CN105588912A - 高效液相色谱法测定血浆及大肠癌细胞中5-氟尿嘧啶含量的方法 - Google Patents

高效液相色谱法测定血浆及大肠癌细胞中5-氟尿嘧啶含量的方法 Download PDF

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Abstract

高效液相色谱法测定血浆及大肠癌细胞中5-氟尿嘧啶含量的方法，属于液相色谱医学分析技术领域。5-氟尿嘧啶（5-Fu）是目前在临床上应用广泛的嘧啶类抗肿瘤药物，其抗癌化疗效应和癌细胞内该药浓度有很大关系，且在体内药物浓度过高时会发生其它的副作用。为了增强药物疗效和减少副作用，必须严格监测其在癌细胞内的浓度及体内药物浓度的动态。进行监测对提高药物疗效，降低毒性，防止术后转移具有较大的临床意义。本发明采用固相萃取提取大肠癌细胞及血浆中的5-Fu，提高了萃取效率；并对色谱条件进行优化，通过在检测流动相中添加三氟乙酸和甲醇体系改善了峰型，提高了理论塔板数并使色谱条件温和，在选定的最佳色谱条件下，使5-Fu的测定比文献报道的更加精密、准确。

Description

高效液相色谱法测定血浆及大肠癌细胞中5-氟尿嘧啶含量的 方法
技术领域
高效液相色谱法进行血浆及大肠癌细胞中5-氟尿嘧啶含量的测定方法，属于液相色谱医学分析技术领域。
背景技术
5-氟尿嘧啶(5-Fu)是目前在临床上应用最广泛的嘧啶类抗肿瘤药物，常用于大肠癌、肝癌、胃癌等恶性肿瘤的治疗。但是临床上不同的肿瘤患者对5-Fu的疗效和毒性反应有明显的个体差异。其抗癌化疗效应和癌细胞内该药物浓度有很大的关系，而且该药在体内药物浓度过高时会发生其它的副作用。为了增强药物的疗效和减少不良副作用，必须严格监测其在癌细胞内的浓度及体内药物浓度的动态。进行监测对提高药物疗效，降低毒性，防止术后转移具有较大的临床意义。
虽然文献已有报道采用HPLC法测定5-Fu，但5-Fu小肠吸收差，口服生物利用度低，细胞及血浆中药物含量极低，加上细胞及各血浆内源性物质干扰大，萃取方法回收率偏低，采用常规的测定方法难以达到所需的检测灵敏度，因而影响生物样本中5-Fu测定的准确性。
本发明采用固相萃取提取大肠癌细胞及血浆中的5-Fu，提高了5-Fu的萃取效率；并对色谱条件进行了优化，文献[1：刘放，刘雪莉，周芝芳等，用HPLC法测定5-Fu在大肠癌细胞中的吸收特性，肿瘤研究与临床，2002，14（3）：155-158.]HPLC测定5-Fu，色谱条件采用磷酸盐缓冲液体系，色谱峰存在严重拖尾现象；而且纯粹的磷酸盐体系对色谱柱和进样体系影响较大，大大缩短其使用寿命；本发明通过在检测流动相中添加三氟乙酸和甲醇体系改善了峰型，提高了理论塔板数并使色谱条件温和，在选定的最佳色谱条件下，使5-Fu的测定比文献报道的更加精密、准确。
发明内容
本发明的目的是提供一种用高效液相色谱法进行血浆及大肠癌细胞中5-氟尿嘧啶含量的测定方法。本发明采用固相萃取提取大肠癌细胞及血浆中的5-Fu，提高了5-Fu的萃取效率；并对色谱条件进行了优化，使5-Fu的测定比文献报道的更加精密、准确。
本发明的技术方案：高效液相色谱法测定血浆及大肠癌细胞中5-氟尿嘧啶含量的方法，步骤为：
（一）、生物样本前处理
血浆样品处理
将固相萃取柱Styre Screen® HP依次用1mL乙醇、1mL含0.1%三氟乙酸的去离子水活化；
吸取0.5mL血浆样品，以1mL/min的速度加入活化后的固相萃取柱，待样品富集后用1mL去离子水淋洗，抽干；用V/V为75︰25的乙醇-含0.1%三氟乙酸的去离子水溶液洗脱，抽干；使用真空离心蒸发浓缩器干燥20min，去掉有机溶剂；经冷冻干燥器干燥浓缩，测定时用流动相稀释到合适的浓度；
大肠癌细胞（SW480-B7及SW480-NC）样品处理
将固相萃取柱Styre Screen® HP依次用1mL乙醇、1mL含0.1%三氟乙酸的去离子水活化；
分别取大肠癌细胞SW480-B7及SW480-NC，细胞数1×106，加质量浓度0.1%的氢氧化钠溶液1 mL，超声5min后，加0.5g硫酸铵，超声5min后，吸取0.5mL超声处理后的溶液，以1mL/min的速度加入活化过的固相萃取柱，待样品富集后用1mL去离子水淋洗，抽干；用V/V为75︰25的乙醇-含0.1%三氟乙酸的去离子水溶液洗脱，抽干；使用真空离心蒸发浓缩器干燥20min，去掉有机溶剂；经冷冻干燥器干燥浓缩，测定时用200μL流动相溶解；
流动相为：磷酸调pH=3.0、再用三氟乙酸调pH=2.0的去离子水-甲醇溶液，去离子水︰甲醇体积比95︰5，使用前经0.45μm滤膜抽滤并脱气；
（二）、色谱条件
色谱条件确定为：仪器：Waters 1525型高效液相色谱仪，2489紫外检测器；色谱柱Diamonsil C18柱，5μm、4.6×250mm；
流动相：磷酸调pH=3.0、再用三氟乙酸调pH=2.0的去离子水-甲醇溶液，去离子水︰甲醇体积比95︰5，使用前经0.45μm滤膜抽滤并脱气；
流速：1mL/min；
进样体积：20μL；
柱温：30℃；
检测波长：266nm；
（三）、固相萃取柱的选择
采用Styre Screen® HP固相萃取柱；
（四）、标准曲线与检测限：
血浆标准曲线
取适量的5-Fu标准品用甲醇溶解，配成1mg/mL标准液，稀释成500，100，50，10，5，1，0.5μg/mL，分别取100μL，各加健康人未给药的空白血浆定容至2mL，混匀，配置为标准血药5-Fu浓度为25，5，2.5，0.5，0.25，0.05，0.025μg/mL，按步骤（一）所述血浆样品处理方法经固相萃取处理后，进行HPLC测定，记录峰面积；以5-Fu浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标进行线性回归，得线性为：Y=34783x+34562，R2=0.9991，结果显示5-Fu质量浓度在0.025~25μg/mL之间呈良好的线性关系；按信噪比S/N为3计，5-Fu的最小检测浓度为0.02μg/mL；
大肠癌细胞标准曲线
取适量的5-Fu标准品用水溶解，配成1mg/mL标准液，稀释成250，125，62.5，12.5，6.25，3.125，0.625μg/mL的5-Fu稀释液，分别取100μL系列5-Fu稀释液各加未给药空白SW480-B7及SW480-NC细胞定容至2mL，混匀，配置成12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.125μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL、0.15625μg/mL、0.03125μg/mL的系列标准溶液，按步骤（一）大肠癌细胞样品处理方法进行固相萃取处理后，进行HPLC分析，记录峰面积；以5-Fu浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标进行线性回归，SW480-B7癌细胞的线性为：Y=37963x+36842，R2=0.9993；SW480-NC癌细胞的线性为：Y=30244x+32421，R2=0.9998；表明5-Fu质量浓度在0.03125~12.5μg/mL之间呈良好的线性关系，按信噪比S/N为3计，5-Fu的最小检测浓度为0.025μg/mL；
（五）、精密度和准确度
血浆样品精密度与准确度测定
分别配制高、中、低三种不同浓度的5-Fu血浆样品，按步骤（四）“血浆标准曲线”项下操作，日内测定5次，日间测定3d，记录峰面积，代入血浆标准曲线，计算回收率和日内、日间相对标准差；
大肠癌细胞样品精密度与准确度测定
分别配制高、中、低三种不同浓度的5-Fu的大肠癌细胞样品，按步骤（四）“大肠癌细胞标准曲线”项下操作，日内测定5次，日间测定3d，记录峰面积，分别代入大肠癌细胞标准曲线，计算回收率和日内、日间相对标准差；
（六）、样品测定
临床血样测定
肿瘤患者于5-Fu静脉输注开始后24 h后取外周血，测定10例样本5-Fu血药浓度；取血浆样品适量，按步骤（一）生物样本前处理血浆样品处理方法处理后，取20μL注入色谱仪进行测定，测定所得峰面积代入相对应的标准曲线方程，计算得到血浆样品中5-Fu的含量；
大肠癌细胞内5-Fu的测定
以一定密度大肠癌细胞SW480-B7、SW480-NC分别接种于4个T100培养瓶中，当细胞为对数生长期时，其中3瓶给药，使5-Fu终浓度为2.0μg/mL、4.0μg/mL、8.0μg/mL，1瓶不给药，作为对照；在给药24 h后收集各浓度组细胞；取细胞数为1×106细胞沉淀的大肠癌细胞，每组各6份，共12份，按步骤（一）生物样本前处理大肠癌细胞样品处理方法处理后，测定所得峰面积代入相对应的标准曲线方程，计算得到5-Fu浓度，最后换算为每个大肠癌细胞内5-Fu含量(10-7μg/个细胞)。
本发明的有益效果：本发明采用固相萃取提取大肠癌细胞及血浆中的5-Fu，提高了5-Fu的回收率；并对色谱条件进行了优化，本发明通过在检测流动相中添加三氟乙酸和甲醇体系改善了峰型，提高了理论塔板数并使色谱条件温和，在选定的最佳色谱条件下，使5-Fu的测定比文献报道的更加精密、准确。
附图说明
图1 Diamonsil C18 柱、流动相：20mM K2HPO4（pH=6.0）-甲醇（95︰5）的5-Fu色谱图。
图2 流动相：去离子水（磷酸调pH=2.0）-甲醇（95︰5）的5-Fu色谱图。
图3 流动相：去离子水（磷酸调pH=3.0，再用三氟乙酸调pH=2.0）-甲醇（95︰5）的5-Fu色谱图。
图4 5-Fu血浆标准曲线。
图5 5-Fu癌细胞（SW480-B7）标准曲线。
图6 5-Fu癌细胞（SW480-NC）标准曲线。
图7 SW480-B7空白细胞色谱图。
图8 SW480-B7 5-Fu（4μg/mL）样品色谱图。
图9 SW480-NC空白细胞色谱图。
图10 SW480-NC 5-Fu（4μg/mL）样品色谱图。
图11 空白血浆色谱图。
图12 血浆样品 5-Fu（4μg/mL）色谱图。
具体实施方式
实施例1生物样本前处理
血浆样品处理
将固相萃取柱Styre Screen® HP依次用1mL乙醇、1mL去离子水（含质量浓度0.1%三氟乙酸）活化；吸取0.5mL血浆样本，以1mL/min的速度加入固相萃取柱，待样品富集后用1mL去离子水淋洗，抽干；用乙醇-含0.1%三氟乙酸的去离子水（V/V，75︰25）溶液洗脱，抽干；使用真空离心蒸发浓缩器干燥20min，去掉有机溶剂；经冷冻干燥器干燥浓缩，测定时用流动相稀释到合适的浓度；
大肠癌细胞（SW480-B7及SW480-NC）样品处理
将固相萃取柱Styre Screen® HP依次用1mL乙醇、1mL去离子水（含0.1%三氟乙酸）活化；取大肠癌细胞（细胞数1×106），加质量浓度0.1%的氢氧化钠溶液1mL，超声5min后，加0.5g硫酸按，超声5min后，吸取0.5mL超声处理后的溶液，以1mL/min的速度加入活化过的固相萃取柱，待样品富集后用1mL去离子水淋洗，抽干；用乙醇-含0.1%三氟乙酸的去离子水（V/V，75︰25）溶液洗脱，抽干；使用真空离心蒸发浓缩器干燥20min，去掉有机溶剂；经冷冻干燥器干燥浓缩，测定时用200μL流动相溶解；；
流动相为：磷酸调pH=3.0、再用三氟乙酸调pH=2.0的去离子水-甲醇溶液，去离子水︰甲醇体积比95︰5，使用前经0.45μm滤膜抽滤并脱气。
实施例2 色谱条件优化
1、萃取柱的选择（不同萃取方法的比较）
分别采用ODS萃取柱、Styre Screen® HP固相萃取柱及文献报道的普通乙酸乙酯萃取法、乙醚-异丙醇萃取法，柱子按上述方法先活化处理，配制含5-Fu 1.0、4.0、12.0μg/mL低、中、高浓度的血浆样品和大肠癌细胞样品，按不同萃取方法处理后进行高效液相色谱测定5-Fu的含量。
萃取效率=C测定值/C标准值×100%。采用Styre Screen® HP萃取，效率大于85%，高于普通的有机溶剂萃取法。
萃取效率测定结果见表1。
表1 不同萃取方法血浆及癌细胞中5-Fu萃取效率测定结果%(n=3)
2、流动相的选择
流动相采用缓冲体系：20mM K2HPO4（pH=6.0）-甲醇（95︰5）在色谱柱Diamonsil C18（250×4.6mm,5μm）进行试验。结果发现，主峰保留时间在12min左右，但峰形太宽，峰发生严重前沿（见图1）。
流动相采用去离子水（磷酸调pH 2.0）-甲醇（95︰5）体系进行试验，结果显示5-Fu在8min左右出峰，峰形前沿现象得到改善，但峰形较宽（见图2）。
3、缓冲液pH的影响
调节流动相缓冲液的pH值，考察pH值是否对色谱的检测有影响。选择流动相为：去离子水（磷酸调pH=2.0）-甲醇（95︰5）这个缓冲体系的基础上，调节水的pH值，用磷酸分别调节pH为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0，结果发现，pH值对色谱分离的保留时间有影响，pH值越大，保留时间越往后；对峰形的宽度并没有影响。在考虑峰宽的因素时，我们加入三氟乙酸来进行调节，选择去离子水（磷酸调pH 3.0，再用三氟乙酸调pH 2.0）-甲醇（95︰5）这个缓冲体系，发现加入三氟乙酸后，峰形由宽变窄，峰形理想，理论塔板数大大提高，且能在10min内出峰，保留时间在8min左右（见图3）。
由上所述，最终，选择流动相为：去离子水（磷酸调pH 3.0，再用三氟乙酸调pH2.0）-甲醇（95︰5）。
表2 流动相对保留时间和理论塔板数的影响
实施例3 标准曲线与检测限：
血浆标准曲线
取适量的5-Fu标准品用水溶解，配成1mg/mL标准液，稀释成500，100，50，10，5，1，0.5μg/mL，分别取100 μL，各加健康人未给药的空白血浆定容至2mL，混匀，配置为标准血药浓度为25，5，2.5，0.5，0.25，0.05，0.025μg/mL，按上述血浆样品处理方法经固相萃取处理后，进行HPLC测定，记录峰面积；以5-Fu浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标进行线性回归，得线性为：Y=34783x+34562，R2=0.9991，结果显示5-Fu质量浓度在0.025~25μg/mL之间呈良好的线性关系。按信噪比(S/N)为3计，5-Fu的最小检测浓度为0.02μg/mL。
大肠癌细胞标准曲线
取适量的5-Fu标准品用水溶解，配成1mg/mL标准液，稀释成250，125，62.5，12.5，6.25，3.125，0.625μg/mL的5-Fu稀释液，分别取100μL系列5-Fu稀释液各加未给药空白SW480-B7及SW480-NC细胞定容至2mL，混匀，配置成12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.125μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL、0.15625μg/mL、0.03125μg/mL的系列标准溶液，按上述大肠癌细胞样品处理方法进行固相萃取处理后，进行HPLC分析，记录峰面积。以5-Fu浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标进行线性回归，得线性为：Y=37963x+36842，R2=0.9993 （SW480-B7）；Y=30244x+32421，R2=0.9998（SW480-NC）；结果显示5-Fu质量浓度在0.03125~12.5μg/mL之间呈良好的线性关系。按信噪比(S/N)为3计，5-Fu的最小检测浓度为0.025μg/mL。
实施例4 专属性试验
取SW480-B7及SW480-NC两种大肠癌细胞空白对照（细胞数1×106），按上述方法测定显示癌细胞空白对照内源性物质对测定无干扰；取空白血浆对照，按上述方法测定显示血浆空白对照对测定无干扰（见图5-图10）。
实施例5 精密度和准确度
血浆样品精密度与准确度测定
分别配制高、中、低三种不同浓度的5-Fu血浆样品，按“血浆标准曲线”项下操作。日内测定5次，日间测定3d，记录峰面积，代入血浆标准曲线，计算回收率和日内、日间相对标准差。结果见表3。
大肠癌细胞样品精密度与准确度测定
分别配制高、中、低三种不同浓度的5-Fu的细胞样品，按“大肠癌细胞标准曲线”项下操作。日内测定5次，日间测定3d，记录峰面积，分别代入细胞标准曲线，计算回收率和日内、日间相对标准差。结果见表3。
表3精密度和准确度测定结果（n=5）
实施例5 样品测定
取样品适量，按生物样本前处理方法处理后，取20μL注入色谱仪进行测定，测定所得峰面积代入相对应的标准曲线方程，计算得到样品含量。
临床血样测定，肿瘤患者于5-Fu静脉输注开始后24 h后取外周血，测定10例样本5-Fu血药浓度。样品测定结果见表4。
表4 血浆样品含量测定结果（n=5）
癌细胞内5-Fu的测定
以一定密度大肠癌细胞SW480-B7、SW480-NC分别接种于4个T100培养瓶中，当细胞为对数生长期时，其中3瓶给药，使5-Fu终浓度为2.0μg/mL、4.0μg/mL、8.0μg/mL，1瓶不给药，作为对照；在给药24 h后收集各浓度组细胞；取细胞数为1×106细胞沉淀的大肠癌细胞，每组各6份，共12份，按步骤（一）生物样本前处理大肠癌细胞样品处理方法处理后，测定所得峰面积代入相对应的大肠癌标准曲线方程，计算得到5-Fu浓度，最后换算为每个细胞内5-Fu含量(10-7μg/个细胞) （见表5）。。
表5不同给药浓度单次给药后大肠癌细胞中5-Fu含量
注：我们用了1*106个细胞，细胞残渣用200μL溶解的，取了20μL进样，测出来的浓度μg/mL换算成每个细胞里的含量为(10-7μg/个细胞)。

Claims (1)

1.高效液相色谱法测定血浆及大肠癌细胞中5-氟尿嘧啶含量的方法，其特征在于步骤为：
（一）、生物样本前处理
血浆样品处理
将固相萃取柱Styre Screen® HP依次用1mL乙醇、1mL含0.1%三氟乙酸的去离子水活化；
吸取0.5mL血浆样品，以1mL/min的速度加入活化后的固相萃取柱，待样品富集后用1mL去离子水淋洗，抽干；用V/V为75:25的乙醇-含0.1%三氟乙酸的去离子水溶液洗脱，抽干；使用真空离心蒸发浓缩器干燥20min，去掉有机溶剂；经冷冻干燥器干燥浓缩，测定时用流动相稀释到合适的浓度；
大肠癌细胞SW480-B7及SW480-NC样品处理
将固相萃取柱Styre Screen® HP依次用1mL乙醇、1mL含0.1%三氟乙酸的去离子水活化；
分别取大肠癌细胞SW480-B7及SW480-NC，细胞数1×106，加质量浓度0.1%的氢氧化钠溶液1mL，超声5min后，加0.5g硫酸铵，超声5min后，吸取0.5mL超声处理后的溶液，以1mL/min的速度加入活化过的固相萃取柱，待样品富集后用1mL去离子水淋洗，抽干；用V/V为75:25的乙醇-含0.1%三氟乙酸的去离子水溶液洗脱，抽干；使用真空离心蒸发浓缩器干燥20min，去掉有机溶剂；经冷冻干燥器干燥浓缩，测定时用流动相稀释到合适的浓度；
流动相为：磷酸调pH=3.0、再用三氟乙酸调pH=2.0的去离子水-甲醇溶液，去离子水:甲醇体积比95:5，使用前经0.45μm滤膜抽滤并脱气；
（二）、色谱条件
色谱条件确定为：仪器：Waters 1525型高效液相色谱仪，2489紫外检测器；色谱柱Diamonsil C18柱，5μm、4.6×250mm；
流动相：磷酸调pH=3.0、再用三氟乙酸调pH=2.0的去离子水-甲醇溶液，去离子水:甲醇体积比95:5，使用前经0.45μm滤膜抽滤并脱气；
流速：1mL/min；
进样体积：20μL；
柱温：30℃；
检测波长：266nm；
（三）、固相萃取柱的选择
采用Styre Screen® HP固相萃取柱；
（四）、标准曲线与检测限：
血浆标准曲线
取适量的5-Fu标准品用水溶解，配成1mg/mL标准液，稀释成500，100，50，10，5，1，0.5μg/mL，分别取100 μL，各加健康人未给药的空白血浆定容至2mL，混匀，配置为标准血药5-Fu浓度为25，5，2.5，0.5，0.25，0.05，0.025μg/mL，按步骤（一）所述血浆样品处理方法经固相萃取处理后，进行HPLC测定，记录峰面积；以5-Fu浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标进行线性回归，得线性为：Y=34783x+34562，R2=0.9991，结果显示5-Fu质量浓度在0.025~25μg/mL之间呈良好的线性关系；按信噪比S/N为3计，5-Fu的最小检测浓度为0.02μg/mL；
大肠癌细胞标准曲线
取适量的5-Fu标准品用水溶解，配成1mg/mL标准液，稀释成250，125，62.5，12.5，6.25，3.125，0.625μg/mL的5-Fu稀释液，分别取100μL系列5-Fu稀释液各加未给药空白SW480-B7及SW480-NC细胞定容至2mL，混匀，配置成12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.125μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL、0.15625μg/mL、0.03125μg/mL的系列标准溶液，按步骤（一）大肠癌细胞样品处理方法进行固相萃取处理后，进行HPLC分析，记录峰面积；以5-Fu浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标进行线性回归，SW480-B7癌细胞的线性为：Y=37963x+36842，R2=0.9993；SW480-NC癌细胞的线性为：Y=30244x+32421，R2=0.9998；表明5-Fu质量浓度在0.03125~12.5μg/mL之间呈良好的线性关系，按信噪比S/N为3计，5-Fu的最小检测浓度为0.025μg/mL；
（五）、精密度和准确度
血浆样品精密度与准确度测定
分别配制高、中、低三种不同浓度的5-Fu血浆样品，按步骤（四）“血浆标准曲线”项下操作，日内测定5次，日间测定3d，记录峰面积，代入血浆标准曲线，计算回收率和日内、日间相对标准差；
大肠癌细胞样品精密度与准确度测定
分别配制高、中、低三种不同浓度的5-Fu的大肠癌细胞样品，按步骤（四）“大肠癌细胞标准曲线”项下操作，日内测定5次，日间测定3d，记录峰面积，分别代入大肠癌细胞标准曲线，计算回收率和日内、日间相对标准差；
（六）、样品测定
临床血样测定
肿瘤患者于5-Fu静脉输注开始后24 h后取外周血，测定10例样本5-Fu血药浓度；取血浆样品适量，按步骤（一）生物样本前处理血浆样品处理方法处理后，取20μL注入色谱仪进行测定，测定所得峰面积代入相对应的标准曲线方程，计算得到血浆样品中5-Fu的含量；
大肠癌细胞内5-Fu的测定
以一定密度大肠癌细胞SW480-B7、SW480-NC分别接种于4个T100培养瓶中，当细胞为对数生长期时，其中3瓶给药，使5-Fu终浓度为2.0μg/mL、4.0μg/mL、8.0μg/mL，1瓶不给药，作为对照；在给药24 h后收集各浓度组细胞；取细胞数为1×106细胞沉淀的大肠癌细胞，每组各6份，共12份，按步骤（一）生物样本前处理大肠癌细胞样品处理方法处理后，测定所得峰面积代入相对应的标准曲线方程，计算得到5-Fu浓度，最后换算为每个大肠癌细胞内5-Fu含量：10-7μg/个细胞。
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