MX2011001962A - Produccion de metionina sin n-acil-metionina. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de metionina o sus derivados mediante el cultivo de un microorganismo en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y una fuente de azufre; el microorganismo y/o el medio de cultivo y/o los parámetros del procedimiento se modificaron de modo que la acumulación del subproducto N-acil-metionina (NAM) se reduce; también se reivindica el aislamiento de metionina o sus derivados del medio de fermentación.

Description

PRODUCCIÓN DE METIONINA SIN N-ACIL-METIONINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de metionina o sus derivados mediante el cultivo de un microorganismo en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y una fuente de azufre. El microorganismo y/o el medio de cultivo y/o los parámetros del procedimiento se modificaron de modo que la acumulación del subproducto N-acil-metionina (NAM) se reduce. También se reivindica el aislamiento de metionina o sus derivados del medio de fermentación.

TÉCNICA ANTERIOR Los compuestos que contienen azufre como cisteína, homocisteína, metionina o S-adenosilmetionina son críticos para el metabolismo celular y se producen industrialmente para su uso como aditivos para alimentos o piensos y productos farmacéuticos. En particular, la metionina, un aminoácido esencial, que no puede ser sintetizado por los animales, desempeña un papel importante en muchas funciones corporales. En la actualidad, la D,L-metionina se produce mediante síntesis química a partir de acroieina, metil-mercaptano y cianuro de hidrógeno. El aumento de los precios de los precursores derivados del petróleo, como la acroleína y el metil-mercaptano junto con la creciente demanda de metionina, hacen que la producción microbiana de metionina sea una opción atractiva.

La ruta para la síntesis de la L-metionina es muy conocida en muchos microorganismos (revisado en Figge RM (2006), ed Wendisch VF, Microbiol onogr (5) Amino acid biosynthesis págs. 164-185). Las cepas productoras de metionina E. coli y C. glutamicum han sido descritas en las solicitudes de patente WO2005/1 11202, WO2007/077041 , WO2007/012078 y WO2007/135188.

La metionina producida por fermentación necesita ser purificada del caldo de fermentación. La purificación rentable de metionina reside en las cepas productoras y en los procedimientos de producción que minimizan la cantidad de subproductos en el caldo de fermentación. Los "subproductos" proceden de las rutas de transformación y/o degradación de la metionina. En particular, estos productos son S-adenosil-metionina (SAM), tio-metil-ribosa y las N-acil-metioninas (NAM) como por ejemplo, N-acetil-metionina y N-propionil-metionina. Como se muestra en la solicitud de patente PCT/EP2007/060433 (con arreglo al Tratado de Cooperación en materia de Patentes), las cepas productoras de metionina de E. coli producen N-acetil-metionina. E. coli también produce N-propionil-metionina.

La producción de NAM no es deseable, ya que reduce la producción de metionina y dificulta la purificación de la metionina. NAM se puede transformar en metionina y acetato añadiendo NAM acilasas al final del ciclo de fermentación, pero esto aumenta drásticamente el coste del producto. Por lo tanto, es necesario reducir o eliminar la acumulación de NAM durante el ciclo de fermentación. Esto requiere una buena comprensión de las reacciones responsables de la acumulación de NAM.

La acetilación del extremo N terminal de la metionina como procedimiento co-traduccional es una de las modificaciones proteicas más comunes en eucariotas. Sin embargo, es poco probable que la N-acetil-metionina se produzca por acetilasas N-terminales (para ver una revisión consulte Polevoda y Sherman 2000 JBC 275, 47, págs. 36479-36482), ya que la metionina parece estar acetilada como un aminoácido libre en las bacterias productoras de metionina y la acetilación de metionina como proceso co-traduccional es poco frecuente en procariotas (Driessen y cois. 1985, CRC Crit. Rev. Biochem. 18, 281-325). Es más probable obtener N-acetil-metionina mediante acetilación de L-metionina libre. Se han descrito enzimas N-acetiladoras, que posiblemente puedan acetilar la metionina. Por ejemplo, ArgA codifica una N-acetil-glutamato sintasa en E. coli (Marvil y Leisinger 1977 JBC 252, 10 págs. 3295-3303).

Hasta ahora se desconocían enzimas capaces de catalizar la producción biosintética de N-acetil-metionina, N-propionil-metionina u otros derivados de la metionina con largas cadenas acílicas. La identificación de las principales actividades metionina-N-acil transferasa y su atenuación en los microorganismos productores de metionina es por lo tanto crucial para la reducción de la producción de NAM.

La acumulación de NAM también puede reducirse desacetilando el NAM acumulado para obtener metionina. En bacterias se ha demostrado la desacetilación de los grupos N-acilo de los aminoácidos. Por ejemplo, ArgE codifica una N-acetil-ornitina desacetilasa que tiene un amplio espectro de sustrato y desacetila eficientemente la N-acetil-metionina (Javid-Majd y Blanchard 2000 Biochemistry 39, 1285-93). Así, la sobreexpresión de argE u otras desacetilasas de aminoácidos, como la acilasa I de riñon de rata (Giardina y cois. 2000 Eur. J. Biochem. 267, 6249-55), desacetilasa de aminoácidos de Aspergillus niger o de riñon de cerdo (Gentzen y cois. 1980 Z. Naturforsch 35 c, 544-50) puede reducir la acumulación de NAM.

Como NAM se exporta al espacio extracelular, la exportación de las NAM acilasas al periplasma o al espacio extracelular puede ser una ventaja. En E. coli se conocen varios sistemas que permiten la exportación al periplasma, por ejemplo los sistemas TAT y Sec (revisados en Manting y Dhessen 2000 Mol Microbiol 37, 226-38, Choi y Lee 2004 Appl. Microbiol. Biotechnol. 64, 625-635). La exportación a través de la ruta TAT o Sec requiere la presencia de péptidos señal específicos. Si se favorece la exportación al espacio extracelular, la proteína de interés puede fusionarse a proteínas transportadoras que normalmente se exporten al medio, como OmpF o hemolisina (Choi y Lee 2004 Appl. Microbiol. Biotechnol. 64, 625-635). La proteína también puede exportarse al medio o ser presentada en la superficie celular fusionándola a dominios proteicos que son necesarios para exportar las proteínas autotransportadoras, como por ejemplo lgA1 de N. gonorrhoeae o AIDA-I de E. coli. Las proteínas también pueden, ser exportadas a través de la ruta V o TPS (siglas en inglés de two-partner system) o de presentación en fago (Jacob-Dubuisson y cois. 2004 Biochim y Biophys Act 1694 235-257, José y Meyer 2007 Microbiol and Molecul Biol Rev 71 , 600-19). También se ha demostrado que el diseño del procedimiento también incluye en la exportación de ciertas proteínas (Shokri y cois. 2003 Appl Microbiol Biotechnol 60, 654-64).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los solicitantes han resuelto el problema de la reducción de la acumulación del subproducto N-acil-metionina (NAM) en las cepas productoras de metionina.

Los inventores han identificado que la principal actividad metionina N-aciltransferasa (MNAT), que cataliza la conversión de metionina en NAM, está codificada por el gen yncA en E. coli.

En este documento se describe un microorganismo modificado que presenta una atenuación de la expresión del gen yncA, y por lo tanto, una producción reducida de NAM.

Los inventores también han demostrado que la sobreexpresión de enzimas desaciladoras, como las acilasas de aminoácidos de Aspergillus oryzae o la acilasa de aminoácidos de riñon de cerdo, que convierten NAM en metionina, conducen a una reducción de la cantidad de NAM.

Preferentemente, dichas enzimas desaciladoras se exportan al periplasma o al espacio extracelular.

En otro aspecto, las condiciones de cultivo se adaptaron para obtener una reducción de la producción y/o de la acumulación de NAM.

Estos tres medios para reducir la acumulación de NAM se aplicaron individualmente o en combinación, para reducir la acumulación de NAM.

La glucosa se usa como sustrato modelo y E. coli recombinante como organismo modelo, pero la invención no se limita a estas características.

Por consiguiente, el objeto de la presente invención es proporcionar un microorganismo en el que la expresión de los principales genes que codifican MNAT (metionina N-acil-transferasa) han sido atenuados, preferentemente habiendo delecionado los genes correspondientes, y/o habiendo sobreexpresado enzimas desaciladoras de NAM homologas o heterólogas, para reducir la acumulación de NAM.

Este microorganismo con una producción y/o acumulación reducida de NAM muestra una producción de metionina y una producción de fuentes de carbono mejoradas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un procedimiento para la producción de metionina, sus derivados o precursores en un proceso fermentativo que comprende las siguientes etapas: - cultivo de un microorganismo modificado en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono, una fuente de azufre y una fuente de nitrógeno y - recuperación de metionina y/o sus derivados a partir del medio de cultivo, en el que en comparación con un microorganismo o un procedimiento no modificado, el microorganismo o el procedimiento han sido modificados para reducir la acumulación del subproducto N-acil-metionina.

En un aspecto particular de la invención, la N-acil-metionina, cuya acumulación es reducida, se escoge entre el grupo siguiente: N-acetil-metionina, N-propionil-metionina, N-butiril-metionina y sus combinaciones.

La acumulación del subproducto N-acil-metionina pude lograrse mediante al menos una de las siguientes modificaciones: - La atenuación de la expresión de al menos una metionina N-acil transferasa (es decir, transacilasas) en el microorganismo y/o La expresión (o potenciación de la expresión) de al menos una aminoacilasa específica de metionina en el microorganismo, y/o - La modificación de las condiciones de cultivo como pH, oxigenación, temperatura y/o adición de NAM acilasa al medio de cultivo. y sus combinaciones, Según la invención, los términos "cultivo", "fermentación" o "proceso fermentativo" se utilizan indistintamente para indicar el crecimiento de bacterias en un medio de crecimiento apropiado que contenga una fuente de carbono sencilla.

Un "medio de cultivo apropiado" es un medio apropiado para el cultivo y crecimiento del microorganismo. Dichos medios son muy conocidos en la técnica de la fermentación de microorganismos, dependiendo del microorganismo que se vaya a cultivar.

La frase "recuperación de metionina y/o sus derivados a partir del medio de cultivo" designa la acción de recuperar la metionina, y posiblemente SA y NAM y el resto de derivados que puedan ser útiles.

El término "microorganismo" se refiere a una bacteria, levadura u hongo. Preferentemente, el microorganismo se selecciona entre Enterobacteríaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae y Corynebacteriaceae. Más preferentemente, el microorganismo es una especie de la Escherichia, Klebsiella, Pantoea, Salmonella o Corynebacterium. Aún rpás preferentemente, el microorganismo es la especie Escherichia coli o Corynebacterium glutamicum.

El término "microorganismo modificado" indica un microorganismo que ha sido genéticamente modificado con el objetivo de reducir la acumulación de NAM en el caldo de fermentación. Los expertos en la materia saben cómo modular la expresión de genes específicos. Las modificaciones habituales incluyen la transformación de microorganismos con elementos genéticos, incluyendo deleción de genes, sustitución de genes, modificación de promotores e introducción de vectores para la expresión de genes heterólogos.

Los inventores han demostrado que el NAM se forma por acilación de la metionina y han identificado a yncA como el gen que codifica la principal enzima productora de NAM. yncA también conocido como el gen de E. coli b1448, ha sido mencionado en la solicitud de patente WO2001070776. Es parte de un grupo de genes inducidos por el regulador Mar, implicado en la resistencia a varios fármacos.

Las enzimas aminoácido acilasa (EC 3.5.1.14), también llamadas desacetilasas, catalizan el corte hidrolítico de un acil-aminoácido para producir el aminoácido libre y el ácido carbónico correspondiente al resto acilo. Más específicamente las N-acil-metionina acilasas catalizan la reacción de NAM a metionina y el ácido carboxílico correspondiente.

El término "N-acil-metionina" indica N-formil-metionina, N-acetil-metionina, N-propionil-metionina, N-butiril-metionina y en general, cualquier derivado de la metionina que comprenda un grupo funcional derivado de cualquier ácido carboxílico que carece de función hidroxilo.

Para medir la acumulación de N-acetil-metionina, se determina la cantidad de N-acetil-metionina en el caldo de fermentación usando HPLC refractométrica usando N-acetil-metionina (Sigma, Ref. 01310) como estándar. La N-propionil-metionina se determina en el caldo de fermentación mediante GC-MS usando N-acetil-metionina como estándar.

La acumulación de NAM debe reducirse en al menos un 20%, preferentemente un 50%, más preferentemente un 80% e incluso más preferentemente un 95% de la cantidad acumulada en un procedimiento con el organismo no modificado o en el proceso no modificado.

El término "fuente de carbono" según la presente invención indica cualquier fuente de carbono que pueden utilizar los expertos en la materia para soportar el crecimiento normal de un microorganismo que pueden ser hexosas (glucosa, galactosa o lactosa), pentosas, monosacáridos, disacáridos (sacarosa, celobiosa o maltosa), oligosacáridos, melaza, almidón o sus derivados, hemicelulosas, glicerol y combinaciones de las mismas. Una fuente de carbono especialmente preferente es la glucosa. Otra fuente de carbono preferente es la sacarosa.

En una modalidad particular de la invención, la fuente de carbono deriva de un producto base renovable. Se define producto base renovable como una materia prima necesaria para determinados procesos industriales que puede regenerarse en poco tiempo y en suficiente cantidad para permitir su transformación en el producto deseado.

El término fuente de nitrógeno corresponde a una sal de amonio o un gas amoniacal. La fuente de nitrógeno se suministra en forma de amonio o amoníaco.

La fuente de azufre usada para la producción fermentativa de L-metionina, sus precursores o compuestos derivados de la misma, puede ser cualquiera de las siguientes: sulfato, tiosulfato, sulfuro de hidrógeno, ditionato, ditionita, sulfito, metilmercaptano, dimetildisulfuro o una combinación de los mismos.

En una modalidad preferida de la invención, la fuente de azufre es sulfato y/o tiosulfato.

La fermentación generalmente se realiza en fermentadores con un medio de cultivo apropiado adaptado a los microorganismos que se estén usando, y contienen al menos una fuente de carbono sencilla, y si fuera necesario cosustratos para la producción de metabolitos.

Los expertos en la materia pueden definir las condiciones de cultivo para los microorganismos según la invención. En particular, las bacterias se fermentan a una temperatura de entre 20 °C y 55 °C, preferentemente entre 25 °C y 40 °C, y más específicamente aproximadamente 30 °C para C. glutamicum y aproximadamente 37 °C para E. coli.

Como ejemplo de medio de cultivo conocido para E. coli puede, el medio de cultivo puede tener una composición idéntica o similar al medio M9 ((Anderson, 1946, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 32:120-128), un medio M63 (Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escheríchia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) o un medio como el definido por Schaefer y cois. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96).

Como ejemplo de medio de cultivo conocido para C. glutamicum, el medio de cultivo puede tener una composición idéntica o similar al medio BMCG (Liebl y cois., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210) o a un medio como el descrito por Riedel y cois. (2001 , J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583).

En una modalidad específica de la invención, la producción de N-acil-metionina se reduce atenuando al menos una de las metionina transacilasas. Las metionina transacilasas también se conocen como metionina N-aciltransferasa (MNAT). argA codifica un enzima con una actividad putativa metionina transacetilasa. Los inventores han purificado la actividad NAT a partir de una cepa de E. coli con una deleción argA, secuenciaron la proteína purificada y demostraron que la proteína purificada, YncA tiene actividad MNAT (solicitud de patente PCT/EP2008/060999). La atenuación de la expresión del gen yncA elimina una gran cantidad de la actividad MNAT residual, lo que conduce a una drástica reducción de la producción de NAM, especialmente de compuestos N-acetil-metionina y N-propionil-metionina. En una modalidad preferida de la invención, YncA se deleciona completamente del genoma de E. coli.

Se han identificado otras N-aciltransferasas con una actividad más baja, que permiten obtener una producción de NAM atenuada; estas enzimas están codificadas por los genes siguientes: yjdJ, yfaP, yedL, yjhQ. Cualquiera de las metionina N-acil-transferasas descritas puede atenuarse individualmente o junto con las otras.

El término "atenuación de un gen" o "atenuación de la expresión de un gen" según la invención indica la supresión parcial o total de la expresión de un gen, que se dice que ha sido "atenuado". Esta supresión de la expresión puede ser una inhibición de la expresión del gen, una deleción de toda o parte de la región del promotor necesaria para la expresión del gen, una deleción o inserción en la región codificadora del gen o la sustitución del promotor silvestre con un promotor menos potente o sintético. Preferentemente, la atenuación de un gen es esencialmente la supresión total de ese gen, que se puede sustituir mediante un gen con un marcador de selección que facilita la identificación, aislamiento y purificación de las cepas según la invención. Un gen se inactiva preferentemente mediante la técnica de recombinación homologa (Datsenko, K.A. y Wanner, B.L. (2000) "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR producís". Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 97: 6640-6645).

En otra modalidad específica de la invención, la acumulación de N-acil-metionina puede reducirse con la expresión en el microorganismo enzimas aminoacilasas específicas de metionina nativas o heterólogas, como: • N-acil-aminoácido acilasa de Aspergillus · N-acil-aminoácido acilasa de cerdo • argE de E. coli que codifica acetilornitina desacetilasa, que actúa también como N-acetil-metionina.

El aumento de la expresión de aminoacilasas específicas de metionina aumenta la tasa de conversión de NAM en metionina con la producción concomitante de una molécula del ácido carboxílico correspondiente, como acetato, propionato o butirato. Favoreciendo el consumo de acetato sobreexpresando los genes acs, pta-ackA o genes que codifican la derivación del glioxilato.

Los términos "potenciado" o "sobreexpresado" en este contexto describe el aumento de la actividad intracelular de una actividad enzimática que está codificada por el ADN correspondiente, por ejemplo, aumentando el número de copias del gen, usando un promotor más potente o usando un alelo con mayor actividad y posiblemente combinando estas medidas.

Los términos "aumento de la expresión", "potenciación de la expresión" o "sobreexpresión" se utilizan indistintamente en el texto y tienen un significado similar.

Para aumentar la expresión de un gen, puede estar codificarse cromosómicamente o extracromosómicamente. Cromosómicamente puede haber una o varias copias en el genoma que puede introducirse con procedimientos de recombinación conocidos por los expertos en la materia. Los genes extracromosómicos pueden transportarse mediante distintos tipos de plásmidos que difieren en su origen de replicación y, de este modo, en su número de copias en la célula. Es posible que estén presentes como 1 a 5 copias, aproximadamente 20 o hasta 500 copias, según los plásmidos de número bajo de copias con replicación limitada (pSC101 , RK2), plásmidos de número bajo de copias (pACYC, pRSF1010) o plásmidos de gran número de copias (pSK bluescript II).

En una modalidad preferida de la invención, el gen puede expresarse utilizando promotores con distintas concentraciones, que pueden ser inducibles. Estos promotores pueden ser homólogos o heterólogos. El experto en la materia conoce cuáles son los promotores más adecuados. Ptrc, Ptac, Plac o el promotor lambda el son los más utilizados.

La expresión de las enzimas puede reforzarse o reducirse con elementos que estabilicen o desestabilicen el ARN mensajero (Carrier y Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64) o las proteínas correspondientes (p. ej., etiquetas de GST, Amersham Biosciences).

La presente invención también se refiere a microorganismos que contienen uno o varios alelos del gen que se va a potenciar según la invención.

Todas las técnicas para transformar microorganismos y sobre los elementos reguladores usados para potenciar la producción de la proteína de la invención, son muy conocidas en la materia y están disponibles en la bibliografía, incluyendo las solicitudes de patentes propiedad del solicitante sobre la modificación de las rutas de biosíntesis en varios microorganismos, incluyendo WO2008/052973, WO2008/052595, WO2008/040387, WO2007/144346, WO2007/1413 6, WO2007/07704 , WO2007/017710, WO2006/082254, WO2006/082252, WO2005/1 11202, WO2005/073364, WO2005/047498, WO2004/076659, cuyo contenido se incorpora en este documento a modo de referencia.

Las enzimas N-acil-metionina acilasas se expresan en el espacio intracelular y pueden permanecer en el espacio intracelular o exportarse al periplasma o exportarse al espacio extracelular. Los expertos en la materia podrán identificar los medios para dirigir la proteína al periplasma. La exportación también puede basarse en la fusión de N-acetil-metionina acilasas a proteínas como OmpF, mediante presentación en fagos o usando sistemas de exportación de proteínas como una ruta Vb o TPS (siglas en inglés de two-partner system) o de autotransporte. En una modalidad preferida de la invención, las enzimas NAM acilasas se exportan al periplasma o al espacio extracelular para evitar ciclos fútiles entre NAM y metionina.

En otra modalidad de la presente invención, los inventores han adaptado los parámetros del proceso de fermentación, es decir, las condiciones de cultivo, para reducir la producción de NAM. Esto se consigue cambiando el pH del caldo de fermentación, modificando los parámetros de oxigenación o de suministro de sustrato. Otra opción es añadir una NAM acilasa específica al medio de cultivo.

En una modalidad, el cambio de los parámetros de fermentación no incluye el cultivo del microorganismo sin una sin un sustrato inorgánico como fosfato, potasio y magnesio.

Estos tres medios para modular la acumulación de NAM pueden usarse por separado o combinados con uno o dos medios diferentes.

Por consiguiente, la atenuación de la actividad MNAT se obtiene atenuando la expresión de los siguientes genes: yncA y/o argA y/o yjdJ, yfaP, yedL, yjhQ, codificando estos genes enzimas con actividad metionina-N-aciltransferasa. Esta atenuación puede combinarse con el aumento de la expresión de las enzimas N-acil-metionina desacilasas, como por ejemplo la N-aminoácido acilasa de Aspergillus, la N-aminoácido acilasa de cerdo o la acetilornitina desacetilasa codificada por el gen argE.

De forma similar, la atenuación de al menos una enzima MNAT, como se describe anteriormente, puede combinarse con la adaptación de los parámetros del proceso, como pH, oxigenación, temperatura y/o añadiendo NAM acilasa al caldo de fermentación, lo que permite también una reducción de la acumulación de NAM.

De forma similar, la expresión de las enzimas NAM acilasas puede combinarse con la adaptación del proceso. Los detalles de ambos medios ya han sido descritos anteriormente.

Finalmente, los tres medios pueden combinarse: la atenuación de la actividad MNAT, el aumentos de la expresión de enzimas NAM acilasas y la adaptación de las condiciones del proceso.

En la descripción de la presente invención, los genes y proteínas se identifican utilizando las denominaciones de los genes correspondientes en la E. coli. Sin embargo, y a menos que se especifique lo contrario, el uso de estas denominaciones tiene un significado más general según la invención y abarca todos los genes y proteínas correspondientes en los demás organismos, más particularmente en microorganismos.

La PFAM (base de datos de familias de proteínas de alineaciones y modelos ocultos de Markov http://www.sanqer.ac.uk/Software/Pfam/) es una gran colección de secuencias de proteínas. Con cada PFAM se pueden visualizar múltiples alineaciones, ver dominios de proteínas, evaluar las distribuciones entre los organismos, obtener acceso a otras bases de datos y visualizar estructuras proteicas conocidas.

Las COG (agrupaciones de grupos ortólogos de proteínas http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) se obtienen comparando las secuencias de proteínas que derivan de genomas de secuencias completas que representan líneas filogenéticas principales. Cada COG se define a partir de al menos tres líneas, permitiendo la identificación de antiguos dominios conservados.

Los expertos en la materia conocen muy bien los medios de identificación de las secuencias homologas y su porcentaje de homología. E incluyen, en particular, los programas BLAST que se pueden utilizar en la página Web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ con los parámetros predeterminados indicados en la página Web. Las secuencias obtenidas se pueden entonces utilizar (alinear) con, por ejemplo, los programas CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) o MULTALIN (http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html), con los parámetros predeterminados indicados en las páginas Web.

Utilizando las referencias de GenBank para los genes conocidos, los expertos en la materia pueden determinar los genes equivalentes en otros organismos, cepas bacterianas, levaduras, hongos, mamíferos, plantas, etc. Esta tarea de rutina se realiza utilizando las secuencias de consenso que se pueden determinar llevando a cabo alineaciones de secuencias con genes derivados de otros microorganismos y diseñando sondas de degeneración para clonar el gen correspondiente en otro organismo. Estos procedimientos de rutina de biología molecular son muy conocidos por los expertos en la materia y se recogen, por ejemplo, en Sambrook y cois. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual 2da ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, Nueva York).

La presente invención también se refiere a un microorganismo como se describe anteriormente. Un microorganismo con una acumulación y/o producción reducidas de N-acil-metionina es particularmente útil para producir metionina con una alta productividad. Preferentemente, el microorganismo según la invención es ya un gran productor de metionina antes de ser usado en el procedimiento según la invención.

La producción eficiente de metionina requiere la optimización de la ruta específica de la metionina y varias rutas suministradoras de precursores. Las cepas productoras de metionina han sido descritas en las en las solicitudes de patente WO 2005/111202, WO2007/077041 y PCT/EP2007/060433 y se incorporan en esta solicitud como referencia.

En la solicitud de patente WO 2005/111202 se describe una cepa productora de metionina que sobreexprese alelos de homoserina succiniltransferasa con una sensibilidad de retroalimentación reducida frente a sus inhibidores SAM y metionina. Esta solicitud también describe una combinación de estos alelos con una deleción del represor de metionina MetJ (GenBank 1790373), responsable de la regulación a la baja del reguión metionina tal y como se sugirió en la solicitud de patente JP 2000/157267. Además, las combinaciones de las dos modificaciones con la sobreexpresión de la aspartoquinasa/homoserina deshidrogenasa se describen en la solicitud de patente WO 2005/11 1202.

La sobreexpresión de los genes cysE, metH y metF se ha sugerido en el documento WO 2007/07704 .

La producción de metionina puede aumentarse adicionalmente usando un alelo metB alterado que usa preferentemente o exclusivamente H2S produciendo así homocisteína a partir de O-succinil-homoserina como se ha descrito en la solicitud de patente WO 2004/076659 que se incorpora en este documento a modo de referencia.

Puede lograrse un aumento adicional en la metionina delecionando los genes pykA, pykF y/o puril como se describe en la solicitud de patente PCT/EP2007/060433. Esta solicitud también describe cepas productoras de metionina en las que los operones cysPUWAM, cysJIH y gcvTHP los genes serA, serB, serC, Ipd y glyA están sobreexpresados.

En E. coli, se puede incrementar la actividad de otras enzimas para aumentar la producción de metionina (seguido por los números de acceso y función del polipéptido correspondiente): Pueden aumentarse la expresión de los genes implicados en la asimilación del azufre: gen número de acceso función cysK 1788754 cisteína sintasa CysZ g1788753 ORF hacia 5' de cysK cys g1789108 ATP sulfurilasa cysD g1789109 sulfato adenililtransferasa cysC g 178910 adenililsulfato quinasa cysZ 1788753 transporte de sulfato sbp 1790351 proteína de de unión al sulfato periplásmico Las reacciones anapleróticas pueden potenciarse expresando ppc 1790393 fosfoenolpiruvato carboxilasa pps 1787994 fosfoenolpiruvato sintasa Las reacciones que consumen acetato pueden reforzarse sobreexpresando acs 1790505 acetil-CoA sintetasa Además, la expresión de los genes de las rutas que degradan la metionina (ver lista siguiente) o que derivan de la ruta de la producción de metionina pueden atenuarse o se pueden delecionar.

En este contexto, atenuación describe la reducción de la actividad intracelular de una enzima por ejemplo, reduciendo su expresión, reduciendo la estabilidad de la enzima, aumentando su degradación y/o otras soluciones conocidas por los expertos en la materia.

Gen Entrada Genbank actividad ackA 1788633 acetato quinasa pía 1788635 fosfotransacetilasa aceE 1786304 piruvato deshidrogenase E1 aceF 1786305 piruvato deshidrogenasa E2 Ipd 1786307 piruvato deshidrogenasa E3 sucC 1786948 succinil-CoA sintetasa, subunidad beta sucD 1786949 succinil-CoA sintetasa, subunidad alfa pck 1789807 fosfoenolpiruvato carboxilquinasa poxB 1787096 piruvato oxidasa HvB 1790104 ácido acetohidroxi sintasa I, subunidad grande HvN 1790103 ácido acetohidroxi sintasa I, subunidad pequeña HvG 1790202 ácido acetohidroxi sintasa II, subunidad grande 1790203 HvM 1790204 ácido acetohidroxi sintasa II, subunidad pequeña ilv\ 1786265 ácido acetohidroxi sintasa III, subunidad grande / H 1786266 ácido acetohidroxi sintasa III, subunidad pequeña aroF 1788953 DAHP sintetasa aroG 1786969 DAHP sintetasa aroH 1787996 DAHP sintetasa thrB 1786184 homoserina quinasa thrC 1786185 treonina sintasa sda/k 1788116 serina desaminasa sdaB 1789161 serina desaminasa speD g178631 1 S-adenosilmetionina descarboxilasa speC g1789337 Ornitina descarboxilasa astA g 1788043 Arginina succiniltransferasa dapA g 1788823 Dihidrodipicolinato sintasa La invención también trata de un procedimiento para la producción de L-metionina, sus precursores o compuesto derivados de la misma, que comprende la fermentación de los microorganismos productores de metionina descritos anteriormente, la concentración de metionina, sus precursores o derivados y el asilamiento de los productos deseados del caldo de fermentación.

Los expertos en la materia pueden definir las condiciones de cultivo para los microorganismos según la invención. En particular, las bacterias se fermentan a una temperatura de entre 20 °C y 55 °C, preferentemente entre 25 °C y 40 °C, y más específicamente aproximadamente 30 °C para C. glutamicum y aproximadamente 37 °C para E. coli.

La fermentación generalmente se realiza en fermentadores con un medio de cultivo inorgánico de composición definida y conocida adaptado a las bacterias que se estén usando, y contienen al menos una fuente de carbono sencilla, y si fuera necesario un cosustrato necesario para la producción del metabolito.

En particular, el medio de cultivo inorgánico para la E. coli puede tener una composición idéntica o similar a un medio M9 (Anderson, 1946, Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 32:120-128), medio M63 (Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) o un medio como el definido por Schaefer y cois. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96).

Análogamente, el medio de cultivo inorgánico para C. glutamicum puede tener una composición idéntica o similar al medio BMCG (Liebl y cois., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210) o a un medio como el descrito por Riedel y cois. (2001 , J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583). Los medios pueden complementarse para compensar las auxotrofías introducidas por las mutaciones.

Después de la fermentación, la L-metionina, sus precursores o compuestos derivados de la misma, se recuperan y se purifican si fuera necesario. Los procedimientos para la recuperación y purificación del compuesto producido, como metionina en el medio de cultivo son muy conocidos por los expertos en la materia.

Opcionalmente, de 0 a 100%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente 95%, más preferentemente aún al menos 99% de la biomasa puede eliminarse durante la purificación del producto de fermentación.

En una modalidad preferida de la invención, el procedimiento para la producción de metionina comprende un paso de asilamiento de los aminoácidos deseados / los componentes del caldo de fermentación y/o quedando la biomasa opcionalmente en porciones o la cantidad total (0-100%) del producto final.

Los medios para reducir la cantidad de NAM se pueden combinar con la limitación de la privación de fosfato y/o potasio. Un experto en la materia puede determinar las cantidades de fosfato o potasio necesarias para el crecimiento del organismo escogido.

"Someter un organismo a una limitación de un sustrato inorgánico" define una condición por la que el crecimiento del microorganismo está regido por la cantidad de producto químico inorgánico suministrado que todavía permita un crecimiento bajo. Los ejemplos de estos sustratos son fosfato, potasio, magnesio o una combinación de los mismos.

Privar a un microorganismo de un sustrato inorgánico define la condición en la cual el crecimiento del microorganismo se detiene por completo debido a la ausencia del sustrato inorgánico. Los ejemplos de estos sustratos son fosfato, potasio, magnesio o una combinación de los mismos.

La invención también se refiere a un microorganismo como se describe anteriormente que se optimiza para la producción fermentativa de metionina con una acumulación reducida de NAM, es decir, que acumula menores cantidades de NAM en comparación con un microorganismo no modificado, y el microorganismo que comprende las modificaciones genéticas descritas anteriormente.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Construcción de una cepa MG1655 metA*M AmeU Ptrc-mefH Ptrc36-ARNmst17-mefF PtrcF-cvsPUWAM PtrcF-cysJIH AP A AP CF Ptrc09-qcvTHP Apuñ AyncA::Km (pMEW'\-thrA*'\-cvsE-PaaDA-metA*JW (pCC1 BAC-serB-serA-se C) Para delecionar el gen putativo yncA de la aciltransferasa en una cepa productora de metionina, usamos la cepa BW25113 AyncA::Km de Escherichia coli de la colección de mutantes Keio (Baba y cois., 2006). La deleción AyncA::Km fue transferida por transduccion fágica con el fago P1 (ver a continuación) de la cepa BW251 13 AyncA::Km a la cepa MG1655 mefA*1 1 Amett Ptrc-mefH Ptrc36-ARNmst17-meíF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP pykA pykF ????/U (descrita en el documento PCT/EP2007/060433). Se seleccionaron los transformantes resistentes a kanamicina y la inserción del cásete de resistencia se verificó con un análisis de PCR con los oligonucleótidos YncAF y YncAR definidos a continuación (secuencia de referencia en la página Web http://ecoqene.org/). La cepa conservada se denominó MG1655 mefA*1 1 AmeU Ptrc-mefH Ptrc36-ARNmst17-mefF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ApykA ApykF Apuñ AyncA::Km.

YncAF: GTTTGCCGATTTGCCCCACCG (homólogo a la región yncA de 1517564 a 1517544) (SEQ ID NO 01) YncAR: CGCCCATCACGGTCGCAAGC (homólogo a la región yncA de 1515827a 1515846) (SEQ ID NO 02) Después, los plásmidos pME101-f/?rA*1-cysE-PgapA-meíA*1 1 y pCC1 BAC-sen3-serA-serC se introdujeron en la cepa MG1655 mefA*H AmefJ Ptrc-mefH Ptrc36-ARNmst17-mefF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ApykA ApykF ApurV AyncAv.Km, que da origen a MG1655 mefA*1 1 AmeU Ptrc-mefH Ptrc36-ARNmst17-mefF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ApykA ApykF Apuri) AyncA::Km (pME101-f/?rA*1-cysE-PgapA-mefA*1 1 ) (pCC1 BAC-serB-serA-se C).

Preparación del lisado fágico P1 : - Inoculación de 10 mi de LB suplementado con kanamicina (50 pg/ml), glucosa (0.2%) y CaCI2 (5 mM) con 100 µ? de cultivo crecido toda la noche de la cepa BW25113 AyncA::Km Incubación durante 30 min a 37 °C con agitación - Adición de 100 µ? de lisado de fago P1 preparado con la cepa BW251 13 AyncA::Km (aproximadamente 1x109 fagos/ml) - Agitación a 37 °C durante 3 horas hasta que todas las células estén lisadas - Adición de 200 µ? de cloroformo y agitación en vórtex - Centrifugación durante 10 min a 4500 g para eliminar restos celulares - Transferencia del sobrenadante a un tubo estéril y adición de 200 µ? de cloroformo - Almacenamiento del lisado a 4 °C Transducción: - Centrifugación durante 10 min a 1500 g de 5 mi del cultivo crecido toda la noche de la cepa MG1655 mefA*11 Ameü Ptrc-mefH Ptrc36-ARNmst17-mefF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ApykA ApykF Apurü en medio LB - Suspensión del sedimento celular en 2.5 mi de MgSC 10 mM, CaCI2 5 mM - Tubos de control: 100 µ? de células 100 µ? de fagos P1 de la cepa BW25113 AyncA:.Km - Tubos de ensayo: 100 µ? de células + 100 µ? de fagos P1 de la cepa BW251 13 AyncA.Km Incubación durante 30 min a 30 °C sin agitación - Adición de 100 µ? de citrato de sodio 1 M en cada tubo y agitación en vórtex - Adición de 1 mi de LB Incubación durante 1 hora a 37 °C con agitación - Siembra en placas petri con LB complementadas con kanamicina (50 pg/ml) después de centrifugar los tubos durante 3 min a 7000 rpm - Incubación a 37 °C durante la noche Verificación de la cepa: Se seleccionaron los transformantes resistentes a la kanamicina y la presencia de la modificación AyncA::Km se verificó con un análisis de PCR con los oligonucleótidos YncAF y YncAR descritos anteriormente.

Construcción de la cepa MG1655 mefA*1 1 AmefJ Ptrc-mefH Ptrc36-ARNmst17-mefF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH AP A AP CF Ptrc09-qcvTHP LouA Ayr?cA::Km AarqA::Cm Para inactivar el gen argA de la aminoácido acetiltransferasa, se empleó la estrategia de recombinación homologa descrita por Datsenko y Wanner (2000). Esta estrategia permite la inserción de un cásete de resistencia a cloranfenicol, mientras se deleciona la mayoría del gen en cuestión. Para este propósito, se emplean dos oligonucleótidos DargAF y DargAR (secuencia de referencia en la página Web http://ecogene.org/): DargAF (SEQ ID NO 03) gtggtaaaggaacgtaaaaccgagttggtcgagggattccgccattcggttccctatatca atacccaccggggaaaaacgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG con - una región (letras minúsculas) homologa a la región argA de 2947264 a 2947344, - una región (letras mayúsculas) para la amplificación del cásete con resistencia al cloranfenicol (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. y Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645) DargAR (SEQ ID NO 04) ccctaaatccgccatcaacactttggatttacgctggtagttgtacaactgctttttgctctcgg gcagtaaatcaatatccCATATGAATATCCTCCTTAG con - una región (letras minúsculas) homologa a la región arg de 2948592a 2948511 , - una región (letras mayúsculas) para la amplificación del cásete con resistencia al cloranfenicol (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. y Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).

Los oligonucleótidos DargAF y DargAR se utilizaron para amplificar el cásete de resistencia al cloranfenicol a partir del plásmido pKD3. El producto de PCR obtenido se introdujo por electroporación en la cepa MG1655 meíA*11 Ameü Ptrc-mefH Ptrc36-ARNmst17-meíF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ApykA ApykF Apurii AyncA/.Km (pKD46) en la que una oenzima recombinasa Red expresada permitió la recombinación homologa. Se seleccionaron los transformantes resistentes a cloranfenicol y la inserción del cásete de resistencia se verificó con un análisis de PCR con los oligonucleótidos ArgAF y ArgAR definidos a continuación (secuencia de referencia en la página Web http://ecogene.org/). La cepa conservada se denominó MG1655 metA*^ ^ AmefJ Ptrc-mefH Ptrc36-ARNmst17-mefF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ApyfrA Apy/cF Apurtl AyncA::Km AargrA::Cm.

ArgAF: cagctgacgatttgattcc (homólogo a la región argA de 2946859 a 2946877) (SEQ ID NO 05) ArgAR: gggttgtttaatggcgatatcgg (homólogo a la región argA de 2949010 a 2948988) (SEQ ID NO 06) Construcción de la cepa MG1655 mefA*1 1 AmefJ Ptrc-mefH Ptrc36-ARNmst17-mefF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH AP A AP CF Ptrc09-gcvTHP Ap¿/rU AyncA araA Para eliminar los casetes de resistencia a cloranfenicol y kanamicina, el plásmido pCP20, que tienen recombinasa FLP que actúa sobre los sitios FRT de los casetes de resistencia a cloranfenicol y kanamicina, se introduce en la cepa recombinante MG1655 mefA*1 1 AmeíJ Ptrc-mefH Ptrc36-ARNmst17-mefF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Apy/ A Apy/cF Apt/rU Ayr>cA::Km AargA::Cm por electroporación. Después de una serie de cultivos a 42 °C, la pérdida de los casetes de resistencia a cloranfenicol y a kanamicina se verifica por análisis de PCR con los oligonucleótidos descritos anteriormente YncAF / YncAR y ArgAF / ArgAR. La cepa conservada se denomina MG1655 mefA*1 1 AmefJ Ptrc-mefH Ptrc36-ARNmst17-mefF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ApykA ApykF Ptrc09-gcvTHP ApurU AyncA AargA.

Construcción de una cepa MG1655 mefA*11 Ameü Ptrc-mefH Ptrc36-ARNmst17-mefF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ApykA ApykF Ptrc09-gcvTHP ApurU Avne A AarqA (pME101-fhrA -cysE-PqapA-mefA*1 1) (pCC1 BAC-serB-serA-serC) Los plásmidos pME101-fnrA*1-cysE-Po;apA-mefA*1 1 y pCC1 BAC-serB-serA-se C se introdujeron en la cepa MG1655 mefA*11 Ameü Ptrc-mefH Ptrc36-ARNmst17-mefF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ApykA ApykF ApurU AyncA AargA que da origen a MG1655 mefA*1 1 Ameü Ptrc-mefH Ptrc36-ARNmst17-mefF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ApykA ApykF Apuri) AyncA AargA (pME101-f/?rA*1-cysE-Pg/apA-mefA*1 1 ) (pCC1 BAC-serB-serA-serC).

Construcción de genes sintéticos que expresan actividad aminoácido acilasa Para transformar NAM en metionina, se expresaron NAM acilasas (aminoácido acilasas) en el microorganismo productor de metionina.

Para este propósito se prepararon genes sintéticos de los genes aminoácido acilasa acyl de Aspergillus a través de la compañía Codon Devices (www.codondevices.com/). El uso de codones y el contenido en GC de los genes se adaptó a E. coli de acuerdo con la matriz del proveedor. A continuación se muestran todas las secuencias con el uso de codones optimizado. La expresión de los genes sintéticos fue dirigida por promotores Ptrc controlados con secuencias de operadores. Se añadieron terminadores transcripcionales hacia el extremo 3' de los genes. Las construcciones se clonaron en vectores pUC19 y se verificaron mediante secuenciación, antes de transformar las cepas productoras de metionina con ellas.

Aminoacilasa acyl de Aspergillus Secuencia del promotor y del operador Gagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtsrgfaafígfgagcgfgafaacaaff tcatgacacaggaaacagacc (SEQ ID NO 07) Secuencia de la aminoacilasa acyl de Aspergillus (XP_001827519.1) (SEQ ID NO 8) Mttstvvsllsslmqtqstseheqelahflddhltnlgytverlpiaegstrenvyaylgtqrkt rvcltshldtvppyiplhegstiygrgacddkgpmaaqicaleelraegavkegdvgllfvvgeekggpgmia anhqdlsfegvifgeptegklvvghkghlvfeligegkachsgypqhgvnanfalietlsdfvqtefpsssllgp stfnvgkieggvsynivpetskalcavrvatdmagikkivsdtvarhsnvrlefkfeypetlldhdvegsfnvrs ccymnrsilvahgdneqieidelmegvraykkltmhalnsar (SEQ ID NO 9) atgaccacgtcgactgtcgtttctctgctgagttcactgatgcagacacaatccacctcgga acacgagcaggaactggcgcactttctggatgaccatctgacaaacctgggatatactgtcgagcgtctgcc gattgcagaagggtccactcgcgagaacgtctacgcatatctggggacccaacgtaaaacgcgtgtatgtct gacctctcacctggatactgttccgccgtacatcccgctgcgtattgagggcagtacaatctatggtcgcgggg cttgtgacgataagggcccgatggctgcacagatctgcgctctggaagagctgcgtgctgaaggtgcggtca aagaaggcgacgtaggtctgctgttcgtcgttggggaggaaaaaggcggtccgggcatgatcgcagcgaa ccaccaggatctgtcttttgaaggggttatttttggggaaccgacggaaggcaagctggtagtaggtcacaaa gggcacctggtttttgagctgatcggtgagggaaaggcttgtcactccggctacccgcaacacggtgtgaac gcgaatttcgccctgattgagacactgtcggattttgtccagacggagtttcctagctctagtctgctggggccgt caacatttaacgttggcaagatcgaaggtggcgtatcctataatattgtgccggaaacgtcgaaagccctgtg tgcagtgcgcgttgcgacggacatggccggtatcaaaaagattgtgagcgataccgtagcacgtcactctaa cgtccgcctggagttcaagtttgaatatccagagacactgctggaccatgatgttgaagggagttttaatgtgc gttcctgctgttatatgaaccgctccatcctggttgcccacggagacaatgagcaaattgaaatcgatgaactg atggagggagtacgcgcctataaaaagctgacaatgcacgccctgaactcagcccgctaa Secuencia del terminador transcripcional: (ref.: Harrington K.J., Laughlin R.B. y Liang S. Proc Nati Acad Sc¡ U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.) Tcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgc (SEQ ID NO 10) Aminoacilasa acyl de cerdo Secuencia del promotor y del operador Gagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaaíígfgagcggafaacaafí tcatgacacaggaaacagaac (SEQ ID NO 11) Secuencia de la aminoacilasa acyl de cerdo (NP_999061.1 ) (SEQ ID NO 12) Maskgregehpsvtlfrqylrirtvqpepdygaavafleerarqlglgcqkvevvpghvvt vltwpgtnptlssillnshtdvvpvfkehwshdpfegfkdadgyiygrgaqdmkcvsiqyleavrrlkveghhf prtihmtfvpdeevgghqgmelfvkrpefqalragfaldeglasptdaftvfyserspwwln^stgkpghgsrf ¡edtaaeklhkvinsilafrekekqrlqsnqlkpgavtsvnltmleggvaynvvpatmsacfdfrvapdvdlkaf eeqlqswcqaagegN^efvqkwmetqvtstddsdpwwaafsgvfkdmklaleleicpastdaryiraagv palgfspmnhtpvllhdhderlheavflrgvdiytqllsalasvpalpses (SEQ ID NO 13) atggcgagcaaaggccgtgaaggtgagcatccgtctgtgaccctgtttcgccagtatctg cgtattcgcacggttcagcctgaaccggattacggagcagctgtggctttcctggaggaacgcgctcgtcag ctgggtctgggttgccaaaaggtagaagttgtcccagggcacgtcgtaactgtactgacttggcctggaacg aatccgaccctgagttcaatcctgctgaactcccatacagatgtagtgccagtgttcaaggaacattggagtc acgaccctttcgaagggtttaaagatgccgatggctatatttacggtcgtggggcacaggacatgaagtgtgt atccattcaatatctggaagctgttcgccgtctgaaagttgaagggcaccactttccacgcactattcacatga ctttcgtgcctgacgaggaagtcgggggtcaccaaggtatggaactgttcgtaaaacgccctgagtttcaggc actgcgtgcgggttttgctctggacgagggtctggcgagcccgacagacgcgtttaccgtgttttacagtgaac gttcgccttggtggctgcgcgttacttccacaggtaagccggggcacggctcgcgtttcatcgaggatacagc cgctgaaaagctgcacaaagttattaatagcatcctggcctttcgcgagaaggaaaagcaacgtctgcaga gcaaccagctgaaaccgggtgcggtcactagcgtgaatctgactatgctggaggggggtgtcgcctataac gttgtgccggcaactatgagcgcatgcttcgactttcgcgtagctccggatgttgacctgaaagccttcgaaga acaactgcagagctggtgtcaagcagcgggagaaggtgtaacctttgagttcgtccagaaatggatggaaa cacaggttacctcgactgatgatagcgatccttggtgggcagccttttctggtgtgttcaaagatatgaagctgg cgctggaactggaaatctgcccagcgagtacagacgctcgttacatccgcgccgcaggcgtaccagccct gggtttttcaccgatgaatcacacgccggtcctgctgcatgatcacgatgagcgcctgcatgaggcagttttcc tgcgcggcgtcgacatttatacccaactgctgagtgcactggcttctgttcctgcgctgccatcggaatca Secuencia del terminador transchpcional: (ref.: Harrington K.J., Laughlin R.B. y Liang S. Proc Nati Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.) Tcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgc (SEQ ID NO 10) EJEMPLO 2 Producción de metionina en condiciones de fermentación Las cepas que produjeron cantidades sustanciales de metabolitos de interés se analizaron en condiciones de producción en termentadores de 2.5 I Pierre Guerin) usando una estrategia de cultivos por lote>(fed-£>afc/7) con privación de fosfato.

Para detener el crecimiento a una concentración celular de 30 g.l"1, se añadió fosfato 28.7 mM al medio mineral B1 b. El medio fedbatch F1 carecía de fosfato.

En resumen, se empleó un cultivo de 8 horas crecido en 10 mi de medio LB con 2.5 g.l"1 de glucosa para inocular una precultivo de 24 h en medio mínimo B1a. Estos cultivos fueron crecidos en un matraz con deflectores de 500 mi con 50 mi de medio mínimo (B1 a) en un agitador rotacional (200 rpm) a 37 °C.

CUADRO 1 Composiciones de los medios minerales en lote de cultivos (B1a y B1b).

CUADRO 2 Composición del medio Fed batch de cultivo (F1).

Posteriormente, se llenaron termentadores de 2.5 1 (Pierre Guerin) con 600 mi de medio mínimo (B1 b) y se inocularon a una concentración de biomasa de 0.1 g.l"1 con un volumen de precultivo que oscilando de 25 a 45 mi.

La temperatura de cultivo se mantuvo constante a 37 °C y el pH también se mantuvo al valor funcional (6.8) con la adición automática de soluciones de NH4OH (NH4OH 10% durante 10 horas y 24% hasta el final del cultivo). La velocidad de agitación inicial se fijó en 200 rpm durante la fase de lote (batch) y se incrementó hasta 1200 rpm durante la fase del cultivo por lote (fed-batch). La tasa de flujo de aire inicial se fijó en 40 NL.h" durante la fase en lote (batch) y se incrementó hasta 100 NL.h"1 al inicio de la fase del cultivo por lote (fed-batch). La concentración de oxígeno disuelto se mantuvo en valores de saturación de entre el 30 y el 40%, preferentemente una saturación del 30% aumentando la agitación.

Cuando la masa celular alcanzó una concentración próxima a 5 g.l"1, se inició el cultivo por lotes (fed-batch) con una tasa de flujo inicial de 5 ml.h"1. La solución de suministro nutricional se inyectó con un perfil sigmoideo con una tasa de flujo creciente que alcanzó los 21 ml.h"1 después de 21 horas. Las condiciones de suministro nutricional se calcularon con la ecuación: m = ? + en la que Q(t) es la tasa de flujo de suministro nutricional en ml.h" 1 para un volumen de lote de 600 mi, con p1 = 1.15, p2 = 18.32, p3 = 0.270, p4 = 5.

Después de 21 horas de fedbatch, la concentración celular alcanzó los 30 g.l'1, se agotó el fosfato del medio y las células entraron en una privación de fosfato. En ese punto, la inyección de solución de suministro nutricional se aumentó a un valor constante de 37 ml.h"1 durante 4 horas. Después, la velocidad de flujo constante se redujo a 10 ml.h"1 y este valor de flujo se mantuvo hasta el final del fedbatch (50 horas).

CUADRO 3 Producción máxima de metionina/glucosa (Ymet), producción de metionina + N-acil-metionina + N-propionil-metionina/glucosa (Ymet + NAM), producción de N-acetil-metionina/glucosa y producción de N-propionil-metionina/glucosa (N-acetil-metionina y producción de N-propionil-metionina se contaron como metionina, % g/g, véase a continuación) obtenida en fermentaciones en cultivos por lotes (fed-batch) de las cepas descritas anteriormente. Para la definición precisa de las producciones véase a continuación. Se muestran los valores medios de tres ciclos de fermentación para la cepa de referencia 1 y de dos ciclos fedbatch para la cepa 1 DyncA. La cepa 1 corresponde a MG1655 metA*11 AmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ApykA ApykF Ptrc09-gcvTHP ApurU (pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11) (pCC1BAC-serB-serA-serC).

Determinación de la producción de metionina/glucosa (Ymat) La concentración de metionina extracelular se cuantificó por HPLC después de una derivatización OPA/FMOC. Las concentraciones de N-acetil-metionina y de glucosa residual se analizaron por HPLC con detección refractométrica. La concentración de N-propionil-metionina se determinó por GC-MS después de sililación, se expresó como equivalente N-acetil-metionina.

El volumen del fermentador se calculó añadiendo al volumen inicial la cantidad de soluciones añadidas para regular el pH y para suministrar nutrientes al cultivo y restando el volumen usado para la toma de muestras y la pérdida por evaporación.

El volumen de fedbatch se siguió continuamente pesando la solución madre de suministro nutricional. Después, se calculó la cantidad de glucosa inyectada según él con respecto al peso inyectado, la densidad de la solución y la concentración de glucosa controlada por el procedimiento de Brix ([glucosa]). La producción de metionina se expresó del siguiente modo: y. _ Metionina, * V, - Metionina0 * V0 t m" Glu eos aconsumida.

Siendo respectivamente Metionina0 y Metioninat, las concentraciones iniciales y de metionina en el tiempo (t) y V0 y Vt los volúmenes iniciales en el instante t.

La YN-acet¡i-metion¡na se calculó del siguiente modo: N - acetil metionina, * V, Glu eos aconsumida, siendo N-acetil-metioninat la concentración en mmol por litro en el instante t.

La YN-propionN-metionina se calculó del siguiente modo: _ N- propionilmetionina* V, ? Glucosaconsumidp siendo N-acetil-met¡oninat la concentración en mmol por litro en el instante t. ? let + N-acetil-metionina + N-propionil-metionina (YlVIet + NAM) Se Calculó d©l siguiente modo: _ Melionina, * Vt + N - acetil - metionina, * Vt » 0,1492 + W - propionil - metionina, * * 0,1492 f M"*NM< Glucosaconsumidat Siendo Metioninat la concentración de metionina en g por litro, N-acetil-metioninat y N-propionil-metioninat, las concentraciones respectivas en mmol por litro en el instante t.

La glucosa consumida se calculó del siguiente modo: pesosu min istrado 0 - pesosu min istrado , Volumensu min istrado, densidaddesoluciónsu min istrada Glucosa inyectadat = volumen suministradot * [glucosa] Glucosa consumidat = [glucosa]o * V0 + glucosa inyectada - [glUCOSa]residual * Vt Siendo [glucosa]o, [glucosa], [glucosa]res¡duai respectivamente las concentraciones inicial, de suministro y de glucosa residual.

EJEMPLO 3 Adaptación de las condiciones de cultivo agregando aminoácido acilasa al medio de fermentación Para transformar N-acetil-metionina en metionina y acetato, se agregaron 160 U de N-aminoácido acilasa (riñon porcino, Sigma) a 200 µ? de caldo de fermentación después del ciclo de fermentación de la cepa 1 (realizado como se describe anteriormente). Esta mezcla de reacción se incubó a 37 °C durante 2 h. Posteriormente, se determinaron las concentraciones de metionina y N-acetil-metionina como se describe anteriormente. El 75-95% de N-acetil-metionina se transformó en metionina con este tratamiento enzimático.

Referencias no patentes - Figge RM (2006), ed Wendisch VF, Microbiol Monogr (5) Amino acid biosynthesis p164-185, - Polevoda y Sherman 2000 JBC 275, 47, págs. 36479-36482, - Driessen y cois. 1985, CRC Crit. Rev. Biochem. 18, 281-325, - Marvil y Leisinger 1977 JBC 252, 10 págs. 3295-3303, - Javid-Majd y Blanchard 2000 Biochemistry 39, 1285-93, - Giardina y cois. 2000 Eur. J. Biochem. 267, 6249-55, - Gentzen y cois. 1980 Z. Naturforsch 35 c, 544-50, - Manting y Driessen 2000 Mol Microbiol 37, 226-38, - Choi y Lee 2004 Appl. Microbiol. Biotechnol. 64, 625-635, - Jacob-Dubuisson y cois. 2004 Biochim et Biophys Act 1694 235-257, - José y Meyer 2007 Microbiol and Molecul Biol Rev 71 , 600- 19, - Shokri y cois. 2003 Appl Microbiol Biotechnol 60, 654-64, - Anderson, 1946, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 32:120-128, - Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, - Schaefer y cois. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96), - Liebl y cois., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210, - Riedel y cois. (2001 , J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583), - Datsenko, K.A. y Wanner, B.L. (2000) "One-step ¡nactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products". Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645, - Carrier y Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64, - Sambrook y cois. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.).

Claims (19)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un procedimiento para la producción de metionina, o sus precursores en un proceso fermentativo que comprende las siguientes etapas: - cultivo de un microorganismo modificado en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono, una fuente de azufre y una fuente de nitrógeno y - recuperación de metionina y/o sus derivados a partir del medio de cultivo, en el que en comparación con un microorganismo o un procedimiento no modificado, la acumulación del subproducto N-acil-metionina es reducida.

2 - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la N-acil-metionina, cuya acumulación es reducida, se escoge entre el grupo siguiente: N-acetil-metionina, N-propionil-metionina, N-butiril-metionina y sus combinaciones.

3. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha reducción de la acumulación de N-acil-metionina se logra mediante una de las siguientes modificaciones: atenuación de la expresión de al menos una enzima metionina transacilasa, y/o expresión o potenciación de la expresión de al menos una aminoacilasa específica de la metionina, y/o cambio de las condiciones de cultivo.

4. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la enzima metionina transacilasa cuya expresión se atenúa está codificada por un gen seleccionado entre yncA, argA, yjdJ, yfaP, yedL, yjhQ y sus combinaciones.

5. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la enzima metionina transacilasa cuya expresión se atenúa está codificada por el gen yncA.

6. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la producción de N-acil-metionina se reduce expresando al menos una enzima nativa o heteróloga N-acil-L-aminoácido amidohidrolasa en el microorganismo, escogida entre las siguientes: a. N-acil-aminoácido acilasa de Aspergillus b. N-acil-aminoácido acilasa de cerdo c. acetilornitina desacetilasa codificada por el gen argE gene.

7. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la producción de N-acil-metionina se reduce adaptando las condiciones del cultivo seleccionadas entre pH, oxigenación y/o temperatura, o añadiendo N-acilaminoácido acilasa en el medio.

8. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la producción de N-acil-metionina se reduce: a) atenuando la expresión de al menos uno de los siguientes genes yncA, argA, yjdJ, yfaP, yedL, yjhQ que codifican enzimas metionina N-aciltransferasa, y b) expresando al menos una enzima nativa o heteróloga N-acil-metionina desacilasa, como por ejemplo: a. N-acil-aminoácido acilasa de Aspergillus b. N-acil-aminoácido acilasa porcina c. acetilornitina desacilasa codificada por el gen argE gene.

9. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la producción de N-acil-metionina se reduce atenuando la expresión de al menos uno de los siguientes genes yncA, argA, yjdJ, yfaP, yedL, yjhQ que codifican enzimas metionina N-acil transferasa y adaptando las condiciones del proceso como pH, oxigenación y/o temperatura o agregando una aminoácido acilasa al medio.

10. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la producción de N-acil-metionina se reduce expresando al menos una enzima nativa o heteróloga N-acil-metionina acilasa, como por ejemplo: a. N-acil-aminoácido acilasa de Aspergillus b. N-acil-aminoácido acilasa de cerdo c. acetilornitina desacetilasa codificada por el gen argE gene y adaptando las condiciones del proceso, como pH, oxigenación y/o temperatura o agregando una aminoácido acilasa al medio. 1 1.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la producción de N-acil-metionina se reduce: -atenuando la expresión de al menos uno de los siguientes genes yncA, argA, yiiD, yhhY, yjdJ, yfaP, yedL, yjhQ que codifican enzimas metionina N-aciltransferasa, y -expresando al menos una enzima nativa o heteróloga N-acil-aminoácido desacetilasa, como por ejemplo a. N-acil-aminoácido acilasa de Aspergillus b. N-acil-aminoácido acilasa de cerdo c. acetilornitina desacetilasa codificada por el gen argE gene y adaptando las condiciones del cultivo, como pH, oxigenación y/o temperatura o agregando una aminoácido acilasa al medio. 12. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la fuente de azufre en el medio de cultivo es sulfato, tiosulfato, sulfuro de hidrógeno, ditionato, ditionita, sulfito, metilmercaptano, dimetilsulfuro o una combinación de las- diferentes fuentes. 13. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la fuente de azufre en el medio de cultivo es sulfato o tiosulfato, o una mezcla de los dos. 14. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la fuente de carbono deriva de un producto base renovable. 15. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la fuente de carbono es glucosa o sacarosa. 16. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la fuente de nitrógeno se suministra en forma de amonio o amoníaco. 17. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la etapa de asilamiento de los aminoácidos deseados/los componentes del caldo de fermentación y/o quedando la biomasa opcionalmente en porciones o la cantidad total (0-100%) del producto final. 18. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque al microorganismo se le limita o se le priva de fosfato y/o potasio. 19.- Un microorganismo que comprende las modificaciones reivindicadas en la reivindicación 3.