CN111562322B - 一种血样中五种抗肿瘤药物的富集检测方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血样中五种抗肿瘤药物的富集检测方法及应用，该方法用碱溶液对血样进行PH调节后，采用具有C8(C18)和阴离子交换能力的混合模式填料对目标物进行富集，再使用液相色谱串联质谱进行分析，通过内标法建立标准曲线计算血样中药物浓度，可实现同时测定涉及三种结构类型的抗肿瘤药物浓度。本方法具有高通量、快捷性的同时，还表现出提取回收率高、无基质效应的优点，满足多种质谱设备的定量需求，可应用于临床上此五种药物的血药浓度监测。

Description

一种血样中五种抗肿瘤药物的富集检测方法及应用
技术领域
本发明属于检验分析技术领域，具体涉及甲氨蝶呤、紫杉醇、多西他赛、伊马替尼、吉 非替尼五种抗肿瘤药物的富集检测方法，以及该方法在治疗药物浓度监测中的应用。
技术背景
抗肿瘤药物治疗是癌症常用治疗方法之一。大部分的抗肿瘤药物治疗指数低，不良反应 多，个体间药代动力学差异较大，同时肿瘤药物间联合用药情况比较普遍，可能存在药物药 物相互作用，影响药物的吸收和代谢。
治疗药物浓度监测(Therapeutic drug mornitoring,TDM)是以药代动力学原理为指导， 分析测定药物在血液中的浓度，使临床给药方案个体化，以提高疗效，避免或减少毒副反应。 因此，对抗肿瘤药物开展TDM工作，可针对患者的个体化差异，指导合理用药，实现临床 安全、有效、合理的用药。
TDM临床应用的前提条件是具有相对明确的量效(毒)关系，即建立血药浓度(或AUC、 峰谷浓度)与疗效、毒性之间的关系，临床使用的抗肿瘤药物众多，经实地和文献调研发现 甲氨蝶呤、紫杉醇、多西他赛、伊马替尼、吉非替尼五种临床常用的抗肿瘤药物，具有比较 明确的血药浓度(或AUC、峰谷浓度)与疗效、毒性间的关系，临床监测需求高。甲氨蝶呤广泛应用于骨肉瘤、儿童急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤，是肿瘤领域公认最需要做TDM的药物。美国食品药品监督管理局(FDA)指出：MTX体内正常清楚浓度为 24h≤10μmol/L，48h≤1μmol/L和72h≤0.2μmol/L。(FDA.FDA Approved Product:MethotrexateInjection,USP drugs.)；紫杉醇和多西他赛均是紫杉烷类抗肿瘤药物。紫杉醇(paclitaxel)是 妇科卵巢癌、乳腺癌和非小细胞肺癌的一线用药，其血药浓度tc≥0.05μmol/L的是临床结局 的良好预测指标(JOERGER M,HUITEMA A D,RICHEL D J,et al.ClinCancer Res,2007, 13(21):6410-6418)。多西他赛主要用于乳腺癌、非小细胞肺癌和前列腺癌等的治疗，其AUC 是评价药物不良反应的指标(王晶，李雅倩等；中国临床药理学杂志，2018，34(24)：2889-2893)； 伊马替尼和吉非替尼为靶向酪氨酸激酶抑制药(TKIs)，伊马替尼为费城染色体阳性慢性粒 细胞白血病(CML)的一线治疗药物，当伊马替尼血中浓度达到1000ng/mL可以获得更 好的治疗效果；吉非替尼用于非小细胞型肺癌治疗中，其推荐的有效血药浓度为200ng/mL (Yu,H.,Steeghs,N.,Nijenhuis,C.M.,et al.ClinicalPharmacokinetics,2014，53(4),305–325)。 故建立一种可同时检测甲氨蝶呤、紫杉醇、多西他赛、伊马替尼、吉非替尼五种药物的血药 浓度方法，对其合理用药十分必要。
2015年，全国临床检验操作规程(第4版)将质谱法作为TDM的金标准。目前，研 究人员已开发了一些液相色谱串联质谱法(LC-MS)用于上述药物的血药浓度监测，例如， 一种同时测定血浆中六种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法(申请号：201710334894.1)，公布 了一种以伊马替尼为内标，采用乙酸乙酯和叔丁基甲醚混合溶液对药物进行液液萃取，结合使用LC-MS分析测定阿帕替尼、克唑替尼、厄洛替尼、吉非替尼、埃克替尼和拉帕替尼的 方法，液质分析时间为8min；Posocco,B.开发了一种血浆中紫杉醇和6α-OH紫杉醇的 LC-MS/MS检测方法，采用400μL甲醇(含0.1％甲酸)进行蛋白沉淀富集，液质分析时间 为21min(Posocco,B.,Buzzo,M.,et al.A new high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of paclitaxel and 6α-hydroxy-paclitaxel in human plasma:Development,validation and application ina clinical pharmacokinetic study.PLOS ONE, 2018,13(2))。
迄今为止，这些方法多是针对一种结构类型的抗肿瘤药物开发检测方法，或针对紫杉类、 或针对TKI类、或对甲氨蝶呤，尚未建立一种可同时检测甲氨蝶呤、紫杉类、TKI类的三 类结构类型的检测方法；同时这些方法检测方法和标准不统一，单样本检测液质分析时间长 (多数大于5min)，联合用药时需进行多次检测，不仅增加了工作量，还增加了实验资源的 浪费，且无法实现样本高通量的准确测定。
本发明从抗肿瘤药物浓度监测的临床实际需求出发，针对五种临床监测意义高的抗肿瘤 药物：甲氨蝶呤、紫杉醇、多西他赛、伊马替尼、吉非替尼，采用具有C8(C18)和阴离子交 换能力的混合模式填料，建立一种能同时富集检测三种结构类型药物的方法，单样本液质分 析时间仅3.5min，极大的增加了检测通量；同时该发明符合“生物样品定量分析方法验证指 导原则(中国药典2015年版四部)”和《液相色谱-质谱临床应用建议(指南与共识)》(中 华检验医学杂志,2017,40(10):770-779)方法学要求，提取回收率高，除杂效果好，灵敏度 高，无明显基质效应，满足多个型号质谱检测设备的定量需求，可应用于此五种药物的临床 血药浓度监测工作中。
发明内容
本发明的目的是提供一种血样中五种抗肿瘤药物的富集检测方法及其应用。
该方法用碱溶液对血样进行pH调节后，采用具有C8(C18)和阴离子交换能力的混合模 式填料对目标物进行富集，再使用高效液相色谱串联质谱进行分析，通过内标法建立标准曲 线计算血样中药物浓度，实现了涉及三种结构类型的肿瘤药物浓度测定。本方法单样本液质 分析时间仅3.5min，极大地增加了检测通量；同时该发明提取回收率高，除杂效果好，灵 敏度高，无明显基质效应，满足多个型号质谱检测设备的定量需求，可应用于此五种药物的 临床血药浓度监测工作中。
为实现上述目的，本发明提供了一种血样中五种抗肿瘤药物的富集检测方法，该方法包 括以下步骤：
(1)五种药物的富集：
取待测血样，首先加入碱溶液将pH值调整至9～12，然后加入内标溶液，混匀 放置15分钟后，过固相萃取装置(SPE)，分别加入水和混合液进行淋洗，最后用 含甲酸的有机试剂进行洗脱，得洗脱液；
(2)五种药物的检测：
将步骤(1)中得到的洗脱液采用高效液相色谱串联质谱进行分析，计算药物 和内标峰面积比值，通过内标法建立标准曲线计算血样中药物浓度。
其中，所述的五种抗肿瘤药物为甲氨蝶呤、紫杉醇、多西他赛、伊马替尼、吉非替尼； 所述血样为血清、血浆、全血等。
优选地，步骤(1)中，血样体积为50～200μL。
优选地，步骤(1)中，所述碱溶液选自KOH溶液或NaOH溶液，质量分数为1％～10％。
优选地，步骤(1)中，所述固相萃取柱的填料选自以下任一：A：具有C8和阴离子 交换能力的混合模式填料，B：具有C18和阴离子交换能力的混合模式填料；固相萃取方 式选自固相萃取柱或固相萃取96孔样品板；选用固相萃取规格为50～200mg/mL，其中mg 为填料重量，mL为萃取柱体积或96孔样品板的单孔体积。
优选地，所述填料是C18SAX。
优选地，步骤(1)中，所述混合液为40％～60％有机试剂水溶液；所述的有机试剂选自 甲醇、乙醇或乙腈，所述甲酸体积分数为0.5％～2％。
优选地，步骤(2)中，其中高效液相色谱条件：色谱柱：Phenomenex Kinetex C182.6μm (5*50mm)；柱温40℃；进样器温度10℃；流动相A为水(含0.1％甲酸)，B为甲醇，梯度洗脱(0-0.2min，流动相B为22％；0.2-1.2min，流动相B由22％升高到95％；1.2-2.5min， 流动相B为95％；2.6-3.5min，流动相B为22％)；流速为0.4mL/min；进样量1μL。
优选地，步骤(2)中，其中质谱参数为：离子化模式：ESI+；喷雾电压：4500V；温度：450℃；雾化器(GS1)：40psi；辅助雾化气(GS2)：40psi；气帘气：30psi；扫描方式：多 反应检测(MRM)；
Figure BDA0002477876360000041
优选地，步骤(2)中，所述标准曲线各药物浓度范围为：紫杉醇5-1000ng/mL，多西他 赛5-1000ng/mL，伊马替尼50-10000ng/mL，吉非替尼20-4000ng/mL，甲氨蝶呤0.1-20μmol/L； 血样中内标D8-伊马替尼浓度为500ng/mL，D3-甲氨蝶呤浓度为500ng/mL。
本发明的第二方面，提供了前述方法在五种药物的治疗药物浓度监测中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明从抗肿瘤药物浓度监测的临床实际需求出发，首次将甲氨蝶呤、紫杉醇、多 西他赛、伊马替尼、吉非替尼五种结构类型不同的抗肿瘤药物，建立了一种同时富集检测的方法，可适用于五种药物的血药浓度监测需求，有利于检测标准的统一， 节约实验资源；
(2)本发明采用具有C8(C18)和阴离子交换能力的混合模式填料对血样进行富集，除杂 效果好，获得了较高的提取回收率，并且能有效避免基质效应，具有良好的灵敏度高，可适用于多种质谱设备的检测需求；
(3)本发明中液质分析时间仅为3.5min，极大地增加了临床实验室的检测通量；
(4)本发明的检测方法符合验证要求，适用于临床甲氨蝶呤、紫杉醇、多西他赛、伊马 替尼、吉非替尼的药物浓度监测工作，协助药物的个体化使用方案，实现抗肿瘤药 物临床使用的安全、有效和经济。
附图说明
图1为五种抗肿瘤药物的化学结构式。
图2为血浆中五种抗肿瘤药物的MRM色谱图，从前至后依次为：甲氨蝶呤、吉非替尼、伊 马替尼、紫杉醇和多西他赛。
图3为血浆中甲氨蝶呤的MRM色谱图。
图4为血浆中吉非替尼的MRM色谱图。
图5为血浆中伊马替尼的MRM色谱图。
图6为血浆中紫杉醇的MRM色谱图。
图7为血浆中多西他赛的MRM色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实例对本申请做进一步详细说明，实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限 定。
实施例1：血浆中五种抗肿瘤药物的富集检测方法的建立和验证
1、材料与试剂
甲氨蝶呤(Solarbio，纯度>99％)、紫杉醇和多西他赛(购自中国药品生物制品检定所)、 伊马替尼(MACKUN，纯度>99％)、吉非替尼(J&K，纯度99％)、D8-伊马替尼(cmass，纯度是99％)、D3-甲氨蝶呤(cmass，纯度是99.4％)；甲酸(HPLC级，纯度≥96％，sigma)、 乙醇、KOH、甲醇(色谱纯，纯度99.9％，Merck)、水(自制超纯水)。
2、仪器和设备
AB SCIEX 4500MD高效液相色谱-串联质谱仪，检测器为三重四极杆串联质谱；万分之 一电子分析天平；MiliQ纯水仪；固相萃取96孔板装置；涡旋混合仪。
3、标准曲线血浆样本和质控血浆样本的制备：
取90μL空白血浆，加入10μL各系列标准工作溶液或质控工作溶液，涡旋混匀30s，制 得各种药物不同浓度的标准曲线血浆样本和质控样本。最终，标准曲线血浆药物浓度和质控 血浆浓度如下表1所示：
表1.各个药物标准曲线和质控血浆样本的最终浓度
Figure BDA0002477876360000051
Figure BDA0002477876360000061
4、血浆、标准曲线血浆样本、质控血浆样本中五种药物的富集过程：
取100μL血浆(标准曲线血浆或质控血浆)样本于1.5mL管中，加入10μL 2％KOH溶液(95％乙醇配制)，涡旋混匀，抽样测试血浆pH在9～12范围内后，加入10μL内标溶液 (D8-伊马替尼浓度为5000ng/mL，D3-甲氨蝶呤浓度为5000ng/mL)，涡旋混匀放置15分钟。
对装有固相萃取填料C18SAX的96孔板使用300μL甲醇活化，再加入300μL水平衡待用；吸取前述60μL血样上样，分别加入300μL水和300μL50％的甲醇水溶液进行淋洗，最 后用400μL 2％甲酸甲醇溶液洗脱；取洗脱液200μL转移至进样瓶中，待检测。
5、五种药物的检测：本实验使用以下的色谱、质谱条件：
A.高效液相色谱条件：色谱柱：Phenomenex Kinetex C18 2.6μm(5*50mm)；柱温40℃； 进样器温度10℃；流动相A为水(含0.1％甲酸)，B为甲醇，梯度洗脱(0-0.2min，流 动相B为22％；0.2-1.2min，流动相B由22％升高到95％；1.2-2.5min，流动相B为95％； 2.6-3.5min，流动相B为22％)；流速为0.4mL/min；进样量1μL。
B.质谱参数为：离子化模式：ESI+；喷雾电压：4500V；温度：450℃；雾化器(GS1)：40psi；辅助雾化气(GS2)：40psi；气帘气：30psi；扫描方式：多反应检测(MRM)；
Figure BDA0002477876360000062
6、方法学评价
根据“生物样品定量分析方法验证指导原则(中国药典2015年版四部)”和《液相色谱- 质谱临床应用建议(指南与共识)》(中华检验医学杂志,2017,40(10):770-779)对本发明进 行验证：包括特异性、线性范围、灵敏度、精密度、准确度、提取回收率、基质效应和稳定 性。
(1)特异性考察
6个不同来源的空白血浆样本按照“4、血浆、标准曲线血浆样本、质控血浆样本的中五 种药物的富集过程”项进行处理后，进行HPLC-MS/MS分析，结果显示在本实验条件下，各个药物和内标峰形良好，无杂峰干扰，具有较高的特异性。
(2)定量下限
五个药物的定量下限结果见表2；结果表明，各个药物的RE小于±6.85％，RSD小于8.09％，符合测试规定，灵敏度高。
表2.各个药物的定量下限
Figure BDA0002477876360000071
(3)线性范围
将标准曲线血浆样本按照“4、血浆、标准曲线血浆样本、质控血浆样本的中五种药物 的富集过程”项进行处理后，进行HPLC-MS/MS分析，根据各个药物峰面积As和内标峰 面积Ai的比值Y(Y＝As/Ai)对药物浓度X进行权重线性回归，拟合标准曲线，权重为1/X2 (X为浓度值)，以Y＝斜率*X+截距表示的标准曲线见表3。
表3.各个药物标准曲线和线性范围
Figure BDA0002477876360000072
(4)精密度和准确度
对质控样本按照“4、血浆、标准曲线血浆样本、质控血浆样本的中五种药物的富集过程” 项进行处理后，进行HPLC-MS/MS分析，每批每个浓度平行做6份，连续做三天，每天一批。将药物峰面积As和内标峰面积Ai的比值Y(Y＝As/Ai)代入当天随行标曲计算样品浓度，由此计算批内/批间精密度(RSD<15％为合格)和准确度(85％～115％为合格)，各个药物精密度和准确度数据见表4。
表4.各个药物精密度和准确度数据
Figure BDA0002477876360000081
(5)提取回收率和基质效应
取6个来源不同的空白血浆样本，配制低、中、高三个浓度的QC样品，按照“4、血浆、标准曲线血浆样本、质控血浆样本的中五种药物的富集过程”项进行操作后，并进行HPLC-MS/MS分析，获得相应峰面积值B。
取6个来源不同的空白血浆100μL，除不加工作溶液和内标溶液外，按照“4、血浆、标准曲线血浆样本、质控血浆样本的中五种药物的富集过程”项进行操作，向最终洗脱液中加入5μL相应的QC溶液和5μL内标溶液，涡流混合后进行LC-MS分析，获得相应峰面积 值A。
取超纯水100μL，除不加工作溶液和内标溶液外，按照“4、血浆、标准曲线血浆样本、 质控血浆样本的中五种药物的富集过程”项进行操作，向最终洗脱液中加入5μL相应的QC 溶液和5μL内标溶液，涡流混合后进行LC-MS分析，获得相应峰面积值C。其中，用峰面 积比值B/A计算提取回收率(绝对回收率)，峰面积比值A/C计算基质效应；结果显示见 表5：
表5.各个药物提取回收率和基质效应
Figure BDA0002477876360000082
Figure BDA0002477876360000091
(6)稳定性考察
采用低、中、高3个浓度的QC血浆样本，每一浓度3个平行样本，样本分析后代入当天随行标曲计算各药物浓度，分别考察样本室温放置6h稳定性、4℃冷藏放置8天稳定性、冻融三次循环稳定性和样本处理后自动进样器10℃放置24h稳定性，结果见表6；
表6.各条件下药物的稳定性情况
Figure BDA0002477876360000092
以上各项符合“生物样品定量分析方法验证指导原则(中国药典2015年版四部)”和《液 相色谱-质谱临床应用建议(指南与共识)》(中华检验医学杂志,2017,40(10):770-779)的各 项要求，可应用于五种药物的血药浓度监测工作中。
实施例2：临床患者血浆样本中甲氨蝶呤的浓度检测
1.材料和试剂：与实施例1相同。
2.仪器和设备：与实施例1相同。
3.建立标准曲线的操作步骤
按照实施例1中第3项和第4项操作，将标准曲线血浆样本处理后，依照实施例1中第 5项的条件，进行HPLC-MS/MS分析，根据各个药物峰面积As和内标峰面积Ai的比值Y (Y＝As/Ai)对药物浓度X进行权重线性回归，拟合标准曲线，权重为1/X2(X为浓度值)， 以Y＝斜率*X+截距表示的标准曲线。
4.血浆样本中甲氨蝶呤的浓度检测
取100μL血浆样本于1.5mL管中，加入10μL 2％KOH溶液(95％乙醇配制)，涡旋混匀，加入10μL混合内标溶液(D8-伊马替尼浓度为5000ng/mL，D3-甲氨蝶呤浓度为5000 ng/mL)，涡旋混匀放置15分钟。
对固相萃取填料C18SAX的96孔板(100mg/1mL)使用300μL甲醇活化，再加入300μL水平衡待用；吸取前述60μL血样上样，分别加入300μL水和300μL50％的甲醇水溶液进行 淋洗，最后用400μL2％甲酸甲醇溶液洗脱；取洗脱液200μL转移至进样瓶中，依照实施例 1中第5项的条件，进行HPLC-MS/MS分析，计算药物峰面积和内标峰面积的比值，代入 标准曲线求得测定浓度。表7为同一患者用药后连续3天测得的甲氨蝶呤浓度值。
表7同一患者用药后连续3天测得的甲氨蝶呤浓度值
Figure BDA0002477876360000101
实施例3：不同固相萃取填料对五种药物的提取回收率考察
取5个来源不同的空白血浆样本，按照实施例1中第3项配制中浓度血浆QC样本，使用4种固相萃取填料C18、SAX、C18 SAX、Phenyl的SPE色谱小柱，规格均为100mg/1mL 进行富集，按照实施例1中第6项“方法学评价”中提取回收率方式进行操作，测定提取回 收率。
表8不同固相萃取填料对五种药物的提取回收率(REC)考察
Figure BDA0002477876360000102
Figure BDA0002477876360000111
从表7中可以看到，C18、Phenyl对甲氨蝶呤的提取较低且不稳定，对紫杉醇、多西他 赛、伊马替尼、吉非替尼提取效果较好；SAX对紫杉醇、多西他赛、伊马替尼、吉非替尼基本无提取作用；而C18SAX可实现对五种药物的充分稳定得提取作用。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公 开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (2)

1.一种血样中五种抗肿瘤药物的富集检测方法，所述方法采用固相萃取技术富集，联合高效液相色谱串联质谱进行检测，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）五种药物的富集：
取待测血样，首先加入碱溶液将pH值调整至9~12，然后加入内标溶液，混匀放置15分钟后，过固相萃取装置，分别加入水和混合液进行淋洗，最后用含甲酸有机试剂进行洗脱，得洗脱液；
（2）五种药物的检测：
将步骤（1）中得到的洗脱液采用高效液相色谱串联质谱进行分析，计算药物和内标峰面积比值，通过内标法建立标准曲线计算血样中药物浓度；
所述五种抗肿瘤药物为甲氨蝶呤、紫杉醇、多西他赛、伊马替尼、吉非替尼；
步骤（1）中，所述血样为血清、血浆或全血，体积为50~200μL；所述碱溶液选自KOH溶液或NaOH溶液，质量分数为1%~10%；所述固相萃取装置的填料为C18SAX；固相萃取方式选自固相萃取柱或固相萃取96孔样品板；选用固相萃取规格为50~200mg/mL，其中mg为填料重量，mL为萃取柱体积或96孔样品板的单孔体积；所述混合液为40%~60%有机试剂水溶液；所述有机试剂选自甲醇、乙醇或乙腈，所述甲酸的体积分数为0.5%~2%；
步骤（2）中，其中高效液相色谱条件：
色谱柱：Phenomenex Kinetex C18 2.6μm，5*50mm；柱温40℃；进样器温度10℃；流动相A为含0.1%甲酸的水，B为甲醇，梯度洗脱为：0-0.2min，流动相B为22%；0.2-1.2min，流动相B由22%升高到95%；1.2-2.5min，流动相B为 95%；2.6-3.5min，流动相B为 22%；流速为0.4mL/min，进样量1μL；
其中质谱参数为：
离子化模式：ESI+；喷雾电压：4500V；温度：450℃；雾化器GS1：40psi；辅助雾化气GS2：40psi；气帘气：30psi；扫描方式：多反应检测MRM；
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述标准曲线的各个药物浓度范围为：紫杉醇5-1000ng/mL，多西他赛5-1000ng/mL，伊马替尼50-10000ng/mL，吉非替尼20-4000ng/mL，甲氨蝶呤0.1-20μmol/L。
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