KR20220017276A - 식품에서 비타민 k1 및 비타민 k2를 동시 검출하는 방법 - Google Patents

식품에서 비타민 k1 및 비타민 k2를 동시 검출하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 시료 내 비타민 K1 및 비타민 K2를 동시 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 (a) 시료에 NaCl, 추출용매 및 분산용매를 첨가하고 분산형 액-액 미세추출법(Dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME)을 수행하여 추출액을 얻는 단계; 및 (b) 추출액에서 비타민 K1 및 비타민 K2를 액체 크로마토그래피-대기압 화학이온화 질량분석(LC-APCI-MS)으로 분석하는 단계를 포함하는, 비타민 K1 및 비타민 K2의 동시 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 동시 검출 방법은 DLLME의 추출 효율에 영향을 주는 요인으로 추출용매와 분산용매의 종류 및 부피, NaCl의 농도 등을 고려하여 추출조건을 최적화시킨 결과, 비타민 K1 및 비타민 K2의 회수율이 높으면서도 기존에 제안된 방법보다 추출 시간과 용매 부피의 약 90% 이상이 감소되어 친환경적인 것을 특징으로 한다.

Description

식품에서 비타민 K1 및 비타민 K2를 동시 검출하는 방법 {Analytical method to detect Vitamin K1 and Vitamin K2 in food using DLLME}
본 발명은 시료 내 비타민 K1 및 비타민 K2를 동시 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 (a) 시료에 NaCl, 추출용매 및 분산용매를 첨가하고 분산형 액-액 미세추출법(Dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME)을 수행하여 추출액을 얻는 단계; 및 (b) 추출액에서 비타민 K1 및 비타민 K2를 액체 크로마토그래피-대기압 화학이온화 질량분석(liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation-tandem mass spectrometry, LC-APCI-MS)으로 분석하는 단계를 포함하는, 비타민 K1 및 비타민 K2의 동시 검출 방법에 관한 것이다.
비타민 K(Vitamin K)는 지용성 비타민의 한 종류로 사슬의 형태에 따라 비타민 K1(필로퀴논, phylloquinone)과 비타민 K2(메나퀴논, menaquinone) 등으로 나뉜다. 비타민 K1은 주로 식물에서 합성되며 광합성에 직접 관여하기 때문에 녹색 잎이 많은 채소에서 많이 발견된다. 비타민 K1은 자연에서 발견되는 대부분의 비타민 K의 전구체이이며, 장내 세균은 비타민 K1을 비타민 K2로 전환할 수 있다. 이러한 비타민 K2는 최근 심혈관계 질환의 예방 및 칼슘 흡수율을 증가시키는 효능이 있는 것으로 보고되고 있어, 고령자들을 위한 고령친화식품에 적용을 위한 연구가 활발하다.
한편, 식품 및 식품첨가물공전 상의 일반시험법에 비타민 K1의 분석법은 규정되어 있으나 비타민 K2의 분석법은 규정되어 있지 않고, 비타민 K1의 추출 및 분석에 사용되는 용매의 부피도 5 내지 100mL로 많고 추출 시간 또한 30분 내지 2시간으로 비교적 오래 걸리는 단점이 있었다. 또한, 최근에는 현대인의 영양섭취 불균형과 인구의 고령화 등으로 인해 영양성분이 강화된 식품에 대한 수요가 증가하고 있는바, 이에 따라 국민들의 식품 선택 시 적절한 정보의 제공을 목적으로 하는 영양표시 제도가 점차 강화되고 있는 실정이다.
이에 본 발명의 발명자들은 이러한 비타민 K의 효능 및 연구에 대한 중요성이 높아지고 영양성분이 강화된 식품들에 대한 국가 차원의 체계적인 관리가 강화되고 있는 상황을 고려하여, 비타민 K1과 함께 기존에 식품공전 상 규정되어 있지 않던 비타민 K2를 동시에 검출/분석할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명의 검출 방법은 DLLME의 추출 효율에 영향을 주는 요인으로 추출용매와 분산용매의 종류 및 부피, NaCl의 농도 등을 고려하여 최적화시킨 결과, 비타민 K의 회수율이 높으면서도 기존에 제안된 방법보다 추출 시간과 용매 부피의 약 90% 이상이 감소되어 친환경적인 특징이 있다.
본 발명은 전술한 문제 및 이와 연관된 다른 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 예시적 목적은 (a) 시료에 NaCl, 추출용매 및 분산용매를 첨가하고 분산형 액-액 미세추출법(Dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME)을 수행하여 추출액을 얻는 단계; 및 (b) 추출액에서 비타민 K1 및 비타민 K2를 액체 크로마토그래피-대기압 화학이온화 질량분석(liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation-tandem mass spectrometry, LC-APCI-MS)으로 분석하는 단계를 포함하는 비타민 K1 및 비타민 K2의 동시 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 명세서에 개시된 발명의 기술적 사상에 따라 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 문제점을 해결하기 위한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제는 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 시료 내 비타민 K1 및 비타민 K2를 동시 검출하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, (a) 시료에 NaCl, 추출용매 및 분산용매를 첨가하고 분산형 액-액 미세추출법(Dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME)을 수행하여 추출액을 얻는 단계; 및 (b) 추출액에서 비타민 K1 및 비타민 K2를 액체 크로마토그래피-대기압 화학이온화 질량분석(liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation-tandem mass spectrometry, LC-APCI-MS)으로 분석하는 단계를 포함하는 비타민 K1 및 비타민 K2의 동시 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 검출 방법은 분산형 액-액 미세추출법(Dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME) 단계 및 액체 크로마토그래피-대기압 화학이온화 질량분석(liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation-tandem mass spectrometry, LC-APCI-MS) 단계를 수행함에 있어서, DLLME의 추출 효율에 영향을 주는 요인으로 추출용매와 분산용매의 종류 및 부피, NaCl의 농도 등을 최적화하였고, 그 결과 비타민 K1 및 비타민 K2의 회수율이 높으면서도 추출 시간과 사용된 용매 부피의 약 90% 이상이 감소되어 친환경적인 특징이 있다.
이하, 본 발명에 따른 방법을 단계별로 설명한다.
본 발명의 검출 방법은 (a) 시료에 NaCl, 추출용매 및 분산용매를 첨가하고 분산형 액-액 미세추출법(Dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME)을 수행하여 추출액을 얻는 단계를 포함한다.
본 발명에서 용어 "시료"는 비타민 K1 및/또는 비타민 K2가 포함되어 있거나 포함되었을 것으로 생각되는 것이면 충분하며, 보다 구체적으로 상기 시료는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등 통상의 식품을 포함한다. 상기 시료는 분산형 액-액 미세추출법에 적용할 수 있도록 사전 처리된 것일 수 있고, 이는 예컨대 액상화한 것을 들 수 있으며 수용액에 제한되지 않는다. 또한, 상기 시료에는 통상의 기술자가 분산형 액-액 미세추출법에 따르기 위해 첨가할 수 있는 다양한 첨가제(예를 들어, 거품방지제)를 첨가할 수 있다.
본 발명에서 용어 "비타민 K"는 지용성 비타민의 한 종류로, 혈액 응고 인자 단백질의 합성에 필수적이며, 사슬의 형태에 따라 비타민 K1(필로퀴논, phylloquinone) 또는 비타민 K2(메나퀴논, menaquinone)일 수 있다. 상기 비타민 K1 또는 비타민 K2는 본 발명의 시료 또는 식품 내 성분으로 자연적으로 존재하거나 인위적으로 첨가된 것일 수 있으며, 이에 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서 "분산형 액-액 미세추출법(Dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME)"은 본 발명에서 특별히 기재하지 않는 이상, 통상의 기술자가 본 발명이 속하는 기술분야의 공지된 방법에 따라 수행할 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에서 "추출용매"는 시료에 대해 DLLME를 수행하기 위해 사용되었으며, 본 발명에서는 DLLMe의 추출 효율에 영향을 줄 수 있는 변수로 추출용매의 종류 및 부피를 설정하였다. 구체적으로, 상기 추출용매는 사염화탄소(carbon tetrachloride), 다이클로로메테인 (dichloromethane), 이황화탄소 (carbon disulfide) 또는 클로로포름(chloroform)일 수 있으며, 바람직하게는 클로로포름일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 클로로포름을 추출용매로 사용한 경우 다른 추출용매를 사용한 경우 대비 비타민 K의 회수율이 가장 높음을 확인하였다(도 1). 또한, 상기 클로로포름은 시료 대비 2% 내지 10%의 농도로 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 4% 내지 8%, 보다 바람직하게는 6%의 농도로 첨가될 수 있다.
본 발명에서 "분산용매"는 시료에 대해 DLLME를 수행하기 위해 사용되었으며, 본 발명에서는 DLLMe의 추출 효율에 영향을 줄 수 있는 변수로 분산용매의 종류 및 부피를 설정하였다. 구체적으로, 상기 분산용매는 아세토니트릴(acetonitrile), 아세톤(acetone) 또는 메탄올(methanol)일 수 있으며, 바람직하게는 메탄올일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 메탄올을 분산용매로 사용한 경우 다른 분산용매를 사용한 경우 대비 비타민 K의 회수율이 가장 높음을 확인하였다(도 2). 또한, 상기 메탄올은 시료 대비 10% 내지 70%의 농도로 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 15% 내지 30%, 보다 바람직하게는 20% 내지 25%의 농도로 첨가될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예 에서는 DLLMe의 추출 효율에 영향을 줄 수 있는 변수로 시료에 첨가되는 NaCl의 농도를 설정하였으며, 구체적으로 상기 NaCl은 DLLME를 수행하는 단계에 있어서, 추출용매 및 분산용매가 첨가되기 전에 시료에 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 시료 대비 3% 내지 9%의 농도, 보다 바람직하게는 6%의 농도로 첨가될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 분산형 액-액 미세추출법을 적용함에 있어서 통상의 기술자는 당업계에 공지된 다양한 화합물을 필요에 따라 선택적으로 첨가하여 사용할 수 있다.
본 발명의 검출 방법은 (b) 추출액에서 비타민 K1 및 비타민 K2를 액체 크로마토그래피-대기압 화학이온화 질량분석(liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation-tandem mass spectrometry, LC-APCI-MS)으로 분석하는 단계를 포함한다.
본 발명에 있어서, 비타민 K1 및 비타민 K2의 검출 및 정량에 바람직하게는 "액체 크로마토그래피-대기압 화학이온화 질량분석(liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation-tandem mass spectrometry, LC-APCI-MS)"를 이용할 수 있다. 대기압 화학이온화(APCI)는 전자분무 이온화(ESI)에서 충분한 양의 이온을 얻는데 적합하지 않은, 적은 극성의 분자들을 검출하기 위해 사용되는 이온화 방법으로, 단일 전하 이온들이 주로 생성된다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 DLLME 수행 후 얻어진 추출액에 대해 3,000 rpm에서 5분 간 원심분리하여 하층액을 유리 syringe를 이용하여 취하고 이를 N2 gas로 농축한 이후 100 ㎕ 메탄올을 첨가하여 재용해하여 LC-APCI-MS/MS 분석을 수행하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 방법에 따라 시료로부터 비타민 K1 및 비타민 K2의 동시 검출할 수 있는 키트를 제공한다. 구체적으로, 본 발명에 따른 키트에는 분산형 액-액 미세추출법을 적용할 수 있는 도구와 시료, 비타민 K1 및 비타민 K2를 각각 검출해 판별할 수 있는 방법에 대해 기술하는 지침서가 포함될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 키트는 추출용매로서 클로로포름, 분산용매로서 메탄올, 및 NaCl 등을 포함하고, 상기 클로로포름, 메탄올 및 NaCL의 부피 및 농도는 전술한 바와 같다.
본 발명의 동시 검출 방법은 DLLME의 추출 효율에 영향을 주는 요인으로 추출용매와 분산용매의 종류 및 부피, NaCl의 농도 등을 고려하여 추출조건을 최적화시킨 결과, 비타민 K1 및 비타민 K2의 회수율이 높으면서도 기존에 제안된 방법보다 추출 시간과 용매 부피의 약 90% 이상이 감소되어 친환경적인 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서 인용되는 도면을 보다 충분히 이해하기 위하여 각 도면의 간단한 설명이 제공된다.
도 1은 DLLME 공정 최적화를 위해 각 추출용매의 사용 시 비타민 K의 회수율을 비교 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 DLLME 공정 최적화를 위해 각 분산용매의 사용 시 비타민 K의 회수율을 비교 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 반응표면분석법(RSM)을 이용한 DLLME 추출 공정의 최적화를 나타낸 것으로, 각각 A는 분산용매 부피, B는 추출용매 부피, C는 NaCl의 농도를 의미한다.
도 4는 본 발명에 시료에 첨가되는 NaCl 농도의 최적화 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 검출 방법의 검증 결과로 비타민 K1 및 비타민 K2 의 calibration curve를 나타낸 것이다.
도 6는 본 발명의 방법에 따라 검출된 비타민 K1 및 비타민 K2 각각의 MRM 크로마토그램을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
[실험방법]
1. 비타민 K 강화 제형의 dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) 추출법
비타민 K 강화 제형을 50 ng/mL 농도로 희석한 뒤 10 mL conical glass tube 에 4 mL를 넣고, sodium chloride 0.24 g을 첨가하였다. 유리 재질의 syringe를 이용하여 1 mL 메탄올(dispersive solvent, 분산용매)과 300 ㎕ 클로로포름(extraction solvent, 추출용매)의 혼합 용액을 샘플 용액에 빠르게 주입하였다. 이 용액은 3,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 하층액(sediment phase)을 유리 syringe를 이용하여 취한 후 N2 gas로 농축하고, 이후 100 ㎕ 메탄올을 첨가하여 재용해한 후 이를 LC-APCI-MS/MS 분석하였다.
2. 비타민 K 분석을 위한 유효성 검증
검량 곡선(Relative calibration curve)은 비타민 K1, K2 stock solution을 사용하여 얻었다. 회수율 실험은 비타민 K 강화 제형에 비타민 K1, K (표준 물질) 5, 10, 500 μg/L을 첨가하여 측정하였다. 비타민 K에 대한 LC-APCI-MS/MS 기기분석을 위해서 1-1000 μg/L 표준용액의 직선성을 확인하였다. 그리고 정밀성 검증을 위해 추출 후 얻은 비타민 K 표준물질의 시험 용액은 Inter-day(1일 1구간, 3일간)와 intra-day(1일, 3 구간)로 6회 반복하여 측정되었다.
3. 액체 크로마토그래피-대기압 화학이온화 질량 분석 (LC-APCI-MS) 기기 조건
비타민 K 강화 제형을 DLLME를 통해 추출한 후, 기기분석을 위해 Waters 사의 ACQUITY UPLC 시스템과 Xevo TQ MS 질량분석기를 이용하여 분석하였고, UPLC BEH C18 컬럼(1.7 ㎛, 2.1×100 mm, Waters)을 통해 분리하였다. LC APCI-MS/MS 분석 조건은 아래 표 1 및 표 2와 같다.
Instrument Waters Xevo TQ MS
Column UPLC BEH C18 (1.7 ㎛, 2.1 × 100 mm, Waters)
Mobile phase A: 90% ACN
B: MeOH		 Flow rate 0.5 mL/min


Gradient
(A : B) 		0 min
0.5 min
2.5 min
4.5 min
5 min
6 min		 100 : 0
100 : 0
0 : 100
0 : 100
100 : 0
100 : 0
Oven temp. 40 ℃ Injection vol. 15 ㎕
Compound K1 K2
Ionization mode APCI
Q1 (m/z) 451.5 445.4
Q3 (m/z) 128
187.1		 81
187.1
RT (min) 3.93 3.06
Cone (V) 20
Probe Temp. (℃) 450
Gas flow (L/hr) 250
Collision (eV) 20 20
Dwell time (s) 0.1
4. 반응표면분석법(response surface methodology, RSM)을 이용한 DLLME 추출조건 최적화
추출조건에 대한 실험계획은 Box-Behnken design(BBD)으로 실시하였다. 분산용매 부피(X1), 추출용매 부피(X2) 및 NaCl 농도(X3)를 독립변수로 설정하고 각각을 부호화하였으며(표 3), 15가지의 추출조건으로 추출하였다(표 4). 또한, 이들 독립변수에 영향을 받은 종속변수로는 추출수율을 측정하여 그 값을 회귀분석에 사용하였다.
Variables Factors Level
Xi Low (-1) Middle(0) High (+1)
분산용매(㎕) X1 500
100
0		 1750
300
6		 3000
500
12
추출용매(㎕) X2
NaCl (%) X3
Exp. No 추출 조건
분산용매(㎕) 추출용매(㎕) NaCl (%)
1 500 (-1) 300 (0) 12 (1)
2 1750 (0) 300 (0) 6 (0)
3 1750 (0) 300 (0) 6 (0)
4 500 (-1) 500 (1) 6 (0)
5 1750 (0) 500 (1) 0 (-1)
6 1750 (0) 500 (1) 12 (1)
7 3000 (1) 500 (1) 6 (0)
8 1750 (0) 100 (-1) 12 (1)
9 3000 (1) 300 (0) 0 (-1)
10 3000 (1) 300 (0) 12 (1)
11 3000 (1) 100 (-1) 6 (0)
12 500 (-1) 100 (-1) 6 (0)
13 500 (-1) 300 (0) 0 (-1)
14 1750 (0) 100 (-1) 0 (-1)
15 1750 (0) 300 (0) 6 (0)
[실험결과]
1. DLLME 추출공정 최적화
(1) 추출용매 선정
추출용매의 선택을 위해, 4가지 추출용매 carbon tetrachloride(CCl4), chloroform(CHCl3), dichloromethane(CH2Cl2), carbon disulfide(CS2)를 사용하여, 추출 효율을 비교하였다. 그 결과, 클로로포름(chloroform)을 사용하였을 때 회수율 값이 사염화탄소(carbon tetrachloride), 다이클로로메테인 (dichloromethane) 또는 이황화탄소(carbon disulfide)를 사용하였을 때에 비해 상대적으로 가장 높게 나타났다(도 1).
(2) 분산용매 선정
분산용매의 선택을 위해, 3가지 분산용매 acetonitrile(CH3CN), methanol(CH3OH), acetone(C3H6O)를 사용하여 각각의 추출 효율을 비교하였다. 그 결과, 메탄올(methanol)을 사용하였을 때 회수율 값이 아세토니트릴(acetonitrile) 또는 아세톤(acetone)을 사용하였을 때에 비해 상대적으로 가장 높게 나타났다(도 2).
(3) 반응표면분석법(RSM)을 이용한 추출조건 최적화
DLLME 조건을 최적화하기 위해, 반응표면분석법을 이용하여 공정을 최적화하였다. Box-Behnken design에 따라 독립변수를 분산용매 부피, 추출용매 부피 및 NaCl 농도로 설정하였고, 종속변수를 비타민 K 함량으로 설정하였다.
그 결과, 분산용매 부피는 500 ㎕부터 점차 증가 하다가 1000 ㎕ 이상부터 비타민 K의 함량이 최고점을 나타내는 것을 확인하였고, 추출용매 부피는 200 ㎕부터 점차 증가 하다가 300 ㎕ 이상부터 비타민 K 함량이 최고점을 나타내는 것을 확인하였다(도 3). 또한, NaCl 농도는 실험 결과에 큰 영향을 미치지는 않지만 시료 대비 3% 내지 9% 농도에서 비타민 K 함량이 상대적으로 높은 경향을 나타냈으며, 특히 6% 농도에서 비타민 K 함량이 가장 높은 것으로 확인되었다(도 4).
따라서, DLLME 조건을 분산용매(메탄올)의 경우 시료 대비 10% 내지 70%의 농도, 바람직하게는 15% 내지 30%의 농도; 추출용매(클로로포름)의 경우 시료 대비 2% 내지 10%의 농도, 바람직하게는 4% 내지 8%의 농도; NaCl의 경우 시료 대비 3% 내지 9%의 농도로 설정하였고, 이 모델의 결정계수(R2)는 0.9476이며 결정계수의 p value는 0.0102보다 작은값으로 회귀 모델에 대한 신뢰도를 입증하였다.
2. 비타민 K 강화 제형의 영양성분 분석법 검증 (method validation)
(1) 직선성(Linearity), 범위(Range), 검출한계(LOD), 정량한계(LOQ) 평가
설정된 분석법의 검증을 위해 비타민 K 강화 제형이 첨가되지 않은 blank sample(제형 matrix)에 비타민 K 표준액 혼합물을 첨가하여 샘플과 같은 방법으로 추출하여 external calibration curve를 측정하고, 직선성, 검출한계 (limit of detection, LOD) 및 정량한계 (limit of quantification, LOQ)를 확인하였다. 비타민 K 표준액 혼합물을 연속희석(serial dilution)하여 초기 표준액 혼합물을 포함한 총 6가지 농도로 하여 농도 대비 면적값으로 각 지표성분의 calibration curve를 얻었다(도 5). 각 물질의 linearity range, LOD, LOQ 평가 내용은 아래 표 5에 나타내었으며, R2이 모두 0.999 이상으로 우수한 직선성을 나타내었다.

Analyte 		Regression equation Correlation coefficient (R 2 ) Linear range
(μg/L)
LOD
OQ
비타민 K1 y = 1773.1x - 23888 0.9996 1 - 1000 1.89 5.72
비타민 K2 y = 399.4x - 254.45 0.9999 1 - 1000 5.00 15.15
(2) 정밀성(Precision), 안정성(Stability), 정확성(Accuracy(Recovery)) 평가
정밀성은 아래 표 6과 같이 3가지 농도에서 3회 반복 측정하여 intra-day, inter-day precision 으로 평가하였다. 아울러 비타민 K 강화 제형의 6회 반복 측정으로 병행정밀성(반복성)을 평가하였다. 안정성은 30시간 내 실온에서 보관한 동일 샘플을 간격을 두고 6회 측정하여 평가하였다. 정확성은 분석하는 비타민 K 강화 제형에 희석된 표준액 혼합물 기지량을 넣고, 이것을 검체로 하여 3 농도, 3회 반복하여 본 검증 수행의 시험방법을 적용하여 평가하였으며, 모든 검체는 RSD < 5% 미만으로 평가되었다.
Analyte Precision RSD (%) Accuracy
Concentration
(μg/L)		 Intra-
day
(n=3)		 Inter-
day
(n=3)		 Repeatability
RSD (%)
(n=5)		 Spiked
(μg/L)		 Detected
(μg/L)		 Recovery
(%)		 RSD
(%)
Emulsion Vit. K1 sample 50 45.93 91.87 ± 1.76 4.4
5 3.83 4.38 3.67 62.5 57.28 99.76 ± 2.05 2.2
10 3.96 3.04 75 70.24 101.95 ± 1.28 1.4
50 1.17 1.16 87.5 80.77 100.48 ± 0.92 1.0
Vit. K2 sample 50 45.36 90.73 ± 0.39 0.4
5 2.71 2.82 3.58 62.5 56.39 99.45 ± 0.43 0.5
10 2.33 2.38 75 68.18 100.19 ± 1.31 1.4
50 3.72 3.74 87.5 80.22 101.05 ± 0.76 0.8
SLN Vit. K1 sample 50 36.82 73.64 ± 1.02 1.6
5 3.83 4.38 3.67 62.5 41.29 101.03 ± 0.94 1.3
10 3.96 3.04 75 45.51 103.00 ± 0.67 0.9
50 1.17 1.16 87.5 48.45 103.44 ± 3.01 4.0
Vit. K2 sample 50 35.49 70.99 ± 0.47 0.7
5 2.71 2.82 3.58 62.5 39.67 100.69 ± 1.77 2.5
10 2.33 2.38 75 44.32 104.04 ± 2.62 3.6
50 3.72 3.74 87.5 44.82 99.27 ± 0.80 1.1
3. 건강기능식품공전의 비타민 K1(제2법) 분석법 및 본 발명의 검출 방법을 이용할 경우 비타민 K1의 회수율 비교
(1) 건강기능식품공전의 비타민 K1(제2법) 분석법: 고속 액체 크로마토그래프에 의한 정량법
1) 시약
용매: 메탄올, 디클로로메탄, 이소옥탄, 아세톤 및 이소프로판올(고속 액체크로마토그래프용); 컨디셔닝 용액(이소프로판올을 이소옥탄에 녹여 0.01%가 되게 함); 용출용매(이동상, 디클로로메탄과 이소프로판올을 이소옥탄에 녹여 각각 15%, 0.02%가 되게 함); 암모니아수(36%); 무수황산나트륨
2) 표준용액 조제
비타민 K1 표준품은 trans와 cis 이성체를 함유하므로, 각각의 이성체들을 분리하여 전체에 대한 cis형과 trans형의 피크 면적비를 구하고(불활성형 cis형을 ≤20% 정도 함유함), 암소에서 보관한다. 표준원액은 비타민 K1 표준품을 이소옥탄에 녹여 5μg/mL가 되게 하고, 표준용액은 상기 표준원액을 검량선을 작성할 수 있도록 이소옥탄으로 희석하여 사용하였다.
3) 시험용액 조제
비누화 및 추출: 시료 일정량(비타민 K1 3.5μg함유)을 정확히 취하여 500mL 분액여두에 넣고 암모니아수 4mL를 가한 후 60초간 흔들어 혼합하였다. 여기에 60mL의 메탄올을 가하고 30초간 혼합한 후 디클로로메탄 100mL와 이소옥탄 50mL 혼합액을 가하여 잘 흔들어 추출하였다. 층 분리 후 하층액을 1,000mL 공전플라스크에 옮기고, 다시 디클로로메탄 100mL와 이소옥탄 50mL 혼합액을 가하여 추출한 후 하층액을 합하고 이 액을 75℃이하에서 감압 농축하였다. 공전 플라스크를 아세톤 20mL로 씻고 그 액을 농축시키는 조작을 3회 반복한 후 질소 충전하여 차광한 채로 밀봉하였다.
시험용액의 정제: 정제 칼럼에 컨디셔닝 용액 20mL를 주입하고 천천히 용출시켜 그 액을 버린 후, 잔류물을 컨디셔닝 용액 10mL로 녹이고 칼럼에 통과시켜 비타민K1을 흡착시켰다. 같은 용액으로 5mL씩 2회에 걸쳐 공전 플라스크를 씻고, 씻은 액을 칼럼에 넣은 후 컨디셔닝 용액으로 용출하여 그 액을 버린다. 이어 시료의 지방 함량에 따라 양을 달리하여 용출용매를 칼럼에 통과시켰다(시료의 지방함량이 0.72 내지 0.80g이면 100mL의 용매를, 0.72g 이하이면 예비실험을 통해 용출액의 양을 결정함). 용출액을 250mL 공전 플라스크에 받아 75℃이하에서 감압 농축하고, 이 농축액을 이소옥탄 1 내지 2mL로 몇 회 나누어 씻어 5mL로 정용하였다. 단, 정제칼럼은 60 내지 200 메쉬 실리카 5.0g(100℃오븐에서 하룻밤 동안 활성화시킴)을 정제 칼럼(1.0cm id×30cm, 유리 칼럼)에 충전하고, 그 위에 무수황산나트륨 2.0g(100℃오븐에서 하룻밤 동안 활성화시킴)을 가하였다.
4) 시험조작
고속 액체크로마토그래프의 측정 조건:
항목 조건
기기 Shiseido HPLC system
컬럼 Capcell-pak C18 UG120V (4.6 x 250 mm, 5 μm)Post column: peakman SP Zinc column (3.0 x 35 mm)
검출기 FLD detector (여기파장: 243 nm, 측정파장: 430 nm)
이동상 메탄올:디클로로메탄 = 9:1에 염화아연 1.37 g 과 무수초산나트륨 0.41 g, 초산 0.3 g 을 메탄올 5 mL 에 녹여 첨가
유속 0.8 mL/min
주입량 20μL
컬럼 온도 35 ℃
분석시간 20 mins
정량시험: 시험용액 및 표준용액을 각각 20μL씩 주입하여 얻은 표준용액의 피크면적 또는 높이에 대해 구한 검량선을 사용하여 시료 중 비타민 K1의 함량을 구한다. 비타민 K1의 함량은 각 이성체의 농도의 합으로 계산하며 옥수수유를 포함하는 조제유류는 trans-비타민 K1만을 계산한다.
계산식:
Figure pat00001
(2) 비타민 K 강화 제형의 회수율 평가
분석하는 비타민 K 강화 제형에 희석된 표준액 혼합물 기지량을 넣고, 이것을 검체로 하여 3농도, 3반복하여 본 발명의 시험방법을 적용하여 평가하였으며, 모든 검체는 RSD < 5% 미만으로 평가되었다.
그 결과, 기존의 건강기능식품공전 3-5 비타민 K1(제2법) 분석법을 이용한 비타민 K1 강화 제형의 회수율은 불과 약 46.5% (에멀젼), 49.0% (SLN)로, 국제규격(CODEX) 범위에 허용되는 수치(80 내지 120%)에 미치지 못하는 것으로 나타난 반면(표 8), 본 발명의 검출 방법은 비타민 K1의 경우 그 농도(5, 10, 50 μg/L)에 따라 에멀젼과 SLN에서 각각 약 99.76 내지 100.48%, 101.03 내지 103.44%로 나타났고, 비타민 K2의 경우 그 농도(5, 10, 50 μg/L)에 따라 에멀젼과 SLN에서 각각 약 99.45 내지 101.05%, 99.27 내지 100.69%로 나타나, 모두 CODEX에서 지정한 범위(80 내지 120%)에 인정되는 것으로 확인되었다(표 6).
Sample Analyte 건강기능식품공전상 분석법
Recovery (%) RSD (%)
Emulsion Vit K1 46.47 ± 0.31 0.66
Vit K2 분석법 없음
SLN Vit K1 49.00 ± 1.39 4.78
Vit K2 분석법 없음
즉, 이러한 결과는 본 발명의 검출 방법은 기존에 제시된 건강기능식품공전상의 분석법 대비 비타민 K1 및 비타민 K2의 회수율이 높으면서도, 추출 시간과 용매 부피 또한 현저히 감소되어 친환경적임을 나타낸다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. (a) 시료에 NaCl, 추출용매 및 분산용매를 첨가하고 분산형 액-액 미세추출법(Dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME)을 수행하여 추출액을 얻는 단계; 및
    (b) 상기 추출액에서 비타민 K1 및 비타민 K2를 액체 크로마토그래피-대기압 화학이온화 질량분석(liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation-tandem mass spectrometry, LC-APCI-MS)으로 분석하는 단계를 포함하는, 시료 내 비타민 K1 및 비타민 K2의 동시 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 추출용매는 클로로포름인 것인, 검출 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 클로로포름은 시료 대비 2% 내지 10%의 농도로 첨가되는 것인, 검출 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 클로로포름은 시료 대비 4% 내지 8%의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는, 검출 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 분산용매는 메탄올인 것인, 검출 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 메탄올은 시료 대비 10% 내지 70%의 농도로 첨가되는 것인, 검출 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 메탄올은 시료 대비 15% 내지 30%의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는, 검출 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 NaCl은 시료 대비 3% 내지 9%의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는, 검출 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 비타민 K는 비타민 K1 및/또는 비타민 K2인 것인, 검출 방법.
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