JP2012500622A - N−アシル−メチオニン不含メチオニンの生産 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、炭素源と硫黄源とを含んでなる適切な培養培地で微生物を培養することによりメチオニンまたはその誘導体を生産するための方法に関する。該微生物および/または培養培地はおよび/またはプロセスパラメーターは、副産物N−アシル−メチオニン(NAM)の蓄積が低減されるように改変されたものである。また、発酵培地からのメチオニンまたはその誘導体の単離も提供される。
システイン、ホモシステイン、メチオニンまたはS−アデノシルメチオニンなどの硫黄含有化合物は細胞代謝に重要であり、食品または飼料添加物および医薬品として使用するために工業的に製造される。特に、動物が合成することのできない必須アミノ酸であるメチオニンは、多くの身体機能において重要な役割を果たす。現在、D,L−メチオニンはアクロレイン、メチルメルカプタンおよびシアン化水素からの化学合成により生産されている。石油由来の前駆体であるアクロレインおよびメチルメルカプタンの価格の高騰とメチオニン需要の増加が相まって、メチオニンの微生物生産が注目されている。
炭素源、硫黄源および窒素源を含んでなる適切な培養培地中で改変微生物を培養する工程;および
該培養培地からメチオニンおよび/またはその誘導体を回収する工程
を含んでなり、
非改変微生物または方法と比較して、該微生物または方法が副産物N−アシルメチオニンの蓄積を低減するように改変されている方法に関する。
微生物における少なくとも1つのメチオニンN−アシルトランスフェラーゼ(すなわち、トランスアシラーゼ)の発現の減衰、および/または
微生物における少なくとも1つのメチオニン特異的アミノアシラーゼの発現(または発現の増強);および/または
pH、酸素供給、温度、および/または培養培地へのNAMアシラーゼの添加、およびそれらの組合せなどの培養条件の変更
の少なくとも1つによって得ることができる。
・コウジカビN−アシルアミノ酸アシラーゼ
・ブタN−アシルアミノ酸アシラーゼ
・N−アセチルメチオニンにも作用するアセチルオルニチンデアセチラーゼをコードする大腸菌argE
などの天然または異種メチオニン特異的アミノアシラーゼ酵素を微生物に発現させることにより低減させることができる。
遺伝子 受託番号 機能
cysK 1788754 システインシンターゼ
CysZ g1788753 cysKの上流のORF
CysZ g1789108 ATPスルフリラーゼ
cysD g1789109 硫酸塩アデニリルトランスフェラーゼ
cysC g1789107 アデニリル硫酸キナーゼ
cysZ 1788753 硫酸輸送
sbp 1790351 周辺質硫酸結合タンパク質
ppc 1790393 ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
pps 1787994 ホスホエノールピルビン酸シンターゼ
acs 1790505 アセチル−CoAシンセターゼ
遺伝子 Genbank登録番号 活性
ackA 1788633 酢酸キナーゼ
pta 1788635 ホスホトランスアセチラーゼ
aceE 1786304 ピルビン酸デヒドロゲナーゼE1
aceF 1786305 ピルビン酸デヒドロゲナーゼE2
lpd 1786307 ピルビン酸デヒドロゲナーゼE3
sucC 1786948 スクシニル−CoAシンセターゼ、βサブユニット
sucD 1786949 スクシニル−CoAシンセターゼ、αサブユニット
pck 1789807 ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ
poxB 1787096 ピルビン酸オキシダーゼ
ilvB 1790104 アセトヒドロキシ酸シンターゼI、大サブユニット
ilvN 1790103 アセトヒドロキシ酸シンターゼI、小サブユニット
ilvG 1790202 アセトヒドロキシ酸シンターゼII、大サブユニット
1790203
ilvM 1790204 アセトヒドロキシ酸シンターゼII、小サブユニット
ilvI 1786265 アセトヒドロキシ酸シンターゼIII、大サブユニット
ilvH 1786266 アセトヒドロキシ酸シンターゼIII、小サブユニット
aroF 1788953 DAHPシンセターゼ
aroG 1786969 DAHPシンセターゼ
aroH 1787996 DAHPシンセターゼ
thrB 1786184 ホモセリンキナーゼ
thrC 1786185 トレオニンシンターゼ
sdaA 1788116 セリンデアミナーゼ
sdaB 1789161 セリンデアミナーゼ
speD g1786311 S−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ
speC g1789337 オルニチンデカルボキシラーゼ
astA g1788043 アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ
dapA g1788823 ジヒドロジピコリン酸シンターゼ
MG1655 metA * 11 ΔmetJ Ptrc−mefH Ptrc36−ARNmst17−metF PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH ΔpykA ΔpykF Ptrc09−gcvTHP ΔpurU ΔyncA::Km(pME101−thrA * 1−cysΕ−PgapA−metA * 11)(pCC1BAC−serB−serA−serC)株の構築物
メチオニン生産株において推定アシルトランスフェラーゼyncA遺伝子を欠失させるために、本発明者らは、慶応ミュータントコレクション(Baba et al., 2006)の大腸菌(Escherichia coli)BW25113 ΔyncA::Km株を用いた。このΔyncA::Km欠失をP1ファージ形質導入(下記参照)によりBW25113ΔyncA::Km株からMG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc−metH Ptrc36−ARNmst17−metF PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTHP ΔpykA ΔpykF ΔpurU株(PCT/EP2007/060433に記載)へ導入した。カナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、下記に定義されるオリゴヌクレオチドYncAFおよびYncAR(ウェブサイトhttp://ecogene.org/に参照配列)を用いたPCR分析により確認した。保有株をMG1655 met A*11 ΔmetJ Ptrc−metH Ptrc36−ARNmst17−meF PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTHP ΔpykA ΔpykF ΔpurU ΔyncA::Kmと呼称した。
YncAR:CGCCCATCACGGTCGCAAGC(yncA領域1515827〜1515846と相同)(配列番号02)
・カナマイシン(50μg/mL)、グルコース(0.2%)およびCaCl2(5mM)を添加した10mL LBにBW25113 ΔyncA::Km株の一晩培養物100μLを植菌し、振盪しながら37℃で30分間インキュベーションする。
・BW25113 ΔyncA::Km株で調製した100μLのファージ溶解液を加える(約1.109ファージ/mL)。
・総ての細胞が溶解するまで37℃で3時間振盪する。
・200μLのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける。
・4500gで遠心分離を行い、細胞残渣を除去する。
・上清を無菌試験管に移し、200μLのクロロホルムを加える。
・溶解液を4℃で保存する。
・LB培地中、MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc−metH Ptrc36−ARNmst17−metF PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTHP ΔpykA ΔpykF ΔpurU株の一晩培養物5mLを1500gで10分間遠心分離する。
・細胞ペレットを2.5mLの10mM MgSO4、5mM CaCl2に懸濁させる。
・対照試験管:100μLの細胞
100μL BW25113 ΔyncA::Km株のファージP1
・供試試験管:100μLの細胞+100μL BW25113 ΔyncA::Km株のファージP1
・振盪せずに30℃で30分間インキュベートする。
・各試験管に100μlの1Mクエン酸ナトリウムを加え、ボルテックスにかける。
・1mlのLBを加える。
・振盪しながら37℃で1時間インキュベートする。
・試験管を7000rpmで3分間遠心分離した後、カナマイシン(50μg/mL)を添加したLBペトリ皿に拡げる。
・37℃で一晩インキュベートする。
カナマイシン耐性形質転換体を選択し、ΔyncA::Km改変の存在を、上記で定義されたオリゴヌクレオチドYncAFおよびYncARを用いたPCR分析により確認した。
アミノ酸アセチルトランスフェラーゼargA遺伝子を不活性化するために、Datsenko & Wanner (2000)が記載している相同組換え戦略を用いた。この戦略によれば、関連する遺伝子の大部分を欠失させるとともに、クロラムフェニコール耐性カセットを挿入することができる。この目的で、2つのオリゴヌクレオチドDargAFおよびDargARを用いた(ウェブサイトhttp ://ecogene.org/に参照配列)。
・argA領域2947264〜2947344に相同な領域(小文字)
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域(大文字)(Datsenko, KA. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)を有する
gtggtaaaggaacgtaaaaccgagttggtcgagggattccgccattcggttccctatatcaatacccaccggggaaaaacgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
・argA領域2948592〜2948511と相同な領域(小文字)
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域(大文字)(Datsenko, KA. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)を有する
ccctaaatccgccatcaacactttggatttacgctggtagttgtacaactgctttttgctctcgggcagtaaatcaatatccCATATGAATATCCTCCTTAG
ArgAR:gggttgtttaatggcgatatcgg(argA領域2949010〜2948988と相同)(配列番号06)
クロラムフェニコールおよびカナマイシン耐性カセットを除去するために、クロラムフェニコールおよびカナマイシン耐性カセットのFRT部位に作用するレコンビナーゼFLPを有するpCP20プラスミドを、エレクトロポレーションにより、組換え株MG1655 met A*11 ΔmetJ Ptvc−metH Ptrc36−ARNmst17−metF PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTHP ΔpykA ΔpykF ΔpurU ΔyncA::Km ΔargA::Cmに導入する。42℃で一連の培養を行った後、クロラムフェニコールおよびカナマイシン耐性カセットの消失を、上記のオリゴヌクレオチドYncAF/YncARおよびArgAF/ArgARを用いたPCR分析により確認する。保有株をMG1655 metA*11 ΔmetJ Ptvc−metH Ptrc36−ARNmst17−metF PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH ΔpykA ΔpykF Ptrc09−gcvTHP ΔpurU ΔyncA ΔargAと呼称した。
プラスミドpME101−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11およびpCC1BAC−serB−serA−serCを、MG1655 metA*11 Δmet Ptrc−metH Ptrc36−ARNmst17−metF PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTHP ΔpykA ΔpykF ΔpurU ΔyncA ΔargA株に導入し、MG1655 met A*11 ΔmetJ Ptvc−metH Ptrc36−ARNmst17−metF PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTHP ΔpykA ΔpykF ΔpurU ΔyncA ΔargA(pME101−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11)(pCC1BAC−serB−serA−serC)を得る。
NAMをメチオニンに変換するために、メチオニン生産微生物においてNAMアシラーゼ(アミノ酸アシラーゼ)を発現させた。
プロモーターおよびオペレーター配列
Gagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcatgacacaggaaacagacc(配列番号07)
Mttstwsllsslmqtqstseheqelahflddhltnlgytverlpiaegstrenvyaylgtqrktrvcltshldtvppyiplriegstiygrgacddkgpmaaqicaleelraegavkegdvgllfwgeekggpgmiaanhqdlsfegvifgeptegklwghkghlvfeligegkachsgypqhgvnanfalietlsdfvqtefpsssllgpstfnvgkieggvsynivpetskalcavrvatdmagikkivsdtvarhsnvrlefkfeypetlldhdvegsfnvrsccymnrsilvahgdneqieidelmegvraykkltmhalnsar
atgaccacgtcgactgtcgtttctctgctgagttcactgatgcagacacaatccacctcggaacacgagcaggaactggcgcactttctggatgaccatctgacaaacctgggatatactgtcgagcgtctgccgattgcagaagggtccactcgcgagaacgtctacgcatatctggggacccaacgtaaaacgcgtgtatgtctgacctctcacctggatactgttccgccgtacatcccgctgcgtattgagggcagtacaatctatggtcgcggggcttgtgacgataagggcccgatggctgcacagatctgcgctctggaagagctgcgtgctgaaggtgcggtcaaagaaggcgacgtaggtctgctgttcgtcgttggggaggaaaaaggcggtccgggcatgatcgcagcgaaccaccaggatctgtcttttgaaggggttatttttggggaaccgacggaaggcaagctggtagtaggtcacaaagggcacctggtttttgagctgatcggtgagggaaaggcttgtcactccggctacccgcaacacggtgtgaacgcgaatttcgccctgattgagacactgtcggattttgtccagacggagtttcctagctctagtctgctggggccgtcaacatttaacgttggcaagatcgaaggtggcgtatcctataatattgtgccggaaacgtcgaaagccctgtgtgcagtgcgcgttgcgacggacatggccggtatcaaaaagattgtgagcgataccgtagcacgtcactctaacgtccgcctggagttcaagtttgaatatccagagacactgctggaccatgatgttgaagggagttttaatgtgcgttcctgctgttatatgaaccgctccatcctggttgcccacggagacaatgagcaaattgaaatcgatgaactgatggagggagtacgcgcctataaaaagctgacaatgcacgccctgaactcagcccgctaa
Tcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgc(配列番号10)
プロモーターおよびオペレーター配列
Gagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcatgacacaggaaacagaac(配列番号11)
Maskgregehpsvtlfrqylrirtvqpepdygaavafleerarqlglgcqkvewpghwtvltwpgtnptlssillnshtdwpvfkehwshdpfeg&dadgyiygrgaqdmkcvsiqyleavrrlkveghhfprtihmtfvpdeevgghqgmelfvkrpefqalragfaldeglasptdaftvfyserspwwlrvtstgkpghgsrf[iota]edtaaeklhkvinsilafrekekqrlqsnqlkpgavtsvnltmleggvaynwpatmsacfdfrvapdvdlkafeeqlqswcqaagegvtfefvqkwmetqvtstddsdpwwaafsgvflcdmklaleleicpastdaryiraagvpalgfspmnhtpvllhdhderlheavflrgvdiytqllsalasvpalpses
atggcgagcaaaggccgtgaaggtgagcatccgtctgtgaccctgtttcgccagtatctgcgtattcgcacggttcagcctgaaccggattacggagcagctgtggctttcctggaggaacgcgctcgtcagctgggtctgggttgccaaaaggtagaagttgtcccagggcacgtcgtaactgtactgacttggcctggaacgaatccgaccctgagttcaatcctgctgaactcccatacagatgtagtgccagtgttcaaggaacattggagtcacgaccctttcgaagggtttaaagatgccgatggctatatttacggtcgtggggcacaggacatgaagtgtgtatccattcaatatctggaagctgttcgccgtctgaaagttgaagggcaccactttccacgcactattcacatgactttcgtgcctgacgaggaagtcgggggtcaccaaggtatggaactgttcgtaaaacgccctgagtttcaggcactgcgtgcgggttttgctctggacgagggtctggcgagcccgacagacgcgtttaccgtgttttacagtgaacgttcgccttggtggctgcgcgttacttccacaggtaagccggggcacggctcgcgtttcatcgaggatacagccgctgaaaagctgcacaaagttattaatagcatcctggcctttcgcgagaaggaaaagcaacgtctgcagagcaaccagctgaaaccgggtgcggtcactagcgtgaatctgactatgctggaggggggtgtcgcctataacgttgtgccggcaactatgagcgcatgcttcgactttcgcgtagctccggatgttgacctgaaagccttcgaagaacaactgcagagctggtgtcaagcagcgggagaaggtgtaacctttgagttcgtccagaaatggatggaaacacaggttacctcgactgatgatagcgatccttggtgggcagccttttctggtgtgttcaaagatatgaagctggcgctggaactggaaatctgcccagcgagtacagacgctcgttacatccgcgccgcaggcgtaccagccctgggtttttcaccgatgaatcacacgccggtcctgctgcatgatcacgatgagcgcctgcatgaggcagttttcctgcgcggcgtcgacatttatacccaactgctgagtgcactggcttctgttcctgcgctgcca tcggaatca
Tcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgc(配列番号10)
発酵条件下でのメチオニン生産
実質的な量の目的代謝産物を生産した株を、リン酸飢餓を伴う流加戦略を用い、2.5L発酵槽(Pierre Guerin)での生産条件下で試験した。
により計算した。
細胞外のメチオニン濃度はOPA/FMOC誘導体化後にHPLCにより定量した。N−アセチル−メチオニン濃度および残留グルコース濃度は、屈折率測定検出とともにHPLCを用いて分析した。N−プロピオニル−メチオニン濃度はシリル化後にGC−MSにより測定し、N−アセチル−メチオニン当量として表した。
消費グルコースt=[グルコース]0 *V0+注入グルコース−[グルコース]残留*Vt
発酵培地へのアミノ酸アシラーゼ添加による培養条件の適合
N−アセチル−メチオニンをメチオニンおよび酢酸塩に変換するために、160UのN−アミノ酸アシラーゼ(ブタ腎臓、Sigma)を、株1の発酵後(上記のように実施)の200μlの発酵液に加えた。反応混合物を37℃で2時間インキュベートした。次に、メチオニン濃度およびN−アセチル−メチオニン濃度を上記のように測定した。この酵素処理により、75〜95%のN−アセチル−メチオニンがメチオニンに変換した。
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Claims (19)
- 発酵プロセスにおいてメチオニンまたはその前駆体を生産するための方法であって、下記の工程:
炭素源、硫黄源および窒素源を含んでなる適切な培養培地中で改変微生物を培養する工程;および
該培養培地からメチオニンおよび/またはその誘導体を回収する工程
を含んでなり、
N−アシルメチオニンの蓄積が非改変微生物および/または方法と比較して低減される、方法。 - 蓄積が低減されるN−アシルメチオニンが下記の群:N−アセチル−メチオニン、N−プロピオニル−メチオニン、N−ブチリル−メチオニンおよびそれらの組合せの中から選択される、請求項1に記載の方法。
- N−アシルメチオニンの蓄積の低減が、下記の改変:
少なくとも1つのメチオニントランスアシラーゼ酵素の発現の減衰、および/または
少なくとも1つのメチオニン特異的アミノアシラーゼの発現または発現の増強、および/または
培養条件の変更
の1つにより達成される、請求項1に記載の方法。 - 発現が減衰されるメチオニントランスアシラーゼ酵素が、yncA、argA、yjdJ、yfaP、yedL、yjhQおよびそれらの組合せの中から選択される遺伝子によりコードされる、請求項3に記載の方法。
- 発現が減衰されるメチオニントランスアシラーゼ酵素が遺伝子yncAによりコードされる、請求項4に記載の方法。
- N−アシル−メチオニンの生産が、
a.コウジカビN−アシルアミノ酸アシラーゼ
b.ブタN−アシルアミノ酸アシラーゼ
c.argE遺伝子によりコードされるアセチルオルニチンデアセチラーゼ
の中から選択される、少なくとも1つの天然または異種N−アシル−L−アミノ酸アミドヒドロラーゼ酵素を微生物に発現させることにより低減される、請求項3に記載の方法。 - N−アシル−メチオニンの生産が、pH、酸素供給および/または温度の中から選択される培養条件を適合させること、または培地にN−アシルアミノ酸アシラーゼを添加することにより低減される、請求項3に記載の方法。
- N−アシル−メチオニンの生産が、
a)メチオニンN−アシルトランスフェラーゼ酵素をコードする下記遺伝子:yncA、argA、yjdJ、yfaP、yedL、yjhQの少なくとも1つの発現を減衰すること、および
b)
a.コウジカビN−アシルアミノ酸アシラーゼ
b.ブタN−アシルアミノ酸アシラーゼ
c.argE遺伝子によりコードされるアシルオルニチンデアシラーゼ
などの少なくとも1つの天然または異種N−アシル−メチオニンデアシラーゼ酵素を発現させること
により低減される、請求項3に記載の方法。 - N−アシル−メチオニンの生産が、メチオニンN−アシルトランスフェラーゼ酵素をコードする下記遺伝子:yncA、argA、yjdJ、yfaP、yedL、yjhQの少なくとも1つの発現を減衰すること、およびpH、酸素供給および/または温度などのプロセス条件を適合させること、または培地にアミノ酸アシラーゼを添加することにより低減される、請求項3に記載の方法。
- N−アシル−メチオニンの生産が、
a.コウジカビN−アシルアミノ酸アシラーゼ
b.ブタN−アシルアミノ酸アシラーゼ
c.argE遺伝子によりコードされるアセチルオルニチンデアセチラーゼ
などの少なくとも1つの天然または異種N−アシル−メチオニンアシラーゼ酵素を発現させること、およびpH、酸素供給および/または温度などのプロセス条件を適合させること、または培地にアミノ酸アシラーゼを添加することにより低減される、請求項3に記載の方法。 - N−アシル−メチオニンの生産が、
メチオニンN−アシルトランスフェラーゼ酵素をコードする下記遺伝子:yncA、argA、yiiD、yhhY、yjdJ、yfaP、yedL、yjhQの少なくとも1つの発現を減衰すること、および
a.コウジカビN−アシルアミノ酸アシラーゼ
b.ブタN−アシルアミノ酸アシラーゼ
c.argE遺伝子によりコードされるアセチルオルニチンデアセチラーゼ
などの天然または異種N−アシル−アミノ酸アシラーゼ酵素の少なくとも1つを発現させること、および
pH、酸素供給および/または温度などの培養条件を適合させること、または培地にアミノ酸アシラーゼを添加すること
により低減される、請求項3に記載の方法。 - 培養培地中の硫黄源が、硫酸塩、チオ硫酸塩、硫化水素、ジチオン酸塩、亜ジチオン酸塩、亜硫酸塩、メチルメルカプタン、二硫化ジメチルまたはこれらの種々の供給源の組合せである、請求項1に記載の方法。
- 培養培地中の硫黄源が、硫酸塩もしくはチオ硫酸塩または両者の混合物である、請求項1に記載の方法。
- 炭素源が再生可能な供給原料に由来する、請求項1に記載の方法。
- 炭素源がグルコースまたはスクロースである、請求項1に記載の方法。
- 窒素源がアンモニウムまたはアンモニアの形態で供給される、請求項1に記載の方法。
- 任意に最終産物の一部または全量(0〜100%)に留まっている発酵液および/またはバイオマスの目的アミノ酸/成分を単離する工程を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 微生物が、リン酸塩および/またはカリウムに対して制限されているか、または飢餓状態である、請求項1に記載の方法。
- 請求項3に記載の改変を含んでなる、微生物。
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