CN113009033A - 一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113009033A CN113009033A CN202110231827.3A CN202110231827A CN113009033A CN 113009033 A CN113009033 A CN 113009033A CN 202110231827 A CN202110231827 A CN 202110231827A CN 113009033 A CN113009033 A CN 113009033A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- folic acid
- acid
- human body
- liquid phase
- tandem mass
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 title claims abstract description 104
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 title claims abstract description 53
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 title claims abstract description 53
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 51
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 51
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 title description 4
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 16
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 22
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 claims description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 13
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 10
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 6
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 6
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 claims description 3
- XBJFCYDKBDVADW-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;formic acid Chemical compound CC#N.OC=O XBJFCYDKBDVADW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 3
- 239000011888 foil Substances 0.000 claims description 3
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 claims description 3
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 abstract description 19
- VVIAGPKUTFNRDU-ABLWVSNPSA-N folinic acid Chemical compound C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C=O)C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 VVIAGPKUTFNRDU-ABLWVSNPSA-N 0.000 abstract description 12
- ZNOVTXRBGFNYRX-ABLWVSNPSA-N levomefolic acid Chemical compound C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C)C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 ZNOVTXRBGFNYRX-ABLWVSNPSA-N 0.000 abstract description 12
- MSTNYGQPCMXVAQ-KIYNQFGBSA-N 5,6,7,8-tetrahydrofolic acid Chemical compound N1C=2C(=O)NC(N)=NC=2NCC1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 MSTNYGQPCMXVAQ-KIYNQFGBSA-N 0.000 abstract description 11
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N S-adenosyl-L-methioninate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H](N)C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N 0.000 abstract description 11
- 229960001570 ademetionine Drugs 0.000 abstract description 11
- 229940105150 5-methyltetrahydrofolic acid Drugs 0.000 abstract description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 10
- QYNUQALWYRSVHF-OLZOCXBDSA-N (6R)-5,10-methylenetetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1C1)N)N1C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 QYNUQALWYRSVHF-OLZOCXBDSA-N 0.000 abstract description 9
- ZJUKTBDSGOFHSH-WFMPWKQPSA-N S-Adenosylhomocysteine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CSCC[C@H](N)C(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZJUKTBDSGOFHSH-WFMPWKQPSA-N 0.000 abstract description 8
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 abstract description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 abstract 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 7
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 6
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 6
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 5
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 5
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 5
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 4
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 4
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 4
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- ZHKQAQKGVKBJPP-YUZLPWPTSA-N (2s)-2-[[4-[(2-amino-4-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-1h-pteridin-6-yl)methyl-methylamino]benzoyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2NC1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 ZHKQAQKGVKBJPP-YUZLPWPTSA-N 0.000 description 2
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical class O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 2
- 235000007635 levomefolic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011578 levomefolic acid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- RTDXMJJSUVCSKB-RUCXOUQFSA-N (2s)-2-azanyl-4-sulfanyl-butanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS.OC(=O)[C@@H](N)CCS RTDXMJJSUVCSKB-RUCXOUQFSA-N 0.000 description 1
- MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N (6S)-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1)N)NC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- VVIAGPKUTFNRDU-STQMWFEESA-N (6S)-5-formyltetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1C=O)N)NC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 VVIAGPKUTFNRDU-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- VVIAGPKUTFNRDU-UHFFFAOYSA-N 6S-folinic acid Natural products C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C=O)C1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 VVIAGPKUTFNRDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BYGYQIVVUSEKKC-VYYJYEHXSA-N CN1C=2C(NC(=NC2NCC1CNC1=CC=C(C(N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)=O)C=C1)N)=O.CN1C=2C(NC(=NC2NCC1CNC1=CC=C(C(N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)=O)C=C1)N)=O Chemical compound CN1C=2C(NC(=NC2NCC1CNC1=CC=C(C(N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)=O)C=C1)N)=O.CN1C=2C(NC(=NC2NCC1CNC1=CC=C(C(N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)=O)C=C1)N)=O BYGYQIVVUSEKKC-VYYJYEHXSA-N 0.000 description 1
- 208000037088 Chromosome Breakage Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 230000030933 DNA methylation on cytosine Effects 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 206010016880 Folate deficiency Diseases 0.000 description 1
- MPJKWIXIYCLVCU-UHFFFAOYSA-N Folinic acid Natural products NC1=NC2=C(N(C=O)C(CNc3ccc(cc3)C(=O)NC(CCC(=O)O)CC(=O)O)CN2)C(=O)N1 MPJKWIXIYCLVCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 208000031448 Genomic Instability Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 230000006093 RNA methylation Effects 0.000 description 1
- DQECMAPJSANQOM-KSEQEIEVSA-N [C@@H]1([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CSCC[C@H](N)C(=O)O)O1)N1C=NC=2C(N)=NC=NC12.[C@@H]1([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CSCC[C@H](N)C(=O)O)O1)N1C=NC=2C(N)=NC=NC12 Chemical compound [C@@H]1([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CSCC[C@H](N)C(=O)O)O1)N1C=NC=2C(N)=NC=NC12.[C@@H]1([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CSCC[C@H](N)C(=O)O)O1)N1C=NC=2C(N)=NC=NC12 DQECMAPJSANQOM-KSEQEIEVSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 150000002224 folic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000008191 folinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011672 folinic acid Substances 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 229910001679 gibbsite Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229960001691 leucovorin Drugs 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005460 tetrahydrofolate Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
- G01N2030/027—Liquid chromatography
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明公开了一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒及检测方法，属于分析检测技术领域。本发明公开的一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒，可以对人体内叶酸代谢衍生物中的叶酸、四氢叶酸、5‑甲基四氢叶酸、5‑甲酰四氢叶酸、5,10‑亚甲基四氢叶酸、S‑腺苷甲硫氨酸、S‑腺苷同型半胱氨酸和同型半胱氨酸血清(血浆)含量进行检测；方法具有简单，快捷，专属性强，灵敏度高，检测指标全面等特点；可以在临床应用中，为了解叶酸代谢情况提供参考依据。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，更具体的说是涉及一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒及检测方法。
背景技术
叶酸(folate)是一类物质的总称，其中包括了叶酸(folic acid)及其衍生物5-甲酰四氢叶酸(5-FoTHF，亚叶酸)，5-甲基四氢叶酸(5-MeTHF)，5,10-亚甲基四氢叶酸和四氢叶酸(THF)等。叶酸主要影响DNA合成和DNA甲基化两个过程，一方面是尿嘧啶脱氧核苷酸(dUMP)到胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP)的转化，dUMP因叶酸缺乏导致积累，而错误掺入DNA。大量掺入的dUMP在随后的DNA复制和修复过程中容易诱发基因突变、DNA单双链断裂、染色体断裂等基因组稳定性下降事件及细胞恶性转化。另一方面是5-甲基四氢叶酸在催化下将甲基转移到同型半胱氨酸上，使其转化为甲硫氨酸，随即形成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，SAM是胞嘧啶甲基化过程中的甲基供体。叶酸摄入不足将影响同型半胱氨酸代谢途径，导致DNA和RNA甲基化异常及改变基因表达，从而引发各类相关疾病的发生。
目前，叶酸检测多以化学发光法为主，常常单独测试叶酸及同型半胱氨酸，主要因为此方法具有自动化程度高，重现性好，灵敏度高等优点。但是，化学发光法无法对叶酸代谢中的多种衍生物同时进行检测。质谱平台上，以往报道多以叶酸和同型半胱氨酸、半胱氨酸等组合或叶酸与5-甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸等组合，都只能对叶酸代谢衍生物的其中一个影响路径指标进行测试。
因此，提供一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒及检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒及检测方法，基于液相串联质谱平台全面对叶酸代谢过程中的多种关键化合物进行定量检测，方法高效，灵敏，检测下限较低，而且准确度高，能对整个叶酸代谢水平进行全面评估。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒，包括如下组分：
进一步，所述校准品的组成如下：
进一步，所述质控品的组成如下：
一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测方法，采用液相串联质谱法：先用提取试剂对样本(校准品、质控品、血清(血浆)样本)提取纯化，然后再通过液相串联质谱仪对各个衍生物进行分离，检测。
一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测方法，对叶酸代谢的衍生物：叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸、S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸和同型半胱氨酸进行区分，并准确检测；利用所述的试剂盒进行检测，具体步骤如下：
(1)取100～200μL样本(血清、校准品或质控品)至Ep管中，加入5μL混合内标溶液后，加入500μL提取液1后涡旋振荡1min，混匀；
(2)离心后转移400～500μL上清于96孔进样板中；
(3)氮气吹干；
(4)加入100μL复溶液2复溶，覆上铝箔封膜，检测备用；
(5)将96孔进样板放入自动进样器中，准备上机；
所述上机条件如下：
①色谱条件
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；
流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液；
流速：450μL/min；
柱温：40℃；
进样量：5μL；
洗脱梯度如下表：
②质谱条件
在电喷雾离子正离子检测模式下，采用MRM扫描分析，离子源参数：雾化气流量为3L/min；干燥气流量为2L/min；加热气流量为15L/min；DL管温度为100-400℃；接口温度为100-400℃；加热块温度为100-400℃，CID气：100-300kPa；前体与产物离子通道如下表所示：
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒及检测方法，通过本发明方法测试，可以对人体内叶酸代谢衍生物中的叶酸(Folic acid)、四氢叶酸(Tetrahydrofolate)、5-甲基四氢叶酸(5-Methyltetrahydrofolate)、5-甲酰四氢叶酸(Folinate)、5,10-亚甲基四氢叶酸(5,10-Methylenetetrahydrofolate)、S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosylme-Thionine)、S-腺苷同型半胱氨酸(S-AdenosylHomocysteine)和同型半胱氨酸(Homocysteine)血清(血浆)含量进行检测；方法具有简单，快捷，专属性强，灵敏度高，检测指标全面等特点；可以在临床应用中，为了解叶酸代谢情况提供参考依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例1的标准品叶酸的色谱图；
图2附图为本发明实施例1叶酸内标的色谱图；
图3附图为本发明实施例1的标准品四氢叶酸的色谱图；
图4附图为本发明实施例1的标准品5-甲基四氢叶酸的色谱图；
图5附图为本发明实施例1的标准品5-甲酰四氢叶酸的色谱图；
图6附图为本发明实施例1的标准品5,10-亚甲基四氢叶酸的色谱图；
图7附图为本发明实施例1的标准品同型半胱氨酸的色谱图；
图8附图为本发明实施例1同型半胱氨酸内标的色谱图；
图9附图为本发明实施例1的标准品S-腺苷甲硫氨酸的色谱图；
图10附图为本发明实施例1的标准品S-腺苷同型半胱氨酸的色谱图；
图11附图为本发明实施例1的标准品叠加色谱图总离子流图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
试剂：所有叶酸标准品纯度均大于65％，购自Sigma-Aldrich。同位素叶酸(内标)、同型半胱氨酸(内标)均来自剑桥同位素实验室。抗坏血酸、柠檬酸和二硫苏糖醇均为色谱纯，购自Sigma–Aldrich公司(St.Lous,美国)。使用Milli-Q系统(Millipore，MA，USA)制备去离子水。仪器：岛津LC-MS/MS8050CL。标准品叶酸购自macklin、5-甲基四氢叶酸购自吉至、四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸、S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸和同型半胱氨酸购自Sigma-Aldrich。
实施例1
一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒，包括如下组分：
叶酸、叶酸内标、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸、同型半胱氨酸、同型半胱氨酸内标、S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸的色谱图见图1-10；标准品叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸、同型半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸的总离子流图见图11。其中，色谱图的横坐标为时间，单位min；纵坐标为响应值。
配制方法为：
①PBS缓冲液：
称取磷酸二氢钾0.24g，磷酸氢二钠1.44g，氯化钠8g，氯化钾0.2g，加入去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容至1L即得。
②5％牛血清白蛋白溶液(5％BSA溶液，模拟人血清)：
称取适量牛血清白蛋白，按50mg/mL加入PBS缓冲液溶解，混匀即得。
③三联抗氧化剂：
称取抗坏血酸、柠檬酸、二硫苏糖醇(DTT)适量，加入甲醇，分别配制成1mg/mL甲醇溶液。然后按抗坏血酸：柠檬酸：DTT：水＝1：1：1：7配制成浓度为100μg/mL的三联抗氧化剂。
④储备液配制
称取适量各标准品叶酸、叶酸内标、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸、S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸和同型半胱氨酸、同型半胱氨酸内标，分别加入三联抗氧化剂配制成1mg/mL的各储备液。
⑤内标准品溶液配制
取叶酸内标和同型半胱氨酸内标储备液，用三联抗氧化剂稀释成叶酸内标浓度为1μg/mL，同型半胱氨酸内标浓度为20μg/mL的内标准品溶液(混合内标溶液)。
⑥校准品
先将各储备液配制成梯度混合标准品溶液，然后按混合标准品溶液：5％牛血清白蛋白溶液＝1：99配制成如下浓度校准品：
⑦质控品
先将各储备液配制成2个混合标准品溶液，然后按混合标准品溶液：5％牛血清白蛋白溶液＝1：99配制成如下浓度质控品：
⑧提取液1
配制含100μg/mL抗坏血酸、柠檬酸、二硫苏糖醇的甲醇溶液，即为提取液1。
⑨复溶液2
配制含100μg/mL抗坏血酸、柠檬酸、二硫苏糖醇的10％乙腈溶液，即为复溶液2。
实施例2一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测方法
(1)样本采集
按照现行静脉血采集方法空腹采血(血清或血浆)，所有样本应当按照血源性传染病标本对待。
(2)样本处理
取100～200μL样本(血清、校准品或质控品)至Ep管中，加入5μL内标准品溶液后，再加入500μL提取液1后涡旋振荡1min，混匀。离心后转移400μL上清于96孔进样板中。氮气吹干。加入100μL复溶液2复溶，覆上铝箔封膜，检测备用。将96孔进样板放入自动进样器中，准备上机。
(3)上机条件
①色谱条件
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；
流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液；
流速：450μL/min；
柱温：40℃
进样量：5μL
洗脱梯度如下表：
②质谱条件
在电喷雾离子正离子检测模式下，采用MRM扫描分析，离子源参数：雾化气流量为3L/min；干燥气流量为2L/min；加热气流量为15L/min；DL管温度为100-400℃；接口温度为100-400℃；加热块温度为100-400℃，CID气：100-300kPa；前体与产物离子通道如下表所示：
(4)方法学考察
①标准曲线及质控品控制
本方法采用内标进行定量：5-甲基四氢叶酸，5-甲酰四氢叶酸，5,10-亚甲基四氢叶酸，叶酸，四氢叶酸均共用叶酸内标；S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸和同型半胱氨酸共用同型半胱氨酸内标。
以校准品待测物峰面积与对应内标峰面积的比值作为纵坐标(y)，以各校准品的浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线y＝bx+a。标准曲线拟合后，相关系数r﹥0.99。
质控品测试准确度应符合85％～115％。
标准曲线范围如下表：
结果如下表：
②检测限及定量限考察
取标准曲线下限样品校准品C1，以5％牛血清白蛋白溶液1：1稀释，再进行前处理，以检测限信噪比3：1，及定量限信噪比10：1进行考察，定量限浓度样本再重复取样6份进行考察，CV值应＜20％。结果见下表：
③精密度考察
3个浓度精密度样本平行取样12份，测试结果代入标准曲线中，计算出浓度，CV值应≤15％。结果见下表：
④回收率考察
配制3个浓度混合标准品溶液，然后按混合标准品溶液：血清样本＝1：99加入血清中，通过上述前处理及测试，计算出回收率，各浓度回收率应≥80％，≤120％。结果见下表：
(5)样本检测
通过对20名检测者按本发明方法进行检测，检测建立范围如下：
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (4)
1.一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒，其特征在于，包括如下组分：
2.根据权利要求1所述的一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒，其特征在于，所述校准品的组成如下：
3.根据权利要求1所述的一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒，其特征在于，所述质控品的组成如下：
4.一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述的试剂盒进行检测，具体步骤如下：
(1)取100～200μL血清、校准品或质控品至Ep管中，加入5μL混合内标溶液后，加入500μL提取液1后涡旋振荡1min，混匀；
(2)离心后转移400～500μL上清于96孔进样板中；
(3)氮气吹干；
(4)加入100μL复溶液2复溶，覆上铝箔封膜，检测备用；
(5)将96孔进样板放入自动进样器中，准备上机；
所述上机条件如下：
①色谱条件
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；
流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液；
流速：450μL/min；
柱温：40℃；
进样量：5μL；
洗脱梯度如下表：
②质谱条件
在电喷雾离子正离子检测模式下，采用MRM扫描分析，离子源参数：雾化气流量为3L/min；干燥气流量为2L/min；加热气流量为15L/min；DL管温度为100-400℃；接口温度为100-400℃；加热块温度为100-400℃，CID气：100-300kPa；前体与产物离子通道如下表所示：
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110231827.3A CN113009033A (zh) | 2021-03-02 | 2021-03-02 | 一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒及检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110231827.3A CN113009033A (zh) | 2021-03-02 | 2021-03-02 | 一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒及检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113009033A true CN113009033A (zh) | 2021-06-22 |
Family
ID=76402777
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110231827.3A Pending CN113009033A (zh) | 2021-03-02 | 2021-03-02 | 一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒及检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113009033A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115144520A (zh) * | 2022-05-31 | 2022-10-04 | 北京豪思生物科技股份有限公司 | 母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法 |
| CN115436540A (zh) * | 2022-09-26 | 2022-12-06 | 汤臣倍健股份有限公司 | 一种同时测定血液中叶酸和同型半胱氨酸含量的方法及试剂盒 |
| CN116718710A (zh) * | 2023-08-09 | 2023-09-08 | 江苏硕世生物科技股份有限公司 | 一种检测叶酸及其代谢物的试剂盒和方法 |
| CN117214350A (zh) * | 2023-11-08 | 2023-12-12 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 多形态叶酸总含量的检测方法及试剂盒 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006096691A1 (en) * | 2005-03-04 | 2006-09-14 | Bergen Teknologioverforing As | Determination of folate in samples of serum or plasma |
| CN107015003A (zh) * | 2017-03-06 | 2017-08-04 | 辽宁润生康泰生物医药科技有限公司 | 一种用于定量检测同型半胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸的试剂盒 |
| CN109652351A (zh) * | 2018-12-18 | 2019-04-19 | 江南大学 | 一种高产5-甲基四氢叶酸重组枯草芽孢杆菌及其应用 |
| CN110146628A (zh) * | 2019-06-18 | 2019-08-20 | 上海可力梅塔生物医药科技有限公司 | 一种高效液相色谱串质谱技术检测血斑中叶酸的试剂盒 |
-
2021
- 2021-03-02 CN CN202110231827.3A patent/CN113009033A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006096691A1 (en) * | 2005-03-04 | 2006-09-14 | Bergen Teknologioverforing As | Determination of folate in samples of serum or plasma |
| CN107015003A (zh) * | 2017-03-06 | 2017-08-04 | 辽宁润生康泰生物医药科技有限公司 | 一种用于定量检测同型半胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸的试剂盒 |
| CN109652351A (zh) * | 2018-12-18 | 2019-04-19 | 江南大学 | 一种高产5-甲基四氢叶酸重组枯草芽孢杆菌及其应用 |
| CN110146628A (zh) * | 2019-06-18 | 2019-08-20 | 上海可力梅塔生物医药科技有限公司 | 一种高效液相色谱串质谱技术检测血斑中叶酸的试剂盒 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| MARKUS KOPP ET AL.: "Stable Isotope Dilution Assays for Clinical Analyses of Folates and Other One-Carbon Metabolites Application to Folate-Deficiency Studies", 《PLOS ONE》 * |
| XIAO-PING LIANG ET AL.: "Simultaneous determination of sixteen metabolites related to neural tube defects in maternal serum by liquid chromatography coupling with electrospray tandem mass spectrometry", 《TALANTA》 * |
| XIUWEI WANG ET AL.: "Quantification of folate metabolites in serum using ultraperformanceliquid chromatography tandem mass spectrometry", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B》 * |
| 丁晓琛 等: "超高效液相色谱-串联质谱法测定血清中叶酸代谢物", 《分析试验室》 * |
| 丁晓琛: "血清叶酸及其相关代谢产物超高效液相色谱-串联质谱法建立及应用研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生辑》 * |
| 唐秀芳 等: "高效液相色谱紫外检测法同时测定小鼠红细胞中S-腺苷甲硫氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸", 《分析化学》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115144520A (zh) * | 2022-05-31 | 2022-10-04 | 北京豪思生物科技股份有限公司 | 母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法 |
| CN115144520B (zh) * | 2022-05-31 | 2023-12-05 | 北京豪思生物科技股份有限公司 | 母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法 |
| CN115436540A (zh) * | 2022-09-26 | 2022-12-06 | 汤臣倍健股份有限公司 | 一种同时测定血液中叶酸和同型半胱氨酸含量的方法及试剂盒 |
| CN116718710A (zh) * | 2023-08-09 | 2023-09-08 | 江苏硕世生物科技股份有限公司 | 一种检测叶酸及其代谢物的试剂盒和方法 |
| CN117214350A (zh) * | 2023-11-08 | 2023-12-12 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 多形态叶酸总含量的检测方法及试剂盒 |
| CN117214350B (zh) * | 2023-11-08 | 2024-04-12 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 多形态叶酸总含量的检测方法及试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113009033A (zh) | 一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒及检测方法 | |
| Nandania et al. | Simultaneous measurement of folate cycle intermediates in different biological matrices using liquid chromatography–tandem mass spectrometry | |
| Zheng et al. | Simultaneous quantitation of folic acid and 5-methyltetrahydrofolic acid in human plasma by HPLC–MS/MS and its application to a pharmacokinetic study | |
| CN110068644B (zh) | 高效液相色谱串联质谱测定血浆中奥氮平浓度的方法 | |
| Alam et al. | Measurement of homocysteine: a historical perspective | |
| CN108828077B (zh) | 一种同时检测血浆中卡培他滨及其代谢产物的试剂盒及其检测方法与应用 | |
| Li et al. | Comparative analysis of nucleosides and nucleobases from different sections of Elaphuri Davidiani Cornu and Cervi Cornu by UHPLC–MS/MS | |
| Bartosiak et al. | Determination of cobalt species in nutritional supplements using ICP-OES after microwave-assisted extraction and solid-phase extraction | |
| CN113917015A (zh) | 一种同时检测人血清中多种维生素的检测方法 | |
| CN113917049A (zh) | 临床研究血浆样本中氯丙嗪及代谢物浓度的生物分析方法 | |
| CN115980248A (zh) | 检测甲氨蝶呤、叶酸、5-甲酰四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸的试剂套装 | |
| CN115902048A (zh) | 甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的方法 | |
| CN113125600B (zh) | 一种同时测定血清中3种维生素b12的浓度的方法 | |
| CN113607854B (zh) | 同时检测多种维生素的方法和检测试剂盒 | |
| CN111693616A (zh) | 液相色谱串联质谱测定血液样本中b族维生素的方法 | |
| CN113533597A (zh) | 测定人血浆中艾司奥美拉唑的方法 | |
| Ji et al. | Determination of plasma homocysteine with a UHPLC–MS/MS method: Application to analyze the correlation between plasma homocysteine and whole blood 5‐methyltetrahydrofolate in healthy volunteers | |
| CN112881550B (zh) | 一种测定饮料饮品中四种嘌呤的超高效液相色谱-串联质谱分析方法 | |
| CN110007034A (zh) | 一种基于液相色谱串联质谱测定医用食品中氨基酸的方法 | |
| CN114624361A (zh) | 同时测定人血浆中别嘌醇和氧别嘌醇浓度的方法 | |
| Cao et al. | A sensitive, robust and high-throughput isotope dilution LC–MS/MS method for quantifying three folate forms in serum | |
| CN111521707A (zh) | 一种lc-ms/ms测定血浆中阿哌沙班浓度的方法 | |
| CN116087373B (zh) | 红细胞中叶酸和5-甲基四氢叶酸的检测方法及前处理方法 | |
| CN112485340A (zh) | 一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中1,5-脱水山梨醇的方法 | |
| CN115436536B (zh) | 同型半胱氨酸生化代谢相关标志物的检测方法以及基于该方法的检测试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210622 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |