CN113125600B - 一种同时测定血清中3种维生素b12的浓度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种同时测定血清中3种维生素B12的浓度的方法，所述3种维生素B12分别为氰钴胺、甲钴胺和腺苷钴胺(5’‑脱氧腺苷钴胺素，辅酶B12)，采用二维液相色谱系统及柱切换技术相结合，对去除蛋白后的血清待测样品进行上机检测。本发明的方法采用了二维液相色谱系统，简单的前处理(去蛋白)方法，减少了操作过程带来的误差，提高了检测通量。相同的分析方法可以进行血清中3种维生素B12的同时测定，可同时建立标准曲线，且各待测物间相互不产生干扰。大大减少了样品分析时不同方法交替平衡系统的时间。

Description

一种同时测定血清中3种维生素B12的浓度的方法

技术领域

本发明涉及药物检测技术领域，具体涉及一种同时测定血清中3种维生素B12的浓度的方法。

背景技术

维生素B12又称为钴胺素(Cobalamin)，是一类含钴的咕啉类化合物的总称，是唯一含金属元素的维生素，也是B族维生素中发现最晚的一种。维生素B12是一种含有3价钴的多环系化合物，4个还原的吡咯环连在一起变成为1个咕啉大环(与卟啉相似)，是维生素B12分子的核心，所以含这种环的化合物都被称为类咕啉。维生素B12是自然界中由生物合成的最为复杂的小分子物质，它参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血；参与人体细胞代谢，影响DNA的合成与调节；还参与脂肪酸的合成和能量的生成。维生素B12也是神经系统功能健全不可缺少的维生素，参与神经组织中一种脂蛋白的形成。

氰钴胺(Cyanocobalamin)、甲钴胺(Methylcobalamin)、羟钴胺(Hydroxycobalamin)和腺苷钴胺(Deoxyadenosylcobalamin)是维生素B12主要存在形式。其中，甲钴胺和腺苷钴胺是水合钴胺素(Aquacobalamin)是另一种潜在的重要形式，但在酸性条件下会转化为它的共轭碱形式-羟钴胺。在钴胺素的四种主要形式中，甲钴胺和腺苷钴胺是B12的活性形式，甲钴胺是蛋氨酸合酶的辅酶，催化同型半胱氨酸转化为蛋氨酸，此反应是叶酸依赖性的，甲基四氢叶酸被转化为四氢叶酸；腺苷钴胺是线粒体酶甲基丙二酰辅酶A变位酶的辅酶，催化甲基丙二酰辅酶A转化为琥珀酰辅酶A，这是丙酸转化为琥珀酸的中间步骤，这种转化是奇链脂肪酸氧化和生酮氨基酸分解代谢的重要步骤。氰钴胺和羟钴胺要转化为B12的活性形式才能发挥作用。所有形式的钴胺素都对光敏感，甲钴胺和腺苷钴胺极不稳定，光照后几秒钟内光降解为羟钴胺。

人们早就知道维生素缺乏会对人体健康造成各种影响。维生素B12水平低会导致严重的健康问题，如巨幼细胞贫血、细胞分裂抑制和髓鞘功能障碍。维生素B12缺乏还与各种神经系统问题相关，研究表明，维生素B12水平异常低可能是导致严重认知功能障碍的原因。目前对维生素B12缺乏症的诊断还没有明确的定义或金标准测试，诊断通常是基于血清维生素B12水平低、临床症状以及对替代治疗有反应这些证据来进行。目前没有公认的参考值来定义维生素B12缺乏症，2008年世界卫生组织建议血清氰钴胺浓度的临界值设定为203pg/mL；然而，已经观察到神经系统表现出现在该临界值以上的水平(可能是由于髓鞘发育不良)，因此建议使用298-350pg/mL的较高临界值。

迄今为止，血清中维生素B12的测定方法主要有免疫分析法，包括酶联免疫法和化学发光免疫分析法，还有高效液相色谱法(HPLC)和高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)等。由于免疫分析法所用的抗体不能区分钴胺素的不同形式，故不能区分测定不同形式的钴胺素，检测精度也不高；而高效液相色谱法虽然检测精度得到很大提高，但灵敏度达不到血清钴胺素的检测要求；目前报道的钴胺素的高效液相色谱-质谱法只检测了氰钴胺，且灵敏度也没有满足要求，还未有同时测定血清中3种维生素B12的的高效液相色谱-质谱法被报道。

发明内容

为了克服上述技术缺陷，本发明的技术目的是提供一种同时测定血清中3种维生素B12的浓度的方法，该方法样品前处理可以采用简单的蛋白沉淀法，减少了操作过程带来的误差，提高了检测通量。该方法对血清样品进行处理后，使用第一维的前处理柱进行净化和富集，第二维的分析柱和检测器(三重四级杆质谱仪)的多维液相色谱分析装置对血清中3种维生素B12进行同时测定，大大降低了干扰和基质效应，提高了检测的特异性和灵敏度。

本发明提供如下技术方案：

一种同时测定血清中3种维生素B12的浓度的方法，采用二维液相色谱系统及柱切换技术相结合，对去除蛋白后的血清待测样品进行检测，所述3种维生素B12为氰钴胺、甲钴胺和腺苷钴胺。

本发明的方法，其中所述二维液相色谱系统及柱切换技术具体是：构建二维液相色谱分析装置，第一维液相色谱采用等度洗脱，进样后，样品随流动相进入前处理柱进行净化和富集，然后进行流路切换，样品进入第二维液相色谱部分的分析柱进行分离，最后进入检测器检测，在第二维液相色谱部分采用梯度洗脱；洗脱后得到色谱图，根据色谱图的不同物质和内标的峰面积，根据已建立好的标准曲线方程，计算出待测样品的目标物浓度。

本发明的方法，优选地，其中所述二维液相色谱系统及柱切换技术中，第一维液相色谱部分中的前处理柱为4.6×30mm,50μm的硅胶C18柱或相当者，前处理流动相为甲醇的10％(V/V)水溶液，流速为1.8mL/min；第二维液相色谱部分中的分析柱为50×4.6mm，2.7μm的C18柱或相当者，分析流动相为甲醇和水，流速为0.7mL/min。

本发明的方法，其中所述二维液相色谱系统及柱切换技术中，色谱柱温为25～50℃，进样量是50～100μL；优选为色谱柱温30℃、进样量50μL。

本发明的方法，其中所述血清待测样品是取血清待测液，加入等量的内标工作液，涡旋混匀；再加入等量的0.2M的硫酸锌水溶液，涡旋混匀后，在10000-15000rpm的高速离心机中离心10-15min，移取上清液进样检测。

所述标准曲线方程的建立方法是：取标准曲线工作液，加入等量的内标工作液，涡旋混匀；再加入等量的0.2M的硫酸锌水溶液，涡旋混匀后，在10000-15000rpm的高速离心机中离心10-15min，移取上清液进样检测；在色谱图上得到各物质的峰面积，以某一物质的溶液浓度为横坐标x，以该物质和内标的峰面积比值为纵坐标y，采用最小二乘法进行线性回归，得到标准曲线方程y＝a*x+b。

所述内标工作液为体积比为4:1的乙腈-甲醇的氰钴胺-13C7和甲钴胺-d3的5ng/mL混合溶液。

所述标准曲线工作液是3种维生素B12的混合系列标准曲线工作液，浓度均为：0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0ng/mL。

该方法样品前处理采用简单的蛋白沉淀法(采用常规的蛋白沉淀剂处理即可)，减少了操作过程带来的误差，提高了检测通量。该方法对血清样品进行处理后，使用第一维的前处理柱进行净化和富集，第二维的分析柱和检测器(三重四级杆质谱仪)的多维液相色谱分析装置对血清中3种维生素B12进行同时测定，大大降低了干扰和基质效应，提高了检测的特异性和灵敏度。相同的分析方法可以进行血清中3种维生素B12的同时测定，可同时建立标准曲线，且各待测物间相互不产生干扰。大大减少了样品分析时不同方法交替平衡系统的时间。

附图说明

图1是本发明实施例中二维液相实施方式的流程示意图；

图2是本发明实施例提供的氰钴胺的代表性色谱图；

图3是本发明实施例提供的甲钴胺的代表性色谱图；

图4是本发明实施例提供的腺苷钴胺的代表性色谱图；

图5是本发明实施例提供的氰钴胺的标准曲线图；

图6是本发明实施例提供的甲钴胺的标准曲线图；

图7是本发明实施例提供的腺苷钴胺的标准曲线图。

具体实施方式

下面，结合实施例对本发明做进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护之中。

一种同时测定血清中3种维生素B12的浓度的方法，所述3种维生素B12分别为氰钴胺、甲钴胺和腺苷钴胺(5’-脱氧腺苷钴胺素，辅酶B12)，采用二维液相色谱系统及柱切换技术相结合，对去除蛋白后的血清待测样品进行上机检测。

装置构建及其工作条件：

作为本实施例中使用的多维液相色谱分析装置，如图1所示构建二维液相色谱分析装置，第一维液相色谱采用等度洗脱，进样器完成进样后，样品随流动相进入前处理柱进行净化和富集(图1a)。然后，采用六通阀进行流路切换，样品进入第二维液相色谱部分的分析柱进行分离(图1b)，最后进入检测器检测，在第二维液相色谱部分采用两个高压梯度泵用以实施梯度洗脱。

第一维液相色谱部分设定为如下的工作条件：

前处理柱：硅胶C18柱或相当者(4.6×30mm,50μm)

前处理流动相：甲醇的10％(V/V)水溶液；

流速：1.8mL/min；

柱温：30℃；

进样量：50μL；

第二维液相色谱部分设定为如下的工作条件：

分析柱：C18 Column(50×4.6mm，2.7μm)或相当者

分析流动相：甲醇和水，梯度洗脱程序见表1；

流速：0.7mL/min；

柱温：30℃；

表1梯度洗脱程序

时间(min)	水(V，％)	甲醇(V，％)
			0.00	80	20
3.00	80	20
			4.00	10	90
5.5	10	90
			5.6	5	95
7.00	5	95
			7.01	80	20
8.50	80	20

本实施例的第一维液相色谱部分与第二维液相色谱部分的切换通过六通阀进行，阀切换的程序见表2；

表2阀切换程序

时间(min)	阀位置
		0.00	图1的(a)所示的位置
3.00	图1的(b)所示的位置
		7.00	图1的(a)所示的位置

检测器：三重四级杆质谱检测器，本实施例使用的是4000QTRAP质谱仪，多反应监测(Multiple reactionmonitoring，MRM)扫描模式，MRM参数见表3；

表3 3种维生素B12及其同位素内标的MRM参数

(1-定量MRM，2-定性MRM)

质谱检测器的质谱条件还包括以下离子源参数：电离源为ESI源，采用正离子模式，其他参数见表4：

表4质谱检测器的离子源参数

气帘气CUR(psi)	30
		碰撞气CAD(psi)	High
离子喷雾电压(IS)	4500
		温度TEM(℃)	650
雾化气GS1(psi)	60
		辅助加热气GS2(psi)	35
接口加热Ihe	On

检测步骤，所有操作均严格避光。

步骤1：配制3种标准品的混合系列标准曲线工作液

用天平精密称量适量的3种维生素B12的标准品，分别溶于甲醇的50％(V/V)水溶液中配制为母液，并继续稀释为合适浓度的中间浓度储备液。最后以磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.2～7.4)为替代空白基质，配制成3种维生素B12的混合系列标准曲线工作液，浓度均为：0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0ng/mL。

步骤2：标准曲线方程的建立

取标准曲线工作液100μL至1.5mL或2.0mL离心管或96孔前处理板中，然后加入100μL的内标工作液(溶剂为体积比为4:1的乙腈-甲醇的氰钴胺-13C7和甲钴胺-d3的5ng/mL混合溶液)，再加入100μL0.2M的硫酸锌水溶液，涡旋混匀30秒钟后，进样检测。氰钴胺、甲钴胺和腺苷钴胺的色谱图分别示于图2、图3和图4。在色谱图上得到各物质的峰面积，以某一物质的溶液浓度为横坐标x，以该物质和内标的峰面积比值为纵坐标y，采用最小二乘法进行线性回归，得到标准曲线方程y＝a*x+b。

步骤3：待测血清样品制备

用移液枪移取血清样品100μL至1.5mL或2.0mL离心管或96孔前处理板中，然后加入100μL的内标工作液(溶剂为体积比为4:1的乙腈-甲醇的氰钴胺-13C7和甲钴胺-d3的5ng/mL混合溶液)，涡旋混匀30秒钟；再加入100μL0.2M的硫酸锌水溶液，涡旋混匀30秒钟后，在10000-15000rpm的高速离心机中离心10-15min，移取上清液进样检测。

步骤4：血清样品的检测

将步骤3中制备得到的待测血清样品溶液，上机测定。在色谱图上得到不同物质和内标的峰面积，根据步骤2中建立的标准曲线方程，计算氰钴胺、甲钴胺和腺苷钴胺的浓度。

步骤5：结果计算

(1)标准曲线方程

根据步骤2进样得到3种维生素B12和2种内标的峰面积，氰钴胺和腺苷钴胺用氰钴胺-13C7作内标，甲钴胺用甲钴胺-d3作内标。以氰钴胺、甲钴胺和腺苷钴胺的6个标准曲线工作液浓度为横坐标(x)，以分析物和其内标的实测峰面积的比值为纵坐标(y)，绘制标准曲线。3种分析物在0.1～10ng/mL的浓度范围内线性关系良好，相关系数r>0.99。氰钴胺、甲钴胺和腺苷钴胺的标准曲线分别示于图5、图6和图7。各标准曲线的详情示于表5。

表5

分析物	校准曲线	权重	相关系数r	线性范围
					氰钴胺	Y＝0.116X+0.00981	1/x2	0.9966	0.1～10ng/mL
甲钴胺	Y＝0.159X+0.0049	1/x2	0.9959	0.1～10ng/mL
					腺苷钴胺	Y＝0.235X-0.00156	1/x2	0.9929	0.1～10ng/mL

(2)检出限与定量限

以信号噪声比(S/N)>3，3次测试结果的重复性(RSD)<20％为检出限。以信号噪声比(S/N)>10，3次测试结果的重复性(RSD)<20％为定量限。测试结果表明，3种维生素B12的检出限和定量限的详情示于表6。

表6

分析物	检出限(ng/mL)	定量限(ng/mL)
			氰钴胺	0.05	0.1
甲钴胺	0.05	0.1
			腺苷钴胺	0.05	0.1

(3)准确度

混合一批实际血清样品，先测定本底浓度值，因储存时间较长，且样品采集时未严格避光，因此经多次测定，该血清样品中的3种维生素B12的浓度已经低于该方法的最低检出限。为验证本方法的准确度，取2个混合标准溶液10μL，浓度为20和100ng/mL，分别加入到990μL实际血清中，涡旋混匀后，制作成2个浓度水平的质控样品(理论浓度分别为0.2和1.0ng/mL)。按照步骤4测定这2个质控样品。测定详情示于表7。

表7

从上述实施例可以看出，本发明的方法采用了二维液相色谱系统，通过在线前处理柱对样本进行在线净化，降低质谱分析中的基质效应，提高了检测灵敏度，同时只需要少量样本(100μL血清)进行简单的前处理(去蛋白)，减少了操作过程带来的误差，提高了检测通量。相同的分析方法可以进行血清中3种维生素B12的同时测定，可同时建立标准曲线，且各待测物间相互不产生干扰。大大减少了样品分析时不同方法交替平衡系统的时间。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种同时测定血清中3种维生素B12的浓度的方法，其特征在于，采用二维液相色谱系统及柱切换技术相结合，对去除蛋白后的血清待测样品进行检测，所述血清待测样品是取血清待测液，加入等量的内标工作液，涡旋混匀；再加入等量的0.2M的硫酸锌水溶液，涡旋混匀后，在10000-15000rpm的高速离心机中离心10-15min，移取上清液进样检测；

所述3种维生素B12为氰钴胺、甲钴胺和腺苷钴胺；

所述二维液相色谱系统及柱切换技术具体是：构建二维液相色谱分析装置，第一维液相色谱采用等度洗脱，进样后，样品随流动相进入前处理柱进行净化和富集，然后进行流路切换，样品进入第二维液相色谱部分的分析柱进行分离，最后进入检测器检测，在第二维液相色谱部分采用梯度洗脱；洗脱后得到色谱图，根据色谱图的不同物质和内标的峰面积，根据已建立好的标准曲线方程，计算出待测样品的目标物浓度；所述二维液相色谱系统及柱切换技术中，第一维液相色谱部分中的前处理柱为4.6×30mm,50μm的硅胶C18柱，前处理流动相为甲醇的10％水溶液，流速为1.8mL/min；第二维液相色谱部分中的分析柱为50×4.6mm，2.7μm的C18柱，分析流动相为甲醇和水，流速为0.7mL/min。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二维液相色谱系统及柱切换技术中，色谱柱温为25～50℃，进样量是50～100μL。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述色谱柱温为30℃、进样量是50μL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准曲线方程的建立方法是：取标准曲线工作液，加入等量的内标工作液，涡旋混匀；再加入等量的0.2M的硫酸锌水溶液，涡旋混匀后，在10000-15000rpm的高速离心机中离心10-15min，移取上清液进样检测；在色谱图上得到各物质的峰面积，以某一物质的溶液浓度为横坐标x，以该物质和内标的峰面积比值为纵坐标y，采用最小二乘法进行线性回归，得到标准曲线方程y＝a*x+b。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述内标工作液为体积比为4:1的乙腈-甲醇的氰钴胺-13C7和甲钴胺-d3的5ng/mL混合溶液。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述标准曲线工作液是3种维生素B12的混合系列标准曲线工作液，浓度均为：0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0ng/mL。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述3种维生素B12：氰钴胺、甲钴胺和腺苷钴胺的检出限均为0.05ng/mL，定量限均为0.1ng/mL。

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