gln Leu Gly Leu Gly 35 40 45 Cys Gln Lys Val Glu Val Val Pro Gly His Val Val Thr Val Leu Thr 50 55 60 Trp Pro Gly Thr Asn Pro Thr Leu Ser Ser Ile Leu Leu Asn Ser His 65 70 75 80 Thr Asp Val Val Pro Val Phe Lys Glu His Trp Ser His Asp Pro Phe 85 90 95 Glu Gly Phe Lys Asp Ala Asp Gly Tyr Ile Tyr Gly Arg Gly Ala Gln 100 105 110 Asp Met Lys Cys Val Ser Ile Gln Tyr Leu Glu Ala Val Arg Arg Leu 115 120 125 Lys Val Glu Gly His His Phe Pro Arg Thr Ile His Met Thr Phe Val 130 135 140 Pro Asp Glu Glu Val Gly Gly His Gln Gly Met Glu Leu Phe Val Lys 145 150 155 160 Arg Pro Glu Phe Gln Ala Leu Arg Ala Gly Phe Ala Leu Asp Glu Gly 165 170 175 Leu Ala Ser Pro Thr Asp Ala Phe Thr Val Phe Tyr Ser Glu Arg Ser 180 185 190 Pro Trp Trp Leu Arg Val Thr Ser Thr Gly Lys Pro Gly His Gly Ser 195 200 205 Arg Phe Ile Glu Asp Thr Ala Ala Glu Lys Leu His Lys Val Ile Asn 210 215 220 Ser Ile Leu Ala Phe Arg Glu Lys Glu Lys Gln Arg Leu Gln Ser Asn 225 230 235 240 Gln Leu Lys Pro Gly Ala Val Thr Ser Val Asn Leu Thr Met Leu Glu 245 250 255 Gly Gly Val Ala Tyr Asn Val Val Pro Ala Thr Met Ser Ala Cys Phe 260 265 270 Asp Phe Arg Val Ala Pro Asp Val Asp Leu Lys Ala Phe Glu Glu Gln 275 280 285 Leu Gln Ser Trp Cys Gln Ala Ala Gly Glu Gly Val Thr Phe Glu Phe 290 295 300 Val Gln Lys Trp Met Glu Thr Gln Val Thr Ser Thr Asp Asp Ser Asp 305 310 315 320 Pro Trp Trp Ala Ala Phe Ser Gly Val Phe Lys Asp Met Lys Leu Ala 325 330 335 Leu Glu Leu Glu Ile Cys Pro Ala Ser Thr Asp Ala Arg Tyr Ile Arg 340 345 350 Ala Ala Gly Val Pro Ala Leu Gly Phe Ser Pro Met Asn His Thr Pro 355 360 365 Val Leu Leu His Asp His Asp Glu Arg Leu His Glu Ala Val Phe Leu 370 375 380 Arg Gly Val Asp Ile Tyr Thr Gln Leu Leu Ser Ala Leu Ala Ser Val 385 390 395 400 Pro Ala Leu Pro Ser Glu Ser 405 <210> 13 <211> 1221 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 13 atggcgagca aaggccgtga aggtgagcat ccgtctgtga ccctgtttcg ccagtatctg 60 cgtattcgca cggttcagcc tgaaccggat tacggagcag ctgtggcttt cctggaggaa 120 cgcgctcgtc agctgggtct gggttgccaa aaggtagaag ttgtcccagg gcacgtcgta 180 actgtactga cttggcctgg aacgaatccg accctgagtt caatcctgct gaactcccat 240 acagatgtag tgccagtgtt caaggaacat tggagtcacg accctttcga agggtttaaa 300 gatgccgatg gctatattta cggtcgtggg gcacaggaca tgaagtgtgt atccattcaa 360 tatctggaag ctgttcgccg tctgaaagtt gaagggcacc actttccacg cactattcac 420 atgactttcg tgcctgacga ggaagtcggg ggtcaccaag gtatggaact gttcgtaaaa 480 cgccctgagt ttcaggcact gcgtgcgggt tttgctctgg acgagggtct ggcgagcccg 540 acagacgcgt ttaccgtgtt ttacagtgaa cgttcgcctt ggtggctgcg cgttacttcc 600 acaggtaagc cggggcacgg ctcgcgtttc atcgaggata cagccgctga aaagctgcac 660 aaagttatta atagcatcct ggcctttcgc gagaaggaaa agcaacgtct gcagagcaac 720 cagctgaaac cgggtgcggt cactagcgtg aatctgacta tgctggaggg gggtgtcgcc 780 tataacgttg tgccggcaac tatgagcgca tgcttcgact ttcgcgtagc tccggatgtt 840 gacctgaaag ccttcgaaga acaactgcag agctggtgtc aagcagcggg agaaggtgta 900 acctttgagt tcgtccagaa atggatggaa acacaggtta cctcgactga tgatagcgat 960 ccttggtggg cagccttttc tggtgtgttc aaagatatga agctggcgct ggaactggaa 1020 atctgcccag cgagtacaga cgctcgttac atccgcgccg caggcgtacc agccctgggt 1080 ttttcaccga tgaatcacac gccggtcctg ctgcatgatc acgatgagcg cctgcatgag 1140 gcagttttcc tgcgcggcgt cgacatttat acccaactgc tgagtgcact ggcttctgtt 1200 cctgcgctgc catcggaatc a 1221

Claims

- 탄소 공급원, 황 공급원 및 질소 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지에서 유전적으로 변형된 미생물을 배양하는 단계, 및
- 상기 배양 배지로부터 메티오닌 또는 그의 유도체 또는 둘 다를 회수하는 단계
를 포함하는 발효 공정에서 메티오닌 또는 그의 전구체를 생산하는 방법으로, 여기서 N-아실 메티오닌의 축적은 하기 변형 중 하나 이상에 의해서, 비-변형된 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 방법에 비해 감소되는 것인 방법:
· 1종 이상의 메티오닌 트랜스아실라제 효소의 발현을 감쇠시키는 것;
· 1종 이상의 메티오닌 특정 아미노 아실라제를 발현시키거나 그의 발현을 증진시키는 것; 및
· 배양 배지로의 N-아실 아미노산 아실라제의 첨가.
제1항에 있어서, 축적이 감소되는 N-아실 메티오닌이 N-아세틸-메티오닌, N-프로피오닐-메티오닌, N-부티릴-메티오닌 및 이들의 조합의 군 중에서 선택된 것인 방법.
제1항에 있어서, 발현을 감쇠시킬 메티오닌 트랜스아실라제 효소가 yncA, argA, yjdJ, yfaP, yedL, yjhQ 및 이들의 조합 중에서 선택된 유전자에 의해 코딩되는 것인 방법.
제3항에 있어서, 발현을 감쇠시킬 메티오닌 트랜스아실라제 효소가 유전자 yncA에 의해 코딩되는 것인 방법.
제1항에 있어서, N-아실-메티오닌의 생산이 메티오닌 트랜스아실라제 효소를 코딩하는 yncA, argA, yjdJ, yfaP, yedL, yjhQ 유전자 중 1종 이상의 발현을 감쇠시키고, 배양 배지에 N-아실 아미노산 아실라제를 첨가하는 것에 의해 감소되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 배양 배지의 황 공급원이 술페이트, 티오술페이트, 황화수소, 디티오네이트, 디티오나이트, 술파이트, 메틸메르캅탄, 디메틸디술피드 또는 다양한 공급원의 조합인 방법.
제1항에 있어서, 배양 배지의 황 공급원이 술페이트 또는 티오술페이트, 또는 이 둘의 혼합물인 방법.
제1항에 있어서, 탄소 공급원이 재생가능한 공급 원료로부터 유래된 것인 방법.
제1항에 있어서, 탄소 공급원이 글루코스 또는 수크로스인 방법.
제1항에 있어서, 질소 공급원이 암모늄 또는 암모니아 형태로 공급되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 최종 생성물 내에서 일부분 또는 총량 (0 내지 100％)으로 임의로 잔존하는 발효 브로쓰 또는 바이오매스 또는 둘 다의 목적하는 아미노산/구성성분을 단리하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 미생물에 포스페이트 또는 칼륨 또는 둘 다를 제한하거나 고갈시키는 방법.
제1항에서 정의된 바와 같은 변형 중 하나 이상을 포함하며 메티오닌 억제자 metJ 유전자의 결실 및 유전자 cysE 및 metH의 과다발현을 추가로 포함하는, 유전적으로 변형된 미생물.
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