CN112083108A - 一种血液中叶酸的精准检测方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种血液中叶酸的精准检测方法和试剂盒，包括如下内容：1)一种血液中叶酸的精准检测方法，步骤为血液样本加入内标后，利用特异性的固相萃取柱对叶酸进行富集和净化，净化液采用串联质谱进行分析，以保留时间和离子对丰度比为定性依据，通过内标法建立校准曲线进行定量，可精准检测血液中叶酸、5‑甲基四氢叶酸、5‑甲酰基四氢叶酸。2)本发明还公开了一种血液中叶酸精准检测的试剂盒，包括特异性固相萃取柱、内标混合液、校准液、活化液、平衡液、淋洗液1和2、萃取液和质控样本。本发明可实现血液中叶酸、5‑甲基四氢叶酸、5‑甲酰基四氢叶酸的精准定量检测，具有良好的精密度和准确度。

Description

一种血液中叶酸的精准检测方法和试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体地说是一种血液中叶酸精准检测方法和试剂盒。

技术背景

叶酸(Folic acid)亦称蝶酰谷氨酸，即维生素B9，是人体重要的营养物质。广义的叶酸是叶酸和其他具有叶酸生物活性的相关化合物的总称，大约有100多种亚型，主要存在形式是叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸和5-甲酰基四氢叶酸等，5-甲基四氢叶酸是血液中叶酸最主要的存在形式，约占总量的82％～93％，是人体中最主要的甲基供体。

叶酸是机体细胞生长和DNA合成的一种必需维生素，直接影响核酸的合成及氨基酸代谢，对细胞分裂、增殖和组织生长具有极其重要的作用。叶酸的缺乏和代谢异常除了引起巨幼红细胞贫血外，还与心血管疾病、神经管畸形、免疫缺陷、肿瘤相关。

目前，微生物改良法和免疫法是进行叶酸评估的常用方法。微生物法操作繁琐，花费时间长，检测结果受微生物敏感度、样品中所含抗叶酸药物或抗生素成分的影响，检测结果缺乏重复性。免疫法具有快速、简单的优势，叶酸检测免疫试剂盒的出现，使得免疫法很快普及用于临床实验室。但由于不同的结合蛋白对各叶酸亚型反应灵敏度各不相同，不同的试剂盒的检测结果差异很大，故其应用于临床检测的可靠性并不高。

以上两种检测方法的检测结果均为叶酸及其亚型的总量，无法得到各叶酸亚型的含量值，不适用于叶酸体内代谢的研究。此外，由于不同试剂盒的叶酸检测结果差异较大，不同方法的检测结果之间缺乏可比性，这种差异不利于正确客观的判定叶酸代谢状况，故目前尚无叶酸缺乏判定的统一标准。随着对叶酸在出生缺陷、心血管疾病、肿瘤及神经异常性疾病的治疗和预防作用认识的不断深入，人们对精准测量机体叶酸水平的要求也日益迫切。

LC-MS/MS是一种联合液相色谱和质谱分析的检测技术，具有高选择性、高特异性以及高灵敏度的特点。目前，已有文献报道应用LC-MS/MS对叶酸及其类似物进行定量分析，例如：1.Lisa Striegel发表了一种同位素稀释质谱法对血浆中5-甲基四氢叶酸进行定量分析的方法，虽然具有极高的准确度和精密度，但该方法仅检测5-甲基四氢叶酸，且定量下限高达4.51nmol/L(2ng/mL)(Striegel,L.,Brandl,B.,etal.Quantitation of5-methyltetraydrofolic acid in plasma for determination of folate status andclinical studies by stable isotope dilution assays.PLOS ONE,2019,14(2))；2.Susanne H发表了一种同位素稀释UPLC-MS/MS测定血清中主要叶酸亚型的方法，虽然该方法可测定叶酸的主要亚型，但单个样本叶酸的萃取需耗费约7ml的试剂(Kirsch,S.H.,Knapp,J.-P.,et al.Quantification of key folate forms in serum using stable-isotope dilution ultra performance liquid chromatography–tandem massspectrometry.Journal of Chromatography B,2010,878(1),68–75).虽有文献报道LC-MS/MS对叶酸及其类似物的定量分析方法，但该类方法尚以基础科学研究为主，多存在以下的缺点：检测成本高、操作复杂、耗时长、定量限高或无法检测含量较低的叶酸和5-甲酰基四氢叶酸，因此无法在临床实验室真正应用，实现叶酸的精准检测。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处而提供一种临床可用的血液中叶酸的精准检测方法和试剂盒。该方法采用特异性的固相萃取材料，高效富集血液中的叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸，有效去除血液中基质的干扰，实现对痕量物质叶酸和5-甲酰基四氢叶酸的精准检测。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种血液中叶酸的精准检测试剂盒，其组成为：特异性固相萃取柱、内标混合液、校准液、活化液、平衡液、淋洗液1和2、萃取液和质控样本。

优选地，所述叶酸为：叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸。

优选地，所述血液样本为血清样本或者血浆样本。

优选地，所述特异性固相萃取柱使用对叶酸类物质的特异性吸附材料，特异性吸附材料以硅胶为基质，键合相结构为：

其中优选地，n等于2-12；固相萃取材料硅胶颗粒度为40μm-50μm，孔径为

更优选地，n等于6；固相萃取材料硅胶颗粒度为50μm，孔径为

优选地，所述校准液为用BSA溶液配制的6个浓度的叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸的混合溶液；其中，叶酸和5-甲酰基四氢叶酸浓度范围为0.1～20ng/mL，5-甲基四氢叶酸浓度范围为0.2～40ng/mL。

优选地，所述内标混合液为0.5～5ng/mL[¹³C₅]-叶酸和0.5～10ng/mL[¹³C₅]-5-甲基四氢叶酸的混合液。

优选地，所述活化液和淋洗液2为甲醇、乙醇或乙腈。

优选地，所述平衡液和淋洗液1为水和活化液的混合溶液(v:v＝100％～50％：0％～50％)。

优选地，所述萃取液为含抗氧化剂和甲酸的活化液，其中抗氧化剂是浓度为1～100μg/mL维生素C和柠檬酸的组合物，甲酸含量为1％～4％(v/v)。

本发明还提供了一种血液中叶酸的精准检测方法，所述方法包括以下步骤：

1)血液样本和内标混合液混合，静置平衡5～30分钟；

2)将特异性吸附材料装柱，所得特异性固相萃取柱经过活化、平衡后，加入平衡好的血液样本，使用淋洗液进行淋洗，然后用萃取液洗脱，收集的洗脱液放置于40℃下使用氮气吹干，加入平衡液复溶，得到复溶液；

3)将步骤2)中的复溶液采用液相色谱串联质谱进行分析，通过校准液建立的校准曲线计算血液样本中叶酸的含量；

优选地，步骤3)中的色谱条件：色谱柱：Waters，Cortecs T3；柱温：35℃；进样室温度：10℃；流动相：(A)0.1％甲酸水，(B)甲醇；梯度洗脱条件：梯度洗脱为：0～0.1min，流动相B为5％；0.1-1.8min，流动相B由5％升高到50％；1.8～2.0min，流动相B由50％升高到80％；2.0～3.5min，流动相B为80％；3.5～3.6min，流动相B由80％降为5％；3.6-5.0min，流动相B为5％；流速为0.3mL/min，进样量：10μL；

优选地，步骤3)中的质谱条件：离子化模式：ESI+；喷雾电压：4500V；温度：500℃；雾化器GS1：50psi；辅助雾化气GS2：50psi；气帘气：20psi；扫描方式：多反应检测(MRM)；

本发明的有益效果：

1.本发明使用特异性吸附材料，对叶酸类化合物能够特异性富集纯化；

2.本发明提供的提取方法，可高效去除杂质，实现对人体内含量较低的叶酸及5-甲酰基四氢叶酸的进行低水平的精准检测，叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸的定量下限分别为100pg/mL、200pg/mL、100pg/mL。

3.本发明通过对液相色谱条件的优化，实现了血样中5-甲酰基四氢叶酸与其干扰物4-羟基,5-甲基四氢叶酸的基线分离，避免干扰物对检测结果的影响(见附图3)；且液相分析时间仅5分钟，可进行高通量检测。

4.本发明为首个基于液质方法开发的叶酸类检测试剂盒，可以同时检测叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸的含量，准确性高，特异性强，易于临床推广和应用。

附图说明

图1为血清中XIC、叶酸、[¹³C₅]-叶酸的MRM色谱图；

图2为血清中XIC、5-甲基四氢叶酸、[¹³C₅]-5-甲基四氢叶酸的MRM色谱图；

图3为血清中XIC、5-甲酰基四氢叶酸的MRM色谱图。

具体实施方式

下面结合实例，对本发明做进一步说明，实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1：一种血液中叶酸的精准检测试剂盒

一种血液中叶酸的精准检测试剂盒，其组成为如下表：

其中，校准液中各个浓度浓度如下表：

实施例2：一种血清中叶酸的精准检测方法

所述检测方法主要包括以下主要步骤：

1.基于试剂盒产品的叶酸提取过程：

A.200μL血清样本和20μL内标混合液混合，静置平衡10分钟；

B.将特异性吸附材料(n等于6；固相萃取材料硅胶颗粒度为50μm，孔径为

)作为填料，取100mg置1mL柱管内装柱，将得到的特异性固相萃取柱使用300μL活化液活化、300μL平衡液平衡后，加入上述血清样本后，使用500μL淋洗液1和淋洗液2进行淋洗(是依次使用500μL淋洗液和500μL淋洗液2进行淋洗吗)，然后采用200μL萃取液洗脱，将收集的洗脱液使用氮气吹干，温度为40℃，最终用100μL平衡液复溶。

2.液质分析条件

A.检测设备：AB SCIEX Triple Quad4500MD液相色谱串联质谱仪；

B.色谱条件：

色谱柱：Waters，Cortecs T3；柱温：35℃；进样室温度：10℃；流动相：(A)0.1％甲酸水，(B)甲醇；梯度洗脱条件：梯度洗脱为：0～0.1min，流动相B为5％；0.1-1.8min，流动相B由5％升高到50％；1.8～2.0min，流动相B由50％升高到80％；2.0～3.5min，流动相B为80％；3.5～3.6min，流动相B由80％降为5％；3.6-5.0min，流动相B为5％；流速为0.3mL/min，进样量：10μL；

C.质谱条件：

离子化模式：ESI+；喷雾电压：4500V；温度：500℃；雾化器GS1：50psi；辅助雾化气GS2：50psi；气帘气：20psi；扫描方式：多反应检测(MRM)；

3.检测结果计算

采用校准曲线法计算血清中各叶酸亚型的浓度。取200μL校准溶液，按照步骤1中“基于试剂盒产品的叶酸提取过程”项进行样品处理后，进行液质分析。根据各物质峰面积As和相应内标峰面积Ai的比值f(f＝As/Ai)对浓度C进行权重线性回归，拟合校准曲线，权重为1/C²(C为浓度值，单位：ng/mL)。血清中各叶酸亚型同其内标测得的峰面积之比代入校准曲线，计算血清中各叶酸亚型的浓度。

表1.LC-MS/MS法测定叶酸结果分析

实施例3：一种血液中叶酸的精准检测方法的准确度和精密度

基于试剂盒的检测方法的准确度和精密度评价实施方案如下：

采用添加低、中、高3个浓度的混合血清样本作为待测样本，对3个浓度样本每批次各6份进行检测，测定3个批次，测定实施过程同实施例2，分别计算准确度、批内CV和批间CV，结果显示如下表，显示该方法具有优异的准确度和精密度性能。

实施例4：特异性吸附材料、SAX、甲醇蛋白沉淀法检测性能结果对比

1.特异性固相萃取柱制备、装填

对硅胶进行酸化、键合等处理得到特异性吸附材料(所述特异性吸附材料的结构中，n等于6，固相萃取材料硅胶颗粒度为50μm，孔径为

)，装填特异性吸附材料100mg置1mL柱管内，备用；

2.性能对比实施方案：

1)使用特异性吸附材料、SAX的检测过程：

以低浓度质控样本，按照实施例2操作，特异性固体萃取柱和SAX固相萃取柱平行实验对比。

2)甲醇沉淀蛋白法的检测过程：

取200μL低浓度质控样本于1.5mL的EP管中，加入20μL内标和200μL(含10μg/mL的维生素C和柠檬酸)甲醇后，2000rpm的转速下涡旋5min，15000g离心5min，取200μL氮气下吹干，加入100μL 50％的甲醇溶液复溶，进样量10μL。

3)检测结果：

各检测过程平行制备6样本进行分析，3种化合物的峰面积相应见下表，结果显示特异性吸附材料对叶酸的富集能力和萃取性能稳定性优于SAX固相萃取柱和蛋白沉淀法。

表2.性能对比：叶酸的峰面积响应

表3.性能对比：5-甲基四氢叶酸的峰面积响应

表4.性能对比：5-甲酰基四氢叶酸的峰面积响应

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种血液中叶酸的精准检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒组成为：特异性固相萃取柱、内标混合液、校准液、活化液、平衡液、淋洗液1和2、萃取液和质控样本。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述叶酸为：叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸；所述血液为血清或者血浆样本。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性固相萃取柱使用对叶酸的特异性吸附材料，所述特异性吸附材料以硅胶为基质，键合相结构为：

其中n等于2-12；固相萃取材料硅胶颗粒度为10μm-80μm，孔径为

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述校准液为用BSA溶液配制的6个浓度的叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸的混合溶液；其中，叶酸和5-甲酰基四氢叶酸浓度范围为0.1～20ng/mL，5-甲基四氢叶酸浓度范围为0.2～40ng/mL。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述内标混合液为0.5～5ng/mL[¹³C₅]-叶酸和0.5～10ng/mL[¹³C₅]-5-甲基四氢叶酸的混合液。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述活化液和淋洗液2为甲醇、乙醇或乙腈。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述平衡液和淋洗液1为水和活化液的混合溶液，水和活化液的体积比v/v＝100％～50％：0％～50％。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述萃取液为含抗氧化剂和甲酸的活化液，其中抗氧化剂是浓度为1～100μg/mL维生素C和柠檬酸的组合物，甲酸含量为1％～4％(v/v)。

9.一种使用权利要求1-8任一项所述试剂盒精准检测血液中叶酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)血液样本和内标混合液混合，静置平衡5～30分钟；

2)将特异性吸附材料装柱，所得特异性固相萃取柱经过活化、平衡后，加入平衡好的血液样本，使用淋洗液进行淋洗，然后用萃取液洗脱，收集的洗脱液放置于40℃下使用氮气吹干，加入平衡液复溶，得到复溶液；

3)将步骤2)得到的复溶液采用液相色谱串联质谱进行分析，通过校准液建立的校准曲线计算血液样本中叶酸的含量。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤3)中的色谱条件：色谱柱：Waters，Cortecs T3；柱温：35℃；进样室温度：10℃；流动相：(A)0.1％甲酸水；(B)甲醇；梯度洗脱条件：梯度洗脱为：0～0.1min，流动相B为5％；0.1-1.8min，流动相B由5％升高到50％；1.8～2.0min，流动相B由50％升高到80％；2.0～3.5min，流动相B为80％；3.5～3.6min，流动相B由80％降为5％；3.6-5.0min，流动相B为5％；流速为0.3mL/min，进样量：10μL；

质谱条件：离子化模式：ESI+；喷雾电压：4500V；温度：500℃；雾化器GS1：50psi；辅助雾化气GS2：50psi；气帘气：20psi；扫描方式：多反应检测(MRM)；

Images