CN103087971B - 增加甲硫氨酸得率 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及增加甲硫氨酸得率，具体地涉及通过在包含碳源和硫源的适当培养基中培养微生物来生产甲硫氨酸或其衍生物的方法。该微生物和/或该培养基经修饰，使得甲硫氨酸/碳源得率增加。本发明也描述了从发酵培养基中分离甲硫氨酸或其衍生物。

Description

增加甲硫氨酸得率
本申请是申请日为2008年9月25日，申请号为“200880110059.9”(国际申请号为“PCT/EP2008/062859”)，名称为“增加甲硫氨酸得率”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种通过在包含碳源和硫源的适宜培养基中培养微生物来生产甲硫氨酸及其衍生物的方法。该微生物和/或该培养基经修饰使得其甲硫氨酸/碳源得率增加。本发明还要求保护从发酵培养基中分离甲硫氨酸及其衍生物。
背景技术
含硫化合物如半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸对细胞代谢是关键的，并工业上生产用作食物或饲料添加剂以及药物。尤其甲硫氨酸是一种动物无法合成的必需氨基酸，在许多身体功能中起着重要作用。除了它在蛋白质生物合成中的作用，甲硫氨酸也涉及转甲基作用，以及硒与锌的生物利用。甲硫氨酸还直接用作对于病症如过敏与风湿热的治疗。然而，大部分生产出的甲硫氨酸添加于动物饲料。
随着动物来源的蛋白质因BSE与禽流感(chicken flu)的缘故而减少使用，对纯甲硫氨酸的需求增加。D,L-甲硫氨酸通常自丙烯醛、甲硫醇以及氰化氢通过化学方法产生。然而，该外消旋混合物的性能并不像纯L-甲硫氨酸一样好，例如在鸡饲料添加剂中(Saunderson,C.L.,(1985)British Journal of Nutrition54,621-633)。纯L-甲硫氨酸可自外消旋甲硫氨酸产生，例如通过酰基酶处理N-乙酰-D,L-甲硫氨酸来进行。这极大地提高了生产成本。对纯L-甲硫氨酸需求增加，连同对环境的考虑，使甲硫氨酸的微生物生产具有吸引力。
微生物发展出高度复杂的调控机制来调整细胞组分的生物合成，从而允许最大生长速率。结果，仅仅必需量的代谢物如氨基酸被合成，通常无法在野生型菌株的培养物上清中检测到。细菌主要通过酶的反馈抑制及基因转录的阻抑或激活来控制氨基酸生物合成。在大部分情况下，这些调控途径的效应物是相关途径的终产物。因此，在微生物中过量生产氨基酸的策略要求对这些控制机制解除调控。
在许多微生物中L-甲硫氨酸合成途径众所周知(图1)。甲硫氨酸衍生自氨基酸天冬氨酸，但是其合成需要另外两条途径的合流(convergence)，即半胱氨酸生物合成与C1代谢。
天冬氨酸自草酰乙酸合成。在大肠杆菌(E.coli)中，稳定的草酰乙酸储备(pool)是柠檬酸循环的正常发挥功能所需的。因此将草酰乙酸转化为天冬氨酸需要对从该储备中移出草酰乙酸进行补偿的反应。数种称为添补反应(anaplerotic reaction)的途径，在大肠杆菌中实现了这些功能(Sauer&Eikmanns(2005)FEMS Microbiol Reviews29p76-94)。在指数生长条件及葡萄糖过剩的情况下，PEP羧化酶催化PEP的羧化产生草酰乙酸。羧化的效率取决于胞内PEP浓度及其他。PEP是参与多种反应的中心代谢物。这些反应之一，PEP糖酵解转化为丙酮酸对大肠杆菌不是必需的，因为葡萄糖通过PTS系统摄入可将产自葡萄糖的两个PEP分子之一转化为丙酮酸。在糖酵解中，酶丙酮酸激酶(其在大肠杆菌由基因pykA和pykF编码的两个同工酶编码)催化PEP转化为丙酮酸。
天冬氨酸通过顺序的三个反应转化为高丝氨酸。高丝氨酸可随后进入苏氨酸/异亮氨酸或甲硫氨酸生物合成途径。在大肠杆菌中，进入甲硫氨酸途径需要将高丝氨酸酰化为琥珀酰高丝氨酸。这个激活步骤允许随后与半胱氨酸缩合，生成含有硫醚的胱硫醚。胱硫醚水解生成高半胱氨酸。生成甲硫氨酸的最后甲基转移通过B12-依赖或B12-非依赖的甲基转移酶进行。
在大肠杆菌中，甲硫氨酸生物合成通过阻抑和激活甲硫氨酸生物合成基因分别经由MetJ和MetR的蛋白来调控(在Figge RM(2006),Wendisch VF编,Microbiol Monogr(5)Amino acid biosynthesis p164-185的综述)。已知MetJ连同其共阻抑物S-腺苷甲硫氨酸调控基因metA、metB、metC、metE和metF。MetR在其共激活子高半胱氨酸的存在下激活编码涉及甲硫氨酸生成的酶的其它基因，如glyA、metE、metH和metF，而metA仅在高半胱氨酸不存在时被MetR激活。所有这些酶参与C1单元的产生及其从丝氨酸到甲硫氨酸的转移。编码丝氨酸羟甲基转移酶的GlyA催化丝氨酸到甘氨酸的转化，以及C1单元在辅酶四氢叶酸(THF)上的伴随转移。甘氨酸可随即转化为CO2、NH3，而另一个C1单元转移到THF上。该反应受到由基因gcvTHP和lpd编码的甘氨酸裂解复合物催化。
由上述两个反应所产生亚甲基-THF形式的C1单元可随后还原为甲基-THF或进一步氧化为甲酰-THF。甲硫氨酸生物合成需要还原为甲基-THF。因此氧化反应与甲硫氨酸生物合成竞争C1单元。甲酰-THF或甲酸对嘌呤和组氨酸的生物合成是必需的。在大肠杆菌中，在通过由purU基因编码的甲酰基-THF脱甲酰基酶催化的反应中，甲酰-THF可转化为THF及游离的甲酸(Nagy等(1995)J.Bacteriol177(5)p.1292-98)。
亚甲基-THF到甲基-THF的还原由MetF蛋白催化。甲基到高半胱氨酸上的转移由MetH通过维生素B12或直接由MetE催化。已知MetH酶的催化速率是MetE酶的一百倍。当缺乏维生素B12因而缺乏活性MetH时，MetE可构成多至5%的总细胞蛋白。活性MetH的存在降低MetE的活性，可能是通过降低通常经由MetR激活metE转录的高半胱氨酸的量来进行。因此，通过MetH产生甲硫氨酸为细胞节约了重要的资源，因为MetE并非大量表达。高半胱氨酸的积累对大肠杆菌是有毒的(Tuite等,2005J.Bacteriol,187,13,4362-4371.)，而且同时对经由MetR的metA表达具有负面的调控效应。因此，显然酶MetH和/或MetE的强表达对有效的甲硫氨酸生成是必需的。
在大肠杆菌中，还原的硫整合至半胱氨酸中，并随即转移到甲硫氨酸前体O-琥珀酰-高丝氨酸上，该过程称为转硫化作用(在Neidhardt,F.C.(主编),R.Curtiss III,J.L.Ingraham,E.C.C.Lin,K.B.Low，B.Magasanik,W.S.Reznikoff，M.Riley,M.Schaechter,和H.E.Umbarger(编).1996.Escherichia coli and Salmonella:Cellularand Molecular Biology.American Society for Microbiology中综述)。半胱氨酸通过硫氢化反应由O-乙酰丝氨酸和H2S产生。该过程受到其产物半胱氨酸的负反馈调控，半胱氨酸作用于由cysE编码的丝氨酸转乙酰酶。N-乙酰丝氨酸(其由O-乙酰丝氨酸自发产生)与转录因子CysB一同激活编码参与如下的酶的基因：含硫化合物的运输，它们变为H2S的还原及它们在有机硫化合物半胱氨酸(其与甲硫氨酸一样是必需氨基酸)中的整合。
在缺乏半胱氨酸时，MetB催化甲硫氨酸前体O-琥珀酰高丝氨酸转化为氨、α-酮丁酸及琥珀酸，该反应称为γ-消去(Aitken&Kirsch,2005,Arch Biochem Biophys433,166-75)。α-酮丁酸可随后被转化为异亮氨酸。该副反应对甲硫氨酸的工业生产而言是不希望的，因为这两种氨基酸难以分开。因此低γ-消去反应活性或保持低异亮氨酸产生的其它手段是甲硫氨酸工业生产的重要方面。临时专利申请US60/650,124描述了如何通过优化酶MetB来减少γ-消去反应。优化半胱氨酸生物合成也可减少γ-消去反应由此减少副产物异亮氨酸的产生，并构成本发明的一个实施方案。
发明内容
本发明涉及一种在发酵过程中产生甲硫氨酸、其衍生物或前体的方法。所述方法包括：
-在包含碳源与硫源的适当培养基中培养经修饰的微生物，和
-从培养基中回收甲硫氨酸，
其中与未修饰的微生物和/或方法相比，该微生物和/或方法通过如下修饰的至少一种或它们的组合而被修饰，以提供增加的甲硫氨酸/碳源得率：
1-减少微生物中甲酰-THF的脱甲酰化
2-减少微生物中磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的消耗
3-通过在培养基中对微生物限制或使其缺乏(starving)一种或数种无机底物而限制微生物的生长。
在本发明的描述中，使用大肠杆菌中相应基因的名称来鉴定基因与蛋白质。然而，除非另外指明，根据本发明使用这些名称具有更一般的含意，并涵盖了其它生物中，尤其是微生物中所有相应的基因和蛋白质。还可以详明来自其它生物的基因和蛋白质，特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的基因和蛋白质作为附加的信息。此附加信息的目的并不是限定基因或蛋白质的一般定义。
在本发明的一个特定实施方案中，通过降低甲酰基-THF的脱甲酰基化(这通过消弱purU基因(在谷氨酸棒杆菌中称为YP_001137322)的表达而实现)来增加甲硫氨酸/碳源得率。PurU酶催化甲酰基-THF脱甲酰基酶反应。脱甲酰基酶活性的削弱增加了甲基-THF的产生，而甲基-THF对于高半胱氨酸的甲基化所需的。脱甲酰基化造成的C1代谢物的损失导致不能转化为甲硫氨酸的高半胱氨酸产量增加。于是，高半胱氨酸可成为酶胱硫醚gamma合酶(MetB)的底物，该酶可催化O-琥珀酰高丝氨酸与高半胱氨酸之间的反应，导致高羊毛氨酸的生成。
在本发明另一个特定的实施方案中，通过降低磷酸烯醇化丙酮酸(PEP)的消耗(这通过削弱丙酮酸激酶编码基因pykA和/或pykF而实现)来增加甲硫氨酸/碳源得率。增加的PEP利用率(availability)可增加天冬氨酸的重要前体草酰乙酸的产生，而天冬氨酸又是甲硫氨酸的前体。谷氨酸棒杆菌仅携带一个丙酮酸激酶基因，其对应于YP_226326。
在本发明的另一个实施方案中，通过限制微生物的生长，或使该微生物缺乏无机底物来增加甲硫氨酸/碳源得率。这可通过限制培养基中可用的磷酸盐和/或钾的量来实现。上述对细胞生长的限制允许改善甲硫氨酸/碳源得率，因为碳并非用来生产生物质和/或维持此生物质，而是用来生产甲硫氨酸。具体而言，培养基中磷酸盐浓度允许生长至OD600小于200，优选为150，更优选为100。对于大肠杆菌，OD600为100相应于30到35g/l生物量，对于酵母为40-50g/l。对于其它微生物，该转换因子是本领域的技术人员所知的。对于大肠杆菌，产生1g生物量所需的磷酸盐量为10-20mg，优选约18mg。产生1g生物量所需的钾量为10-20mg，优选约18mg。对于谷氨酸棒杆菌，产生1g生物量所需的磷酸盐量为14-21mg，优选约17mg。产生1g生物量所需的钾量为23-33mg，优选约28mg。对于其它微生物，该转换因子是本领域的技术人员所知的。
微生物可在丰富培养基或基本培养基中，优选在基本培养基中生长。合适的基本培养基如下所述。
上述三种调节甲硫氨酸/碳源得率的方法可以单独使用或者与其它一种或两种方法组合使用。
因此，通过削弱purU基因表达减少甲酰基-THF脱甲酰基化可与通过削弱基因pykA和/或pyKF的表达来减少PEP消耗以及与在培养基中限制或缺乏磷酸盐和/或钾相结合。
类似的，通过削弱purU基因表达减少甲酰基-THF脱甲酰基化可与通过削弱基因pykA和/或pyKF的表达来减少PEP消耗相结合。
类似的，通过削弱purU基因表达减少甲酰基-THF脱甲酰基化可与在培养基中限制或缺乏磷酸盐和/或钾相结合。
类似的，通过削弱基因pykA和/或pyKF的表达来减少PEP消耗可与在培养基中限制或缺乏磷酸盐和/或钾相结合。
如本申请使用的下列术语可用来解释权利要求与说明书。
根据本发明，术语“培养”、“发酵”或“发酵过程”可以互换使用，以表示在含有简单碳源的合适生长培养基中培养细菌。
总甲硫氨酸/碳源得率定义为甲硫氨酸+NAM(与甲硫氨酸等当量的NAM质量)(g)%/在发酵操作过程中消耗的葡萄糖(g)。
甲硫氨酸衍生物源自甲硫氨酸转化和/或降解途径。具体而言，这些产物是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)硫甲基核糖和N-乙酰甲硫氨酸。特别的，NAM是一种可易于回收的甲硫氨酸衍生物，可将其分离并通过脱乙酰作用转化为甲硫氨酸。短语“从培养基中回收甲硫氨酸”表示回收甲硫氨酸，SAM与NAM，以及所有其它可能有用的衍生物的行动。
甲硫氨酸前体定义为其为甲硫氨酸特异代谢途径一部分的代谢物，或可由这些代谢物得到。具体而言，这些前体是O-琥珀酰高丝氨酸(OSH)，gamma-胱硫醚，高半胱氨酸和高羊毛氨酸。甲硫氨酸特异性途径始自通过酶高丝氨酸琥珀酰转移酶将高丝氨酸转化为琥珀酰高丝氨酸。
术语“微生物”表示细菌，酵母或真菌。优选地，微生物选自肠细菌科(Enterobacteriaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)和棒杆菌科(Corynebacteriaceae)。更优选地，微生物为埃希杆菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、沙门氏菌属(Salmonella)或棒杆菌属(Corynebacterium)的菌种。还更优选，微生物为大肠杆菌(Escherichia coli)或谷氨酸棒杆菌菌种。
术语“经修饰的微生物”指以增加甲硫氨酸/碳源得率为目标而经遗传修饰的微生物。本领域的技术人员知道如何调节特定基因的表达。通常的修饰包括用遗传元件转化微生物，包括基因替代、修饰启动子，以及引入用于表达异源基因的载体。
术语“甲硫氨酸/碳源得率”定义为发酵过程中获得的甲硫氨酸量除以消耗的碳源量。它可以g甲硫氨酸/g碳源百分比，或mol甲硫氨酸/mol碳源来表示。术语“增强的”在此上下文中描述与无特定修饰的微生物和/或无修饰的培养基相比可测量的增加。在优选实施方案中，该增加为至少2%g/g，优选至少4%g/g，更优选至少7%g/g。总甲硫氨酸/碳源得率优选为至少7%g/g，优选至少12%g/g，优选至少15%g/g，最优选至少19%g/g。
为测量该增加，需确定消耗的葡萄糖量与产生的甲硫氨酸量。消耗的碳源量可通过如下方法计算：通过HPLC用折射检测或根据Brix针对补料分批溶液的方法确定生长培养基中的葡萄糖浓度。对于分批培养，消耗的葡萄糖对应于实验开始时残留的葡萄糖量减去实验结束时残留的葡萄糖量。对于补料分批发酵(关于详细的解释参见实施例)，消耗的葡萄糖量对应于分批培养中葡萄糖量，接种时加入的葡萄糖量以及补料分批阶段过程中注入的葡萄糖量之和减去实验结束时残留的葡萄糖量。
术语“获得的甲硫氨酸”包括L-甲硫氨酸与易于回收的甲硫氨酸衍生物NAM。培养基中获得的甲硫氨酸量可在OPA/Fmoc衍生化后用HPLC，以L-甲硫氨酸(Fluka,Ref64319)为标准品通过荧光检测获得。使用折射HPLC使用NAM(Sigma,Ref01310)作为标准品测定NAM的量。
根据本发明的术语“碳源”是指本领域的技术人员可用来支持微生物正常生长的任何碳源，其可为己糖(如葡萄糖、半乳糖或乳糖)，戊糖，单糖，二糖，寡糖(如蔗糖、纤维二糖或麦芽糖)，糖蜜，淀粉或其衍生物，半纤维素，甘油或它们的组合。一种特别优选的简单碳源是葡萄糖。另一种优选的简单碳源是蔗糖。
本发明中术语“基因表达的削弱”表示基因表达的部分或完全抑制，此时该基因的表达被称为“削弱的”。此表达抑制可以是基因表达的抑制，基因表达所需的启动子区的部分或全部缺失，基因编码区的缺失，或将野生型启动子交换为较弱的天然或合成启动子。优选地，基因削弱基本上是所述基因的完全缺失，该基因可替换为选择性标记基因以帮助鉴定、分离和纯化本发明所述的菌株。优选通过同源重组技术使基因失活(Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.(2000)“One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichiacoli K-12using PCR products”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6640-6645)。
术语“增强的”或“过表达的”在本上下文中描述由相应DNA编码的酶活性的胞内活性的增加，例如通过增加基因的拷贝数，使用更强的启动子或使用具有增加活性的等位基因，及可能地组合这些方法。
术语“表达增加”“表达增强”或“过表达”在本文中可互换使用，含意相似。
为增加基因表达，该基因可编码于染色体中或染色体外。如于染色体中，可通过本领域技术人员所知的重组方法将一个或数个拷贝引入基因组中。如于染色体外，可用不同类型的质粒携带基因，所述质粒的复制起点和由此在细胞内的拷贝数方面不同。所述基因可以1-5拷贝，大约20拷贝或者直至500拷贝存在，对应于严紧复制的低拷贝数质粒(PSC101、RK2)，低拷贝数质粒(pACYC、pRSF1010)或高拷贝数质粒(pSK bluescript II)。
在本发明的一个优选实施方案中，该基因可用不同强度的启动子表达，该启动子可为诱导型。这些启动子可为同源的或异源的。本领域的技术人员知道哪些启动子最为便利，举例而言，启动子Ptrc、Ptac、Plac或lambda启动子cI是广泛使用的。
酶的表达可由使其相应信使RNA(Carrier和Keasling(1998)Biotechnol.Prog.15,58-64)或蛋白质(例如GST标签,Amersham Biosciences)稳定化或不稳定化的元件而增大或减小。
本发明还涉及含有根据本发明要增强的基因的一个或数个等位基因的微生物。
在本发明的描述中，使用大肠杆菌中相应基因的名称来鉴定基因与蛋白质。然而，除非另外指出，根据本发明使用这些名称具有更一般的含意，并涵盖了其它生物中，尤其是微生物中所有相应的基因和蛋白质。
PFAM(protein families database of alignments and hidden Markovmodels，比对和隐藏马尔可夫模型的蛋白质家族数据库http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)是蛋白质序列比对的大集合。每个PFAM可用于观察多重比对，观察蛋白质域，评价生物中的分布，获准进入其他数据库，以及观察已知蛋白质结构。
COGs(clusters of orthologous groups of proteins蛋白质正向同源组的簇;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)可通过比较来自66个全部测序完成的基因组的蛋白质序列来获得，所述基因组代表了30个主要的系统发生系。每个COG自至少三个系定义，其允许鉴定以前保守的域。
识别同源序列及其百分比同源性的方法对于本领域的技术人员来说是公知的，并具体地包含BLAST程序，可由网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/以该网址上所示的默认参数使用该程序。获得的序列可以使用如CLUSTALW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)或者MULTALIN(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)以这些网站上所示的默认参数加以利用(例如，比对)。
使用GenBank上给出的关于已知基因的参考文献，本领域的技术人员可确定在其它生物体、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中等同的基因。可以使用可通过与源自其它微生物的基因进行序列比对而确定的共有序列并设计简并探针以克隆在另一种生物中的相应基因而有利地完成此常规工作。这些分子生物学常规方法对于本领域的技术人员而言是熟知的，并描述于例如Sambrook等(1989 Molecular Cloning:a LaboratoryManual.第2版.Cold Spring Harbor Lab.,Cold Spring Harbor,New York.)。
“对生物体限制无机底物”定义为该微生物的生长受到添加的非有机化合物的量支配，但仍允许微弱生长的情况。上述底物的实例为磷酸盐、钾、镁或它们的组合。
使生物体缺乏无机底物定义为由于缺乏无机底物而导致微生物生长完全停止的情况。上述底物的实例为磷酸盐、钾、镁或它们的组合。
在本发明中，发明人旨在通过代谢工程改造生产菌株以增加甲硫氨酸/碳源得率。在本发明的一个特定实施方案中，甲硫氨酸/葡萄糖和/或甲硫氨酸/蔗糖得率(g/g)为至少10%g/g，优选至少15%g/g，更优选19%g/g。
在本发明的一个特定实施方案中，参与硫同化、丝氨酸生成、丝氨酸转化为甘氨酸或甘氨酸裂解的至少一个基因的表达增加。增加微生物的硫同化是有利的，因为甲硫氨酸是一种含硫氨基酸(C5H11NO2S)。此外，增加氨基酸丝氨酸和甘氨酸的产量以及甘氨酸裂解(即代谢)是有利的。甘氨酸裂解与丝氨酸转化为甘氨酸是生成亚甲基-THF的两个主要的反应，亚甲基-THF可还原为甲基-THF，甲基-THF又是高半胱氨酸甲基化生成甲硫氨酸所需的。丝氨酸生成由3-磷酸甘油酸脱氢酶，磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸氨基转移酶等酶催化。甘氨酸裂解由甘氨酸裂解复合体催化。
在大肠杆菌与谷氨酸棒杆菌中，涉及前述活性且其活性可增加的酶由下述基因编码(其后为登录号和相应多肽的功能)：
在本发明的一个特定实施方案中，增加了编码硫酸(盐)/硫代硫酸(盐)输入蛋白及硫代硫酸(盐)特异性半胱氨酸合酶的操纵子cysPUWAM，和/或编码亚硫酸(盐)还原酶及PAPS还原酶的操纵子cysJIH的表达。在棒杆菌属的情况中，优选增加cysA、cysT、cysI与cysJ的表达。
在本发明的另一个特定实施方案中，增加了操纵子gcvTHP和/或编码甘氨酸裂解复合体的基因lpd的表达。可通过从杰氏棒杆菌(Corynebacterium jekeium)将基因gcvTHP可能作为合成基因引入，将甘氨酸裂解复合体引入甘氨酸棒杆菌，并在其中过表达。
在本发明的另一个特定实施方案中，至少一个参与甘氨酸生成的基因，如serA、serB、serC或glyA被过表达。
在本发明的另一个实施方案中，参与甲硫氨酸生物合成的代谢途径的酶可以过表达，或其活性增加，从而增加甲硫氨酸生成。具体而言，可以过表达编码这些酶的下述基因中的至少一个：
-metF 1790377 Cgl2171 5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶
-编码高丝氨酸琥珀酰转移酶的metA(1790443)等位基因，该基因针对S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸的反馈敏感性减少，如WO2005/10856所述。或在谷氨酸棒杆菌的情况中，基因metXCgl0652。
-编码天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶的thrA或thrA(1786183)等位基因，该基因针对苏氨酸的反馈抑制减少。
-在谷氨酸棒杆菌的情况中，可过表达asp和hom，潜在的反馈抗性，如WO2007/012078所述。
-metH 1790450 Cgl1507 B12-依赖性高半胱氨酸-N5-甲基四氢叶酸转甲基酶
-CysE 1790035 Cgl2563 丝氨酸乙酰转移酶
在具有或不具有基因aecD/metB过表达，均可以预想metY(Cgl0653)在谷氨酸棒杆菌中的过表达。
WO2007/077041和WO2007/012078中显示了metF和metH的过表达，所述文件通过提述并入本申请中。在此文件中，发明人阐明：即使使用稳定metF信使RNA的元件进一步过表达metF也会进一步增加甲硫氨酸生成。这些稳定元件通常是降低RNA降解核酸酶攻击的环结构(Carrier和Keasling(1998)Biotechnol.Prog.15,58-64)。
在专利申请WO2005/111202中，描述了过表达对其抑制剂SAM及甲硫氨酸的反馈敏感性降低的高丝氨酸琥珀酰转移酶等位基因。该文件通过提述并入本申请中。
WO2007/077041表明了cysE的过表达，该文件通过提述并入本申请中。
在专利申请WO2004/076659中，描述了通过采用改变的metB等位基因可进一步增加甲硫氨酸的生成，所述等位基因优先或单独地使用H2S并由此自O-琥珀酰高丝氨酸产生高半胱氨酸，该文件通过提述并入本申请中。
在专利申请JP2000/157267中，描述了通过削弱或缺失负责下调甲硫氨酸调节子的抑制蛋白MetJ(GenBank1790373)的基因实现了在大肠杆菌中产生L-甲硫氨酸、其前体或其衍生的化合物的进一步增加。在棒杆菌属中，应该缺失主要的硫调节物McbR(AAP45010)，如WO2007/012078所示。
在本发明的另一个特定实施方案中，降低副产物异亮氨酸的产生。只能以极大难度才能将异亮氨酸与甲硫氨酸分离，且生成纯甲硫氨酸的成本急剧增加。另外，异亮氨酸的生成消耗了可用于甲硫氨酸生成的碳。因此希望使异亮氨酸的生成尽可能低。
可通过苏氨酸生物合成途径或在不存在半胱氨酸时通过O-琥珀酰高丝氨酸的γ-消去反应生成异亮氨酸。在专利申请WO2006/082254和WO2007/077041中描述了减少γ-消去活性的方法，该文件通过提述并入本申请中。
在未修饰的微生物如大肠杆菌中，异亮氨酸的生成低于检出水平(HPLC)。在经修饰的微生物中，产生的量可达到2%g异亮氨酸/g葡萄糖。从培养基中回收的异亮氨酸量可高于40mM。
本发明人显示参与丝氨酸生物合成的下述基因中至少一个的过表达也减少异亮氨酸的生成。
在本发明更特定的实施方案中，本发明人阐明了serA、serB和/或serC的增强表达降低副产物异亮氨酸的生成。
在本发明另一个特定实施方案中，降低副产物高羊毛氨酸的生成。高羊毛氨酸是自激活的高丝氨酸和高半胱氨酸生成的氨基酸(Kromer等(2006)J Bacteriol 188,609-18;和BASF的专利申请WO2007/051725)。只能以极大难度才能将高羊毛氨酸与甲硫氨酸分离，且生成纯甲硫氨酸的成本急剧增加。另外，高羊毛氨酸包括两个自天冬氨酸衍生的高丝氨酸分子以及一个还原的硫分子，所有这些分子若转化为甲硫氨酸均可以增加甲硫氨酸/碳源得率。因此，希望使高羊毛氨酸的生成尽可能低，并将使用的前体转化为甲硫氨酸。PCT申请WO2007/057125提出了降低高羊毛氨酸生成的一些其他方法。本发明人发现了降低高羊毛氨酸生成且与此同时使其底物高半胱氨酸转化为甲硫氨酸的其它方法。具体而言，有利于高半胱氨酸转化为甲硫氨酸的方法是削弱由purU基因编码的甲酰基-THF脱甲酰基酶活性，过表达由metF编码的亚甲基-THF还原酶活性，削弱pykA和/或pykF基因的表达，过表达serA、serB或serC，或者过表达lpd基因。
发酵产生L-甲硫氨酸所用的硫源，其前体或由其得到的化合物可为如下的任一种：硫酸盐，硫代硫酸盐，硫化氢，连二硫酸盐，连二亚硫酸盐，亚硫酸盐，或它们的组合。
在本发明的一个优选实施方案中，硫源是硫酸盐和/或硫代硫酸盐。
关于优选的碳源，本发明人推荐葡萄糖或蔗糖。
本发明还涉及生成L-甲硫氨酸、其前体或由其得到的化合物的方法，包括发酵上述产生甲硫氨酸的微生物，浓缩甲硫氨酸、其前体或衍生物，以及分离从发酵液中的期望的产物。
本领域的技术人员能够限定用于本发明微生物的培养条件。具体而言，细菌在20℃-55℃，优选25℃-40℃的温度发酵，更具体地对谷氨酸棒杆菌为大约30℃，对大肠杆菌为大约37℃。
通常，发酵是在发酵罐中以适于所用细菌的具有已知确定的组成的无机培养基进行，所述培养基包含至少一种简单碳源，如果需要，还包含生成代谢物必需的共底物。
具体而言，用于大肠杆菌的无机培养基可与M9培养基(Anderson,1946,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32:120-128)和M63培养基(Miller,1992;A Short Course inBacterial Genetics:A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli andRelated Bacteria,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork)，或与如Schaefer等(1999,Anal.Biochem.270:88-96)限定的培养基具有相同或类似的组成。
类似地，用于谷氨酸棒杆菌的无机培养基可与BMCG培养基(Liebl et al.,1989,Appl.Microbiol.Biotechnol.32:205-210)，或与如Riedel等(2001,J.Mol.Microbiol.Biotechnol.3:573-583)描述的培养基具有相同或类似的组成。可补充所述培养基以补偿突变引入的营养缺陷。
发酵后，可回收L-甲硫氨酸、其前体或由其得到的化合物，并如果需要进行纯化。在培养基中回收和纯化生成的化合物(如甲硫氨酸和N-乙酰甲硫氨酸)的方法是本领域的技术人员公知的。
任选地，在纯化发酵产物的过程中，可保留0%到100%，优选至少90%，更优选95%，还更优选至少99%的生物质。
任选地，在回收甲硫氨酸之前，将甲硫氨酸衍生物N-乙酰甲硫氨酸通过脱乙酰化转化为甲硫氨酸。
本发明也涉及经优化以发酵生成甲硫氨酸的微生物，即与未修饰微生物相比具有改进的甲硫氨酸/碳源得率并包含上述遗传修饰的微生物。
具体地，本发明涉及如下方面：
1.一种在发酵工艺中产生甲硫氨酸，其衍生物或前体的方法，包括以下步骤：
-在包含碳源与硫源的适当培养基中培养经修饰的微生物，和
-从所述培养基中回收甲硫氨酸，
其中与未修饰的微生物和/或方法相比，该微生物和/或方法通过如下修饰的至少一种或它们的组合而被修饰，以提供增加的甲硫氨酸/碳源得率：
-减少微生物中甲酰-THF的脱甲酰化，
-减少微生物中PEP的消耗
-通过对该经修饰的微生物限制或使其缺乏培养基中一种或数种无机底物，而限制该微生物生长及生物质的产生。
2.项1的方法，其中通过削弱基因purU的表达来减少甲酰-THF的脱甲酰化。
3.项1的方法，其中通过削弱下述至少一个基因的表达来减少PEP的消耗：
·pykA
·pykF。
4.项1的方法，其中对该微生物限制或使其缺乏磷酸盐和/或钾。
5.项1的方法，其中通过削弱基因purU的表达来减少甲酰-THF的脱甲酰化，其中通过削弱pykA和/或pykF基因的表达来减少PEP的消耗，而且其中对该微生物限制或使其缺乏磷酸盐和/或钾。
6.项1的方法，其中通过削弱基因purU的表达来减少甲酰-THF的脱甲酰化，而且其中通过削弱pykA和/或pykF基因的表达来减少PEP的消耗。
7.项1的方法，其中通过削弱基因purU的表达来减少甲酰-THF的脱甲酰化，而且其中对该微生物限制或使其缺乏磷酸盐和/或钾。
8.项1的方法，其中通过削弱pykA和/或pykF基因的表达来减少PEP的消耗，而且其中对该微生物限制或使其缺乏磷酸盐和/或钾。
9.项1-8的方法，其中在该微生物中下列至少一个基因的表达增加：cysP、cysU、cysW、cysA、cysM、cysJ、cysI、cysH、cysE、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、glyA。
10.项9的方法，其中在该微生物中操纵子cysPUWAM和/或cysJIH的表达增加。
11.项9的方法，其中在该微生物中由基因gcvTHP和/或lpd编码的甘氨酸裂解复合物的表达增加。
12.项9的方法，其中至少一个涉及甘氨酸生物合成途径的基因如serA、serB、serC或glyA过表达。
13.项1-12的方法，其中在该微生物中下列至少一个基因过表达：metF、metA等位基因，其编码对S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸的反馈敏感度降低的酶，thrA或thrA等位基因，其对苏氨酸的反馈抑制降低，cysE，metH。
14.项1-13的方法，其中在该微生物中由metJ基因编码的甲硫氨酸阻抑物的表达削弱。
15.项1-14的方法，其中所述培养基中的硫源是硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化氢、连二硫酸盐、连二亚硫酸盐、亚硫酸盐或不同来源的组合。
16.项15的方法，其中所述培养基中的硫源是硫酸盐或硫代硫酸盐或两者的混合物。
17.项1-16的方法，其中所述碳源是葡萄糖或蔗糖。
18.项1-17的方法，包括分离任选地在终产物中以部分或总量(0-100%)残留的生物质和/或发酵液中所需的氨基酸/组分的步骤
19.项18的方法，其中在回收甲硫氨酸之前，通过脱乙酰作用将甲硫氨酸衍生物N-乙酰-甲硫氨酸转变为甲硫氨酸。
20.一种微生物，其包含如项1-3与5-14中所述的修饰。
附图：
图1
大肠杆菌中的甲硫氨酸生物合成。缩写：P磷酸，GA3P3-磷酸甘油醛，PGA磷酸甘油酸，PEP磷酸烯醇丙酮酸，Pyr丙酮酸，Asp天冬氨酸，Asp-P天冬氨酰磷酸，Asp-SA天冬氨酸半醛，homoser高丝氨酸，OSH O-琥珀酰高丝氨酸，γ-cysγ-胱硫醚，homocys高半胱氨酸，homolan高羊毛氨酸，THF四氢叶酸，Ser丝氨酸，Cyst半胱氨酸，Gly甘氨酸，PPP磷酸戊糖支路。
图2
在三种不同培养条件下生长的菌株1PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHΔpykF ΔpykA Ptrc09-gcvTHP的DO600nm和Ymet+NAM的变化：磷酸盐过量的生长(实心符号)、在100UDO600nm时缺乏磷酸盐的生长(空心符号)和磷酸盐限制的生长(灰色符号)。
发明详述
2004年5月12日提交的PCT WO2005108561描述了一种大肠杆菌菌株，其中由metJ基因编码的甲硫氨酸阻抑物由氯霉素盒取代(ΔmetJ::Cm)，并携带具有对甲硫氨酸和SAM反馈敏感性降低的metA等位基因(metA*11)。在专利申请WO2007/077041中描述了由整合入染色体中位于结构基因上游的人工启动子(Ptrc-metF，Ptrc-metH)过表达基因metF和metH。此文件也描述了过表达具有对苏氨酸反馈抑制降低的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶(thrA*)，及过表达来自质粒pME101的metA*11和丝氨酸乙酰转移酶(cysE)。具有上述专利申请所描述的所有修饰的菌株在本申请中称为菌株1，它具有基因型ΔmetJ metA*11Ptrc-metH Ptrc-met F(pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)。下述所有的后续构建均基于这些构建体。
构建过表达操纵子cysPUWAM、cysJIH、gcvTHP和基因metF、serA、serC、serB、glyA与lpd的菌株，以及缺失基因pykA、pykF及purU的菌株
除metF外所有构建体最初在大肠杆菌菌株MG1655中制备，并随后通过转导转移到最终的菌株中。
构建MG1655 Ptrc-cysPUWAM
使用Datsenko和Wagner(2000)描述的同源重组策略，将操纵子cysPUWAM置于异源Ptrc启动子的控制下。该策略允许将氯霉素或卡那霉素抗性盒与异源启动子一起插入目标基因上游。为此，使用下列寡核苷酸：
Ptrc-cysPUWAMF(SEQ ID NO1)
GCGCGAGTGAGTTCTTTTTCAGTAAGTTAACGGCCATTGCGCACCCTTATAAATTTAATGACTTTC
具有
-与基因cysP的序列(2541512-2541578)同源的区域(大写字母)(网址http:// www.ecogene.org/上的参考序列)，
-用来扩增氯霉素抗性盒的区域(粗体大写字母)(Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645中的参考序列)，
-trc启动子序列的区域(斜体大写字母)，其中-35和-10盒以下划线表示
Ptrc-cysPUWAM R(SEQ ID NO2)
CCAAATCACCAAACGGTATATAAAACCGTTACTCCTTTCACGTCCGTTATAAATATGATGGCTATTA
具有
-与基因cysP上游区域的序列(2541644-2541578)同源的区域(大写字母)(网址http://www.ecogene.org/上的参考序列)，
-用来扩增氯霉素抗性盒的区域(粗体大写字母)(Datsenko,K.A.&Wanner，B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645中的参考序列)，
-噬菌体T7终止子序列的区域(下划线斜体大写字母)(Genbank V01146)
使用寡核苷酸Ptrc-cysPUWAM F与Ptrc-cysPUWAM R从质粒pKD3扩增氯霉素抗性盒。然后将获得的PCR产物通过电穿孔引入菌株MG1655(pKD46)。在该菌株中，表达Red重组酶并允许同源重组。然后选择氯霉素抗性转化体，并用如下所示的寡核苷酸Ptrc-cysPUWAMRv与Ptrc-cysPUWAMFv通过PCR分析验证抗性盒的插入。保留的菌株命名为MG1655Ptrc-cysPUWAM：Cm。
Ptrc-cysPUWAMRv(SEQ ID NO3):GCAGGATTTGTACGTCGGTCACC(与2541260到2541282的序列同源)。
Ptrc-cysPUWAMFv(SEQ ID NO4):cgtcttgaactaagttcaccaggc(与2541812到2541789的序列同源)。
构建MG1655Ptrc-cysJIH
使用Datsenko和Wagner(2000)描述的同源重组策略，将操纵子cysJIH置于异源Ptrc启动子的控制下。该策略允许将氯霉素或卡那霉素抗性盒与异源启动子一起插入目标基因的上游。为此，使用下列寡核苷酸：
PtrcF-cysJIH R(SEQ ID NO5)
CCAGTAAGCAAAGCTGTTTCTGCGCCCTGTCAGCGCCCATAAAACAGAAGAGA
具有
-与基因cysJ的序列(2889935-2889987)同源的区域(大写字母)(网址http:// www.ecogene.org/上的参考序列)，
-用来扩增卡那霉素抗性盒的区域(粗体大写字母)(Datsenko,K.A.&Wanner，B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645中的参考序列)，
-trc启动子序列的区域(斜体大写字母)，其中-35和-10盒以下划线表示
PtrcF-cysJIH F(SEQ ID NO6)
GGTTATTAGTTATCGCTATCCCGTCTTTAATCCACACCGTTTGCCCCGTTAACCTTACCT
具有
-与基因cysJ上游区域的序列(2890047-2889988)同源的区域(大写字母)(网址http://www.ecogene.org/上的参考序列)，
-用来扩增卡那霉素抗性盒的区域(粗体大写字母)(Datsenko,K.A.&Wanner，B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645中的参考序列)，
-噬菌体T7终止子序列的区域(下划线斜体大写字母)(GenbankV01146)
使用寡核苷酸PtrcF-cysJIH F与PtrcF-cysJIH R从质粒pKD4扩增卡那霉素抗性盒。然后将获得的PCR产物通过电穿孔引入菌株MG1655(pKD46)。在该菌株中，表达Red重组酶并允许同源重组。然后选择卡那霉素抗性转化体，并用如下所示的寡核苷酸Ptrc-cysJIHFv与Ptrc-cysJIHRv通过PCR分析验证抗性盒的插入。保留的菌株命名为MG1655Ptrc-cysJIH:Km。
Ptrc-cysJIHFv(SEQ ID NO7):GCAGTTCGACAAGTTCTTTCACC(与2889042到2889064的序列同源)。
Ptrc-cysJIHRv(SEQ ID NO8):CCAGAACACAACACCCTAACATAGCG(与2890663到2890638的序列同源)。
构建MG1655Ptrc09-gcvTHP
使用Datsenko和Wagner(2000)描述的同源重组策略，将操纵子gcvTHP置于异源Ptrc启动子的控制下。该策略允许氯霉素或卡那霉素抗性盒与异源启动子一起插入目标基因上游。为此，使用下列寡核苷酸：
Ptrc-gcvTHPF(SEQ ID NO9)
CCACCATGCGA GCGCCGCAAAGCGTGTGTTGTTCGTACAAAGGAGTCTGTTGTGC
具有
-与基因gcvT的序列(3048630-3048687)同源的区域(大写字母)(网址http:// www.ecogene.org/上的参考序列)，
-用来扩增卡那霉素抗性盒的区域(粗体大写字母)(Datsenko,K.A.&Wanner，B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645中的参考序列)，
-trc启动子序列的区域(斜体大写字母)，其中-35和-10盒以下划线表示
Ptrc-gcvTHPR(SEQ ID NO10)
CTGTCGCGATTTTTGCATTTTTTAACCATAAGCTAATGTGATGATCAATTTTACCTTA
具有
-与基因gcvT上游区域的序列(3048887-3048830)同源的区域(大写字母)(网址http://www.ecogene.org/上的参考序列)，
-用来扩增卡那霉素抗性盒的区域(粗体大写字母)(Datsenko,K.A.&Wanner，B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645中的参考序列)，
使用寡核苷酸Ptrc-gcvTHP F与Ptrc-gcvTHP R从质粒pKD4扩增卡那霉素抗性盒。然后将或得的PCR产物通过电穿孔引入菌株MG1655(pKD46)。在该菌株中，表达Red重组酶并允许同源重组。随机选择卡那霉素抗性转化体，并用如下所示的寡核苷酸Ptrc-gcvTHP F2与Ptrc-gcvTHP R2通过PCR分析验证抗性盒的插入。所得菌株命名为MG1655Ptrc-gcvTHP:Km。
Ptrc-gcvTHP F2(SEQ ID NO11):CTATCACACCGCCAGAGGCATTC(与3048399到3048421的序列同源)。
Ptrc-gcvTHP R2(SEQ ID NO12):CCCATCACACTTTCATCTCCCG(与3049106到3049085的序列同源)，
构建MG1655ΔpykA
使用Datsenko和Wagner(2000)描述的同源重组策略，缺失pykA基因。该策略允许氯霉素或卡那霉素抗性盒插入目标基因。为此，使用下列寡核苷酸：
DpykAF(SEQ ID NO13)
cgcggcgggtgccaacgttgtacgtatgaacttttctcacggctcgcctgaagatcacaaaatgcgcgcggataaagttcg
具有
-与pykA区域的序列(1935756-1935838)同源的区域(小写字母)(网址http:// www.ecogene.org/上的参考序列)，
-用来扩增氯霉素抗性盒的区域(粗体大写字母)(Datsenko,K.A.&Wanner，B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645中的参考序列)，
DpykAR(SEQ ID NO14)
CGCCGCATCCGGCAACGTACTTACTCTACCGTTAAAATACGCGTGGTATTAGTAGAACCCACGGTACTCATCACGTCGCCC
具有
-与pykA区域的序列(1937135-1937055)同源的区域(大写字母)(网址http:// www.ecogene.org/上的参考序列)，
-用来扩增氯霉素抗性盒的区域(粗体大写字母)(Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645中的参考序列)，
使用寡核苷酸DpykA F与DpykA R从质粒pKD3扩增氯霉素抗性盒。然后将获得的PCR产物通过电穿孔引入菌株MG1655(pKD46)。在该菌株中，表达Red重组酶并允许同源重组。然后选择氯霉素抗性转化体，并用如下所示的寡核苷酸pykA F与pykA R通过PCR分析验证抗性盒的插入。所得菌株命名为MG1655ΔpykA::Cm。
PykA F(SEQ ID NO15):ggcaattaccctcgacgtaccgg(与1935338到1935360的序列同源)
PykA R(SEQ ID NO16):ccgcctctaacagatcatccatcgg(与1935401到1937425的序列同源)
构建MG1655ΔpykF
使用Datsenko和Wagner(2000)描述的同源重组策略，缺失pykF基因。该策略允许氯霉素或卡那霉素抗性盒插入目标基因。为此，使用下列寡核苷酸：
DpykF F(SEQ ID NO17)
cccatccttctcaacttaaagactaagactgtcatgaaaaagaccaaaattgtttgcaccatcggaccgaaaaccgaa
具有
-与pykF区域的序列(1753689-1753767)同源的区域(小写字母)(网址http:// www.ecogene.org/上的参考序列)，
-用来扩增卡那霉素抗性盒的区域(粗体大写字母)(Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645中的参考序列)，
DpykF R(SEQ ID NO18)
ggacgtgaacagatgcggtgttagtagtgccgctcggtaccagtgcaccagaaaccataactacaacgtcacctttgtg
具有
-与pykF区域的序列(1755129-1755051)同源的区域(大写字母)(网址http:// www.ecogene.org/上的参考序列)，
-用来扩增卡那霉素抗性盒的区域(粗体大写字母)(Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645中的参考序列)，
使用寡核苷酸DpykF F与DpykF R R从质粒pKD4扩增卡那霉素抗性盒。然后将获得的PCR产物通过电穿孔引入菌株MG1655(pKD46)。在该菌株中，表达Red重组酶并允许同源重组。然后选择卡那霉素抗性转化体，并用如下所示的寡核苷酸pykF F与pykF R通过PCR分析验证抗性盒的插入。所得菌株命名为MG1655 DpykF::Km。
PykF F(SEQ ID NO19):gcgtaaccttttccctggaacg(与1753371到1753392的序列同源)。
PykF R(SEQ ID NO20):gcgttgctggagcaacctgccagc(与1755518到1755495的序列同源)。
构建MG1655ΔpurU
使用Datsenko和Wagner(2000)描述的同源重组策略，缺失purU基因。该策略允许氯霉素或卡那霉素抗性盒插入目标基因。为此，使用下列寡核苷酸：
DpurU F(SEQ ID NO21)
ggtaaaaaatttaaaaagtgctgcggccaataatggttgacggtacggtttagcaaacactctcaacaaggtttttccagc
具有
-与purU区域的序列(1287929-1287849)同源的区域(小写字母)(网址http:// www.ecogene.org/上的参考序列)，
-用来扩增卡那霉素抗性盒的区域(粗体大写字母)(Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645中的参考序列)，
DpurU R(SEQ ID NO22)
ggttgcgtaattttcatccgtaacggattaaaggtaaccagttatttttgctggcgattaaagaataatcgttcgattacc
具有
-与purU区域的序列(1286948-1287028)同源的区域(大写字母)(网址http:// www.ecogene.org/上的参考序列)，
-用来扩增卡那霉素抗性盒的区域(粗体大写字母)(Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645中的参考序列)，
使用寡核苷酸DpurU F与DpurU R从质粒pKD4扩增卡那霉素抗性盒。然后将获得的PCR产物通过电穿孔引入菌株MG1655(pKD46)。在该菌株中，表达Red重组酶并允许同源重组。然后选择卡那霉素抗性转化体，并用如下所示的寡核苷酸purU F与purU R通过PCR分析验证抗性盒的插入。所得菌株命名为MG1655DpurU::Km。
PurU F(SEQ ID NO23):ggaatgcaatcgtagccacatcgc(与1288447到1288424的序列同源)。
PurU R(SEQ ID NO24):gcggattcgttgggaagttcaggg(与1286129到1286452的序列同源)。
构建pCC1BAC-serA-serC
为增加serA和serC基因的表达，通过表达来自拷贝数控制载体pCC1BAC(Epicentre)的酶使它们的适当启动子，在产生甲硫氨酸的细胞中增加这两种基因的基因剂量。
为此，首先用寡核苷酸-serC F(XbaI)和serC R(HindIII)从大肠杆菌基因组中扩增serC基因。使用酶xbaI和HindIII限制性切割PCR产物，并克隆入经相同限制酶限制性切割的载体pUC18(Stratagene)中。所得载体命名为pUC18-serC。
serC F(XbaI)(SEQ ID NO25):
tgcgtccgcgctgtgcaaatccagaatgg
具有
-与基因serC区域的序列(956619-956644)同源的区域(小写字母)(网址http:// www.ecogene.org/上的参考序列)，
-携带XbaI位点的区域(粗体大写字母)
serC R(HindIII)(SEQ ID NO26):
cccAACTCTCTACAACAGAAATAAAAAC
具有
-与基因serC区域的序列(958028-958004)同源的区域(大写字母)(网址http:// www.ecogene.org/上的参考序列)，
-包含HindIII位点的区域(粗体大写字母)
随后用寡核苷酸serA F(XbaI)和serA R(SmaI-HindIII)从大肠杆菌基因组中扩增serA基因。使用酶xbaI和SmaI限制性切割PCR产物，并克隆入经相同限制酶限制切割的载体pUC18-serC中。所得载体经测序验证，并命名为pUC18-serA-serC。
serA F(XbaI)(SEQ ID NO27):
ctagttagtacagcagacgggcgcg
具有
-与基因serA区域的序列(3055198-3055218)同源的区域(小写字母)(网址http://www.ecogene.org/上的参考序列)，
-携带XbaI位点的区域(大写字母)
serA R(SmaI-HindIII)(SEQ ID NO28):
tccCCGTCAGGGCGTGGTGACCG
具有
-与基因serA区域的序列(3056878-3056859)同源的区域(大写字母)(网址http://www.ecogene.org/上的参考序列)，
-携带SmaI和HindIII位点的区域(粗体字母)
为将基因serA与serC转移到拷贝数控制载体pCC1BAC中，用酶HindIII限制性切割载体pUC-serA-serC，并克隆入准备用于HindIII克隆的pCC1BAC(Epicentre)中。
所得构建体经验证，称为pCC1BAC-serA-serC。
构建载体pCC1BAC-serB-serA-serC
为增加serA、serB和serC基因的表达，通过表达来自拷贝数控制载体pCC1BAC(Epicentre)的酶使用它们的适当启动子，在产生甲硫氨酸的细胞中增加这三种基因的基因剂量。
为此，用寡核苷酸serB(SphI)和serB(SmaI)从大肠杆菌基因组中扩增serB基因。用酶SphI和SmaI限制性切割PCR产物，并克隆入经相同限制酶限制切割的pUC18-serA-serC中。所得载体命名为pUC18-serB-serA-serC。
serB(SphI)(SEQ ID NO29):
atgcCCACCCTTTGAAAATTTGAGAC
具有
-与基因serB区域的序列(4622362-4622383)同源的区域(大写字母)(网址http://www.ecogene.org/上的参考序列)，
-携带SphI位点的区域(下划线大写字母)
serB(SmaI)(SEQ ID NO30):
gcatgtcgacat TTACTTCTGATTCAGGCTGCC
具有
-与基因serB区域的序列(4623433-4623412)同源的区域(大写字母)(网址http://www.ecogene.org/上的参考序列)，
-携带SmaI位点的区域(下划线大写字母)
-噬菌体T7终止子序列的区域(斜体大写字母)(Genbank V01146)
为将serA，serB与serC基因转移到拷贝数控制载体pCC1BAC中，用酶HindIII限制性切割载体pUC18-serB-serA-serC，并克隆入准备用于HindIII克隆的pCC1BAC(Epicentre)中。
所得构建体经验证，称为pCC1BAC-serB-serA-serC。
构建pCC1BAC-serB-glyA-serA-serC
为增加serA、serB、serC和glyA基因表达，通过表达来自拷贝数控制载体pCC1BAC(Epicentre)的酶使用它们的适当启动子，在产生甲硫氨酸的细胞中增加这三种基因的基因剂量。
为此，使用寡核苷酸PglyA F(HindIII)和glyA R(EcoRI-HindIII)从大肠杆菌基因组中扩增glyA基因。将PCR产物用酶HindIII限制性切割，用Klenow片段平头化并克隆入经限制酶SmaI限制切割的载体pUC18-serB-serA-serC中。所得载体命名为pUC18-serB-glyA-serA-serC。
PglyA F(HindIII)(SEQ ID NO31):
TCATCGGATCCATCAAGCTTGAA
具有
-与基因glyA区域的序列(2683760-2683742)同源的区域(大写粗体字母)(网址http://www.ecogene.org/上的参考序列)，
-携带HindIII位点的区域(下划线大写字母)
glyA R(EcoRI-HindIII)(SEQ ID NO32):
ATCTAGTAAGCTTAGTGAATTC
具有
-与glyA区域的序列(2682084-2682061)同源的区域(斜体大写字母)(网址http://www.ecogene.org/上的参考序列)，
-携带HindIII和EcoRI位点的区域(下划线大写字母)
为将serA、serB、serC和glyA基因转移到拷贝数控制载体pCC1BAC中，用酶HindIII限制性切割载体pUC18-serB-glyA-serA-serC，并克隆入准备用于HindIII克隆的pCC1BAC(Epicentre)中。
所得构建体经验证，称为pCC1BAC-serB-glyA-serA-serC。
构建载体pJB137-lpd
使用寡核苷酸lpd F(HindIII)和lpd R(EcoRI)从大肠杆菌基因组中扩增lpd基因。用酶EcoRI和HindIII限制性切割PCR产物并克隆入经相同限制酶限制切割的载体pJB137中。所得载体命名为pJB137-lpd。
lpd F(HindIII)(SEQ ID NO33):
atgcgctaGGTTATTAGCGAATAGACAAATCGG
具有
-与基因lpd区域的序列(127644-127668)同源的区域(大写字母)(网址http:// www.ecogene.org/上的参考序列)，
-携带HindIII位点的区域(粗体大写字母)
lpd R(EcoRI)(SEQ ID NO34):
gcatgatcTGCAGACGTAAAAAAAGCGGCGTGG
具有
-与基因lpd区域的序列(129404-129380)同源的区域(大写字母)(网址http:// www.ecogene.org/上的参考序列)，
-携带EcoRI位点的区域(粗体大写字母)
所得构建体经验证，称为pJB137-lpd。
将上述各个突变整合入菌株1
随后，通过P1噬菌体转导及视需要移除抗性盒，由菌株ΔmetJ metA*11Ptrc-metHPtrc-metF得到下列菌株。
构建出的菌株
ΔmetJmetA*11Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH
ΔmetJmetA*11Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH
ΔmetJmetA*11Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHΔpykFΔpykA
ΔmetJmetA*11Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHΔpykFΔpykAPtrc09-gcvTHP
ΔmetJmetA*11Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHΔpykFΔpykAPtrc09-gcvTHPΔpurU
ΔmetJmetA*11Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cys PUWAMPtrcF-cysJIHΔpykFΔpykAPtrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF
ΔmetJmetA*11Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHΔpykFΔpykAPtrc09-gcvTHPΔpurUPtrc36-ARNmst17-metF
经由P1转导及移除抗性盒的转移将通过菌株ΔmetJ metA*11Ptrc-metHPtrc-metF PtrcF-cysPUWAM::Cm PtrcF-cysJIH::Km例示。除包含Ptrc36-ARNmst17-metF的菌株(见下)外，所有其它构建体以相似方式构建。
为将启动子构建体PtrcF-cysPUWAM::Cm转移到菌株MG1655ΔmetJmetA*11Ptrc-metH Ptrc-metF中，使用噬菌体P1转导的方法。在制备菌株MG1655 PtrcF-cysPUWAM::Cm的噬菌体裂解液和后续转导入菌株MG1655ΔmetJmetA*11Ptrc-metHPtrc-metF的两个步骤中实施下述规程。
制备噬菌体P1裂解液
-用100μl过夜培养的菌株MG1655PtrcF-cysPUWAM::Cm接种10ml LB+Km50μg/ml+葡萄糖0.2%+CaCl25mM。
-在37℃振荡温育30分钟
-加入100μl在菌株MG1655中制备的噬菌体裂解液P1(大约1.109噬菌体/ml)
-在37℃振荡3小时直至所有细胞裂解
-加入200μl氯仿，并涡旋振荡
-在4500g离心10分钟以去除细胞碎片
-将上清转移到无菌试管中，加入200μl氯仿
-将裂解液储藏在4℃
转导
-将5ml的菌株MG1655ΔmetJmetA*11Ptrc-metH Ptrc-metF在LB培养基中的过夜培养物在1500g离心10分钟
-在2.5ml10mM MgSO4,5mM CaCl2中悬浮细胞沉淀
-对照管：100μl细胞
100μl菌株MG1655PtrcF-cysPUWAM::Cm的噬菌体P1
-测试管：100μl细胞+100μl菌株MG1655PtrcF-cysPUWAM::Cm的噬菌体P1
-无振荡条件下在30℃温育30分钟
-向每管中添加100μl1M柠檬酸钠并并涡旋振荡
-添加1mlLB
-在37℃振荡温育1小时
-在7000rpm将管离心3分钟后，涂布在LB+Cm50μg/ml平板上
-在37℃温育过夜
验证菌株
选择氯霉素抗性转化体，并使用上述用于验证菌株MG1655PtrcF-cysPUWAM::Cm的寡核苷酸通过PCR分析，来验证启动子构建体MG1655PtrcF-cysPUWAM::Cm的存在。保留的菌株命名为ΔmetJ metA*11Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cys PUWAM::Cm。随后，使用如上所述P1转导过程引入PtrcF-cysJIH等位基因。将所得菌株命名为ΔmetJ metA*11Ptrc-metHPtrc-metF PtrcF-cysPUWAM::Cm PtrcF-cysJIH::Km。
为引入pykA与pykF的缺失，将抗性盒自菌株DmetJ metA*11Ptrc-metHPtrc-metFPtrcF-cysPUWAM::Cm PtrcF-cysJIH::Km中消除。
为此，通过电穿孔将质粒pCP20引入重组菌株，该质粒携带在抗性盒的FRT位点起作用的FLP重组酶。在42℃一系列培养之后，通过PCR分析验证两个盒的丢失。将保留的菌株命名为ΔmetJ metA*11Ptrc-metH Ptrc-metFPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH。然后，可通过P1转导引入pykA和pykF等位基因的缺失。类似地，在消除了相应的盒后，引入甘氨酸裂解复合物过表达构建体Ptrc09-gcvTHP和purU基因的缺失。
由于邻近，构建体Ptrc36-ARNmst17-metF无法通过P1转导而引入，而是经由PCR通过引入而构建。
为此，使用Datsenko和Wagner(2000)描述的同源重组策略。该策略允许在目标基因附近插入氯霉素或卡那霉素抗性盒。为此，使用下列寡核苷酸：
Ptrc36-ARNmst-metF(SEQ ID NO35)(
GGCTCTGATTCAGGGCATCCCGCTGGCTGGCGTGAAAAAAGCTCAT cgtcaacaatatctcactcgagataactccacc
粗体大写字母：核糖体结合位点和-10区域
小写字母：RNA稳定化序列
斜体大写字母：Ptrc启动子的部分
Ptrc-metF F(SEQ ID NO36)
ccttcatctttacatctggacgtctaaacggatagatgtgcacaacacaacatataactacaagcgattgatgaggtaaggttcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgc
包含
-与基因metF区域的序列(4130114-4130195)同源的区域(小写字母)(网址http://www.ecogene.org/上的参考序列)，
-与噬菌体T7末端序列同源的区域(斜体小写字母)(GenbankV01146)
-用来扩增卡那霉素抗性盒的区域(大写字母)(Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645中的参考序列)，
对于PCR，使用从专利申请WO2007077041中描述的MG1655metA*11DmetJ::CmPtrc-metF::Km中分离出的DNA作为基质(matrix)。
使用寡核苷酸Ptrc-metF F与Ptrc36-ARNmst-metF从质粒pKD4中扩增卡那霉素抗性盒。然后通过电穿孔将所得PCR产物转移到菌株ΔmetJ metA*11Ptrc-metH Ptrc-metFPtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔpykF ΔpykAPtrc09-gcvTHP ΔpurU(pKD46)中，其中表达的Red重组酶允许同源重组。选择卡那霉素抗性转化体，并使用下述寡核苷酸Ptrc-metFvF与Ptrc-metFv R通过PCR分析验证抗性盒的插入。
Ptrc-metFv F(SEQ ID NO37):GCCCGGTACTCATGTTTTCGGGTTTATGG(与4129866到4129894的序列同源)。
Ptrc-metFv R(SEQ ID NO38):CCGTTATTCCAGTAGTCGCGTGCAATGG(与4130524到4130497的序列同源)。
所得菌株称为ΔmetJ metA*11Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cys PUWAMPtrcF-cysJIH ΔpykF ΔpykA Ptrc09-gcvTHP ΔpurU Ptrc36-ARNmst17-metF:Km。
随后，将质粒(pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11)导入上述菌株，得到下述菌株：
菌株1PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH
菌株1PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHΔpykFΔpykA
菌株1PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHΔpykFΔpykA Ptrc09-gcvTHP
菌株1PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHΔpykFΔpykA Ptrc09-gcvTHPΔpurU
菌株1PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHΔpykFΔpykA Ptrc09-gcvTHPPtrc36-ARNmst17-metF
菌株1PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHΔpykFΔpykA Ptrc09-gcvTHPΔpurUPtrc36-ARNmst17-metF
在某些菌株中，导入质粒pJB137-lpd,pCC1BAC-serA-serC、pCC1BAC-serB-serA-serC或pCC1BAC-serB-glyA-serA-serC，得到：
菌株1PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH ΔpykF ΔpykA Ptrc09-gcvTHP(pJB137-lpd)
菌株1PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHΔpykFΔpykA Ptrc09-gcvTHP ΔpurU(pCC1BAC-serA-serC)
菌株1PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHΔpykFΔpykA Ptrc09-gcvTHP ΔpurUPtrc36-ARNmst17-metF(pCC1BAC-serA-serC)
菌株1PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHΔpykFΔpykA Ptrc09-gcvTHP ΔpurUPtrc36-ARNmst17-metF(pCC1BAC-serB-serA-serC)
菌株1PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIHΔpykFΔpykA Ptrc09-gcvTHPΔpurUPtrc36-ARNmst17-metF(pCC1BAC-serB-glyA-serA-serC)
评估产生甲硫氨酸的菌株
首先在小锥形瓶中评估生产菌株。在混合培养基(10%含2.5gL-1葡萄糖的LB培养基(Sigma25%)，和90%基本培养基PC1)中培养5.5mL的预培养物，并将其用于接种50mL培养物至培养基PC1中OD600为0.2。如果需要以50mg.L-1的浓度加入卡那霉素与大观霉素(spectinomycin)，以30mg.L-1的浓度加入氯霉素。当培养物达到OD600为6到7时，在OPA/Fmoc衍生化后通过HPLC确定胞外氨基酸的量。使用HPLC以折射检测(有机酸和葡萄糖)和甲硅烷基化(silylation)后的GC-MS来确定其它相关代谢物的量。
表1：基本培养基组成(PC1)
化合物 浓度
ZnSO4.7H2O 0.0040g.L-1
CuCl2.2H2O 0.0020g.L-1
MnSO4.H2O 0.0200g.L-1
CoCl2.6H2O 0.0080g.L-1
H3BO3 0.0010g.L-1
Na2MoO4.2H2O 0.0004g.L-1
MgSO4.7H2O 1g.L-1
柠檬酸 6g.L-1
CaCl2.2H2O 0.04g.L-1
K2HPO4.3H2O 10.5g.L-1
Na2HPO4 2g.L-1
(NH4)2HPO4 8g.L-1
NH4Cl 0.13g.L-1
NaOH4M 调至pH6.8
FeSO4,7H2O 0.04g.L-1
硫胺素 0.01g.L-1
葡萄糖 10g.L-1
硫代硫酸铵 5.6g.L-1
维生素B12 0.01g.L-1
MOPS 5g.L-1
IPTG 0.0024g.L-1
可由表2看出在过表达cysJIH与cysPUWAM后甲硫氨酸/葡萄糖得率(Ymet)增加。编码丙酮酸激酶的等位基因pykA与pykF的缺失可进一步增加甲硫氨酸/葡萄糖得率。由purU基因编码的甲酰基-THF脱甲酰基酶的缺失进一步增加甲硫氨酸/葡萄糖得率。metF基因通过构建体Ptrc36-ARNmst17-metF额外的进一步表达还给出更高的甲硫氨酸/萄萄糖得率。serA、serC和serB的过表达还进一步增加甲硫氨酸/葡萄糖得率，而额外的glyA表达还增加甲硫氨酸/葡萄糖得率。
表2.上述菌株在分批培养中产生的以%g甲硫氨酸/g葡萄糖表示的甲硫氨酸得率(Ymet)。n.d.表示未测定。甲硫氨酸/葡萄糖得率的精确定义见下。SD表示Ymet的标准偏差。
*在终培养物中用5g/l葡萄糖进行的测试
确定CysM、cysJI、pykA/F、GcvTHP与Lpd、serA、serB、serC和glyA的酶活性的变化
为确证CysM、CysJI、PykA/F、GcvTHP、SerA、SerB、SerC、GlyA与Lpd表达的变化，在粗提取物中测定相应酶的活性。
为了在体外测定酶活性，如上所述在基本培养基中培养大肠杆菌菌株，并在对数中期收获。将细胞悬浮在冷磷酸钾缓冲液中，并在冰上超声处理(Branson sonifier,70W)。在两种情况下(在表3中用灰色字母表示)用precellys提取系统(Bertin technologies,法国)提取蛋白质：将细胞悬浮在冷磷酸钾缓冲液中，与0.1mm玻璃珠混合并以一次操作30秒进行提取。离心后，确定上清含有的蛋白质的量(Bradford,1976)。
通过LC-MS定量产生的硫代半胱氨酸(sulfocysteine)以测定硫代半胱氨酸合酶活性(CysM)。在测定中，将25μg/mL蛋白质置于含有25mM O-乙酰丝氨酸和25mM硫代硫酸盐的磷酸钾缓冲液(0.5M,pH6.5)中。在30℃进行10分钟反应，并进一步处理用于LC-MS定量。
通过NADPH的消失测定亚硫酸还原酶活性(CysJI)。反应混合液由10mM亚硫酸氢钠和10mM NADPH于Tris-HCl(0.5M，pH7.5)中组成。反应通过添加30μL蛋白质提取物开始，并在340nm在恒温分光光度计中追踪30分钟。
为测定丙酮酸激酶活性(PykA/F)，进行了乳酸脱氢酶(LDH)偶联的测定法。将10μL蛋白质提取物加入含有10mM DTT、100mM MgCl2、100mMKCl、10mM PEP、50mM AMP、10mM1,6-二磷酸果糖、10mM NADH和10单位LDH的用Tris-HCl(0.5M,pH7.5)缓冲的溶液中。在340nm在30℃在恒温分光光度计中追踪反应30分钟。
通过测量甘氨酸脱羧反应过程中发生的CO2生成来估计甘氨酸裂解复合物的组分GcvTHP的活性。该反应在含有pH7的0.5M磷酸钾缓冲液，2mM磷酸吡哆醛，200mM硫辛酰胺和50μCi/mL的1-14C-甘氨酸1M的侧臂Warburg烧瓶中进行。将400μL海胺(hyamine)放置在烧瓶的中孔中，整个反应系统在37℃预温育5分钟。通过添加2mg蛋白质开始反应，在37℃进行。通过穿过支管的隔膜添加500μL6N H2SO4以终止反应，通过在37℃再温育1小时用海胺俘获14C-CO2。然后移除在中孔中的液体，并添加至3mL闪烁液，然后在闪烁计数器中测定CPM。
通过放射性去甲基化的甲基载体的衍生化测定亚甲基四氢叶酸还原酶活性(MTHFR,MetF)。反应混合液含有磷酸钾(50mM,pH6.7)，0.02%BSA(将2%BSA溶于30mM EDTA)，37.5μM FAD，140μM甲萘醌和300μM5-14C-甲基-THF(925dpm/nmol)。在37℃预温育5分钟后，以1μg蛋白质/μL添加100μL蛋白质提取物。反应在37℃进行15分钟，通过添加300μL的3mg/mL溶于乙酸钠(1M，pH4.7)的双甲酮溶液来终止反应。然后将反应溶液在100℃温育2分钟，在冰上冷却5分钟。然后添加3mL甲苯，并将反应溶液在室温下以1500g离心5分钟。取1.5mL液相并添加到3mL闪烁液中。用闪烁计数器测定CPM并计算活性。
基于用NADH作为电子供体还原硫辛酰胺来测定Lpd的硫辛酰胺脱氢酶活性。将EDTA 10mM,NADH 1mM和NAD+25mM和1μg蛋白质提取物添加到Tris-HCl(0.5M,pH8.0)缓冲的溶液中。通过添加200mM硫辛酰胺开始反应，并在340nm在30℃在恒温分光光度计中追踪NADH消失30分钟。
通过追踪NADH的消失来监测SerA的磷酸甘油酸脱氢酶活性。将30μL蛋白质提取物置于含有360μM 3-P-羟基丙酮酸的Tris-HCl(10mM,pH8.8)溶液中。添加200μM NADH以开始反应，在340nm在30℃在恒温分光光度计中追踪NADH消失30分钟。
通过用GC-MS测量产生的丝氨酸来测定SerB蛋白携带的磷酸丝氨酸磷酸酶活性。反应混合液包含TEA-HCl(10mM,pH7.5)，1mM MgCl2，1mM O-磷酸-L-丝氨酸以及15μg蛋白质。在37℃温育反应，在10和30分钟通过添加丙酮终止反应，并进一步处理用于GC-MS定量。
通过将测定法与谷氨酸脱氢酶偶联来测定SerC的磷酸丝氨酸-氨基-转移酶活性。反应混合液用Tris-HCl(50mM,pH8.2)缓冲，并包含30mM乙酸铵，2mM谷氨酸(盐)，2uts谷氨酸脱氢酶，200μM NADH。通过添加30μL蛋白质提取物开始反应，在340nm在30℃在恒温分光光度计中追踪NADH消失30分钟。
通过用GC-MS监测生成的甘氨酸来测定丝氨酸羟甲基转移酶活性。将30μg蛋白质添加到含有磷酸钾(50mM,pH7.3)，400μM四氢蝶酰谷氨酸(Tetrahydopteroyl glutamate)，10mM L-丝氨酸和500μM DTT的溶液。反应在37℃进行10分钟，10分钟后通过添加丙酮终止反应，并进一步处理用于GC-MS定量。
表3.以mUI/mg蛋白质表示产生甲硫氨酸的菌株中下列蛋白的活性：半胱氨酸合酶B(CysM)，亚硫酸还原酶(CysJI)，丙酮酸激酶(PykA/F)，亚甲基-四氢叶酸还原酶(MetF)，硫辛酰胺脱氢酶(Lpd)，3-磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)，磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)，磷酸丝氨酸-氨基-转移酶(SerC)，丝氨酸羟甲基转移酶(GlyA)。GcvTHP的甘氨酸脱羧酶活性以μU/mg蛋白质表示。灰色字符标记的活性是由以Precellys系统提取的培养物获得的。
LOQ：定量限度；ND：未测定
如表3所示，构建体PtrcF-cysPUWAM，PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP和Ptrc39-ARNmst17-metF，pJB137-lpd，pCC1BAC-serB-serA-serC和pCC1BAC-serB-glyA-serA-serC与相应等位基因未修饰的菌株相比，均增加了相应酶的活性。pykA与pykF的缺失导致丙酮酸激酶活性完全丧失。
在发酵条件下确证甲硫氨酸生成
然后使用磷酸盐缺乏的补料分批策略，在生产条件下在2.5L发酵罐(PierreGuerin)中测试产生大量目标代谢物的菌株。
预培养基B1仅包含50mM磷酸盐以避免用接种物将额外的磷酸盐引入分批培养基。为在细胞浓度为30g.L-1时停止生长，向无机培养基B2中添加磷酸盐至28.7mM。补料分批培养基(F1与F2)不含磷酸盐。
简言之，使用在10mL含2.5g.L-1葡萄糖的LB培养基中生长的8小时培养物接种基础培养基(B1，不含硫代硫酸铵，但含有5g.L-1MOPS)中的12小时预培养物。在含有50mL基本培养基(B1)的500mL带挡板的烧瓶中，在37℃在旋转振荡器(200RPM)中进行温育。
第三个预培养步骤在装有200mL基础培养基(B1)的生物反应器中进行，所述培养基中用1.5mL浓缩预培养物(5g.L-1)接种至生物量浓度为0.05g.L-1。该预培养温度在37℃保持恒定，并使用10%NH4OH溶液将pH自动保持在6.8。以通气和/或搅拌将溶氧浓度持续调节到30%的饱和空气分压。在分批培养基中的葡萄糖耗尽后，以0.7mL.h-1的初始流速开始补料分批培养，以0.18h-1的生长速率指数性增加24小时以获得大约24g.L-1的最终细胞浓度。
表4：用于分批预培养的无机培养基组成(B1)
化合物 浓度(g.L-1)
Zn(CH3COO)2,2H2O 0.0130
CuCl2,2H2O 0.0015
MnCl2,4H2O 0.0150
CoCl2.6H2O 0.0025
H3BO3 0.0030
Na2MoO4.2H2O 0.0025
MgSO4.7H2O 1
CaCl2 0.0800
柠檬酸 1.7000
KH2PO4 4.50
K2HPO4,3H2O 2.50
(NH4)2HPO4 1.10
(NH4)2SO4 4.90
Fe(III)柠檬酸盐H2O 0.1064
(NH4)2S2O3 1
EDTA 0.0084
硫胺素 0.01
葡萄糖 5
维生素B12 0.01
NaOH8N 调节至pH6.8
表5：用于补料分批预培养的无机培养基组成(F1)
化合物 浓度(g.L-1)
Zn(CH3COO)2.H2O 0.0104
CuCl2.2H2O 0.0012
MnSO4.H2O 0.0120
CoCl2.6H2O 0.0020
H3BO3 0.0024
Na2MoO4.2H2O 0.0020
MgSO4 5
(NH4)2SO4 8.30
Na2SO4 8.90
Fe(III)柠檬酸盐H2O 0.0524
(NH4)2S2O3 24.80
EDTA 0.0067
硫胺素 0.01
葡萄糖 500
维生素B12 0.01
NH4OH28% 调节至pH6.8
表6：用于分批培养的无机培养基组成(B2及B3)
化合物 浓度(g.L-1)B2 浓度(g.L-1)B3
Zn(CH3COO)2.2H2O 0.0130 0.0130
CuCl2.2H2O 0.0015 0.0015
MnCl2.4H2O 0.0150 0.0150
CoCl2.6H2O 0.0025 0.0025
H3BO3 0.0030 0.0030
Na2MoO4.2H2O 0.0025 0.0025
MgSO4.7H2O 1 1
CaCl2.2H2O 0.0800 0.0800
柠檬酸 1.70 1.70
KH2PO4 2.50 16.42
K2HPO4.3H2O 1.38 9.12
(NH4)2HPO4 0.6040 4
Fe(III)柠檬酸盐H2O 0.11 0.11
(NH4)2S2O3 3.70 4.88
EDTA 0.0080 0.0080
硫胺素 0.01 0.01
葡萄糖 10 10
维生素B12 0.01 0.01
NaOH8N 调节至pH6.8 调节至pH6.8
IPTG 0.0024 0.0024
表7：用于补料分批培养的培养基组成(F2)
化合物 浓度(g.L-1)
Zn(CH3COO)2,2H2O 0.0104
CuCl2,2H2O 0.0012
MnCl2,4H2O 0.0120
CoCl2.6H2O 0.0020
H3BO3 0.0024
Na2MoO4.2H2O 0.0020
Fe(III)柠檬酸盐H2O 0.0524
MgSO4 5.0000
(NH4)2S2O3 39.0900
EDTA 0.0067
硫胺素 0.0100
葡萄糖 500.0000
维生素B12 0.0100
IPTG 0.0190
随后，用600mL基础培养基(B2)充满2.5L发酵罐(Pierre Guerin)，并用45到60mL的预培养物体积接种至生物量浓度为2.1g.L-1。
培养物温度在37℃保持恒定，通过自动添加NH4OH溶液(10%NH4OH进行10小时，和24%NH4OH直至培养结束)将pH保持在工作值(6.8)。在分批阶段过程中将初始搅拌速率设定为200rpm，而在补料分批阶段过程中增加到多至1000rpm。在分批阶段过程中将初始气流速率设定为40NL.h-1，而在补料分批阶段开始时增加到100NL.h-1。通过增加搅拌将溶解氧浓度保持在20-40％，优选30%的饱和度。
当细胞量达到接近5g.L-1的浓度时，以5mL.h-1的初始流速开始补料分批。以S曲线分布以在21小时后达到21mL.h-1的渐增流速注入补料溶液。通过下列方程计算精确的补料条件：
其中Q(t)是用mL.h-1表示的补料流速，及分批体积为600mL，p1=1.15，p2=18.32，p3=0.270，p4=5。
在21小时补料分批之后，细胞浓度达到30g.L-1，培养基中的磷酸盐耗尽，细胞进入磷酸盐饥饿(phosphate starvation)。此时，补料溶液的注入增加到37mL.h-1的恒定值，进行4小时。然后，恒定流速降至10mL.h-1，保持该流速值直至补料分批结束(50小时)。
表8.上述菌株经补料分批发酵中得到的最大甲硫氨酸/葡萄糖得率(NAM计算为甲硫氨酸，%g/g，见下)。甲硫氨酸/葡萄糖得率的精确定义见下。
由表8可见，purU基因的缺失显著增加甲硫氨酸/葡萄糖得率。通过过表达来自pCC1BAC-serA-serC的serA serC显著降低了异亮氨酸生成。serB基因额外的进一步表达进一步降低异亮氨酸生成并增加甲硫氨酸/葡萄糖得率。
甲硫氨酸/葡萄糖得率的确定(Ymet)
胞外甲硫氨酸浓度在OPA/FMOC衍生化后通过HPLC定量。NAM浓度与残余葡萄糖浓度使用HPLC以折射检测分析。甲硫氨酸得率表示如下：
分批培养：
为确定初始与最终培养物体积，分别在空瓶，装有培养基及培养结束时称量锥形瓶。甲硫氨酸得率表示如下：
其中甲硫氨酸0与甲硫氨酸f分别为初始与最终甲硫氨酸的浓度，葡萄糖0与葡萄糖f分别为初始与最终葡萄糖的浓度，而V0与Vf分别为初始与最终体积。
补料分批培养：
通过初始容积加上添加以调节pH和补料培养物的溶液的量，再减去取样使用与蒸发损失的体积来计算发酵罐体积。
通过称量补料储液(feeding stock)连续追踪补料分批体积。然后基于注入的重量、溶液密度和用Brix([葡萄糖])的方法确定的葡萄糖浓度计算注入的葡萄糖量。甲硫氨酸得率表示如下：
其中甲硫氨酸0与甲硫氨酸t分别为初始与最终甲硫氨酸的浓度，而V0与Vt分别为初始与时间t时的体积。
消耗的葡萄糖计算如下：
注入的葡萄糖t=补料体积t*[葡萄糖]
消耗的葡萄糖t=[葡萄糖]0*V0+注入的葡萄糖-[葡萄糖]残留*Vt
其中[葡萄糖]0、[葡萄糖]、[葡萄糖]残留分别为初始、补料以及残留的葡萄糖浓度。
磷酸盐限制或缺乏增加甲硫氨酸/葡萄糖得率
为证明磷酸盐限制以及磷酸盐缺乏(饥饿)增加甲硫氨酸/葡萄糖得率，如上所述进行补料分批发酵。对没有磷酸盐限制或缺乏的培养物，使用无机培养基B3，且补料分批培养基为用Na2SO4(8.95g.L-1)和(NH4)2SO4(8.32g.L-1)补足的F2。对于在磷酸盐限制条件下生长的培养物，引入下述改变。使用的分批无机培养基为B2，且补料分批培养基是以60mM磷酸盐补足的F2。在OD600nm为100时进行磷酸盐限制。
由图2可见，在磷酸盐过剩的条件下，OD600nm在培养过程中持续增加，并在实验结束时达到160UDO。在磷酸盐限制或缺乏的情况下，细胞生长速率在OD600nm为100(20小时)时开始降低，且最终OD600nm接近于120。通过离子色谱证实，残留的磷酸盐浓度接近零。作为磷酸盐缺乏(饥饿)和限制的结果，甲硫氨酸得率增加，并达到分别为0.147与0.139g.g-1的最大值，作为比较在磷酸盐过剩条件下为0.124g.g-1。

Claims (19)

1.一种在发酵工艺中产生甲硫氨酸及其衍生物的方法，包括以下步骤：
-在包含碳源与硫源的适当培养基中培养来自大肠杆菌的种的经修饰的微生物，和
-从所述培养基中回收甲硫氨酸，
其中与来自大肠杆菌的种的未修饰的微生物相比，该经修饰的微生物通过缺失基因purU呈现降低的甲酰-THF的脱甲酰化，而且通过在所述培养基中对该经修饰的微生物限制磷酸盐或使其缺乏磷酸盐来限制所述微生物的生长。
2.权利要求1的方法，其中还通过PEP消耗的减少修饰该微生物，所述PEP消耗的减少通过削弱pykA基因和/或pykF基因的表达而获得。
3.权利要求1的方法，其中通过在所述培养基中对该经修饰的微生物进一步限制钾或使其缺乏钾来限制所述微生物的生长。
4.权利要求1的方法，其中通过削弱pykA和/或pykF基因的表达来减少PEP的消耗，而且其中在所述培养基中对该微生物进一步限制钾或使其缺乏钾来限制所述微生物的生长。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中在该经修饰的微生物中下列至少一个基因的表达增加：cysP、cysU、cysW、cysA、cysM、cysJ、cysI、cysH、cysE、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、glyA。
6.权利要求5的方法，其中在该微生物中操纵子cysPUWAM和/或cysJIH的表达增加。
7.权利要求5的方法，其中在该微生物中由基因gcvTHP和/或lpd编码的甘氨酸裂解复合物的表达增加。
8.权利要求5的方法，其中至少一个涉及甘氨酸生物合成途径的基因过表达。
9.权利要求8的方法，其中至少一个涉及甘氨酸生物合成途径的基因选自serA、serB、serC或glyA。
10.权利要求1-4、6、7、8或9中任一项的方法，其中在该经修饰的微生物中下列至少一个基因过表达：metF、metA等位基因，其编码对S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸的反馈敏感度降低的酶，thrA或thrA等位基因，其对苏氨酸的反馈抑制降低，cysE和metH。
11.权利要求1-4、6、7、8或9中任一项的方法，其中在该微生物中由metJ基因编码的甲硫氨酸阻抑物的表达削弱。
12.权利要求1-4、6、7、8或9中任一项的方法，其中所述培养基中的硫源选自硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化氢、连二硫酸盐、连二亚硫酸盐、亚硫酸盐或不同来源的组合。
13.权利要求1-4、6、78、或9中任一项的方法，其中所述碳源是葡萄糖或蔗糖。
14.权利要求1-4、6、7、8或9中任一项的方法，其中在回收甲硫氨酸之前，通过脱乙酰作用将甲硫氨酸衍生物N-乙酰-甲硫氨酸转变为甲硫氨酸。
15.权利要求5的方法，其中在该经修饰的微生物中下列至少一个基因过表达：metF、metA等位基因，其编码对S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸的反馈敏感度降低的酶，thrA或thrA等位基因，其对苏氨酸的反馈抑制降低，cysE和metH。
16.权利要求5的方法，其中在该微生物中由metJ基因编码的甲硫氨酸阻抑物的表达削弱。
17.权利要求5的方法，其中所述培养基中的硫源选自硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化氢、连二硫酸盐、连二亚硫酸盐、亚硫酸盐或不同来源的组合。
18.权利要求5的方法，其中所述碳源是葡萄糖或蔗糖。
19.权利要求5的方法，其中在回收甲硫氨酸之前，通过脱乙酰作用将甲硫氨酸衍生物N-乙酰-甲硫氨酸转变为甲硫氨酸。
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