CN105080492A - 一种分离碱性化合物用硅胶色谱填料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种分离碱性化合物用硅胶色谱填料及其制备方法，该方法包括，将硅胶与非极性硅烷偶联剂和极性硅烷偶联剂的混合物反应，制得所述硅胶色谱填料。本发明的分离碱性化合物用硅胶色谱填料的制备方法所制备的色谱填料能够提供疏水作用、氢键作用、静电引力、离子交换等多种形式的作用力，与传统的反相色谱填料相比具有更好的分离选择性。
Description
技术领域
本发明涉及一种硅胶基质反相色谱填料及其制备方法，具体为一种分离碱性化合物用硅胶色谱填料及其制备方法。
背景技术
高效液相色谱(HPLC)是20世纪70年代发展起来的一项高效、新颖、快速的分析分离技术。自从1971年Kirkland首次将制备的硅胶反相色谱填料用于高效液相色谱(HPLC)分离以来，反相高效液相色谱(RP-HPLC)已成为化学化工、食品卫生、药物检测、环保监测等诸多领域中最常用的分析分离手段。据统计，约有80％的分离是在反相模式下进行的。但是，在一般的分离模式下，由于采用传统方法制备反相色谱填料的硅胶表面仍然残留相当数量的硅羟基，它们往往容易与碱性化合物形成不利的电荷作用而造成色谱峰拖尾，因而使得某些极性化合物特别是碱性化合物的分离受到了很大的影响。尤其是在进样量较大的情况下，常常导致峰型拖尾、峰变宽、保留时间漂移甚至产生不可逆吸附等问题。一直以来，碱性化合物的分离都是色谱界的难题，尽管随着超高纯度球形硅胶的应用，高碳载量键合、高pH耐受及其各种端基封尾技术的发展，碱性化合物的色谱峰型已经得到了较大的改善，但是并未能在本质上克服其拖尾等问题，特别是在纯化制备和微量杂质检测所需高进样量情况下，由于过载导致的峰型拖尾问题尤其突出。
为了解决该问题，近年来研制出了静电屏蔽作用的新型填料。这种填料的主要制备方法是在硅胶反相填料的中下部嵌入一些极性基团，如烷基胺、酰胺、季铵或氨基甲酸酯等极性基团[O’Gara.J.E.etal.Anal.Chem.1995,67(20):3908-3913]，它可屏蔽硅羟基与目标物的相互作用，增强填料在高pH值流动相中的稳定性，并且在分离碱性化合物时取得了较好的分离效果。但是，这种“静电屏蔽”作用的新型反相色谱填料也存在一定的缺点，即由于该填料的制备方式是在每一个非极性基团和硅胶之间插入一个极性基团，因而非极性基团与极性基团之间的比例为基本上是1:1，导致很难调控非极性基团与极性基团之间的比例，并且非极性基团与极性基团的空间位置也相对固定，难于进行调控。另外，这种制备方法的缺点是需要通过两步反应制备极性基团嵌入反相色谱填料，即首先将氨基硅烷化试剂和高反应活性的烷基酰氯、烷基胺等试剂进行反应，生成极性基团改性的硅烷化试剂，然后将极性基团改进硅烷化试剂和硅胶进行反应。而众所周知：这种制备方法存在的最大问题是填料的过程复杂，并且填料的稳定性和重现性也难于控制。
Guo等发展了一种基于硅胶表面共聚反应的色谱分离材料及其制备的方法[Guo.Z.M.etal.J.Chromatogr.A,2010,1217(27):4555-4560]。该制备方法是通过两种或者两种以上的硅烷试剂在硅胶表面经过共聚反应，形成“非极性/极性共聚固定相”。该方法所制备的填料对碱性化合物具有较好的峰型，填料同时具有非极性基团和极性基团，能同时提供疏水作用力和多种形式的极性作用力，可极大程度地提高反相高效液相色谱的选择性。但是由于该方法是采用共聚反应的方法，因而导致所制备的色谱填料存在重现性和稳定性不够理想等问题。
综上所述，研制一种既能够保证碱性化合物具有理想的峰型，且制备过程简单易行、稳定性和重现性均较好的硅胶反相色谱填料，非常有必要。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种分离碱性化合物用硅胶色谱填料的制备方法，包括，将硅胶与非极性硅烷偶联剂和极性硅烷偶联剂的混合物反应，制得所述硅胶色谱填料；
所述非极性硅烷偶联剂的化学式为：X(Si)(CH3)2R1，X为可水解基团，R1选自包含1～20个碳原子的烷基、1～20个碳原子的含苯基的取代烷基、1～20个碳原子的含五氟苯基的取代烷基、或全氟辛基；所述极性硅烷偶联剂的化学式为：X3(Si)R2，X为所述可水解基团，R2选自包含2～4个碳原子的一卤代烷基；或者
所述非极性硅烷偶联剂的化学式为：X3(Si)R1，X为所述可水解基团，R1选自包含1～20个碳原子的烷基、1～20个碳原子的含苯基的取代烷基、1～20个碳原子的含五氟苯基的取代烷基、或全氟辛基；所述极性硅烷偶联剂的化学式为：X(Si)(CH3)2R2，X为所述可水解基团，R2选自包含2～4个碳原子的一卤代烷基。
根据本发明的一实施方式，所述硅胶色谱填料的制备方法包括如下步骤，
(1)将所述硅胶通过活化预处理，制得活化硅胶；
(2)将所述活化硅胶进行水合处理，制得水合硅胶；
(3)将所述水合硅胶、所述非极性硅烷偶联剂及所述极性硅烷偶联剂在有机溶剂中回流反应；
(4)将所述步骤(3)中回流反应后的产物过滤，并依次用甲苯、四氢呋喃/水、甲醇以及乙腈洗涤，制得所述硅胶色谱填料。
根据本发明的另一实施方式，所述步骤(1)包括：向所述硅胶中加入质量浓度为0.04～0.08％的氢氟酸水溶液，回流反应制得所述活化硅胶；其中，所述硅胶的质量与所述氢氟酸水溶液的体积之比为1:(8～10)。
根据本发明的另一实施方式，所述步骤(2)包括：向所述活化硅胶中加入水搅拌，制得所述水合硅胶；所述硅胶与所述水的质量比为1:(0.005～0.1)，搅拌的速率为150～300转/分钟。
根据本发明的另一实施方式，所述有机溶剂选自甲苯、二甲苯、正己烷或正庚烷。
根据本发明的另一实施方式，所述硅胶的质量与所述有机溶剂的体积之比为1:(4～10)。
根据本发明的另一实施方式，所述步骤(3)的回流反应是在80～150℃下搅拌回流反应24～48小时。
根据本发明的另一实施方式，所述可水解基团X选自氯、甲氧基或乙氧基。
根据本发明的另一实施方式，所述非极性硅烷偶联剂选自氯二甲基-n-十八烷基硅烷、十八烷基三氯硅烷、辛基二甲基氯硅烷、辛基三氯硅烷、氯化二甲基-(1H,1H,2H,2H)全氟辛基硅烷、全氟辛基三氯硅烷、3-苯丙基二甲基氯硅烷、3-苯基丙基三氯硅烷、6-苯基己基二甲基氯硅烷、6-苯基己基三氯硅烷、五氟苯基丙基二甲基氯硅烷、或五氟苯基丙基三氯硅烷；
所述极性硅烷偶联剂选自3-氯丙基二甲基氯硅烷、3-氯丙基三氯硅烷、4-氯丁基二甲基氯硅烷、2-溴代乙基三氯硅烷、3-溴丙基三氯硅烷、溴丁基二甲基氯硅烷、或溴丁基三氯硅烷。
根据本发明的另一实施方式，所述硅胶表面的硅羟基与硅烷偶联剂的摩尔比为1:(0.3～1.2)，所述硅烷偶联剂包括所述非极性硅烷偶联剂和所述极性硅烷偶联剂。
根据本发明的另一实施方式，所述极性硅烷偶联剂与所述非极性硅烷偶联剂的摩尔比为1:(2～8)。
根据本发明的另一实施方式，所述硅胶的粒径为3～10μm，孔径为100～比表面积为180～400m2/g。
本发明进一步提供了一种分离碱性化合物用硅胶色谱填料，由上述任一项的方法制得。
根据本发明的一实施方式，所述填料包括硅胶以及通过硅氧键键合于所述硅胶表面的非极性基团R1、极性基团R2，所述硅胶色谱填料的结构为：
其中，黑色球代表硅胶基质微球；所述非极性基团R1选自包含1～20个碳原子的烷基、1～20个碳原子的含苯基的取代烷基、1～20个碳原子的含五氟苯基的取代烷基、或全氟辛基；所述极性基团R2选自包含2～4个碳原子的卤代烷基。
根据本发明的另一实施方式，所述非极性基团R1选自n-十八烷基、辛基、全氟辛基、3-苯丙基、6-苯基己基或五氟苯基丙基；所述极性基团R2选自3-氯丙基、4-氯丁基、2-溴代乙基、3-溴丙基、或溴丁基。
本发明的分离碱性化合物用硅胶色谱填料的制备方法所制备的色谱填料能够提供疏水作用、氢键作用、静电引力、离子交换等多种形式的作用力，与传统的反相色谱填料相比具有更好的分离选择性。本发明提供的制备方法具有制备方法简单、稳定性好、重现性好以及易于规模化生产等优点。
附图说明
图1为本发明应用例1的硅胶色谱填料分离分析头孢他啶(CEZ)及其相关杂质的紫外色谱图；
图2为本发明应用例2的硅胶色谱填料分离分析6-氨基青霉烷酸(6-APA)及其相关杂质的紫外色谱图。
具体实施方式
体现本发明特征与优点的典型实施方式将在以下的说明中详细叙述。应理解的是本发明能够在不同的实施方式上具有各种的变化，其皆不脱离本发明的范围，且其中的说明及图示在本质上是当作说明之用，而非用以限制本发明。
本发明提供一种分离碱性化合物用硅胶色谱填料的制备方法，包括，将硅胶与非极性硅烷偶联剂和极性硅烷偶联剂的混合物反应，制得所述硅胶色谱填料；其中，所述非极性硅烷偶联剂包含三个可水解基团，所述极性硅烷偶联剂包含一个可水解基团；或者所述非极性硅烷偶联剂包含一个可水解基团，所述极性硅烷偶联剂包含三个可水解基团。
在本发明的一实施方式中，所述非极性硅烷偶联剂的化学式为：X(Si)(CH3)2R1，X为可水解基团，R1选自包含1～20个碳原子的烷基、1～20个碳原子的含苯基的取代烷基、1～20个碳原子的含五氟苯基的取代烷基、或全氟辛基；所述极性硅烷偶联剂的化学式为：X3(Si)R2，X为所述可水解基团，R2选自包含2～4个碳原子的一卤代烷基。
在本发明的另一实施方式中，所述非极性硅烷偶联剂的化学式为：X3(Si)R1，X为所述可水解基团，R1选自包含1～20个碳原子的烷基、1～20个碳原子的含苯基的取代烷基、1～20个碳原子的含五氟苯基的取代烷基、或全氟辛基；所述极性硅烷偶联剂的化学式为：X(Si)(CH3)2R2，X为所述可水解基团，R2选自包含2～4个碳原子的一卤代烷基。
其中，可水解基团可选自氯、甲氧基或乙氧基。
非极性硅烷偶联剂优选为氯二甲基-n-十八烷基硅烷、十八烷基三氯硅烷、辛基二甲基氯硅烷、辛基三氯硅烷、氯化二甲基-(1H,1H,2H,2H)全氟辛基硅烷、全氟辛基三氯硅烷、3-苯丙基二甲基氯硅烷、3-苯基丙基三氯硅烷、6-苯基己基二甲基氯硅烷、6-苯基己基三氯硅烷、五氟苯基丙基二甲基氯硅烷、或五氟苯基丙基三氯硅烷；
极性硅烷偶联剂优选为3-氯丙基二甲基氯硅烷、3-氯丙基三氯硅烷、4-氯丁基二甲基氯硅烷、2-溴代乙基三氯硅烷、3-溴丙基三氯硅烷、溴丁基二甲基氯硅烷、或溴丁基三氯硅烷。
本发明的硅胶优选为全多孔球形硅胶，进一步优选为超高纯度全多孔球形色谱用硅胶，具体地，供活化用的原料硅胶的粒径优选为3～10μm，孔径优选为比表面积优选为180～400m2/g。本发明以硅胶作为制备色谱填料的基质微球，选用非极性硅烷偶联剂和极性硅烷偶联剂的混合物为键合反应试剂，采用单官能团键合和三官能团聚合键合相结合的反应方式，在硅胶基质上形成具有静电屏蔽功能的极性基团嵌入反相色谱填料。该填料引入极性基团取代大量硅羟基位点，极大程度克服了硅羟基和目标物之间的“次级保留”作用，从而使得碱性化合物具有极为优异的峰型。
本发明的硅胶基质表面所进行的化学修饰除了非极性硅烷偶联剂和极性硅烷偶联剂混合物键合修饰以外，并不需要像传统的反相色谱填料制备一样，对色谱填料进行端基封端处理。经化学修饰后的硅胶微球的结构如下所示：
其中，黑色球代表硅胶基质微球，R1表示非极性硅烷偶联剂中与硅相连的非极性基团，R2表示极性硅烷偶联剂中与硅相连的极性基团；包含三个可水解基团的非极性硅烷偶联剂或极性硅烷偶联剂与硅羟基(Si-OH)反应后，通过三个硅氧键键合于硅胶的表面，包含一个可水解基团的非极性硅烷偶联剂或极性硅烷偶联剂与硅羟基反应后，通过一个硅氧键键合于硅胶的表面。
非极性基团R1选自包含1～20个碳原子的烷基、含苯基的取代烷基、含五氟苯基的取代烷基、或全氟辛基；极性基团R2选自包含2～4个碳原子的卤代烷基。
非极性基团R1进一步优选为n-十八烷基、辛基、全氟辛基、3-苯丙基、6-苯基己基或五氟苯基丙基；极性基团R2进一步优选为3-氯丙基、4-氯丁基、2-溴代乙基、3-溴丙基、或溴丁基。
具体地，硅胶表面的硅羟基与硅烷偶联剂(包括非极性硅烷偶联剂和极性硅烷偶联剂)的摩尔比可以为1:(0.3～1.2)。极性硅烷偶联剂与非极性硅烷偶联剂的摩尔比优选为1:(2～8)。
本发明一实施方式的分离碱性化合物用硅胶色谱填料的制备方法，包括如下步骤：
(1)将原料硅胶通过活化预处理，制得活化硅胶；
(2)将活化硅胶进行水合处理，制得水合硅胶；目前常用的制备水合硅胶的工艺是采用通入相对湿度20～80％氮气的方法制备而成，这种方法存在操作步骤繁琐，且费力费时等问题；
(3)将水合硅胶、非极性硅烷偶联剂及极性硅烷偶联剂在有机溶剂中回流反应；
(4)将回流反应后的产物过滤，并依次用甲苯、四氢呋喃/水、甲醇以及乙腈洗涤，制得硅胶色谱填料。
其中步骤(1)可包括：向所述硅胶中加入质量浓度为0.04～0.08％的氢氟酸水溶液，回流反应制得所述活化硅胶；所述硅胶的质量与氢氟酸水溶液的体积之比优选为1:(8～10)。进一步优选地，硅胶与氢氟酸水溶液在搅拌加热回流的方式下反应22～24小时，之后在减压抽滤的方式下进行过滤，将硅胶与氢氟酸水溶液分离，并用超纯水(二次蒸馏水)清洗硅胶，以去除其表面残留的氢氟酸，直至用于清洗的水溶液呈中性，于90～110℃真空干燥至恒重，制得活化硅胶。
步骤(2)可包括：向所述活化硅胶中加入超纯水搅拌，制得水合硅胶；所述的原料硅胶与所加入的水的质量比优选为1:(0.005～0.1)，搅拌的速率优选为150～300转/分钟。
步骤(3)中的有机溶剂优选为非极性的溶剂，例如甲苯、二甲苯、正己烷或正庚烷。所述的原料硅胶的质量与有机溶剂的体积之比优选为1:(4～10)。
步骤(3)的回流反应优选为在80～150℃下搅拌回流反应24～48小时。
步骤(4)可包括：将步骤(3)中回流反应完成后容器的溶液冷却至有机溶剂的回流温度以下，减压条件下过滤，依次用甲苯、四氢呋喃/水、甲醇以及乙腈洗涤；优选地，所得的固体产品在90～200℃温度下真空干燥12小时以上，即制得填料。进一步优选地，上述的四氢呋喃/水的体积比可以为8:2。所使用甲苯、四氢呋喃/水、甲醇以及乙腈的温度为40～80℃。
与传统的反相色谱填料相比，本发明所制备的用于分离碱性化合物用硅胶色谱填料具有以下优点：
1.本发明色谱填料的结构新颖，硅胶基质能够很容易修饰各种非极性基团和极性基团；
2.本发明制备的色谱填料由于硅胶基质上极性基团的引入，确保硅胶表面的残余硅羟基被极大程度的屏蔽，从而使得碱性化合物具有极为优异的峰型；
3.本发明制备的色谱填料结构上同时具有非极性基团和极性基团，在分离过程中能够与目标物形成疏水作用、氢键作用、静电引力等各种形式的作用力，使得该色谱填料相比传统反相色谱填料具有更为优异的分离选择性。
4.本发明制备的色谱填料与现有的制备极性基团嵌入反相色谱填料的方法相比，具有填料结构中的非极性基团和极性基团的种类和比例可以自由调控的优势；本发明提供的制备方法可通过对不同种类的非极性硅烷化试剂和极性硅烷化试剂进行组合或者调整非极性硅烷化试剂和极性硅烷化试剂的比例，制备各种选择性差异大的硅胶反相色谱填料，可以满足各种化合物的分离需求；
5.本发明制备的色谱填料采用的是单官能团和三官能团聚合键合相结合的方式，从而极大程度地改善了由于纯粹的三官能团聚合键合而造成的色谱填料重现性差、稳定性和重现性不够理想、难以规模化扩大制备生产等问题。
以下，结合具体实施例对本发明的分离碱性化合物用硅胶色谱填料的制备方法做进一步说明。
制备例1
(1)往2L玻璃材质反应容器中加入100g硅胶(5μm,购于日本DAISO公司)，并加入1000mL蒸馏水搅拌30分钟、过滤，重复该步骤两次。然后加入1000mL质量比为0.08％的氢氟酸水溶液，搅拌24小时后用蒸馏水清洗至中性，最后加入1000mL丙酮洗涤、过滤，110℃干燥12小时，得到活化硅胶；
(2)称取活化硅胶100g(5μm,比表面积：300m2/g)，置于2L玻璃材质反应容器中；向反应容器中加入5g超纯水，于170转/分钟搅拌30分钟以上，得到水合硅胶；
(3)向玻璃材质反应容器中加入步骤(2)中制备的水合硅胶，并加入800mL干燥的无水甲苯溶剂，于170转/分钟搅拌均匀后加入含有24.45g十八烷基三氯硅烷和3.593g氯丙基二甲基氯硅烷两种硅烷试剂的混合物，使用电加热套加热至110℃，搅拌回流反应24小时：
(4)反应结束后，关掉电热套，待玻璃材质反应容器溶剂温度冷却至60℃左右，使用减压滤斗进行过滤，然后依次用甲苯、四氢呋喃/水溶液(v/v＝8/2)、甲醇、乙腈进行洗涤，产物在110℃真空干燥12小时即得结构式所示的固定相硅胶填料。
制备例2
(1)往2L玻璃材质反应容器中加入100g硅胶(5μm,购于日本DAISO公司)，并加入1000mL蒸馏水搅拌30分钟、过滤，重复该步骤两次。然后加入900mL质量比为0.06％氢氟酸水溶液，搅拌24小时后用蒸馏水清洗至中性，最后加入1000mL丙酮洗涤、过滤，110℃干燥12小时，得到活化硅胶；
(2)称取活化硅胶100g(5μm,比表面积：300m2/g)，置于2L反应容器中；向玻璃材质反应容器中加入8g超纯水，于250转/分钟搅拌30分钟，得到水合硅胶；
(3)向玻璃材质反应容器中加入步骤(2)中制备的水合硅胶，并加入800mL干燥的无水甲苯溶剂，于170转/分钟搅拌均匀后加入含有26.07g十八烷基三氯硅烷和3.111g4-氯丁基二甲基氯硅烷两种硅烷试剂的混合物，使用电加热套加热至110℃，搅拌回流反应24小时；
(4)反应结束后，关掉电热套，待玻璃材质反应容器溶剂温度冷却至60℃，使用减压滤斗进行过滤，然后分别用甲苯洗涤两次；四氢呋喃/水溶液(v/v＝8/2)、甲醇、乙腈进行洗涤，产物在110℃真空干燥12小时即得结构式所示的固定相硅胶填料。
制备例3
(1)往2L玻璃材质反应容器中加入100g硅胶(5μm,购于日本DAISO公司)，并加入1000mL蒸馏水搅拌30分钟、过滤，重复该步骤两次。然后加入800mL质量比为0.04％氢氟酸水溶液，搅拌24小时后用蒸馏水清洗至中性，最后加入1000mL丙酮洗涤、过滤，110℃干燥12小时，得到活化硅胶；
(2)称取活化硅胶100g(5μm,比表面积：300m2/g)，置于2L玻璃材质反应容器中；向反应容器中加入8g超纯水，于250转/分钟搅拌30分钟，得到水合硅胶；
(3)向玻璃材质反应容器中加入步骤(2)中制备的水合硅胶，并加入800mL干燥的无水甲苯溶剂，于170转/分钟搅拌均匀后加入含有22.29g辛基三氯硅烷和6.887g4-溴丁基二甲基氯硅烷两种硅烷试剂的混合物，使用电加热套加热至110℃，搅拌回流反应24小时：
(4)反应结束后，关掉电热套，待玻璃材质反应容器溶剂温度冷却至60℃，使用减压滤斗进行过滤，然后分别用甲苯洗涤两次；四氢呋喃/水溶液(v/v＝8/2)、甲醇、乙腈进行洗涤，产物在110℃真空干燥12小时即得结构式所示的固定相硅胶填料。
制备例4
(1)往2L玻璃材质反应容器中加入100g硅胶(5μm,购于日本DAISO公司)，并加入1000mL蒸馏水搅拌30分钟、过滤，重复该步骤两次。然后加入800mL质量比为0.08％氢氟酸水溶液，搅拌24小时后用蒸馏水清洗至中性，最后加入1000mL丙酮洗涤、过滤，110℃干燥12小时，得到活化硅胶；
(2)称取活化硅胶100g(5μm,比表面积：300m2/g)，置于2L玻璃材质反应容器中；向反应容器中加入10g超纯水，于300转/分钟搅拌30分钟以上，得到水合硅胶；
(3)向玻璃材质反应容器中加入步骤(2)中制备的水合硅胶，并加入800mL干燥的无水甲苯溶剂，搅拌均匀后加42.55g辛基二甲基氯硅烷和8.792g3-溴丙基三氯硅烷两种硅烷混合后加入反应器中，使用电加热套加热至110℃，搅拌回流反应24小时；
(4)反应结束后，关掉电热套，待玻璃材质反应容器溶剂温度冷却至60℃左右，使用减压滤斗进行过滤，然后分别用甲苯洗涤两次；四氢呋喃/水溶液、甲醇、乙腈进行洗涤，产物在110℃真空干燥12小时即得结构式所示的固定相硅胶填料。
制备例5
(1)往2L玻璃材质反应容器中加入100g硅胶(5μm,购于日本DAISO公司)，并加入1000mL蒸馏水搅拌30分钟、过滤，重复该步骤两次。然后加入800mL质量比为0.06％氢氟酸水溶液，搅拌24小时后用蒸馏水清洗至中性，最后加入1000mL丙酮洗涤、过滤，110℃干燥12小时，得到活化硅胶；
(2)称取活化硅胶100g(5μm,比表面积：300m2/g)，置于2L玻璃材质反应容器中；向反应容器中加入10g超纯水，于300转/分钟搅拌30分钟以上，得到水合硅胶；
(3)向反应容器中加入步骤(2)中制备的水合硅胶，并加入800mL干燥的无水甲苯溶剂，于170转/分钟搅拌均匀后加入含有102.73g全氟辛基三氯硅烷和4.938g4-氯丁基二甲基氯硅烷两种硅烷试剂的混合物，使用电加热套加热至110℃，搅拌回流反应24小时；
(4)反应结束后，关掉电热套，待玻璃材质反应容器溶剂温度冷却至60℃，使用减压滤斗进行过滤，然后分别用甲苯洗涤两次；四氢呋喃/水溶液、甲醇、乙腈进行洗涤，产物在110℃真空干燥12小时即得结构式所示的固定相硅胶填料。
应用例1
将制备例1中制得的分离碱性化合物用硅胶填料进行装柱，柱长250mm，柱内径4.6mm。装柱条件如下：装柱压力3000～7000psi，匀浆剂：1-甲基-2-吡咯烷酮和四氢呋喃，料液比为1:10，最后用甲醇顶替30min。以乙腈-磷酸二氢铵缓冲盐溶液作为分离的流动相，流动相的流速为1.0mL/min，检测温度为35℃，紫外检测波长为255nm，分离的对象为头孢类的头孢他啶(CEZ)及其有关物质。分离效果如图1所示，图1是制备例1分离碱性化合物用硅胶填料色谱柱分离分析CEZ及其有关杂质的效果示意图。横坐标是保留时间，单位为分钟(min)，纵坐标是检测信号的响应值，单位为μV(微伏)。由图可知：采用本发明制备例1所制备的极性基团嵌入反相色谱填料装成的色谱柱用于CEZ的分离，CEZ主峰及其相关的杂质峰能够获得较好的分离效果(如图1D所示)，并且能够在较短的时间内分离；而在完全一样的流动相测试条件下普通的C18色谱柱却难于获得满意的分离度(如图1A,1B,1C所示)，图1A、图1B所用的色谱柱填料为不进行极性基团嵌入的C18色谱填料(将十八烷基三氯硅烷和硅胶的硅羟基直接进行键合反应所得)，图1C所用的色谱柱填料为酰胺基改性C18色谱填料，酰胺基没有在硅胶上进行改性修饰，仅仅是修饰在C18烷基链上(将十八酰氯和氨基硅烷化试剂反应生成酰胺基十八烷基硅烷，然后再使之与硅胶反应所得)。
应用例2
将制备例2制得的分离碱性化合物用硅胶填料进行装柱，柱长250mm，柱内径4.6mm。装柱条件如下：装柱压力3000-7000psi，匀浆剂：三氯甲烷和环己醇，料液比为1:10，最后用甲醇顶替30min。以乙腈-磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液作为分离的流动相，流动相的流速为1.0mL/min，检测温度为30℃，紫外检测波长为220nm，分离的对象为青霉素合成的原料6-氨基青霉烷酸(6-APA)及其有关物质。分离的效果如图2所示，图2是制备例2分离碱性化合物用硅胶填料分离分析6-APA及其有关杂质的效果示意图。横坐标是保留时间，单位为min，纵坐标是检测信号的响应值，单位为mV(毫伏)。由图可知：6-APA主峰及其相关的杂质峰能够获得较好的分离效果，由于空白梯度的变化造成的溶剂空白峰不对6-APA有关物质造成干扰，并且能够在较短的时间内分离(如图1D所示)；而在普通的C18色谱柱由于存在梯度空白峰的干扰，使得主峰和杂质峰难于获得满意的分离度(如图1A,1B,1C所示)。图1A、图1B所用的色谱柱填料为不进行极性基团嵌入的C18色谱填料(将十八烷基三氯硅烷和硅胶的硅羟基直接进行键合反应所得)，图1C所用的色谱柱填料为酰胺基改性C18色谱填料，酰胺基没有在硅胶上进行改性修饰，仅仅是修饰在C18烷基链上(将十八酰氯和氨基硅烷化试剂反应生成酰胺基十八烷基硅烷，然后再使之与硅胶反应所得)。
本发明的分离碱性化合物用硅胶色谱填料，引入极性基团取代大量硅羟基位点，极大程度克服了硅羟基和目标物之间的“次级保留”作用，从而使得碱性化合物具有极为优异的峰型。本发明所制备的色谱填料能够提供疏水作用、氢键作用、静电引力、离子交换等多种形式的作用力，与传统的反相色谱填料相比具有更好的分离选择性。
除非特别限定，本发明所用术语均为本领域技术人员通常理解的含义。
本发明所描述的实施方式仅出于示例性目的，并非用以限制本发明的保护范围，本领域技术人员可在本发明的范围内作出各种其他替换、改变和改进，因而，本发明不限于上述实施方式，而仅由权利要求限定。
Claims (15)
1.一种分离碱性化合物用硅胶色谱填料的制备方法，包括，将硅胶与非极性硅烷偶联剂和极性硅烷偶联剂的混合物反应，制得所述硅胶色谱填料；
所述非极性硅烷偶联剂的化学式为：X(Si)(CH3)2R1，X为可水解基团，R1选自含1～20个碳原子的烷基、1～20个碳原子的含苯基的取代烷基、1～20个碳原子的含五氟苯基的取代烷基、或全氟辛基；所述极性硅烷偶联剂的化学式为：X3(Si)R2，X为所述可水解基团，R2选自包含2～4个碳原子的一卤代烷基；或者
所述非极性硅烷偶联剂的化学式为：X3(Si)R1，X为所述可水解基团，R1选自含1～20个碳原子的烷基、1～20个碳原子的含苯基的取代烷基、1～20个碳原子的含五氟苯基的取代烷基、或全氟辛基；所述极性硅烷偶联剂的化学式为：X(Si)(CH3)2R2，X为所述可水解基团，R2选自包含2～4个碳原子的一卤代烷基。
2.根据权利要求1所述的方法，包括如下步骤，
(1)将所述硅胶通过活化预处理，制得活化硅胶；
(2)将所述活化硅胶进行水合处理，制得水合硅胶；
(3)将所述水合硅胶、所述非极性硅烷偶联剂及所述极性硅烷偶联剂在有机溶剂中回流反应；
(4)将所述步骤(3)中回流反应后的产物过滤，并依次用甲苯、四氢呋喃/水、甲醇以及乙腈洗涤，制得所述硅胶色谱填料。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤(1)包括：向所述硅胶中加入质量浓度为0.04～0.08％的氢氟酸水溶液，回流反应制得所述活化硅胶；其中，所述硅胶的质量与所述氢氟酸水溶液的体积之比为1:(8～10)。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤(2)包括：向所述活化硅胶中加入水搅拌，制得所述水合硅胶；所述硅胶与所述水的质量比为1:(0.005～0.1)，搅拌的速率为150～300转/分钟。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述有机溶剂选自甲苯、二甲苯、正己烷或正庚烷。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述硅胶的质量与所述有机溶剂的体积之比为1:(4～10)。
7.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤(3)的回流反应是在80～150℃下搅拌回流反应24～48小时。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述可水解基团X选自氯、甲氧基或乙氧基。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述非极性硅烷偶联剂选自氯二甲基-n-十八烷基硅烷、十八烷基三氯硅烷、辛基二甲基氯硅烷、辛基三氯硅烷、氯化二甲基-(1H,1H,2H,2H)全氟辛基硅烷、全氟辛基三氯硅烷、3-苯丙基二甲基氯硅烷、3-苯基丙基三氯硅烷、6-苯基己基二甲基氯硅烷、6-苯基己基三氯硅烷、五氟苯基丙基二甲基氯硅烷、或五氟苯基丙基三氯硅烷；
所述极性硅烷偶联剂选自3-氯丙基二甲基氯硅烷、3-氯丙基三氯硅烷、4-氯丁基二甲基氯硅烷、2-溴代乙基三氯硅烷、3-溴丙基三氯硅烷、溴丁基二甲基氯硅烷、或溴丁基三氯硅烷。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述硅胶表面的硅羟基与硅烷偶联剂的摩尔比为1:(0.3～1.2)，所述硅烷偶联剂包括所述非极性硅烷偶联剂和所述极性硅烷偶联剂。
11.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述极性硅烷偶联剂与所述非极性硅烷偶联剂的摩尔比为1:(2～8)。
12.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述硅胶的粒径为3～10μm，孔径为比表面积为180～400m2/g。
13.一种分离碱性化合物用硅胶色谱填料，由权利要求1至12中任一项所述的方法制得。
14.根据权利要求13所述的硅胶色谱填料，其中所述填料包括硅胶以及通过硅氧键键合于所述硅胶表面的非极性基团R1、极性基团R2，所述硅胶色谱填料的结构为：
其中，黑色球代表硅胶基质微球；所述非极性基团R1选自包含1～20个碳原子的烷基、1～20个碳原子的含苯基的取代烷基、1～20个碳原子的含五氟苯基的取代烷基、或全氟辛基；所述极性基团R2选自包含2～4个碳原子的卤代烷基。
15.根据权利要求14所述的硅胶色谱填料，其中所述非极性基团R1选自n-十八烷基、辛基、全氟辛基、3-苯丙基、6-苯基己基或五氟苯基丙基；所述极性基团R2选自3-氯丙基、4-氯丁基、2-溴代乙基、3-溴丙基、或溴丁基。
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