CN114034805A - 一种五氟尿嘧啶类药物的代谢动力学分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种五氟尿嘧啶类药物的代谢动力学分析方法，通过特异性材料对血清或血浆样品进行净化，选择性保留分离五氟尿嘧啶类药物，可以有效去除血清或血浆中基质的干扰，提高五氟尿嘧啶类药物灵敏度，保证五氟尿嘧啶类药物检测分析的准确度，解决五氟尿嘧啶类药物在反相色谱无法有效富集的过程，具有广阔的应用前景。

Description

一种五氟尿嘧啶类药物的代谢动力学分析方法

技术领域

本发明属于医学检验分析技术领域，具体地说是一种检测血清或血浆样品中五氟尿嘧啶类药物代谢动力学的检测分析方法。

背景技术

治疗药物浓度监测是指在临床进行的药物治疗中，在指定的时间间隔测量患者血液中特定药物的浓度。

5-氟尿嘧啶(5-Fluoraciles，5-Fu)是一种常用的广谱抗癌药物，5-氟尿嘧啶在细胞内转变为5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸，抑制脱氧胸苷酸合成酶，阻止脱氧尿苷酸甲基化转变为脱氧胸苷酸，影响DNA的合成。5-氟尿嘧啶在体内转化为5-氟尿嘧啶核苷，以伪代谢产物形式掺入RNA中干扰蛋白质的合成。因此，5-氟尿嘧啶在抗肿瘤治疗的同时，也会因用量过高产生损害消化系统、神经系统、血液系统及黏膜系统的毒副作用。5-氟尿嘧啶的剂量通常是根据患者的体表面积计算的，而通过体表面积给药的患者，个体药理差异(例如血浆中的5-氟尿嘧啶血药浓度)高达30倍。已有很多临床结果证明患者药理学个体间及自身的巨大差异是引起5-氟尿嘧啶毒性过高甚至治疗失败的主要原因。Kirkwood研究组最早展示了5-氟尿嘧啶药理差异以及血药浓度曲线下的面积与毒性之间的统计相关性，并且建议对此药物进行常规监测以降低毒性[李文欢等.山东省抗癌协会,2015.]。

卡陪他滨为氟尿嘧啶氨基甲酸酯，是一种口服的氟尿嘧啶类药物，是氟尿嘧啶的前药。卡陪他滨定时口服与5-氟尿嘧啶持续静脉输注作用相似，从药物经济学角度，卡陪他滨在结直肠癌的治疗中优于5-氟尿嘧啶。且该药使用方便，临床应用日益广泛。临床应用中其总体不良反应程度较轻，严重不良反应少见。鉴于卡陪他滨在体内代谢过程中的复杂性，加之其与5-氟尿嘧啶具有相类似的最终代谢过程，卡陪他滨同样表现出较大的个体差异。[熊璐琪,等,医药导报,2019；6(38):786-791]。

现阶段，国内临床5-氟尿嘧啶和卡陪他滨类药物血药浓度监测的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、薄层层析法(TLC)、气相色谱法(GC)、微生物法、液质联用法(LC-MS)和气质联用法(GC-MS)等。[陆基宗等,中国医院药学杂志,2014；23(2):83-84]。HPLC是上世纪七八十年代发展起来的一种血药浓度的测定方法，采用合适的色谱柱，对卡陪他滨及其代谢物的分离和鉴定。该方法特异性高，结果准确可靠，但该方法需要花费更多时间精力用在前处理样品的干扰物质的去除，操作复杂，且HPLC达不到到精准检测定量。气相色谱法具有分离效能高，分析速度快，样品量少等特点，但适用范围仅用于气体和易挥发物的定性和定量分析。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种五氟尿嘧啶类药物的代谢动力学分析方法。该方法采用特异性净化材料，该材料是以硅胶为基质，键合相为五氟苯基的材料，血清或血浆通过固相萃取柱，可以对样品中的五氟尿嘧啶类药物的进行富集净化，有效去除血清或血浆样品中基质的干扰，减少干扰物质对目标物检测分析的影响，以实现简单、高效、可行的前处理过程及液相色谱-串联质谱的高灵敏度检测。

为实现上述技术效果，本发明提供如下的技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种五氟尿嘧啶类药物的代谢动力学分析方法，该方法包括如下步骤：

1)血清或血浆样品提取：取血清或血浆样品加入结构类似物或氘代同位素内标，涡旋混合后得到样品溶液备用；

2)装填固相萃取柱：装填规格：填料50-500mg，柱管体积1-6mL；固相萃取材料硅胶颗粒度为15μm-100μm，孔径为

比表面积150m²/g-400m²/g；

3)固相萃取分离：固相萃取柱先采用纯有机溶剂进行活化；再加入纯水进行平衡；将步骤1)得到的样品溶液上样后；加入纯水进行第一步淋洗；第二步用体积比有机溶剂：水(10:90)混合液进行淋洗，最后用体积比有机溶剂：水：酸(90:9:1)混合液进行洗脱，收集全部的洗脱馏分；

4)样品的分析：将步骤3)收集的洗脱馏分，采用反相高效液相色谱分离，串联质谱检测分析，扫描得到样品谱图，检测五氟尿嘧啶类药物及其结构类似物或氘代同位素内标负离子。

优选地，步骤1)中血清或血浆样品的体积为5μL-500μL；内标的体积为1μL-100μL。

优选地，步骤2)中装填规格：填料50-500mg，柱管体积1-6mL。

优选地，步骤2)中填料为以硅胶为基质的固相萃取填料，结构式如下：

其中，固相萃取材料硅胶颗粒度为20μm-100μm，孔径为

比表面积200m²/g-400m²/g。

优选地，步骤3)中固相萃取柱先采用0.2mL-2mL有机溶剂进行活化；再加入0.2mL-2mL纯水溶液进行平衡；血清或血浆样品溶液上样；加入0.1mL-2mL纯水进行第一步淋洗；加入0.1mL-2mL有机溶剂：水(体积比1:9)进行第二步淋洗；最后用0.1mL-2mL有机溶剂：水：酸(体积比90:9:1)进行洗脱，收集全部的洗脱馏分；所述的有机溶剂为甲醇、乙腈、异丙醇、乙醇、丙酮中的一种或几种；所述的酸为甲酸或乙酸溶液，酸浓度0.1-5％。

优选地，步骤5)中所述高效液相色谱条件为：

色谱柱：C183μm，50*4.6mm；流速0.6mL/min；梯度洗脱；柱温30-50℃；进样量：5μL；

所述质谱分析条件：

离子化模式：ESI^-；喷雾电压：-4.5KV；脱溶剂气温度：500℃；雾化气：50psi；辅助雾化气：50psi；气帘气：20psi；扫描方式：多反应监测(MRM)。

本发明相对于现有技术具有如下有益的技术效果：

(1)结构新颖：本发明首次提出以硅胶为基质，键合相为五氟苯基，该填料利用氟原子之间的亲和作用，对五氟尿嘧啶类药物能够特异性富集净化；

(2)前处理操作简单、高通量：本发明提供的前处理方法，操作简单可靠，利于临床血清或血浆样品实现高通量；

(3)定性定量准确：本方法采用高效液相-串联质谱法检测，血清或血浆样品加内标校正，标准曲线定量，结果准确度高且稳定，可用于临床血液样品(血清或血浆)中5-氟尿嘧啶和卡陪他滨等五氟尿嘧啶类药物的准确定性定量，测定5-氟尿嘧啶和卡陪他滨定量下限20ng/mL的回收率在90.00％-110.00％，定量下线和血清样本的精密度RSD均在8％以下。

附图说明

图1为实施例1中所述5-氟尿嘧啶标准品溶液离子通道的MRM色谱图；

图2为实施例2中所述卡陪他滨标准品溶液离子通道的MRM色谱图；

图3为实施例1中所述血清中5-氟尿嘧啶的MRM色谱图；

图4为实施例2中所述血清中卡陪他滨的MRM色谱图。

具体实施方式

下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。

实施例1血清中五氟尿嘧啶类药物5-氟尿嘧啶的检测分析

1、材料与试剂

色谱柱：Gemini C183μm，50*4.6mm(Phenomenex)

5-氟尿嘧啶标准品购自中国食品药品检定研究院；结构类似物内标5-溴尿嘧啶标准品购自百灵威科技有限公司；甲醇、乙腈、异丙醇、甲酸(色谱纯)、甲酸铵(色谱纯)；超纯水：Mili-Q超纯水机制备。

2、仪器和设备

高效液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾(ESI)电离源(3200MD，美国ABSCIEX公司)，液相色谱分离模式为反相色谱分离，检测器为三重四极杆串联质谱；万分之一电子分析天平；SPE固相萃取装置。

3、高效液相色谱-串联质谱法检测五氟尿嘧啶类药物5-氟尿嘧啶的分析方法，步骤为：

1)标准工作液的配制：准确配制5-氟尿嘧啶标准品储备液(1mg/mL)，分别用50％甲醇水逐级稀释到20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL和0.2μg/mL七个浓度水平5-氟尿嘧啶标准溶液，备用；

2)内标标准溶液的配制：准确配制5-溴尿嘧啶内标标准储备液(1mg/mL)，用50％甲醇水稀释得到浓度为5μg/mL，备用；

3)标准溶液的配制：分别取步骤1)的20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL和0.2μg/mL不同浓度标准溶液各20μL，加入不含5-氟尿嘧啶的空白血清基质溶液180μL，加入20μL内标(5-溴尿嘧啶：5μg/mL)，涡旋混匀，得到血清样品溶液，备用。

4)样品的提取：取200μL血清加入20μL内标(5-溴尿嘧啶：5μg/mL)，涡旋混匀，得到血清样品溶液，备用。

5)装填固相萃取柱：装填以硅胶为基质、键合相为五氟苯基的特异性净化填料100mg置1mL柱管内(填料硅胶颗粒度为30μm，孔径为

比表面积300m²/g)；特异性净化填料结构如下：

6)固相萃取分离：固相萃取柱先采用1mL甲醇活化；再加入1mL纯水平衡；将步骤3)、步骤4)血清样品溶液各200μL上样；依次加入400μL纯水、400μL 10％甲醇水淋洗；最后用200μL 90％甲醇水(1％甲酸)洗脱，收集全部的洗脱馏分，待上样分析。

7)样品的分析：将步骤6)待测样品上样检测，采用反相色谱对待测组分进行分离，三重四极杆串联质谱检测分析，得到样品谱图，检测5-氟尿嘧啶负离子：

高效液相色谱条件和质谱条件：

i)高效液相色谱条件

色谱柱：Gemini C183μm，50*4.6mm；流动相：2mM甲酸铵水溶液(A)、乙腈(B)，梯度洗脱见表1；柱温40℃，进样体积：5μL。

表1高效液相色谱梯度条件

ii)质谱条件

离子化模式：ESI^-；喷雾电压：-4.5KV；脱溶剂气温度：500℃；雾化气(GAS1)：50psi；辅助雾化气(GAS 2)：50psi；气帘气：20psi；扫描方式：多反应监测(MRM)

5-氟尿嘧啶的定性定量离子对、驻留时间碰撞能量等见表2.

表2 5-氟尿嘧啶的质谱参数

4、定量计算结果分析：根据样品色谱图中5-氟尿嘧啶离子色谱峰的峰面积与5-溴尿嘧啶内标离子色谱峰的峰面积的比值作为Response，与其相对应的浓度做线性回归方程(如表3所示)，外标法计算血清样品中5-氟尿嘧啶的浓度，得到血清样品5-氟尿嘧啶的浓度(如表4所示)。

表3 5-氟尿嘧啶线性回归方程

表4 5-氟尿嘧啶血清样本和定量下限样本测定浓度

5、结论：

该检测方法对血清样品中目标化合物5-氟尿嘧啶的检测稳定性好。实施例2血浆 中五氟尿嘧啶类药物卡陪他滨的检测分析

1、材料与试剂

与实施例1不同之处在于卡培他滨购自百灵威科技有限公司；

2、仪器和设备

与实施例1不同之处在于高效液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾(ESI)电离源(4500MD，美国AB SCIEX公司)；

3、高效液相色谱-串联质谱法检测五氟尿嘧啶类药物卡陪他滨的方法，步骤为：

1)标准工作液的配制：准确配制卡陪他滨标准品储备液(1mg/mL)，分别用50％甲醇水逐级稀释到20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL和0.2μg/mL七个浓度水平卡陪他滨标准溶液，备用；

2)内标标准溶液的配制：准确配制5-溴尿嘧啶内标标准储备液(1mg/mL)，用50％甲醇水稀释得到浓度10μg/mL，备用；

3)标准溶液的配制：分别取步骤1)的20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL和0.2μg/mL不同浓度标准溶液各20μL，加入不含卡陪他滨的空白血浆基质溶液180μL，加入10μL内标(5-溴尿嘧啶：10μg/mL)，涡旋混匀，得到血浆样品溶液，备用；

4)样品的提取：取200μL血浆加入10μL内标(5-溴尿嘧啶：10μg/mL)，涡旋混匀，得到血浆样品溶液，备用；

5)装填以硅胶为基质、键合相为五氟苯基的特异性净化填料100mg置1mL柱管内(填料硅胶颗粒度为30μm，孔径为

比表面积300m²/g)；特

异性净化填料结构如下：

6)固相萃取分离：固相萃取柱先采用1mL乙腈活化；再加入1mL纯水平衡；将步骤3)、步骤4)血浆样品溶液各200μL上样；依次加入400μL纯水、400μL 10％乙腈水淋洗；最后用300μL 90％乙腈水(1％甲酸)洗脱，收集全部的洗脱馏分，待上样分析。

7)样品的分析：将步骤6)待测样品上样检测，采用反相色谱对待测组分进行分离，三重四极杆串联质谱检测，得到样品谱图，检测卡陪他滨负离子：

与实施例1不同之处在于液相色谱进样体积为1μL。

卡陪他滨的定性定量离子对、驻留时间碰撞能量等见表5.

表5卡陪他滨的质谱参数

4、定量计算结果分析：根据样品色谱图中卡陪他滨离子色谱峰的峰面积与5-溴尿嘧啶内标离子色谱峰的峰面积的比值作为Response，与其相对应的浓度做线性回归方程(如表6所示)，外标法计算血浆样品中卡陪他滨的浓度，得到血浆样品卡陪他滨的浓度(如表7所示)。

表6卡陪他滨线性回归方程

表7卡陪他滨血浆样本和定量下限样本测定浓度

5、结论：

该检测方法对血浆样品中目标化合物5-氟尿嘧啶的检测稳定性好。

实施例3本发明与现有技术的比较

比较商品化固相萃取柱C18HC、C18SAX、C18CN、C18AEX、C18EC和本发明特异性净化固相萃取柱(五氟苯基)同时对5-氟尿嘧啶和卡陪他滨进行固相萃取比较。

1.材料与试剂

商品化固相萃取柱C18HC、C18SAX、C18CN、C18AEX、C18EC、特异性净化填料(键合相为五氟苯基)。

2.仪器和设备

与实施例1相同。

3.高效液相色谱-串联质谱法检测分析不同类型固相萃取柱对五氟尿嘧啶类药物5-氟尿嘧啶和卡陪他滨固相萃取前处理，步骤为：

1)4.5mL空白人血清和0.5mL 5-氟尿嘧啶和卡陪他滨标准品混合工作液(浓度均为0.5μg/mL)加入到10mL离心管内，混匀后血清备用；

2)装填固相萃取柱：装填本发明的特异性净化材料(同实施例1-2)填料100mg置1mL柱管内。

3)固相萃取柱C18HC、C18SAX、C18CN、C18AEX、C18EC(规格：100mg/mL)：采用1mL甲醇活化；1mL纯水平衡；将步骤1)混合血清300μL上样；分别加入0.5mL纯水(淋洗1)、0.5mL10％甲醇水(淋洗2)依次淋洗；用0.3mL 90％甲醇水(1％甲酸)(洗脱1)洗脱，用0.3mL 90％甲醇水(1％甲酸)(洗脱2)重复洗脱，分别收集上样、淋洗1、淋洗2、洗脱1、洗脱2收集的馏分，分别上样分析；

4)固相萃取分离：采用1mL甲醇活化；1mL纯水平衡；将步骤1)混合血清样品300μL上样；分别加入0.5mL纯水(淋洗1)、0.5mL 10％甲醇水(淋洗2)依次淋洗；用0.3mL 90％甲醇水(1％甲酸)(洗脱1)洗脱，用0.3mL90％甲醇水(1％甲酸)(洗脱2)重复洗脱，分别收集上样、淋洗1、淋洗2、洗脱1、洗脱2收集的馏分，分别上样分析；

4.样品的分析：将待测样品上机检测，采用反向色谱对待测组分进行分离，三重四极杆串联质谱检测，得到样品谱图，检测5-氟尿嘧啶和卡陪他滨负离子的峰面积响应：

高效液相色谱条件和质谱条件：

i)高效液相色谱条件

色谱柱：Gemini C183μm，50*4.6mm；流动相：2mM甲酸铵水溶液(A)、乙腈(B)，梯度洗脱见表8；柱温40℃，进样体积：2μL。

表8高效液相色谱梯度条件

ii)质谱条件

离子化模式：ESI^-；喷雾电压：-4.5KV；脱溶剂气温度：500℃；雾化气(GAS1)：50psi；辅助雾化气(GAS 2)：50psi；气帘气：20psi；扫描方式：多反应监测(MRM)

5-氟尿嘧啶和卡陪他滨的定性定量离子对、驻留时间碰撞能量等见表9。

表9 5-氟尿嘧啶和卡陪他滨的质谱参数

5.实验结果：

表10六种不同填料固相萃取柱萃取血清中5-氟尿嘧啶结果

表11六种不同填料固相萃取柱萃取血清中卡陪他滨结果

以上结果显示，本发明特异性固相萃取柱(五氟苯基)处理的同一血清样本，在固相萃取柱中保留分离效果明显好于普通C18HC、C18SAX、C18CN、C18AEX、C18EC固相萃取柱，且洗脱过程的响应也比较高，本发明特异性填料对五氟尿嘧啶药物的分离前处理具有明显优势。

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (9)

1.一种可用于处理血清或血浆样品的特异性净化材料，其特征在于，所述材料的结构式为：

2.一种五氟尿嘧啶类药物的代谢动力学分析方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

将血清或血浆样品经过如权利要求1所述的特异性净化材料预处理，得到净化的样品洗脱溶液，将所述洗脱溶液进液相色谱-串联质谱检测分析，测定样品中5-氟尿嘧啶和卡陪他滨等五氟尿嘧啶类药物的含量。

3.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述血清或血浆样品的制备方法为：将血清或血浆中加入结构类似物或氘代同位素作为内标，涡旋混合得到血清或血浆样品溶液。

4.根据权利要求3所述的分析方法，其特征在于，血清或血浆样品取样的体积为5μL-500μL。

5.根据权利要求3所述的分析方法，其特征在于，每1μL血清或血浆样品加入结构类似物或氘代同位素内标1μL-100μL，内标加入的浓度为1μg/mL-100μg/mL。

6.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述特异性净化材料为固相萃取柱填料，所述材料可特异性净化富集血清或血浆中五氟尿嘧啶类药物。

7.根据权利要求6所述的分析方法，其特征在于，固相萃取柱填料硅胶颗粒度为15μm-100μm，孔径为

比表面积150m²/g-400m²/g，固相萃取柱装填规格：填料50-500mg，柱管体积1-6mL。

8.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，固相萃取柱先采用有机溶剂进行活化；再加入纯水进行平衡；血清或血浆样品溶液上样后；加入纯水进行淋洗；再加入体积比为有机溶剂：水＝10：90混合液进行淋洗；最后用体积比为有机溶剂：水：酸＝90：9：1混合液洗脱，收集全部的洗脱馏分；其中，所述有机溶剂为甲醇、乙腈、异丙醇、乙醇、丙酮中的一种或几种；所述的酸为甲酸或乙酸溶液，酸浓度0.1-5％。

9.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，五氟尿嘧啶类药物的代谢动力学分析方法采用反相高效液相色谱分离，串联质谱检测分析，扫描得到样品谱图，检测五氟尿嘧啶类药物负离子：

所述高效液相色谱条件：

色谱柱：C183μm，50*4.6mm；流动相流速0.6mL/min；等度洗脱；柱温30-50℃；进样量：5μL；

所述质谱分析条件：

离子化模式：ESI^-；喷雾电压：-4.5KV；脱溶剂气温度：500℃；雾化气：50psi；辅助雾化气：50psi；气帘气：20psi；扫描方式：多反应监测(MRM)。

Images