CN115144520A - 母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法，涉及理化检测技术领域。上述母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法，首先将待测母乳样品经固相萃取预处理；随后利用LC‑MS质液联用色谱对预处理后的待测母乳样品进行检测，通过与叶酸和五甲基四氢叶酸的对照品溶液比较进行定量、定性分析。本申请母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法具有选择性好、特异性佳、灵敏度高等特点，在对叶酸和五甲基四氢叶酸分型定量上具有明显的优势，能够有效缓解现有微生物法、化学发光法、液相色谱法等母乳中叶酸的检测方法没有对叶酸和五甲基四氢叶酸进行分型定量的局限性。
Description
技术领域
本发明涉及理化检测技术领域，尤其是涉及一种母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法。
背景技术
母乳是产后妇女乳房产生的汁液，能用作喂育新生儿之用，被誉为“白色血液”。母乳中含有碳水化合物、蛋白质、脂肪、维生素、矿物质、生物活性物质、免疫因子等，能满足新生儿的营养需要。因此，对新生儿而言，母乳是营养全面的最佳食物，出生后最初6个月的纯母乳喂养为最佳喂养新生儿方式，接着以持续母乳喂养并添加适当的补充食品的方式进行喂养，直至2岁或更长。国外研究表明，在3岁以下的婴儿食品中添加叶酸，有助于促进其脑细胞生长，并有提高智力的作用。
目前，国内外关于母乳成分的研究主要包括母乳成分方法学研究、乳母及婴幼儿对营养素代谢需要量、各成分与婴幼儿健康效应的关联、母乳成分变化规律及影响因素、母乳成分的干预研究、乳汁分泌机制研究等。其中研究最为广泛的是母乳成分含量分布、变化规律及影响因素。
叶酸由蝶啶、对氨基苯甲酸和L-谷氨酸组成，也叫蝶酰谷氨酸，是一种水溶性维生素，为人体细胞生长和繁殖所必需，可用于治疗由叶酸缺乏引起的贫血，也是孕妇的营养素补充剂。补充叶酸可显著降低新生儿神经管缺陷的发生率，也有助于降低心脑血管疾病的发生风险。目前，针对母乳叶酸和五甲基四氢叶酸的检测非常少见。
因此，研究开发出一种针对母乳叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法，变得十分必要和迫切。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法，该分析方法具有选择性好、特异性佳、灵敏度高等特点，在对叶酸和五甲基四氢叶酸分型定量上具有明显的优势，能够有效缓解现有微生物法、化学发光法、液相色谱法等母乳中叶酸的检测方法没有对叶酸和五甲基四氢叶酸进行分型定量的局限性。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供的一种母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法，其特征在于，所述分析方法包括：
将待测母乳样品经固相萃取进行预处理；随后利用LC-MS质液联用色谱对预处理后的待测母乳样品进行检测，通过与叶酸和五甲基四氢叶酸的对照品溶液比较进行定量、定性分析。
进一步的，所述待测母乳样品包括人母乳、动物乳汁、复原乳中的任意一种。
进一步的，所述预处理包括对待测母乳样品依次进行水解孵育、弱碱皂化和固相萃取的步骤。
进一步的，所述水解孵育的温度为37℃，时间为1～24小时；
优选地，所述水解孵育的保护剂为1％抗坏血酸和0.5％巯基乙醇的水溶液。
进一步的，所述弱碱皂化为：
在水解孵育后的待测母乳样品中加入0.1％～5％氨水，随后60～90℃金属浴5～60min。
进一步的，所述固相萃取的萃取板为Waters Oasis MAX 96-well μElutionPlate。
进一步的，所述LC-MS质液联用色谱的色谱条件包括：
液相分析色谱柱：Acquity UPLC HSS T3(50mm*2.1mm,1.8μm)；
柱温：40℃；进样量：5μL。
A相为0.1％甲酸水，B相为乙腈；
梯度洗脱程序为：
| 时间(min) | 流速(mL/min) | A相：0.1％甲酸水 | B相：纯乙腈 |
| 0 | 0.4 | 95 | 5 |
| 1.5 | 0.4 | 85 | 15 |
| 2 | 0.4 | 20 | 80 |
| 2.5 | 0.4 | 20 | 80 |
| 2.51 | 0.4 | 95 | 5 |
| 3 | 0.4 | 95 | 5 |
进一步的，所述LC-MS质液联用色谱的质谱的离子源参数包括：
进一步的，所述定性分析为LC-MS质液联用色谱测定待测母乳样品，如果检测出的色谱峰保留时间与标准品一致，并且在扣除背景后的待测母乳样品谱图中，各定性离子的相对丰度与浓度接近的同样条件下，与得到的对照品溶液谱图相比，来判定样品中是否存在对应的叶酸和/或五甲基四氢叶酸。
进一步的，所述定量分析为分别测定所述叶酸和五甲基四氢叶酸的响应，以浓度为横坐标，峰面积比为纵坐标绘制标准曲线；液相色谱-质谱测定所述待测母乳样品，以内标法或外标法进行定量分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法，该分析方法首先将待测母乳样品经固相萃取进行预处理；随后利用LC-MS质液联用色谱对预处理后的待测母乳样品进行检测，通过与叶酸和五甲基四氢叶酸的对照品溶液比较进行定量、定性分析。本申请母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法具有选择性好、特异性佳、灵敏度高等特点，在对叶酸和五甲基四氢叶酸分型定量上具有明显的优势，能够有效缓解现有微生物法、化学发光法、液相色谱法等母乳中叶酸的检测方法没有对叶酸和五甲基四氢叶酸进行分型定量的局限性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例3提供的质控标准品的总离子流图；
图2为本发明实施例3提供的叶酸外标质谱图；
图3为本发明实施例3提供的叶酸内标质谱图；
图4为本发明实施例3提供的五甲基四氢叶酸外标质谱图；
图5为本发明实施例3提供的五甲基四氢叶酸内标质谱图；
图6为本发明实施例4提供的乳液中叶酸标准曲线图；
图7为本发明实施例4提供的乳液中五甲基四氢叶酸标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，一种母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法，所述分析方法包括：
将待测母乳样品经固相萃取进行预处理；随后利用LC-MS质液联用色谱对预处理后的待测母乳样品进行检测，通过与叶酸和五甲基四氢叶酸的对照品溶液比较进行定量、定性分析。
本发明提供的母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法，该分析方法首先将待测母乳样品经固相萃取进行预处理；随后利用LC-MS质液联用色谱对预处理后的待测母乳样品进行检测，通过与叶酸和五甲基四氢叶酸的对照品溶液比较进行定量、定性分析。本申请母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法具有选择性好、特异性佳、灵敏度高等特点，在对叶酸和五甲基四氢叶酸分型定量上具有明显的优势，能够有效缓解现有微生物法、化学发光法、液相色谱法等母乳中叶酸的检测方法没有对叶酸和五甲基四氢叶酸进行分型定量的局限性。
在本发明的一种优选实施方式中，所述待测母乳样品包括人母乳、动物乳汁、复原乳中的任意一种。
作为一种优选的实施方式，本申请待测母乳样品不局限于母乳样本，其他动物的乳汁，奶粉，复原乳等样本依然适用。
在本发明的一种优选实施方式中，所述预处理包括对待测母乳样品依次进行水解孵育、弱碱皂化和固相萃取的步骤。
作为一种优选的实施方式，上述待测母乳样品的预处理方法通过水解孵育水解叶酸多聚谷氨酸盐，通过弱碱进行皂化水解乳脂基质，通过固相萃取技术分离纯化全血中各种叶酸，预处理后运用先进的液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术对母乳中的叶酸和五甲基四氢叶酸进行定量检测。由通过以上检测可以了解母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的含量和分布情况。
在本发明的一种优选实施方式中，所述水解孵育的温度为37℃，时间为3～24小时；
优选地，所述水解孵育的保护剂为1％抗坏血酸和0.5％巯基乙醇的水溶液。
在本发明的一种优选实施方式中，所述弱碱皂化为：在水解孵育后的待测母乳样品中加入0.1％～5％氨水，随后60℃～90℃金属浴5min～60min。
在本发明的一种优选实施方式中，所述固相萃取的萃取板为Waters Oasis MAX96-wellμElution Plate。
作为一种优选的实施方法，上述Waters Oasis MAX 96-well μElution Plate萃取板主要洗脱原理为阴离子交换(碱性上样，酸性洗脱)，兼有反向洗脱原理(高水相上样，高有机相洗脱)。两种洗脱原理使得洗脱更加充分。此外洗脱液中的甲酸比例进行了单因素实验，在0.1％-5％的范围内，2％左右的甲酸最为适宜。
优选地，所述待测母乳样品的预处理方法包括：
(a)、向200μL待测样品中添加10μL内标(含叶酸内标和五甲基四氢叶酸内标)，100μL保护剂，20μL大鼠血清，500μL 2％氨水(此步骤也可在孵育完成后添加)，充分混匀后，放入37℃恒温箱中孵育3小时以上(可过夜孵育)；
(b)、取出孵育后的样本，混合均匀后，瞬时离心甩掉盖子上的液体，在金属浴上80℃加热20min，皂化过程中可适当震荡样品(防止乳脂分离且有利于皂化完全)；
(c)、固相萃取处理共分五步，分别为活化、平衡、上样、淋洗、洗脱。活化液为400μL纯甲醇；平衡液为400μL 0.2％氨水；上样液为上述步骤e中孵育后的溶液；淋洗液为100μL纯水；洗脱液为自配试剂(含90％甲醇，8％稀释液，2％甲酸)，100μL洗脱两次；以上步骤控制流速为3-5秒一滴，上样和洗脱时略慢效果更佳。
(d)、洗脱下来的溶液在氮气下50℃加热吹干，再用100μL纯水复溶，震荡混匀后，离心10分钟，取上层清液90μL准备上机。洗脱下来的溶液在氮气下50℃加热吹干，再用100μL纯水复溶，震荡混匀后，离心10分钟，取上层清液90μL准备上机。
在本发明的一种优选实施方式中，所述LC-MS质液联用色谱的色谱条件包括：
液相分析色谱柱：Acquity UPLC HSS T3(50mm*2.1mm,1.8μm)；
柱温：40℃；进样量：5μL。
A相为0.1％甲酸水，B相为乙腈；
梯度洗脱程序为：
| 时间(min) | 流速(mL/min) | A相：0.1％甲酸水 | B相：纯乙腈 |
| 0 | 0.4 | 95 | 5 |
| 1.5 | 0.4 | 85 | 15 |
| 2 | 0.4 | 20 | 80 |
| 2.5 | 0.4 | 20 | 80 |
| 2.51 | 0.4 | 95 | 5 |
| 3 | 0.4 | 95 | 5 |
在本发明的一种优选实施方式中，所述LC-MS质液联用色谱的质谱的离子源参数包括：
在本发明的一种优选实施方式中，所述定性分析为LC-MS质液联用色谱测定待测母乳样品，如果检测出的色谱峰保留时间与标准品一致，并且在扣除背景后的待测母乳样品谱图中，各定性离子的相对丰度与浓度接近的同样条件下，与得到的对照品溶液谱图相比，来判定样品中是否存在对应的叶酸和/或五甲基四氢叶酸。
在本发明的一种优选实施方式中，所述定量分析为分别测定所述叶酸和五甲基四氢叶酸的响应，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线；液相色谱-质谱测定所述待测母乳样品，以内标法或外标法进行定量分析。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行进一步地说明。
注：下述实施例中叶酸和五甲基四氢叶酸的标准品信息如下：
| 名称 | name | CAS号 |
| 叶酸 | folic acid | 59-30-3 |
| 五甲基四氢叶酸 | 5-methyl tetrahydrofolic acid | 31690-09-2 |
。
实施例1溶液的配置：
一、内标溶液：
精密称取叶酸内标和五甲基四氢叶酸内标各1mg，用标准品稀释液(纯甲醇，内含0.1％抗坏血酸钠和0.05％巯基乙醇)定容至10mL容量瓶中，制得100μg/mL的单标储液。分别取叶酸内标单标储液100μL和五甲基四氢叶酸内标单标储液100μL加入10mL容量瓶中，用标准品稀释液定容后得到1ug/mL内标准品混合溶液(10倍浓度)。
二、母乳样品预处理过程中的溶液：
保护剂：1％抗坏血酸和0.5％巯基乙醇的水溶液；
固相萃取过程中用到4种试剂：活化液、平衡液、淋洗液、洗脱；
活化液：甲醇；
实验中选用的甲醇作为活化液，同时比较了乙腈、乙醇和异丙醇，虽然作为有机试剂，都具有活化填料的作用，但是甲醇略好一些。
平衡液：0.2％氨水，0.01％-2％的范围内均可满足使用；
淋洗液：纯水；
洗脱液：90％甲醇、8％稀释液、2％甲酸；
三、母乳样品的预处理：
(a)、向200μL待测样品中添加10μL内标(含叶酸内标和五甲基四氢叶酸内标)，100μL保护剂，20μL大鼠血清，500μL 2％氨水(此步骤也可在孵育完成后添加)，充分混匀后，放入37℃恒温箱中孵育3小时以上(可过夜孵育)；
注：2％氨水(弱碱的pH在8—14之间最佳，强碱会破坏叶酸稳定性)。
(b)、取出孵育后的样本，混合均匀后，瞬时离心甩掉盖子上的液体，在金属浴上90℃加热20min，皂化过程中可适当震荡样品(防止乳脂分离且有利于皂化完全)；
(c)、固相萃取处理共分五步，分别为活化、平衡、上样、淋洗、洗脱。活化液为400μL纯甲醇；平衡液为400μL 0.2％氨水；上样液为上述步骤e中孵育后的溶液；淋洗液为100μL纯水；洗脱液为自配试剂(含90％甲醇，8％稀释液，2％甲酸)，100μL洗脱两次；以上步骤控制流速为3-5秒一滴，上样和洗脱时略慢效果更佳。
(d)、洗脱下来的溶液在氮气下50℃加热吹干，再用100μL纯水复溶，震荡混匀后，离心10分钟，取上层清液90μL准备上机。洗脱下来的溶液在氮气下50℃加热吹干，再用100μL纯水复溶，震荡混匀后，离心10分钟，取上层清液90μL准备上机。
四、用于绘制标准曲线的对照品溶液制备：
精密称取叶酸和五甲基四氢叶酸各2.5mg，用标准品稀释液(纯甲醇，内含0.1％抗坏血酸钠和0.05％巯基乙醇)定容至5mL容量瓶中，制得500μg/mL的单标储液。分别取叶酸单标储液100μL和五甲基四氢叶酸单标储液200μL加入10mL容量瓶中，用标准品稀释液定容后得到20倍浓度的标准曲线S7溶液，然后按照下表所示浓度(20倍)逐级稀释：
| S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | S7 | |
| FOL | 2.5 | 5 | 12.5 | 25 | 50 | 125 | 250 |
| 5m-THF | 5 | 10 | 25 | 50 | 100 | 250 | 500 |
实施例2LC-MS检测条件：
一、色谱：
液相方法信息表：
二、质谱：
离子源参数信息表：
质谱方法信息表：
实施例3样品检测图谱：
按照实施例1配置混合标准品对照溶液。分别按照实施例2中的液相色谱-质谱条件进行空白样品溶液及混合标准品对照溶液的测定，结果见图1所示。
图1为质控标准品的总离子流图。五甲基四氢叶酸内外标出峰时间在0.96±0.05，叶酸内外标出峰时间在1.66±0.08。
图2为叶酸外标质谱图；
图3为叶酸内标质谱图；
图4为五甲基四氢叶酸外标质谱图；
图5为五甲基四氢叶酸内标质谱图
实施例4：标准曲线绘制：
实施例1的标准品对照液按20倍的梯度比稀释，配置一系列不同浓度的标准品溶液，具体对照品梯度溶液浓度(单位：ng/mL)如下：
| S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | S7 | |
| FOL | 2.5 | 5 | 12.5 | 25 | 50 | 125 | 250 |
| 5m-THF | 5 | 10 | 25 | 50 | 100 | 250 | 500 |
分别进行检测，以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，图6为乳液中叶酸标准曲线图；
图7为乳液中五甲基四氢叶酸标准曲线图；
具体评价结果如下：
叶酸连续3个分析批的标准曲线回归方程参数评价结果：
五甲基四氢叶酸连续3个分析批的标准曲线回归方程参数评价结果：
实施例5：准确度、精密度和回收率：
一、质控溶液配置：(单位：ng/mL)
| QCL | QCM | QCH | |
| FOL | 7.5 | 37.5 | 187.5 |
| 5m-THF | 15 | 75 | 375 |
准确度评价结果：
批内精密度评价结果：
批间精密度评价结果：
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法，其特征在于，所述分析方法包括：
将待测母乳样品进行预处理；随后利用LC-MS质液联用色谱对预处理后的待测母乳样品进行检测，通过与叶酸和五甲基四氢叶酸的对照品溶液比较进行定量、定性分析。
2.根据权利要求1所述的母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法，其特征在于，所述待测母乳样品包括人母乳、动物乳汁、复原乳中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法，其特征在于，所述预处理包括对待测母乳样品依次进行水解孵育、弱碱皂化和固相萃取的步骤。
4.根据权利要求3所述的母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法，其特征在于，所述水解孵育的温度为37℃，时间为1～24小时；
优选地，所述水解孵育的保护剂为1％抗坏血酸和0.5％巯基乙醇的水溶液。
5.根据权利要求3所述的母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法，其特征在于，所述弱碱皂化为：
在水解孵育后的待测母乳样品中加入氨水，随后60～90℃金属浴5～30min。
6.根据权利要求3所述的母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法，其特征在于，所述固相萃取的萃取板为Waters Oasis MAX 96-well μElution Plate。
7.根据权利要求1所述的母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法，其特征在于，所述LC-MS质液联用色谱的色谱条件包括：
液相分析色谱柱：Acquity UPLC HSS T3(50mm*2.1mm,1.8μm)；
柱温：40℃；进样量：5μL；
A相为0.1％甲酸水，B相为乙腈；
梯度洗脱程序为：
。
8.根据权利要求1所述的母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法，其特征在于，所述LC-MS质液联用色谱的质谱的离子源参数包括：
9.根据权利要求1所述的母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法，其特征在于，所述定性分析为LC-MS质液联用色谱测定待测母乳样品，如果检测出的色谱峰保留时间与标准品一致，并且在扣除背景后的待测母乳样品谱图中，各定性离子的相对丰度与浓度接近的同样条件下，与得到的对照品溶液谱图相比，来判定样品中是否存在对应的叶酸和/或五甲基四氢叶酸。
10.根据权利要求1所述的母乳中叶酸和五甲基四氢叶酸的检测方法，其特征在于，所述定量分析为分别测定所述叶酸和五甲基四氢叶酸的响应，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线；液相色谱-质谱测定所述待测母乳样品，以内标法或外标法进行定量分析。
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