CN102203270A - 产生甲硫氨酸而不产生n-酰基甲硫氨酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过在包含碳源和硫源的适当培养基中培养微生物产生甲硫氨酸或其衍生物的方法。所述微生物和/或所述培养基和/或所述工艺参数经修饰使得副产品N-酰基甲硫氨酸(NAM)的累积减少。还要求保护从发酵培养基分离甲硫氨酸或其衍生物。

Description

产生甲硫氨酸而不产生N-酰基甲硫氨酸
技术领域
本发明涉及通过在包含碳源和硫源的适当培养基中培养微生物产生甲硫氨酸或其衍生物的方法。所述微生物和/或所述培养基和/或所述工艺参数经修饰使得副产物N-酰基甲硫氨酸(NAM)的积累减少。还要求保护从发酵培养基分离甲硫氨酸或其衍生物。
背景技术
含硫化合物如半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸对于细胞代谢是至关重要的，且其在工业上被产生用作食物或饲料添加剂和药物。具体而言，不能由动物合成的甲硫氨酸(一种必需氨基酸)在许多人体机能中起重要作用。目前，D，L-甲硫氨酸是通过化学合成从丙烯醛、甲硫醇和氰化氢产生的。石油衍生前体丙烯醛和甲硫醇的价格增加连同甲硫氨酸的需求增加使得甲硫氨酸的微生物产生有吸引力。
在许多微生物中的L-甲硫氨酸合成途径是公知的(综述于Figge RM(2006)，ed Wendisch VF，Microbiol Monogr(5)Amino acid biosynthesis p164-185)。大肠杆菌(E.coli)和谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)甲硫氨酸生产株已描述于专利申请WO2005/111202、WO2007/077041、WO2007/012078和WO2007/135188。
通过发酵产生的甲硫氨酸需要从发酵液纯化。甲硫氨酸的划算的纯化依赖于使发酵液中的副产物的量最小化的生产株和生产方法。“副产物”来源于甲硫氨酸转化和/或降解途径。具体而言，这些产物是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)、硫代甲基核糖和N-酰基甲硫氨酸(NAM)如N-乙酰甲硫氨酸和N-丙酰甲硫氨酸。如在专利申请PCT/EP2007/060433中所示，大肠杆菌甲硫氨酸生产株产生N-乙酰甲硫氨酸。大肠杆菌还产生N-丙酰甲硫氨酸。
NAM的产生是不理想的，因为其减少甲硫氨酸产量并使得甲硫氨酸纯化更加困难。可通过在发酵运行最后添加NAM酰基酶将NAM转化为甲硫氨酸和乙酸，但这极大地增加了产物的成品。因此，必需减少或消除NAM在发酵运行过程中的累积。这需要对导致NAM累积的反应的良好理解。
甲硫氨酸的N端乙酰化作为共翻译过程是真核生物中最常见的蛋白质修饰之一。尽管如此，N端乙酰化酶产生N-乙酰甲硫氨酸的可能性不大(对于综述，参见Polevoda&Sherman 2000JBC 275，47，pp 36479-36482)，因为甲硫氨酸在甲硫氨酸产生细菌中表现为作为游离氨基酸而乙酰化，而在原核生物中作为共翻译过程的甲硫氨酸乙酰化是罕见的(Driessen等1985，CRC Crit.Rev.Biochem.18，281-325)。N-乙酰甲硫氨酸最可能是通过乙酰化游离L-甲硫氨酸获得的。已描述了可能能够乙酰化甲硫氨酸的N-乙酰化酶。例如，ArgA在大肠杆菌中编码N-乙酰谷氨酸合成酶(Marvil&Leisinger 1977 JBC252，10 pp.3295-3303)。
迄今为止，尚未知有能够催化N-乙酰甲硫氨酸、N-丙酰甲硫氨酸或其它具有更长酰基链的甲硫氨酸衍生物的生物合成产生的酶。因此，主要的甲硫氨酸-N-酰基转移酶活性的鉴定及其在甲硫氨酸产生微生物中的减弱对于减少NAM产生至关重要。
NAM累积还可通过将累积的NAM脱乙酰获得甲硫氨酸来减少。来自氨基酸的N-酰基基团的脱乙酰化已在细菌中得到阐明。例如，ArgE编码的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰酶具有广谱底物，并有效地将N-乙酰甲硫氨酸脱乙酰基(Javid-Majdd&Blanchard 2000 Biochemistry 39，1285-93)。因此，argE或其它氨基酸脱乙酰酶如大鼠肾酰基酶I(Giardina等2000Eur.J.Biochem.267，6249-55)，来自黑曲霉(Aspergillus niger)或猪肾的氨基酸酰基酶(Gentzen等.1980 Z.Naturforsch 35c，544-50)的过表达可减少NAM的累积。
因为NAM输出至细胞外空间，将NAM酰基酶输出至周质或细胞外空间可能是有利的。在大肠杆菌中已知几种输出系统允许输出至周质，例如系统TAT和Sec(综述于Manting&Driessen 2000Mol Microbiol 37，226-38，Choi&Lee 2004Appl.Microbiol.Biotechnol.64，625-635)。通过TAT或Sec途径的输出需要特定信号肽的存在。如果有利于输出至细胞外空间，可将目标蛋白融合于通常输出至培养基的载体蛋白，如OmpF或溶血素(Choi&Lee 2004 Appl.Microbiol.Biotechnol.64，625-635)。还可通过将所述蛋白融合于自转运蛋白(autotransporter protein)的输出所需的蛋白域如来自淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)的IgA1或来自大肠杆菌的AIDA-I来将其输出至培养基或展示于细胞表面。还可将蛋白通过双伴侣途径(two-partner pathway)或噬菌体展示来输出(Jacob-Dubuisson等2004 Biochim et Biophys Act 1694235-257，José&Meyer 2007Microbiol and Molecul Biol Rev 71，600-19)。也显示工艺设计影响某些蛋白的输出(Shokri等2003Appl Microbiol Biotechnol 60，654-64)。
发明内容
本申请人解决了减少甲硫氨酸产生菌株中副产物N-酰基甲硫氨酸(NAM)累积的问题。
本发明人鉴定出大肠杆菌中基因yncA编码主要的甲硫氨酸N-酰基转移酶活性(MNAT)，其催化甲硫氨酸至NAM的转化。
本文中公开了修饰的微生物，其呈现基因yncA的表达的减弱，因此减少了NAM的产生。
本发明人还显示脱酰基酶如米曲霉(Aspergillus oryzae)氨基酸酰基酶或猪肾氨基酸酰基酶(其将NAM转化为甲硫氨酸)的过表达导致NAM量的减少。优选地，将所述脱酰基酶输出至周质或进入细胞外空间。
在另一个方面，将培养条件适应于获得NAM产生和/或累积的减少。
这三种减少NAM累积的手段可单独施用或组合施用来减少NAM的累积。
葡萄糖用作模式底物，而重组大肠杆菌作为模式生物，但本发明并不限于这些特征。
因此，本发明的目标是提供微生物，其中主要MNAT(甲硫氨酸N-酰基转移酶)编码基因的表达已减弱，优选相应的基因缺失和/或过表达同源或异源NAM脱酰基酶，以减少NAM的累积。
该具有减少的NAM产生和/或累积的微生物显示甲硫氨酸产生/碳源得率的改进。
发明详述
本发明涉及在发酵方法中产生甲硫氨酸、其衍生物或前体的方法，包括下述步骤：
-在包含碳源、硫源和氮源的适当培养基中培养修饰的微生物，和
-从所述培养基回收甲硫氨酸和/或其衍生物，
其中与未经修饰的微生物或方法相比，所述微生物或方法经修饰而减少副产物N-酰基甲硫氨酸的累积。
在本发明的一个具体方面，其累积减少的N-酰基甲硫氨酸选自下组：N-乙酰甲硫氨酸、N-丙酰甲硫氨酸、N-丁酰甲硫氨酸及其组合。
副产物N-酰基甲硫氨酸的累积可通过下述修饰至少之一获得：
-在微生物中减弱至少一种甲硫氨酸N-酰基转移酶(即，转酰基酶)的表达，和/或
-在微生物中表达至少一种甲硫氨酸特异性氨基酰基酶(或增强其表达)；和/或
-变化培养条件如pH、加氧温度和/或将NAM酰基酶添加入培养基，
及其组合。
根据本发明术语“培养”、“发酵”或“发酵方法”可互换使用，表示细菌在含有简单碳源的适当生长培养基上的生长。
“适当培养基”是适于微生物培养和生长的培养基。上述培养基在微生物发酵领域是公知的，取决于待培养的微生物。
短语“从培养基回收甲硫氨酸和/或其衍生物”指回收甲硫氨酸以及可能的话SAM和NAM以及所有其它可能有用的衍生物的行为。
术语“微生物”指细菌、酵母或真菌。优选地，所述微生物选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)和棒杆菌科(Corynebacteriaceae)。更优选地，所述微生物是埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、沙门氏菌属(Salmonella)或棒杆菌属(Corynebacterium)的菌种。甚至更优选地，所述微生物是菌种大肠杆菌(Escherichia coli)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
术语“经修饰的微生物”表示经遗传修饰的微生物，修饰的目标是减少发酵液中NAM的累积。本领域技术人员知道如何调节具体基因的表达。通常的修饰包括用遗传元件(genetic element)转化微生物，包括基因缺失、基因替换、启动子修饰和引入载体以供表达异源基因。
本发明人显示了NAM是通过甲硫氨酸的酰基化形成的，并鉴定出基因yncA作为主要的NAM产生酶。也称作大肠杆菌基因b1448的yncA已在专利申请WO2001070776中提及。其为由调节子Mar诱导的一组基因的一部分，涉及多药抗性。
氨基酸酰基酶(EC 3.5.1.14)，也称作脱乙酰酶，催化酰基氨基酸的水解裂解以产生游离氨基酸和对应于酰基剩余物的羧酸(carbonic acid)。更具体而言，N-酰基甲硫氨酸酰基酶催化NAM至甲硫氨酸及其相应羧酸的反应。
术语“N-酰基甲硫氨酸”指N-甲酰甲硫氨酸、N-乙酰甲硫氨酸、N-丙酰甲硫氨酸、N-丁酰甲硫氨酸以及一般而言，任何包含衍生自任何缺少羟基官能的羧酸的官能团的甲硫氨酸衍生物。
为了测量N-乙酰甲硫氨酸的累积，在发酵液中使用折射分析HPLC使用N-乙酰甲硫氨酸(Sigma，Ref01310)作为标准来确定N-乙酰甲硫氨酸的量。在发酵液中通过GC-MS使用N-乙酰甲硫氨酸作为标准来确定N-丙酰甲硫氨酸。
NAM累积应减少至少20％，优选50％，更优选80％且甚至更优选95％的在使用未修饰的生物或在未修饰的方法中积累的量。
根据本发明术语“碳源”表示任何本领域技术人员可用于支持微生物正常生长的碳源，其可为己糖(如葡萄糖、半乳糖或乳糖)、戊糖、单糖、二糖(如蔗糖、纤维二糖或麦芽糖)、寡糖、糖蜜、淀粉或其衍生物、半纤维素、甘油及其组合。特别优选的碳源是葡萄糖。另一个优选的碳源是蔗糖。
在本发明的一个具体实施方案中，碳源来自可再生原料。可再生原料定义为某些工业方法所需的原材料，其可在短的间隔内以足够量再生以允许其转化为所需产物。
术语氮源对应于铵盐或氨气。氮源以铵盐或氨(ammoniac)的形式供应。
用于发酵产生L-甲硫氨酸、其前体或自其衍生的化合物的硫源可为下述任何硫源：硫酸盐(sulfate)、硫代硫酸盐(thiosulfate)、硫化氢(hydrogen sulfide)、连二硫酸盐(dithionate)、连二亚硫酸盐(dithionite)、亚硫酸盐(sulfite)、甲硫醇(methylmercaptan)、二甲基二硫化物(dimethyldisulfide)或其组合。
在本发明的一个优选实施方案中，所述硫源是硫酸盐和/或硫代硫酸盐。
发酵通常在具有适应于所用微生物的适当培养基的发酵罐中进行，所述培养基含有至少一种简单碳源，若需要，还含有用于产生代谢物的共底物。
本领域技术人员能够限定用于本发明微生物的培养条件。具体而言，细菌在20℃至55℃的温度，优选在25℃至40℃的温度，且最优选对于谷氨酸棒杆菌约30℃而对于大肠杆菌约37℃的温度进行发酵。
作为用于大肠杆菌的已知培养基的实例，所述培养基可与M9培养基(Anderson，1946，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32：120-128)、M63培养基(Miller，1992；A Short Course in Bacterial Genetics：A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)或如Schaefer等(1999)限定的培养基具有相同或相似的组成。
作为用于谷氨酸棒杆菌的已知培养基的实例，所述培养基可与BMCG培养基(Liebl等，1989，Appl.Microbiol.Biotechnol.32：205-210)或如Riedel等(2001，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.3：573-583)所述的培养基具有相同或相似的组成。
在本发明的一个具体实施方案中，N-酰基甲硫氨酸的产生通过减弱至少一种甲硫氨酸转酰基酶来减少。甲硫氨酸转酰基酶也称为甲硫氨酸N-酰基转移酶(MNAT)。argA编码具有推定的甲硫氨酸转乙酰酶活性的酶。本发明人已从具有argA缺失的大肠杆菌菌株纯化了MNAT活性，对该纯化蛋白进行了测序并显示所述纯化蛋白YncA具有MNAT活性(专利申请PCT/EP2008/060999)。基因yncA的表达的减弱消除了大量的残留MNAT活性，导致NAM特别是化合物N-乙酰甲硫氨酸和N-丙酰甲硫氨酸的产生的极大减少。在本发明一个优选实施方案中，YncA完全从大肠杆菌基因组缺失。
已鉴定了其它具有较低活性的N-酰基转移酶，其使得当其减弱时能够获得减少的NAM产生；这些酶由下述基因编码：yjdJ、yfaP、yedL、yjhQ。任何这些描述的甲硫氨酸N-酰基转移酶可单独或与其它组合减弱。
根据本发明，术语“减弱基因”或“基因表达的减弱”表示基因表达的部分或完全抑制，然后可称其为“减弱的”。该表达抑制可为基因表达的抑制，基因表达所需的启动子区域的插入或全部或部分缺失，或由较弱的天然或人工启动子替换野生型启动子。优选地，基因减弱基本上是该基因的完全缺失，其可由便于鉴定、分离和纯化本发明的菌株的选择性标记基因所替代。基因优选通过同源重组技术来失活(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.(2000)“One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6640-6645)。
在本发明的另一个具体实施方案中，N-酰基甲硫氨酸的累积可通过在微生物中表达同源或异源甲硫氨酸特异性氨基酰基酶来减少，如：
曲霉属(Aspergillus)N-酰基氨基酸酰基酶
猪N-酰基氨基酸酰基酶
编码乙酰鸟氨酸脱乙酰酶的大肠杆菌argE、其也作用于N-乙酰甲硫氨酸。
甲硫氨酸特异性氨基酰基酶的增加表达增加了NAM至甲硫氨酸的转化率，同时产生一分子的相应的羧酸如乙酸、丙酸或丁酸。通过过表达基因acs、pta-ackA或编码乙醛酸支路的基因而利于消耗乙酸也是本发明的一部分。
在该上下文中，术语“增强的”或“过表达的”描述了由相应DNA编码的酶活性的胞内活性的增加，例如通过增加基因的拷贝数，使用更强的启动子或使用具有增加活性的等位基因，以及可能地组合这些方法来进行。
术语“增加的表达”、“增强的表达”或“过表达”在本文中可互换使用，并具有类似含意。
为了增加基因表达，其在染色体上或染色体外编码。在染色体上，可具有通过本领域专家已知的重组方法可引入基因组的一个或几个拷贝。染色体外基因可由不同类型的质粒携带，其由于它们的复制起点不同因而其细胞中的拷贝数不同。其可作为1-5个拷贝，约20个或多至500个拷贝存在，对应于具有严格复制的低拷贝数质粒(pSC101、RK2)，低拷贝数质粒(pACYC、pRSF1010)或高拷贝数质粒(pSK bluescript II)。
在本发明的一个优选实施方案中，基因可使用具有不同强度的启动子表达，其可为诱导型的。这些启动子可为同源的或异源的。本领域技术人员知道何种启动子最为方便，例如，启动子Ptrc、Ptac、Plac或λ启动子cI广为使用。
酶的表达可通过稳定化或脱稳定化其相应的信使RNA(Carrier和Keasling(1998)Biotechnol.Prog.15，58-64)或蛋白(例如GST标记，Amersham Biosciences)的元件增强或减少。
本发明还涉及含有根据本发明待增强的基因的一个或多个等位基因的微生物。
所有用于转化微生物的技术，以及用于增强本发明蛋白质产生的调节元件在本领域是公知的，并可从参考文献中获得，包括申请人自己关于在多种微生物中生物合成途径修饰的专利申请，包括WO2008/052973、WO2008/052595、WO2008/040387、WO2007/144346、WO2007/141316、WO2007/077041、WO2007/017710、WO2006/082254、WO2006/082252、WO2005/111202、WO2005/073364、WO2005/047498、WO2004/076659，其内容通过提述并入本文。
N-酰基甲硫氨酸酰基酶在胞内空间(intracellular space)中表达，并可留在胞内空间内或输出至周质或输出至细胞外空间。本领域专家能够鉴定出将所述蛋白靶向周质的手段。输出还可基于将所述N-乙酰甲硫氨酸酰基酶融合于像OmpF的蛋白，通过噬菌体展示或通过蛋白输出系统如双伴侣途径或自主转运(autotransport)进行。在本发明的一个优选实施方案中，将NAM酰基酶输出至周质或胞外区室(excellular compartment)以避免NAM和甲硫氨酸之间的无效循环。
在本发明的另一个实施方案中，发明人调适(adapt)发酵工艺的参数(即培养条件)以减少NAM的产生。这是通过改变发酵液的pH、修饰加氧(oxygenation)或底物补料参数来实现的。另一个选项是将NAM特异性酰基酶添加入培养基。
在一个实施方案中，发酵参数的改变并不包括使微生物对无机底物如磷酸盐、钾、镁饥饿。
这三种调节NAM累积的手段可单独或与其它一种或两种手段组合使用。
相应地，MNAT活性的减弱是通过减弱下述基因的表达来获得的：yncA和/或argA和/或yjdJ、yfaP、yedL、yjhQ，这些基因编码具有甲硫氨酸-N-酰基转移酶活性的酶。该减弱可与N-酰基-甲硫氨酸脱酰基酶如曲霉属N-氨基酸酰基酶、猪N-氨基酸酰基酶或由argE基因编码的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶的增加表达组合。
类似地，如上所述至少一种MNAT酶的减弱可与调适工艺参数如pH、加氧、温度和/或通过向发酵液添加NAM酰基酶相组合，一起使得NAM累积减少。
类似地，NAM酰基酶的表达可与工艺的调适组合。两种手段的细节已如上所述。
最后，可组合所有三种手段：MNAT活性的减弱，NAM酰基酶的表达增加和调适工艺条件。
在本发明的说明书中，使用大肠杆菌中对应基因的命名来识别基因和蛋白。然而，且除非另行指明，根据本发明这些命名的使用具有更加一般的含意，并涵盖其它生物更具体而言其它微生物中所有的相应基因和蛋白。
PFAM(比对和隐藏Markov模型的蛋白质家族数据库(protein families database of alignments and hidden Markov models)；http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)代表蛋白序列比对的大集合。每个PFAM使得能够显现多重比对、发现蛋白质域、评价生物间的分布、访问其它数据库并显现已知的蛋白结构。
COG(蛋白质直向同源组的簇(clusters of orthologous groups of proteins)；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)是通过将来自代表主要系统发生系的完全测序的基因组的蛋白序列相比较而获得的。每个COG根据至少三个系来限定，其使得能够鉴定之前保守的域。
鉴定同源序列及其同源性百分比的手段对于本领域技术人员是公知的，并包括特别是BLAST程序，其可从网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/用该网站所示的缺省参数来使用。可使用例如程序CLUSTALW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)或MULTALIN(http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html)用这些网站所示的缺省参数来发掘(exploit)(例如比对)获得的序列。
使用GenBank给出的用于已知基因的参照，本领域技术人员能够确定其它生物、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中的等同基因。该常规工作是使用通过与来源于其它微生物的基因进行序列比对，并涉及简并探针克隆另一种生物中相应基因而确定的共同序列来有利地进行的。这些分子生物学常规方法对于本领域技术人员是公知的，并记载于例如Sambrook等(1989 Molecular Cloning：a Laboratory Manual.第2版.Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，New York.)。
本发明还涉及如上所述的微生物。具有N-酰基甲硫氨酸的累积和/或产生减少的微生物对于高产量地产生甲硫氨酸是特别有用的。优选地，本发明的微生物在用于本发明的方法之前已经是甲硫氨酸的高生产者(high-producer)。
甲硫氨酸的有效产生需要优化甲硫氨酸特异性途径和几种提供前体的途径。甲硫氨酸生产株已描述于专利申请WO 2005/111202、WO2007/077041和PCT/EP2007/060433，并通过提述并入本文。
过表达对其抑制剂SAM和甲硫氨酸具有减少的反馈敏感度的高丝氨酸琥珀酰转移酶等位基因的甲硫氨酸生产株描述于专利申请WO 2005/111202。该申请还描述了这些等位基因与甲硫氨酸阻抑物MetJ(GenBank 1790373)的缺失的组合，MetJ如专利申请JP 2000/157267中所示负责甲硫氨酸调节子的下调。此外，两种修饰与过表达天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶的组合描述于专利申请WO 2005/111202。
WO 2007/077041中表明了基因cysE、metH和metF的过表达。
如专利申请WO 2004/076659(其通过提述并入本文)所述，甲硫氨酸的产生还可通过使用优选或排他地使用H2S并因此从O-琥珀酰高丝氨酸脱氢酶产生高丝氨酸的改变的metB等位基因来增加。
甲硫氨酸产生的进一步增加还可如专利申请PCT/EP2007/060433中所述通过缺失基因pykA、pykF和/或purU来获得。该申请还描述了其中操纵子cysP UWAM、cysJIH和gcvTHP以及基因serA、serB、serC、lpd和glyA过表达的甲硫氨酸生产株。
在大肠杆菌中，可增加其它酶的活性以增加甲硫氨酸的产生(之后为其登录号和相应多肽的功能)：
可增加这些涉及硫同化的基因的表达：
Figure BDA0000056814640000101
可通过表达下述来增强添补反应(anaplerotic reaction)：
ppc    1790393    磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
pps    1787994    磷酸烯醇式丙酮酸合酶
可通过过表达下述来增强乙酸消耗反应：
acs    1790505    乙酰CoA合成酶
此外，可减弱降解甲硫氨酸途径(参加下述列表)中或从甲硫氨酸产生途径偏离的基因的表达或将所述基因缺失。
在该上下文中，减弱描述了通过方法如减少其表达、减少酶稳定性、增加其降解和/或其它本领域专家已知的方案来减少酶的胞内活性。
Figure BDA0000056814640000102
Figure BDA0000056814640000111
本发明还涉及用于产生L-甲硫氨酸、其前体或其衍生化合物的方法，包括发酵上述产生甲硫氨酸的微生物，浓缩甲硫氨酸、其前体或衍生物以及分离发酵液中的所需产物。
本领域技术人员能够限定用于本发明的微生物的培养条件。具体而言细菌在20℃至55℃，优选25℃至40℃，特别是对于谷氨酸棒杆菌约30℃而对于大肠杆菌约37℃的温度发酵。
发酵通常是在发酵罐中用适应于所用细菌的已知限定组成的无机培养基已经进行，包含至少一种简单碳源，以及若需要，还包含产生代谢物所需的共底物。
具体而言，用于大肠杆菌的无机培养基可与M9培养基(Anderson，1946，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32：120-128)、M63培养基(Miller，1992；A Short Course in Bacterial Genetics：A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)或如Schaefer等(1999)限定的培养基具有相同或相似的组成。
类似地，用于谷氨酸棒杆菌的无机培养基可与BMCG培养基(Liebl等，1989，Appl.Microbiol.Biotechnol.32：205-210)或如Riedel等所述的培养基(2001，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.3：573-583)具有相同或相似的组成。可补充培养基以补偿由突变引入的营养缺陷型(auxotrophies)。
在发酵之后，回收并(若需要的话)纯化L-甲硫氨酸，其前体或其来源的化合物。在培养基中用于回收和纯化产生的化合物如甲硫氨酸的方法对于本领域技术人员而言是公知的。
任选地，可在纯化发酵产物过程中消除0至100％，优选至少90％，更优选95％，甚至更优选至少99％的生物质。
在本发明的一个优选实施方案中，用于产生甲硫氨酸的方法包括分离发酵液中所需的氨基酸/组分和/或任选地以部分或总量(0-100％)残留于终产物中的生物质的步骤。
减少NAM量的手段可与对磷酸盐和/或钾的限制或饥饿组合。本领域专家能够确定所选生物生长所需的磷酸盐或钾的量。
“对生物进行无机底物的限制”限定了其中微生物生长受所供应的无机化学物的量控制并仍允许弱生长的条件。这些底物的实例为磷酸盐、钾、镁或其组合。
使微生物对无机底物饥饿限定了其中微生物生长由于缺乏无机底物而完全停止的条件。这些底物的实例为磷酸盐、钾、镁或其组合。
本发明还涉及如前所述的微生物，其优化用于发酵产生甲硫氨酸，而具有减少的NAM累积，即与未经修饰的微生物相比累积较低量的NAM，并涉及包含上述遗传修饰的微生物。
实施例：
实施例1
构建菌株MG1655 metA＊11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metFPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔpykAΔpykF Ptrc09-gcvTHP ΔpurU ΔyncA::Km(pME101-thrA＊1-cysE-PgapA-metA＊11)(pCC1BAC-serB-serA-serC)
为了在甲硫氨酸生产株中缺失推定的酰基转移酶yncA基因，我们使用了Keio突变体集合(Keio mutant collection)的大肠杆菌BW25113ΔyncA::Km菌株(Baba等，2006)。通过P1噬菌体转导(见下)将ΔyncA::Km缺失从BW25113ΔyncA::Km菌株转移至菌株MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ΔpykA ΔpykF ΔpurU(描述于PCT/EP2007/060433)。选择卡那霉素抗性转化体并通过PCR分析用下述限定的寡核苷酸YncAF和YncAR(参照序列见于网站http://ecogene.org/)验证抗性盒的插入。该菌株命名为MG1655 metA*11ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ΔpykA ΔpykF ΔpurU ΔyncA::Km。
YncAF：GTTTGCCGATTTGCCCCACCG(与yncA区从1517564至1517544同源)(SEQ ID NO：01)
YncAR：CGCCCATCACGGTCGCAAGC(与yncA区从1515827至1515846同源)(SEQ ID NO：02)
然后，将质粒pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11和pCC 1BAC-serB-serA-serC引入菌株MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ΔpykAΔpykF ΔpurU ΔyncA::Km，得到MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ΔpykA ΔpykF ΔpurU ΔyncA::Km (pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)(pCC1BAC-serB-serA-serC)。
制备噬菌体裂解液P1：
-将补充卡那霉素(50μg/ml)、葡萄糖(0.2％)和CaCl2(5mM)的10ml LB用100μl菌株BW25113ΔyncA::Km的过夜培养物接种。在37℃振荡温育30分钟。
-将100μl制备的噬菌体裂解液P1添加至菌株BW25113ΔyncA::Km(约1.109个噬菌体/ml)。
-在37℃振荡3小时直至所有细胞裂解。
-添加200μl氯仿并涡旋。
-以4500g离心10分钟以消除细胞碎片。
-将上清转移至灭菌试管并添加200μl氯仿。
-将裂解液储藏于4℃。
转导：
-将5ml菌株MG1655 met*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHPΔpykAΔpykF ΔpurU在LB培养基中的过夜培养物以1500g离心10分钟。
-将细胞沉淀悬浮于2.5ml的10mM MgSO4和5mM CaCl2。
-对照试管：100μl细胞
100μl菌株BW25113ΔyncA::Km的噬菌体P1
-测试试管：100μl细胞+100μl菌株BW25113ΔyncA::Km的噬菌体P1
-在30℃温育30分钟而不振荡。
-在每个试管中添加100μl的1M柠檬酸钠并涡旋。
-添加1ml LB。
-在37℃振荡温育1小时。
-在以7000rpm将管离心3分钟之后，在补充卡那霉素(50μg/ml)的LB培养皿上涂布。
-在37℃温育过夜。
验证菌株：
选择卡那霉素抗性转化体，并通过PCR分析用上述限定的寡核苷酸YncAF和YncAR验证ΔyncA::Km修饰的存在。
构建菌株MG1655 metA＊11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metFPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔpykA ΔpykF Ptrc09-gcvTHP ΔpurUΔyncA::Km ΔargA::Cm
为了失活氨基酸乙酰转移酶argA基因，使用了Datsenko&Wanner(2000)所述的同源重组策略。该策略使得能够插入氯霉素抗性盒而缺失大部分相关基因。为此，使用了两种寡核苷酸，DargAF和DargAR(参照序列见于网站http://ecogene.org/)：
DargAF(SEQ ID NO：03)
gtggtaaaggaacgtaaaaccgagttggtcgagggattccgccattcggttccctatatcaatacccaccgg ggaaaaacgTGTAGGCTGGAGCTGCTT
具有
-与argA区从2947264至2947344同源的区(小写)，
-用于扩增氯霉素抗性盒的区(大写)(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97：6640-6645中的参照序列)。
DargAR(SEQ ID NO：04)
ccctaaatccgccatcaacactttggatttacgctggtagttgtacaactgctttttgctctcgggcagtaaatca atatccCATATGAATATCCTCCT
具有
-与argA区从2948592至2948511同源的区(小写)，
-用于扩增氯霉素抗性盒的区(大写)(Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.，2000，PNAS，97：6640-6645中的参照序列)。
将寡核苷酸DargAF和DargAR用于从质粒pKD3扩增氯霉素抗性盒。所得的PCR产物通过电穿孔引入菌株MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ΔpykA ΔpykFΔpurU ΔyncA::Km(pKD46)，其中表达的Red重组酶使得同源重组成为可能。选择氯霉素抗性转化体，并通过PCR分析用下述限定的寡核苷酸ArgAF和ArgAR验证抗性盒的插入(参照序列见于网站http://ecogene.org/)。获得的菌株命名为MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ΔpykA ΔpykF ΔpurU ΔyncA::KmΔargA::Cm。
ArgAF：cagctgacgatttgattcc(与argA区从2946859至2946877同源)(SEQ ID NO：05)
ArgAR：gggttgtttaatggcgatatcgg(与argA区从2949010至2948988同源)(SEQ ID NO 06)
构建菌株MG1655 metA＊11ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔpykA ΔpykF Ptrc09-gcvTHP ΔpurU ΔyncA ΔargA
为了消除氯霉素和卡那霉素抗性盒，将携带作用于氯霉素和卡那霉素抗性盒FRT位点的重组酶FLP的pCP20质粒通过电穿孔引入重组菌株MG1655metA*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ΔpykA ΔpykF ΔpurU ΔyncA::Km ΔargA::Cm。在一系列42℃的培养之后，通过PCR分析用上述的寡核苷酸YncAF/YncAR和ArgAF/ArgAR验证氯霉素和卡那霉素抗性盒的丧失。获得的菌株命名为MG1655 metA*11ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAMPtrcF-cysJIH ΔpykA ΔpykF Ptrc09-gcvTHP ΔpurU ΔyncA ΔargA。
构建菌株MG1655metA＊11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metFPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔpykA ΔpykF Ptrc09-gcvTHP ΔpurU ΔyncA ΔargA(pME 101-thrA＊1-cysE-PgapA-metA＊11)(pCC 1BAC-serB-serA-serC)
将质粒pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 and pCC1BAC-serB-serA-serC引入菌株MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ΔpykAΔpykF ΔpurU ΔyncA ΔargA得到MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc-metH Ptrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP ΔpykAΔpykF ΔpurU ΔyncA ΔargA(pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)(pCC1BAC-serB-serA-serC)。
构建表达氨基酸酰基酶活性的合成基因
为了将NAM转化为甲硫氨酸，在产生甲硫氨酸的微生物中表达NAM酰基酶(氨基酸酰基酶)。
为此，由Codon Devices(www.codondevices.com/)公司制备了猪和曲霉属acy1氨基酸酰基酶基因的合成基因。所述基因的密码子选择和GC含量根据供应商的基质(matrix)适应于大肠杆菌。下面显示了所有具有经优化的密码子选择的序列。合成基因的表达是由操纵基因序列调控的Ptrc启动子驱动的。在基因下游添加了转录终止子。将构建体克隆入pUC19载体，并通过测序来验证，然后将其转化入甲硫氨酸产生菌株。
曲霉属acy1氨基酰基酶
启动子和操纵基因序列
Gagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcatgacacag gaaacagacc(SEQ ID NO：07)
曲霉属acy1氨基酰基酶序列(XP_001827519.1)(SEQ ID NO：8)
Mttstvvsllsslmqtqstseheqelahflddhltnlgytverlpiaegstrenvyaylgtqrktrvcltshldtvppyiplriegstiygrgacddkgp maaqicaleelraegavkegdvgllfvvgeekggpgmiaanhqdlsfegvifgeptegklvvghkghlvfeligegkachsgypqhgvnanfalietlsd fvqtefpsssllgpstfnvgkieggvsynivpetskalcavrvatdmagikkivsdtvarhsnvrlefkfeypetlldhdvegsfnvrsccymnrsilva
(SEQ ID NO：9)
atgaccacgtcgactgtcgtttctctgctgagttcactgatgcagacacaatccacctcggaacacgagcaggaactggcgcactttctggatgaccatctgacaaacctgggatatactgtcgagcgtctgccgattgcagaagggtccactcgcgagaacgtctacgcatatctggggacccaacgtaaaacgcgtgtatgtctgacctctcacctggatactgttccgccgtacatcccgctgcgtattgagggcagtacaatctatggtcgcggggcttgtgacgataagggcccgatggctgcacagatctgcgctctggaagagctgcgtgctgaaggtgcggtcaaagaaggcgacgtaggtctgctgttcgtcgttggggaggaaaaaggcggtccgggcatgatcgcagcgaaccaccaggatctgtcttttgaaggggttatttttggggaaccgacggaaggcaagctggtagtaggtcacaaagggcacctggtttttgagctgatcggtgagggaaaggcttgtcactccggctacccgcaacacggtgtgaacgcgaatttcgccctgattgagacactgtcggattttgtccagacggagtttcctagctctagtctgctggggccgtcaacatttaacgttggcaagatcgaaggtggcgtatcctataatattgtgccggaaacgtcgaaagccctgtgtgcagtgcgcgttgcgacggacatggccggtatcaaaaagattgtgagcgataccgtagcacgtcactctaacgtccgcctggagttcaagtttgaatatccagagacactgctggaccatgatgttgaagggagttttaatgtgcgttcctgctgttatatgaaccgctccatcctggttgcccacggagacaatgagcaaattgaaatcgatgaactgatggagggagtacgcgcctataaaaagctgacaatgcacgccctgaactcagcccgctaa
转录终止子序列：(参照：Harrington K.J.，Laughlin R.B.和Liang S.Proc Natl Acad Sci U S A.2001 Apr 24；98(9)：5019-24)
Tcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgc(SEQ ID NO：10)
猪acy1氨基酰基酶
启动子和操纵基因序列
Gagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggatacaatttcatgacacag gaaacagaac(SEQ ID NO：11)
猪acy1氨基酰基酶序列(NP_999061.1)(SEQ ID NO：12)
Maskgregehpsvtlfrqylrirtvqpepdygaavafeerarqlglgcqkvevvpghvvtvltwpgtnp tlssillnshtdvvpvfkehwshdpfegfkdadgyiygrgaqdmkcvsiqyleavrrlkveghhfprtihmtfvpdeevgghqgmelfvkrpefqalragfaldeglasptdaftvfyserspwwlrvtstgkpghgsrfiedtaaeklhkvinsilafrekekqrlqsnqlkpgavtsvnltmleggvaynvvpatmsacfdfrvapdvdlkafeeqlqswcqaagegvtfefvqkwmetqvtstddsdpwwaafsgvfkdmklaleleicpastdaryiraagvpalgfspmnhtpvllhdhderlheavflrgvdiytqllsalasvpalpses
(SEQ ID NO：13)
atggcgagcaaaggccgtgaaggtgagcatccgtctgtgaccctgtttcgccagtatctgcgtattcgcacggttcagcctgaaccggattacggagcagctgtggctttcctggaggaacgcgctcgtcagctgggtctgggttgccaaaaggtagaagttgtcccagggcacgtcgtaactgtactgacttggcctggaacgaatccgaccctgagttcaatcctgctgaactcccatacagatgtagtgccagtgttcaaggaacattggagtcacgaccctttcgaagggtttaaagatgccgatggctatatttacggtcgtggggcacaggacatgaagtgtgtatccattcaatatctggaagctgttcgccgtctgaaagttgaagggcaccactttccacgcactattcacatgactttcgtgcctgacgaggaagtcgggggtcaccaaggtatggaactgttcgtaaaacgccctgagtttcaggcactgcgtgcgggttttgctctggacgagggtctggcgagcccgacagacgcgtttaccgtgttttacagtgaacgttcgccttggtggctgcgcgttacttccacaggtaagccggggcacggctcgcgtttcatcgaggatacagccgctgaaaagctgcacaaagttattaatagcatcctggcctttcgcgagaaggaaaagcaacgtctgcagagcaaccagctgaaaccgggtgcggtcactagcgtgaatctgactatgctggaggggggtgtcgcctataacgttgtgccggcaactatgagcgcatgcttcgactttcgcgtagctccggatgttgacctgaaagccttcgaagaacaactgcagagctggtgtcaagcagcgggagaaggtgtaacctttgagttcgtccagaaatggatggaaacacaggttacctcgactgatgatagcgatccttggtgggcagccttttctggtgtgttcaaagatatgaagctggcgctggaactggaaatctgcccagcgagtacagacgctcgttacatccgcgccgcaggcgtaccagccctgggtttttcaccgatgaatcacacgccggtcctgctgcatgatcacgatgagcgcctgcatgaggcagttttcctgcgcggcgtcgacatttatacccaactgctgagtgcactggcttctgttcctgcgctgccatcggaatca
转录终止子序列：(参照：Harrington K.J.，Laughlin R.B.和Liang S.Proc Natl Acad Sci U S A.2001Apr 24；98(9)：5019-24.)
Tcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgc(SEQ ID NO 10)
实施例2
在发酵条件下的甲硫氨酸产生
对于产生大量目标代谢物的菌株在产生条件下在2.5L发酵罐(Pierre Guerin)中使用分批补料策略以及磷酸盐饥饿进行测试。
为了在细胞浓度为30g.L-1时停止生长，将磷酸盐添加至矿物质培养基B1b至28.7mM。分批补料培养基F1不含磷酸盐。
简言之，使用在10mL具有2.5g.L-1葡萄糖的LB培养基中生长的8小时培养物接种基本培养基B1a中的24h预培养物。将这些培养物在旋转振荡器(rotary shaker)(200RPM)中的500mL含有50mL基本培养基(B1b)带挡板的烧瓶中在37℃生长。
表1：分批培养矿物质培养基组成(B1a和B1b)
  化合物   浓度(g.L-1)B1a   浓度(g.L-1)B1b
  Zn(CH3COO)2.2H2O   0.0130   0.0130
  CuCl2.2H2O   0.0015   0.0015
  MnCl2.4H2O   0.0150   0.0150
  CoCl2.6H2O   0.0025   0.0025
  H3BO3   0.0030   0.0030
  Na2MoO4.2H2O   0.0025   0.0025
  MgSO4.7H2O   1.00   1.00
  CaCl2.2H2O   0.08   0.08
  柠檬酸   1.70   1.70
  KH2PO4   2.50   2.50
  K2HPO4.3H2O   1.38   1.38
  (NH4)2HPO4   0.6040   0.6040
  柠檬酸Fe(III)H2O   0.11   0.11
  (NH4)2S2O3   3.70   3.70
  EDTA   0.0080   0.0080
  硫胺素   0.01   0.01
  葡萄糖   15.00   20.00
  维生素B12   0.01   0.01
  NaOH 8N   调整至pH 6.8   调整至pH 6.8
  IPTG   0.0024   0.0024
  MOPS   5.00   0.00
表2：分批补料培养培养基组成(F1)。
  化合物   浓度(g.L-1)
  Zn(CH3COO)2，2H2O   0.0104
  CuCl2，2H2O   0.0012
  MnCl2，4H2O   0.0120
  CoCl2.6H2O   0.0020
  H3BO3   0.0024
  Na2MoO4.2H2O   0.0020
  柠檬酸Fe(III)H2O   0.0524
  MgSO4   5.00
  (NH4)2S2O3   44.10
  EDTA   0.0067
  硫胺素   0.01
  葡萄糖   500.00
  维生素B12   0.01
  IPTG   0.0190
之后将2.5L发酵罐(Pierre Guerin)用600mL基本培养基(B1b)填充，并接种至生物质浓度为0.1g.L-1，而预培养物体积范围为25至45mL。
将培养温度在37℃维持恒定，并通过自动添加NH4OH溶液(添加10％NH4OH 10小时并添加24％直至培养结束)来将pH维持在工作值(6.8)。在分批阶段中初始搅拌速率设定为200rpm，并在分批补料阶段中增加到多至1200rpm。初始气流速率在分批阶段设为40NL.h-1，并在分批补料阶段开始时增加至100NL.h-1。溶解氧浓度维持在20至40％的值，优选通过增加搅拌维持在30％饱和度。
当细胞质量达到接近5g.L-1的浓度时，以起始流速5mL.h-1开始补料分批。以S形分布注入补料溶液，流速增加，在21小时之后达到21mL.h-1。准确的补料条件通过下述等式计算：
Figure BDA0000056814640000201
其中Q(t)是以mL.h-1计的补料流速，对于600mL的分批体积，p1＝1.15，p2＝18.32，p3＝0.270，p4＝5。
在21小时的分批补料之后，细胞浓度达到30g.L-1，磷酸盐在培养基中耗尽，而细胞进入磷酸盐饥饿。在此时点，补料溶液的注入增加至37mL.h-1的恒定值，进行4小时。然后该恒定流速减至10mL.h-1，且维持该流速值直至分批补料结束(50小时)。
表3：在上述菌株的分批补料发酵中获得的最大甲硫氨酸/葡萄糖得率(Ymet)，甲硫氨酸+N-酰基甲硫氨酸+N-丙酰甲硫氨酸/葡萄糖得率(Ymet+NAM)，N-乙酰甲硫氨酸/葡萄糖得率和N-丙酰甲硫氨酸/葡萄糖得率(N-乙酰甲硫氨酸和N-丙酰甲硫氨酸计为甲硫氨酸，％g/g见下)。对于得率的准确定义，见下。对于参照菌株1显示三次发酵运行的平均值，并对于菌株1DyncA显示两次分批补料运行的平均值。菌株1对应MG1655metA*11 ΔmetJ Ptrc-metHPtrc36-ARNmst17-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔpykA ΔpykFPtrc09-gcvTHP ΔpurU(pME 101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)(pCC1BAC-serB-serA-serC)。
Figure BDA0000056814640000211
确定甲硫氨酸/葡萄糖得率(Ymet)
胞外甲硫氨酸浓度在OPA/FMOC衍生化之后通过HPLC来定量。N-乙酰甲硫氨酸和残留葡萄糖浓度使用具有折射检测的HPLC来分析。N-丙酰甲硫氨酸的浓度在硅烷化之后通过GC-MS来确定，其表示为N-乙酰甲硫氨酸当量。
发酵罐体积通过起始体积加上为了调节pH和向培养物补料而添加的溶液量并减去用于取样和通过蒸发丧失的体积来计算。
通过称重原料来持续跟踪分批补料体积。然后基于注入的重量、溶液密度和通过Brix方法控制的葡萄糖浓度([葡萄糖])来计算注入的葡萄糖量。甲硫氨酸得率表示如下：
Figure BDA0000056814640000212
其中甲硫氨酸0和甲硫氨酸t分别为起始和时点(t)时的甲硫氨酸浓度，且V0和Vt为起始和时点t时的体积。
YN-乙酰-甲硫氨酸计算如下：
Figure BDA0000056814640000213
其中N-乙酰甲硫氨酸t为以mmol每升计的时点t时的浓度。
YN-丙酰甲硫氨酸t计算如下：
其中N-丙酰甲硫氨酸t为以mmol每升计的时点t时的浓度。
YMet+N-乙酰甲硫氨酸+N-丙酰甲硫氨酸(YMet+NAM)计算如下：
Figure BDA0000056814640000215
其中甲硫氨酸t为以g每升计的时点t时的甲硫氨酸浓度，N-乙酰甲硫氨酸t和N-丙酰甲硫氨酸t分别为以mmol每升计的时点t时的浓度。
消耗的葡萄糖计算如下：
Figure BDA0000056814640000221
注入的葡萄糖t＝补料体积t*[葡萄糖]
消耗的葡萄糖t＝[葡萄糖]0*V0+注入的葡萄糖-[葡萄糖]残留*Vt
其中[葡萄糖]0、[葡萄糖]、[葡萄糖]残留分别为起始、补料和残留葡萄糖浓度。
实施例3
通过将氨基酸酰基酶添加至发酵培养基来调适培养条件
为了将N-乙酰甲硫氨酸转化为甲硫氨酸和乙酸，将160U的N-氨基酸酰基酶(猪肾，Sigma)在菌株1的发酵运行(如上所述进行)之后添加至200μl发酵液。将反应混合物在37℃温育2小时。随后，如上所述确定甲硫氨酸和N-乙酰甲硫氨酸的浓度。通过此酶处理，75-95％的N-乙酰甲硫氨酸转化为甲硫氨酸。
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Figure IDA0000056814680000011
Figure IDA0000056814680000031
Figure IDA0000056814680000041
Figure IDA0000056814680000051
Figure IDA0000056814680000061

Claims (19)

1.一种在发酵方法中产生甲硫氨酸或其前体的方法，包括下述步骤：
-在包含碳源、硫源和氮源的适当培养基中培养修饰的微生物，和
-从培养基回收甲硫氨酸和/或其衍生物，
其中N-酰基甲硫氨酸的累积相对于未经修饰的微生物和/或方法减少。
2.权利要求1的方法，其中累积减少的N-酰基甲硫氨酸选自下组：N-乙酰甲硫氨酸、N-丙酰甲硫氨酸、N-丁酰甲硫氨酸及其组合。
3.权利要求1的方法，其中所述N-酰基甲硫氨酸累积的减少是通过下述修饰之一实现的：
○减弱至少一种甲硫氨酸转酰基酶的表达，和/或
○表达至少一种甲硫氨酸特异性氨基酰基酶或增强至少一种甲硫氨酸
特异性氨基酰基酶的表达；和/或
○改变培养条件。
4.权利要求3的方法，其中其表达减弱的甲硫氨酸转酰基酶是由选自下组的基因编码的：yncA、argA、yjdJ、yfaP、yedL、yjhQ及其组合。
5.权利要求4的方法，其中其表达减弱的甲硫氨酸转酰基酶是由基因yncA编码的。
6.权利要求3的方法，其中N-酰基甲硫氨酸的产生通过将选自下组的至少一种天然或异源的N-酰基-L-氨基酸酰胺水解酶在微生物中表达来减少：
a.曲霉属(Aspergillus)N-酰基氨基酸酰基酶
b.猪N-酰基氨基酸酰基酶
c.由argE基因编码的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶。
7.权利要求3的方法，其中N-酰基甲硫氨酸的产生通过调适选自下组的培养条件来减少：pH，加氧(oxygenation)和/或温度，或通过将N-酰基氨基酸酰基酶添加入培养基来减少。
8.权利要求3的方法，其中N-酰基甲硫氨酸的产生通过下述来减少：
a)减弱至少一种下述编码甲硫氨酸N-酰基转移酶的基因的表达：yncA、argA、yjdJ、yfaP、yedL、yjhQ，和
b)表达至少一种天然或异源的N-酰基甲硫氨酸脱酰基酶，如：
a.曲霉属N-酰基氨基酸酰基酶
b.猪N-酰基氨基酸酰基酶
c.由argE基因编码的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶。
9.权利要求3的方法，其中N-酰基甲硫氨酸产生通过如下来减少：减弱至少一种下述编码甲硫氨酸N-酰基转移酶的基因的表达：yncA、argA、yjdJ、yfaP、yedL、yjhQ，并且调适工艺条件，如pH，加氧和/或温度，或将氨基酸酰基酶添加入培养基。
10.权利要求3的方法，其中N-酰基甲硫氨酸产生通过如下来减少：表达至少一种天然或异源的N-酰基甲硫氨酸酰基酶，如：
a.曲霉属N-酰基氨基酸酰基酶
b.猪N-酰基氨基酸酰基酶
c.由argE基因编码的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶；
以及调适工艺条件，如pH，加氧和/或温度，或将氨基酸酰基酶添加入培养基。
11.权利要求3的方法，其中N-酰基甲硫氨酸产生通过如下来减少：
-减弱至少一种下述编码甲硫氨酸N-酰基转移酶的基因的表达：yncA、argA、yiiD、yhhY、yjdJ、yfaP、yedL、yjhQ，和
-表达至少一种天然或异源的N-酰基甲硫氨酸酰基酶，如：
a.曲霉属N-酰基氨基酸酰基酶
b.猪N-酰基氨基酸酰基酶
c.由argE基因编码的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶。和
-调适培养条件，如pH，加氧和/或温度，或将氨基酸酰基酶添加入培养基。
12.权利要求1的方法，其中培养基中的硫源是硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化氢、连二硫酸盐、连二亚硫酸盐、亚硫酸盐、甲硫醇、二甲基二硫化物或所述不同来源的组合。
13.权利要求1的方法，其中培养基中的硫源是硫酸盐或硫代硫酸盐，或两者的混合物。
14.权利要求1的方法，其中所述碳源来源于可再生原料。
15.权利要求1的方法，其中所述碳源是葡萄糖或蔗糖。
16.权利要求1的方法，其中所述氮源以铵或氨的形式供应。
17.权利要求1的方法，包括分离发酵液中所需的氨基酸/组分和/或任选地以部分或全部量(0-100％)残留于终产物中的生物质的步骤。
18.权利要求1的方法，其中使所述微生物对于磷酸盐和/或钾受限制或饥饿。
19.一种微生物，包含权利要求3中所述的修饰。
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