CN109652351B

CN109652351B - 一种高产5-甲基四氢叶酸重组枯草芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN109652351B
Application number: CN201811547725.7A
Authority: CN
Inventors: 刘延峰; 朱进伟; 杨晗; 彭湘屏; 李江华; 郑玲辉; 陈坚
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-12-18
Filing date: 2018-12-18
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2038-12-18
Also published as: CN109652351A

Abstract

本发明公开了一种高产5‑甲基四氢叶酸重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。本发明以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168为表达宿主，通过过量表达5,10‑亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF，二氢叶酸还原酶编码基因dfrA，二氢叶酸合成酶编码基因folC、敲除双功能同型半胱氨酸S‑甲基转移酶/5,10‑亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因yitJ，甲酰四氢叶酸脱甲酰酶编码基因purU，得到了积累5‑甲基四氢叶酸枯草芽孢杆菌基因工程菌，5‑甲基四氢叶酸产量达到952.05ug/L，换算细胞干重，产量为342.40ug/g DCW。

Description

一种高产5-甲基四氢叶酸重组枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种高产5-甲基四氢叶酸重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。

背景技术

L-5-甲基四氢叶酸(5-MeTHF)是叶酸在人体内发挥作用的唯一活性形式，是叶酸类药物中唯一能透过血脑屏障的药物。5-MeTHF能预防新生儿神经管缺陷，并具有防治阿尔茨海默病的作用。此外，由于5-MeTHF对正常细胞有较高的选择性保护作用，临床上逐步代替抗肿瘤药甲氨蝶呤的解毒剂5-甲酰四氢叶酸。5-MeTHF也被用于巨幼红细胞性贫血、风湿性关节炎等疾病的治疗。欧盟于2005年底批准5-MeTHF系列产品为安全的食品增补剂，更促进了市场对5-MeTHF的需求。目前，国内5-MeTHF的研究主要集中在化学合成方面，合成方法涉及不对称中心的拆分，此过程中5-MeTHF易失活，收率不理想。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别，Bacillus subtilis 168 中存在合成5-甲基四氢叶酸的内源途径，因此运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级5-甲基四氢叶酸的有效途径。

然而，枯草芽孢杆菌生产5-甲基四氢叶酸存在诸多问题，例如，5-甲基四氢叶酸的合成与分解代谢同时进行，并且前提物质叶酸的产量也很低，导致野生型菌株5-甲基四氢叶酸产量极低。

发明内容

为解决上述科学问题，本发明通过增加前体物质供应，并且阻断5-甲基四氢叶酸的分解代谢途径，以提高5-甲基四氢叶酸的产量。

本发明的第一个目的是构建一种积累5-甲基四氢叶酸的重组枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌敲除了基因组上双功能同型半胱氨酸S-甲基转移酶/5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因yitJ。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌过表达外源5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌敲除了甲酰四氢叶酸脱甲酰酶编码基因purU。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌过表达二氢叶酸还原酶编码基因 dfrA。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌过表达了二氢叶酸合成酶编码基因 folC。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌敲除了基因组上双功能同型半胱氨酸S-甲基转移酶/5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因yitJ，并过表达外源5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF。

在本发明的一种实施方式中，敲除了基因组上双功能同型半胱氨酸S-甲基转移酶/5,10- 亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因yitJ，敲除了甲酰四氢叶酸脱甲酰酶编码基因purU，并过表达外源5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF。

在本发明的一种实施方式中，敲除了基因组上双功能同型半胱氨酸S-甲基转移酶/5,10- 亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因yitJ，敲除了甲酰四氢叶酸脱甲酰酶编码基因purU，并过表达外源5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF及二氢叶酸还原酶编码基因dfrA。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌敲除枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组上双功能同型半胱氨酸S-甲基转移酶/5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶的编码基因 yitJ，敲除甲酰四氢叶酸脱甲酰酶的编码基因purU，过表达E.coliK-12 MG1655来源的10- 亚甲基四氢叶酸还原酶的编码基因metF、二氢叶酸还原酶编码基因dfrA及二氢叶酸合成酶编码基因folC。

在本发明的一种实施方式中，所述双功能同型半胱氨酸S-甲基转移酶/5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(yitJ)的序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(metF)的序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述甲酰四氢叶酸脱甲酰酶(purU)的序列如SEQ IDNO.3 所示。

本发明的一种实施方式中，所述二氢叶酸还原酶(dfrA)的序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，其特征在于，所述二氢叶酸合成酶(folC)的序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的第二个目的是提供一种构建上述重组枯草芽孢杆菌的方法，包括如下步骤：

1)构建重组片段：

通过融合PCR，将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组上的双功能同型半胱氨酸 S-甲基转移酶/5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因yitJ克隆片段，与同源重组臂以及 Spectinomycin-lox抗性基因敲除框融合；

通过融合PCR，将大肠杆菌(Escherichia coli K-12 MG1655)基因组上的5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF克隆片段，与同源重组臂以及氯霉素抗性(crm)基因融合；

通过融合PCR，将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组上的甲酰四氢叶酸脱甲酰酶编码基因purU克隆片段，与同源重组臂以及Spectinomycin-lox抗性基因敲除框融合；

通过融合PCR，将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组上的二氢叶酸还原酶编码基因dfrA克隆片段，与同源重组臂以及crm抗性基因融合；

通过融合PCR，将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组上的二氢叶酸合成酶编码基因folC克隆片段，与同源重组臂以及crm抗性基因融合；

2)构建产5-甲基四氢叶酸(5-MeTHF)重组枯草芽孢杆菌

将上述步骤1)中重组片段逐步转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168，重组到基因组上，获得生产5-甲基四氢叶酸的重组枯草芽孢杆菌工程菌，命名为A10。

本发明另一个目的是提供一种上述重组枯草芽孢杆菌在营养保健品方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌用于发酵生产含5-甲基四氢叶酸的产品。

本发明的第三个目的是提供一种生产5-甲基四氢叶酸的方法，所述方法是将所述枯草芽孢杆菌用于发酵生产，具体包括35-38℃、180-220rpm下培养10-20h的重组枯草芽孢杆菌以10％-20％的接种量转入发酵培养基，于35-38℃、180-220rpm条件下发酵8-24h。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基含有(按g/L计)：酵母粉10～15，胰蛋白胨5～8，硫酸铵4～8，四水合磷酸氢二钾12～14，磷酸二氢钾2～3，七水合硫酸镁2～5，葡萄糖50～80。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基含有(按g/L计)：玉米浆12～15，硫酸铵2～5，七水合硫酸镁2～4，谷氨酸0.8～1.2，葡萄糖50～80，对氨基苯甲酸0.2～0.4。

本发明还要求保护所述重组枯草芽孢杆菌在制备5-甲基四氢叶酸及其相关衍生物方面的应用。

本发明的有益效果：本发明构建了过表达5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF，二氢叶酸还原酶编码基因dfrA，二氢叶酸合成酶编码基因folC克隆片段、敲除双功能同型半胱氨酸S-甲基转移酶/5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因yitJ，甲酰四氢叶酸脱甲酰酶编码基因purU合成5-甲基四氢叶酸的新途径。强化了枯草芽孢杆菌自有的代谢途径。外源表达大肠杆菌(Escherichia coli K-12 MG1655)5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF，阻断5- 甲基四氢叶酸分解代谢途径。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌5-甲基四氢叶酸胞内产量与 Bacillus subtilis 168模式菌株相比有较大提高，可达952.05ug/L，换算细胞干重，产量可达 342.40ug/g DCW。为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产5-甲基四氢叶酸奠定了基础。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。

附图说明

图1是重组枯草芽孢杆菌A10中GTP与分支酸途径到5-甲基四氢叶酸的合成改造途径示意图。

具体实施方式

重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵：

种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

发酵培养基1(g/L)：酵母粉12，胰蛋白胨6，硫酸铵6，四水合磷酸氢二钾12.5，磷酸二氢钾2.5，七水合硫酸镁3，葡萄糖60。

改良发酵培养基2(g/L)：玉米浆15，硫酸铵3，七水合硫酸镁3，谷氨酸1，葡萄糖60，对氨基苯甲酸0.3。

培养条件：将37℃、200rpm下培养10h的种子以10％的接种量转入发酵培养基，于37℃、220rpm条件下培养24h。

5-甲基四氢叶酸的测定方法：

高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1260，FLD检测器，ODS-C18柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：7％乙腈，93％0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(pH3.0)，流速1.0mL/min，柱温23℃，进样量为20μL，激发波长为295nm，发射波长为356nm。

实施例1基因yitJ重组片段的构建

在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组上扩增yitJ基因两侧同源臂，序列分别为左侧(Genbank登录号CP019662.1)Bacillus subtilis subsp.subtilisstr.168 genome 1180393 to 1181395和右侧(Genbank登录号CP019662.1)Bacillussubtilis subsp.subtilis str.168 genome: 1177554 to 1178553，设计同源臂引物，左侧同源臂引物为yitL_1F：

CGAAGTCGGTTTGGTGATCTATACTCAAGG；yitJ_1R：TGTGAAATTGTTATCCGCTCTGTCTGCCTCCTTTATTCACATCAGCAAGGAA，右侧同源臂引物为yitJ_3F：CCTGGCGTTATTTCCAAAAGACTGCCTGATCGAATCGG；yitJ-3R：CGTGAAAGTCTTGTTCTCTAAAGGA TGTCAGTTC。根据lox71-spc-lox66敲除框(如SEQ ID NO.6所示)，设计引物spc_yitJ_2F： GTGAATAAAGGAGGCAGACAGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG；

spc_yitJ_2R：CTTTTGGAAATAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCA。将扩增的3段扩增片段通过融合PCR技术融合，获得重组片段spc_lox_yitJ。

实施例2基因metF重组片段的构建

在大肠杆菌(Escherichia coli K-12MG1655)基因组上扩增metF基因两侧同源臂，序列分别为左侧(Genbank登录号CP019662.1)Bacillus subtilis subsp.subtilisstr.168 genome 1180393 to 1181395和右侧(Genbank登录号CP032667.1)Escherichiacoli str.K-12substr. MG1655 chromosome,complete genome:4389561 to 4390451，设计同源臂引物，左侧同源臂引物为metF_1F：CGAAGTCGGTTTGGTGATCTATACTCAAG；metF_1R：TTATCCGCTCTGTCTGCCTCCTTTATTCACATCAGCAA，右侧同源臂引物为metF_3F： GAATGTACACATGAGCTTTTTTCACGCCAGCC；metF_3R： TCCACGGAAATGGTTTTGACTTCGAG。根据P7CP43表达框lox71-crmP43-lox66的序列信息(如SEQ ID NO.7所示)，设计引物P7CP43_metF_2F： GAGGCAGACAGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAAC；P7CP43_metF_2R： AAAAGCTCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATGGTACCG。将上述3段扩增片段通过融合PCR技术融合，获得重组片段P7CP43_metF。

实施例3基因purU重组片段的构建

在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组上扩增purU基因两侧同源臂，序列分别为左侧(Genbank登录号CP019662.1)Bacillus subtilis subsp.subtilisstr.168 genome：1376004 to 1376972和右侧(Genbank登录号CP019662.1)Bacillussubtilis subsp.subtilis str.168 genome： 1377827 to 1379009，设计同源臂引物，左侧同源臂引物为purU_1F： GGGTAGCGGAGAAAATCGGCATGCATTACA；purU_1R： CCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCTTATGACAGAATTTTTAAACCAACTGCTGAGCATA AAATCAACGCGA，右侧同源臂引物为purU_3F： CCTGGCGTTACGGAAGCGCTGAAAAACATCGGAAGAAC；purU_3R： CTCTCCGCTGCCAGTTCCAATGAATACTTTCA。根据lox71-spc-lox66敲除框(SEQ ID NO.6 所示)，设计引物spc_putU_2F： TTGGTTTAAAAATTCTGTCATAAGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCT；

spc_purU_2R：CAGCGCTTCCGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC。3段扩增片段通过融合PCR技术融合，获得重组片段spc_lox_purU。

实施例4基因dfrA重组片段的构建

在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组上扩增dfrA基因两侧同源臂，序列分别为左侧(Genbank登录号CP019662.1)Bacillus subtilis subsp.subtilisstr.168 genome：2296898 to 2297898和右侧(Genbank登录号CP019662.1)Bacillussubtilis subsp.subtilis str.168 genome： 2295901 to 2296901，设计同源臂引物，左侧同源臂引物为dfrA_1F： CACACCTTTTTGGATGATATTGTGGCAG；dfrA_1R: TTATCCGCTCTCATACGCTGACCGCCCCTTTTAT，右侧同源臂引物为dfrA_3F: GAATGTACACATGATTTCATTCATTTTTGCGATGGATGCC；dfrA_3R： ATCACCAACGGAAGATGATAGCGG。根据P7CP43表达框lox71-crmP43-lox66(的序列信息(如SEQ ID NO.7所示)，设计引物P7CP43_dfrA_2F： CAGCGTATGAGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACA；P7CP43_dfrA_2R： ATGAAATCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATGGTACCG。将上述3段扩增片段通过融合PCR技术融合，获得重组片段P7CP43_dfrA。

实施例5基因folC重组片段的构建

在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组上扩增folC基因两侧同源臂，序列分别为左侧(Genbank登录号CP019662.1)Bacillus subtilis subsp.subtilisstr.168 genome:2866396 to 2867395和右侧(Genbank登录号CP019662.1)Bacillussubtilis subsp.subtilis str.168 genome: 2865396 to 2866395，设计同源臂引物，左侧同源臂引物为folC_1F： AAGTGGAATCGACCTGGAATTTTGCCAA；folC_1R： TTGTTATCCGCTCTGATAATCCCCTCTTTTATAAGACAAGGCGGTTTC，右侧同源臂引物为folC_3F：AAGAGAGGAATGTACACTTGTTTACTGCATATCAAGATGCGCGCA；folC_3R： AACGCTGCTTCATCGTTTCCG。根据P7CP43表达框lox71-crmP43-lox66(本实验前期构建) 的序列信息(Genbank登录号JF812998.1)Cloningvector pVLG6,complete sequence 5350 to 6391，设计引物P7CP43_folC_2F AGAGGGGATTATCAGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG；P7CP43_folC_2R： TCTTGATATGCAGTAAACAAGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATGGTACCGC。将上述 3段扩增片段通过融合PCR技术融合，获得重组片段P7CP43_folC。

实施例6枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168发酵生产5-甲基四氢叶酸

将37℃、220rpm下培养10h的种子液以10％的接种量转入发酵培养基1，于37℃、220rpm条件下培养16h。最终枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168胞内5-甲基四氢叶酸产量达到2.60ug/L，换算细胞干重，产量为0.75ug/g DCW。

实施例7枯草芽孢杆菌A1的构建及发酵生产

将实施例1构建好的重组片段spc_lox_yitJ转化枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis 168)。进行菌落PCR及测序，验证重组枯草芽孢杆菌A1构建成功。

将37℃、220rpm下培养10h的种子液以10％的接种量转入发酵培养基1，于37℃、220 rpm条件下培养16h。最终重组芽孢杆菌A1胞内5-甲基四氢叶酸产量达到0.66ug/L，换算细胞干重，产量为0.21ug/g DCW。敲除双功能同型半胱氨酸S-甲基转移酶/5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因yitJ，产量下降。

实施例8枯草芽孢杆菌A5的构建及发酵生产

将实施例2构建好的重组片段P7CP43_metF转化枯草芽孢杆菌工程菌A1。进行菌落PCR 及测序，验证重组枯草芽孢杆菌A5构建成功。

将37℃、220rpm下培养10h的种子液以10％的接种量转入发酵培养基1，于37℃、220rpm条件下培养16h。最终重组芽孢杆菌胞内5-甲基四氢叶酸产量达到36.55ug/L，换算细胞干重，产量为12ug/g DCW。过表达5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF，产量提高。

实施例9枯草芽孢杆菌A6的构建及发酵生产

将实施例3构建好的重组片段spc_lox_purU转化枯草芽孢杆菌工程菌A5。进行菌落PCR 及测序，验证重组枯草芽孢杆菌A6构建成功。

将37℃、220rpm下培养10h的种子液以10％的接种量转入发酵培养基1，于37℃、220rpm条件下培养16h。最终重组芽孢杆菌胞内5-甲基四氢叶酸产量达到363.93ug/L，换算细胞干重，产量为101.91ug/g DCW。敲除甲酰四氢叶酸脱甲酰酶编码基因purU，产量提高。

实施例10枯草芽孢杆菌A8的构建及发酵生产

将实施例4构建好的重组片段P7CP43_dfrA转化枯草芽孢杆菌工程菌A6。进行菌落PCR 及测序，验证重组枯草芽孢杆菌A8构建成功。

将37℃、220rpm下培养10h的种子液以10％的接种量转入发酵培养基1，于37℃、220 rpm条件下培养16h。最终重组芽孢杆菌胞内5-甲基四氢叶酸产量达到473.63ug/L，换算细胞干重，产量为124.82ug/g DCW。过表达二氢叶酸还原酶编码基因dfrA，产量提高。

实施例11枯草芽孢杆菌A10的构建及发酵生产

将实施例5构建好的重组片段P7CP43_folC转化枯草芽孢杆菌工程菌A8。进行菌落PCR 及测序，验证重组枯草芽孢杆菌A10构建成功。

将37℃、220rpm下培养10h的种子液以10％的接种量转入发酵培养基1，于37℃、220rpm条件下培养16h。最终重组芽孢杆菌胞内5-甲基四氢叶酸产量达到539.49ug/L，换算细胞干重，产量为149.77ug/g DCW。过表达二氢叶酸合成酶编码基因folC，产量提高。

实施例12枯草芽孢杆菌A10发酵生产5-甲基四氢叶酸

将实施例11构建的重组芽孢杆菌A10于37℃、220rpm下培养10h的种子液以10％的接种量转入改良发酵培养基2，于37℃、220rpm条件下培养16h。最终重组芽孢杆菌胞内 5-甲基四氢叶酸产量达到952.05ug/L，换算细胞干重，产量为342.40ug/g DCW。

本发明通过过量表达5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF，二氢叶酸还原酶编码基因dfrA，二氢叶酸合成酶编码基因folC、敲除双功能同型半胱氨酸S-甲基转移酶/5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因yitJ，甲酰四氢叶酸脱甲酰酶编码基因purU实现了5-甲基四氢叶酸在枯草芽孢杆菌内的积累。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种高产5-甲基四氢叶酸重组枯草芽孢杆菌及其应用

<160> 37

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 612

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Gly Leu Leu Glu Asp Leu Gln Arg Gln Val Leu Ile Gly Asp Gly

1 5 10 15

Ala Met Gly Thr Leu Leu Tyr Ser Tyr Gly Ile Asp Arg Cys Phe Glu

20 25 30

Glu Leu Asn Ile Ser Lys Pro Glu Glu Ile Gln Arg Ile His Lys Ala

35 40 45

Tyr Val Glu Ala Gly Ala Asn Ile Ile Gln Thr Asn Thr Tyr Gly Ala

50 55 60

Asn Tyr Ile Lys Leu Ser Arg His Gly Leu Glu Asp Asp Ile Lys Lys

65 70 75 80

Met Asn Gln Glu Ala Val Lys Ile Ala Arg Ala Ser Ala Gly Asp Ala

85 90 95

Tyr Val Leu Gly Thr Met Gly Gly Ile Arg Thr Phe Asn Lys Asn Ala

100 105 110

Tyr Ser Leu Asp Glu Ile Lys Arg Ser Phe Arg Glu Gln Leu Tyr Leu

115 120 125

Leu Leu His Glu Glu Pro Asp Gly Leu Leu Leu Glu Thr Tyr Tyr Asp

130 135 140

Leu Glu Glu Ala Arg Glu Val Leu Lys Ile Ala Arg Lys Glu Thr Asp

145 150 155 160

Leu Pro Ile Met Leu Asn Val Ser Met His Glu Gln Gly Val Leu Gln

165 170 175

Asp Gly Thr Pro Leu Ser Asp Ala Leu Arg Ser Ile Ala Asp Leu Gly

180 185 190

Ala Asp Ile Val Gly Ile Asn Cys Arg Leu Gly Pro Tyr His Met Ile

195 200 205

Glu Ala Leu Ser Glu Val Pro Ile Phe Asp Asp Val Phe Leu Ser Val

210 215 220

Tyr Pro Asn Ser Ser Leu Pro Ser Leu Glu Glu Gly Arg Leu Val Tyr

225 230 235 240

Glu Thr Asp Asp Thr Tyr Phe Gln Asn Ser Ala Ser Glu Phe Arg Lys

245 250 255

Gln Gly Ala Arg Ile Ile Gly Gly Cys Cys Gly Thr Thr Pro Asn His

260 265 270

Ile Arg Ala Met Ala Glu Ala Val Gly Gly Leu Ala Pro Ile Thr Glu

275 280 285

Lys Glu Val Lys Thr Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ser Val His His Glu

290 295 300

Arg Thr Glu Pro Gly Leu Asp Glu Ile Ala Ala Lys Lys Arg Ser Ile

305 310 315 320

Ile Val Glu Leu Asp Pro Pro Lys Lys Leu Ser Phe Asp Lys Phe Leu

325 330 335

Ser Ala Ala Ala Glu Leu Lys Glu Ala Gly Ile Asp Ala Leu Thr Leu

340 345 350

Ala Asp Asn Ser Leu Ala Thr Pro Arg Ile Ser Asn Val Ala Cys Gly

355 360 365

Ala Leu Val Lys Gln Gln Leu Asp Met Arg Ser Leu Val His Ile Thr

370 375 380

Cys Arg Asp Arg Asn Ile Ile Gly Leu Gln Ser His Leu Met Gly Leu

385 390 395 400

Asp Thr Leu Gly Leu Asn Asp Val Leu Ala Ile Thr Gly Asp Pro Ser

405 410 415

Lys Ile Gly Asp Phe Pro Gly Ala Thr Ser Val Tyr Asp Leu Thr Ser

420 425 430

Phe Asp Leu Ile Arg Leu Ile Lys Gln Phe Asn Glu Gly Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Gly Lys Pro Leu Gly Lys Lys Thr Asn Phe Ser Val Ala Ala Ala

450 455 460

Phe Asn Pro Asn Val Arg His Leu Asp Lys Ala Val Lys Arg Leu Glu

465 470 475 480

Lys Lys Ile Asp Cys Gly Ala Asp Tyr Phe Val Ser Gln Pro Val Tyr

485 490 495

Ser Glu Gln Gln Leu Val Asp Ile His Asn Glu Thr Lys His Leu Lys

500 505 510

Thr Pro Ile Tyr Ile Gly Ile Met Pro Leu Thr Ser Ser Arg Asn Ala

515 520 525

Glu Phe Ile His Asn Glu Ile Pro Gly Ile Lys Leu Ser Asp Thr Ile

530 535 540

Arg Glu Lys Met Ala His Ala Gly Glu Asp Lys Glu Lys Gln Lys Ala

545 550 555 560

Glu Gly Leu Ala Ile Ala Arg Ser Leu Leu Asp Thr Ala Cys Glu Leu

565 570 575

Phe Asn Gly Ile Tyr Leu Ile Thr Pro Phe Leu Arg Ser Asp Leu Thr

580 585 590

Ala Glu Leu Thr Ser Tyr Ile Gln Gln Lys Asp Glu Gln Arg Gln Asn

595 600 605

Ile Phe Leu His

610

<210> 2

<211> 296

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ser Phe Phe His Ala Ser Gln Arg Asp Ala Leu Asn Gln Ser Leu

1 5 10 15

Ala Glu Val Gln Gly Gln Ile Asn Val Ser Phe Glu Phe Phe Pro Pro

20 25 30

Arg Thr Ser Glu Met Glu Gln Thr Leu Trp Asn Ser Ile Asp Arg Leu

35 40 45

Ser Ser Leu Lys Pro Lys Phe Val Ser Val Thr Tyr Gly Ala Asn Ser

50 55 60

Gly Glu Arg Asp Arg Thr His Ser Ile Ile Lys Gly Ile Lys Asp Arg

65 70 75 80

Thr Gly Leu Glu Ala Ala Pro His Leu Thr Cys Ile Asp Ala Thr Pro

85 90 95

Asp Glu Leu Arg Thr Ile Ala Arg Asp Tyr Trp Asn Asn Gly Ile Arg

100 105 110

His Ile Val Ala Leu Arg Gly Asp Leu Pro Pro Gly Ser Gly Lys Pro

115 120 125

Glu Met Tyr Ala Ser Asp Leu Val Thr Leu Leu Lys Glu Val Ala Asp

130 135 140

Phe Asp Ile Ser Val Ala Ala Tyr Pro Glu Val His Pro Glu Ala Lys

145 150 155 160

Ser Ala Gln Ala Asp Leu Leu Asn Leu Lys Arg Lys Val Asp Ala Gly

165 170 175

Ala Asn Arg Ala Ile Thr Gln Phe Phe Phe Asp Val Glu Ser Tyr Leu

180 185 190

Arg Phe Arg Asp Arg Cys Val Ser Ala Gly Ile Asp Val Glu Ile Ile

195 200 205

Pro Gly Ile Leu Pro Val Ser Asn Phe Lys Gln Ala Lys Lys Phe Ala

210 215 220

Asp Met Thr Asn Val Arg Ile Pro Ala Trp Met Ala Gln Met Phe Asp

225 230 235 240

Gly Leu Asp Asp Asp Ala Glu Thr Arg Lys Leu Val Gly Ala Asn Ile

245 250 255

Ala Met Asp Met Val Lys Ile Leu Ser Arg Glu Gly Val Lys Asp Phe

260 265 270

His Phe Tyr Thr Leu Asn Arg Ala Glu Met Ser Tyr Ala Ile Cys His

275 280 285

Thr Leu Gly Val Arg Pro Gly Leu

290 295

<210> 3

<211> 300

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Lys Ser Tyr Met Thr Gln Arg Leu Asp Glu Tyr Arg Asp Gly Asn

1 5 10 15

Glu Asp Lys Gly Arg Leu Leu Val Ser Cys Pro Asp Gln Pro Gly Ile

20 25 30

Val Ser Ala Val Ser Ala Phe Leu Phe Glu His Gly Ala Asn Ile Ile

35 40 45

Glu Ser Asn Gln Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Gly Gly Arg Phe Phe Leu

50 55 60

Arg Ile Glu Phe Asp Cys Ala Gly Ile Arg Glu Lys Lys Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Ala Ala Phe Ala Ser Val Ala Glu Lys Phe Asp Met Thr Trp Ser

85 90 95

Leu Thr Leu Ala Ser Glu Leu Lys Arg Val Ala Ile Phe Val Ser Lys

100 105 110

Glu Leu His Cys Leu His Glu Leu Ile Trp Glu Trp Gln Thr Gly Asn

115 120 125

Leu Met Ala Glu Ile Ala Val Val Ile Ser Asn His Glu Glu Ala Arg

130 135 140

Glu Leu Val Glu Arg Leu Asn Ile Pro Phe His Tyr Met Lys Ala Asn

145 150 155 160

Lys Asp Ile Arg Ala Glu Val Glu Lys Lys Gln Leu Glu Leu Leu Glu

165 170 175

Gln Tyr Asp Val Asp Val Ile Val Leu Ala Arg Tyr Met Gln Ile Leu

180 185 190

Thr Pro Asp Phe Val Ser Ala His Pro Asn Arg Ile Ile Asn Ile His

195 200 205

His Ser Phe Leu Pro Ala Phe Ile Gly Ala Asn Pro Tyr Lys Arg Ala

210 215 220

Tyr Glu Arg Gly Val Lys Leu Ile Gly Ala Thr Ser His Tyr Val Thr

225 230 235 240

Asn Asp Leu Asp Glu Gly Pro Ile Ile Glu Gln Asp Ile Glu Arg Val

245 250 255

Asp His Arg Asp Asn Ala Glu Ala Leu Lys Asn Ile Gly Arg Thr Ile

260 265 270

Glu Arg Ser Val Leu Ala Arg Ala Val Lys Trp His Leu Glu Asp Arg

275 280 285

Val Ile Val His Glu Asn Lys Thr Ile Val Phe Asn

290 295 300

<210> 4

<211> 168

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Ile Ser Phe Ile Phe Ala Met Asp Ala Asn Arg Leu Ile Gly Lys

1 5 10 15

Asp Asn Asp Leu Pro Trp His Leu Pro Asn Asp Leu Ala Tyr Phe Lys

20 25 30

Lys Ile Thr Ser Gly His Ser Ile Ile Met Gly Arg Lys Thr Phe Glu

35 40 45

Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Asn Arg Lys Asn Ile Val Val Thr Ser

50 55 60

Ala Pro Asp Ser Glu Phe Gln Gly Cys Thr Val Val Ser Ser Leu Lys

65 70 75 80

Asp Val Leu Asp Ile Cys Ser Gly Pro Glu Glu Cys Phe Val Ile Gly

85 90 95

Gly Ala Gln Leu Tyr Thr Asp Leu Phe Pro Tyr Ala Asp Arg Leu Tyr

100 105 110

Met Thr Lys Ile His His Glu Phe Glu Gly Asp Arg His Phe Pro Glu

115 120 125

Phe Asp Glu Ser Asn Trp Lys Leu Val Ser Ser Glu Gln Gly Thr Lys

130 135 140

Asp Glu Lys Asn Pro Tyr Asp Tyr Glu Phe Leu Met Tyr Glu Lys Lys

145 150 155 160

Asn Ser Ser Lys Ala Gly Gly Phe

165

<210> 5

<211> 430

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Phe Thr Ala Tyr Gln Asp Ala Arg Ser Trp Ile His Gly Arg Leu

1 5 10 15

Lys Phe Gly Val Lys Pro Gly Leu Gly Arg Met Lys Gln Leu Met Ala

20 25 30

Arg Leu Gly His Pro Glu Lys Lys Ile Arg Ala Phe His Val Ala Gly

35 40 45

Thr Asn Gly Lys Gly Ser Thr Val Ala Phe Ile Arg Ser Met Leu Gln

50 55 60

Glu Ala Gly Tyr Thr Val Gly Thr Phe Thr Ser Pro Tyr Ile Ile Thr

65 70 75 80

Phe Asn Glu Arg Ile Ser Val Asn Gly Ile Pro Ile Ser Asp Glu Glu

85 90 95

Trp Thr Ala Leu Val Asn Gln Met Lys Pro His Val Glu Ala Leu Asp

100 105 110

Gln Thr Glu Tyr Gly Gln Pro Thr Glu Phe Glu Ile Met Thr Ala Cys

115 120 125

Ala Phe Leu Tyr Phe Ala Glu Phe His Lys Val Asp Phe Val Ile Phe

130 135 140

Glu Thr Gly Leu Gly Gly Arg Phe Asp Ser Thr Asn Val Val Glu Pro

145 150 155 160

Leu Leu Thr Val Ile Thr Ser Ile Gly His Asp His Met Asn Ile Leu

165 170 175

Gly Asn Thr Ile Glu Glu Ile Ala Gly Glu Lys Ala Gly Ile Ile Lys

180 185 190

Glu Gly Ile Pro Ile Val Thr Ala Val Thr Gln Pro Glu Ala Leu Gln

195 200 205

Val Ile Arg His Glu Ala Glu Arg His Ala Ala Pro Phe Gln Ser Leu

210 215 220

His Asp Ala Cys Val Ile Phe Asn Glu Glu Ala Leu Pro Ala Gly Glu

225 230 235 240

Gln Phe Ser Phe Lys Thr Glu Glu Lys Cys Tyr Glu Asp Ile Arg Thr

245 250 255

Ser Leu Ile Gly Thr His Gln Arg Gln Asn Ala Ala Leu Ser Ile Leu

260 265 270

Ala Ala Glu Trp Leu Asn Lys Glu Asn Ile Ala His Ile Ser Asp Glu

275 280 285

Ala Leu Arg Ser Gly Leu Val Lys Ala Ala Trp Pro Gly Arg Leu Glu

290 295 300

Leu Val Gln Glu His Pro Pro Val Tyr Leu Asp Gly Ala His Asn Glu

305 310 315 320

Glu Gly Val Glu Lys Leu Ala Glu Thr Met Lys Gln Arg Phe Ala Asn

325 330 335

Ser Arg Ile Ser Val Val Phe Ser Ala Leu Lys Asp Lys Pro Tyr Gln

340 345 350

Asn Met Ile Lys Arg Leu Glu Thr Ile Ala His Ala Ile His Phe Ala

355 360 365

Ser Phe Asp Phe Pro Arg Ala Ser Leu Ala Lys Asp Leu Tyr Asp Ala

370 375 380

Ser Glu Ile Ser Asn Lys Ser Trp Ser Glu Asp Pro Asp Asp Val Ile

385 390 395 400

Lys Phe Ile Glu Ser Lys Lys Gly Ser Asn Glu Ile Val Leu Ile Thr

405 410 415

Gly Ser Leu Tyr Phe Ile Ser Asp Ile Arg Lys Arg Leu Lys

420 425 430

<210> 6

<211> 1267

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgaat tcgagctcgg 60

tacccgggga tcctctagag attgtaccgt tcgtatagca tacattatac gaagttatcg 120

attttcgttc gtgaatacat gttataataa ctataactaa taacgtaacg tgactggcaa 180

gagatatttt taaaacaatg aataggttta cacttacttt agttttatgg aaatgaaaga 240

tcatatcata tataatctag aataaaatta actaaaataa ttattatcta gataaaaaat 300

ttagaagcca atgaaatcta taaataaact aaattaagtt tatttaatta acaactatgg 360

atataaaata ggtactaatc aaaatagtga ggaggatata tttgaataca tacgaacaag 420

ttaataaagt gaaaaaaata cttcggaaac atttaaaaaa taaccttatt ggtacttaca 480

tgtttggatc aggagttgag agtggactaa aaccaaatag tgatcttgac tttttagtcg 540

tcgtatctga accattgaca gatcaaagta aagaaatact tatacaaaaa attagaccta 600

tttcaaaaaa aataggagat aaaagcaact tacgatatat tgaattaaca attattattc 660

agcaagaaat ggtaccgtgg aatcatcctc ccaaacaaga atttatttat ggagaatggt 720

tacaagagct ttatgaacaa ggatacattc ctcagaagga attaaattca gatttaacca 780

taatgcttta ccaagcaaaa cgaaaaaata aaagaatata cggaaattat gacttagagg 840

aattactacc tgatattcca ttttctgatg tgagaagagc cattatggat tcgtcagagg 900

aattaataga taattatcag gatgatgaaa ccaactctat attaacttta tgccgtatga 960

ttttaactat ggacacgggt aaaatcatac caaaagatat tgcgggaaat gcagtggctg 1020

aatcttctcc attagaacat agggagagaa ttttgttagc agttcgtagt tatcttggag 1080

agaatattga atggactaat gaaaatgtaa atttaactat aaactattta aataacagat 1140

taaaaaaatt ataaataact tcgtatagca tacattatac gaacggtaga atcgtcgacc 1200

tgcaggcatg caagcttggc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct 1260

ggcgtta 1267

<210> 7

<211> 1530

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgaat tcgagctcgg 60

tacccgggga tcctctagag attgtaccgt tcgtatagca tacattatac gaagttatgc 120

catagtgact ggcgatgctg tcggaatgga cgacggcaat agttaccctt attatcaaga 180

taagaaagaa aaggattttt cgctacgctc aaatccttta aaaaaacaca aaagaccaca 240

ttttttaatg tggtctttta ttcttcaact aaagcaccca ttagttcaac aaacgaaaat 300

tggataaagt gggatatttt taaaatatat atttatgtta cagtaatatt gacttttaaa 360

aaaggattga ttctaatgaa gaaagcagac aagtaagcct cctaaattca ctttagataa 420

aaatttagga ggcatatcaa atgaacttta ataaaattga tttagacaat tggaagagaa 480

aagagatatt taatcattat ttgaaccaac aaacgacttt tagtataacc acagaaattg 540

atattagtgt tttataccga aacataaaac aagaaggata taaattttac cctgcattta 600

ttttcttagt gacaagggtg ataaactcaa atacagcttt tagaactggt tacaatagcg 660

acggagagtt aggttattgg gataagttag agccacttta tacaattttt gatggtgtat 720

ctaaaacatt ctctggtatt tggactcctg taaagaatga cttcaaagag ttttatgatt 780

tatacctttc tgatgtagag aaatataatg gttcggggaa attgtttccc aaaacaccta 840

tacctgaaaa tgctttttct ctttctatta ttccatggac ttcatttact gggtttaact 900

taaatatcaa taataatagt aattaccttc tacccattat tacagcagga aaattcatta 960

ataaaggtaa ttcaatatat ttaccgctat ctttacaggt acatcattct gtttgtgatg 1020

gttatcatgc aggattgttt atgaactcta ttcaggaatt gtcagatagg cctaatgact 1080

ggcttttata atatgagata atgccgactg tactttttac agtcggtttt ctaacgatac 1140

attaataggt acgaaaaagc aacttttttt gcgcttaaaa ccagtcatac caataaataa 1200

cttcgtatag catacattat acgaacggta tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt 1260

taaatacagc cattgaacat acggttgatt taataactga caaacatcac cctcttgcta 1320

aagcggccaa ggacgccgcc gccggggctg tttgcgttct tgccgtgatt tcgtgtacca 1380

ttggtttact tatttttttg ccaaggctgt aatggctgaa aattcttaca tttattttac 1440

atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg 1500

taccattata ggtaagagag gaatgtacac 1530

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgaagtcggt ttggtgatct atactcaagg 30

<210> 9

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgtgaaattg ttatccgctc tgtctgcctc ctttattcac atcagcaagg aa 52

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cctggcgtta tttccaaaag actgcctgat cgaatcgg 38

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cgtgaaagtc ttgttctcta aaggatgtca gttc 34

<210> 12

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gtgaataaag gaggcagaca gagcggataa caatttcaca caggaaacag 50

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cttttggaaa taacgccagg gttttcccag tca 33

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cgaagtcggt ttggtgatct atactcaag 29

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ttatccgctc tgtctgcctc ctttattcac atcagcaa 38

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gaatgtacac atgagctttt ttcacgccag cc 32

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tccacggaaa tggttttgac ttcgag 26

<210> 18

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gaggcagaca gagcggataa caatttcaca caggaaac 38

<210> 19

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

aaaagctcat gtgtacattc ctctcttacc tataatggta ccg 43

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gggtagcgga gaaaatcggc atgcattaca 30

<210> 21

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cctgtgtgaa attgttatcc gctcttatga cagaattttt aaaccaactg ctgagcataa 60

aatcaacgcg a 71

<210> 22

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cctggcgtta cggaagcgct gaaaaacatc ggaagaac 38

<210> 23

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ctctccgctg ccagttccaa tgaatacttt ca 32

<210> 24

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ttggtttaaa aattctgtca taagagcgga taacaatttc acacaggaaa cagct 55

<210> 25

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

cagcgcttcc gtaacgccag ggttttccca gtcacgac 38

<210> 26

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cacacctttt tggatgatat tgtggcag 28

<210> 27

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ttatccgctc tcatacgctg accgcccctt ttat 34

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gaatgtacac atgatttcat tcatttttgc gatggatgcc 40

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

atcaccaacg gaagatgata gcgg 24

<210> 30

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

cagcgtatga gagcggataa caatttcaca caggaaaca 39

<210> 31

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

atgaaatcat gtgtacattc ctctcttacc tataatggta ccg 43

<210> 32

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

aagtggaatc gacctggaat tttgccaa 28

<210> 33

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

ttgttatccg ctctgataat cccctctttt ataagacaag gcggtttc 48

<210> 34

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

aagagaggaa tgtacacttg tttactgcat atcaagatgc gcgca 45

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

aacgctgctt catcgtttcc g 21

<210> 36

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

agaggggatt atcagagcgg ataacaattt cacacaggaa acag 44

<210> 37

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

tcttgatatg cagtaaacaa gtgtacattc ctctcttacc tataatggta ccgc 54

Claims

1.一种高产5-甲基四氢叶酸的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的出发菌株为枯草芽孢杆菌168，由如下方法制备而成：

（1）敲除了基因组上双功能同型半胱氨酸S-甲基转移酶/ 5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因yitJ，编码所述yitJ的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

（2）在（1）的基础上，过表达外源5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶编码基因metF，编码所述metF的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

（3）在（2）的基础上，敲除了甲酰四氢叶酸脱甲酰酶编码基因purU，编码所述purU的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

（4）在（3）的基础上，过表达二氢叶酸还原酶编码基因dfrA，编码所述dfrA的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

（5）在（4）的基础上，过表达二氢叶酸合成酶编码基因folC，编码所述folC的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.权利要求1的高产5-甲基四氢叶酸的枯草芽孢杆菌在制备含5-甲基四氢叶酸的产品方面的应用。

3.一种生产5-甲基四氢叶酸的方法，其特征在于，应用权利要求1的高产5-甲基四氢叶酸的枯草芽孢杆菌进行发酵。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将权利要求1的高产5-甲基四氢叶酸的枯草芽孢杆菌接种至发酵培养基，于35-38 ^oC、180-220 rpm条件下发酵8-24h。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，用于发酵的发酵培养基按g/L计，含有：酵母粉10~15，胰蛋白胨5~8，硫酸铵4~8，四水合磷酸氢二钾12~14，磷酸二氢钾2~3，七水合硫酸镁2~5，葡萄糖50~80；

或，按g/L计，含有：玉米浆12~15，硫酸铵2~5，七水合硫酸镁2~4，谷氨酸0.8~1.2，葡萄糖50~80，对氨基苯甲酸0.2~0.4。

6.权利要求1的高产5-甲基四氢叶酸的枯草芽孢杆菌在制备5-甲基四氢叶酸的应用。