KR20160030963A - 황산화 올리고당을 검출하기 위한 분석 방법 - Google Patents

황산화 올리고당을 검출하기 위한 분석 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20160030963A
KR20160030963A KR1020167003059A KR20167003059A KR20160030963A KR 20160030963 A KR20160030963 A KR 20160030963A KR 1020167003059 A KR1020167003059 A KR 1020167003059A KR 20167003059 A KR20167003059 A KR 20167003059A KR 20160030963 A KR20160030963 A KR 20160030963A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
mobile phase
hilic
sample
poly
salt
Prior art date
Application number
KR1020167003059A
Other languages
English (en)
Inventor
청야오 왕
이민 황
치아옌 우
융테 장
헬렌 차오
Original Assignee
시노팜 타이완 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 시노팜 타이완 리미티드 filed Critical 시노팜 타이완 리미티드
Publication of KR20160030963A publication Critical patent/KR20160030963A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/30—Partition chromatography
    • B01D15/305—Hydrophilic interaction chromatography [HILIC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
    • C08B37/0078—Degradation products
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8836—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving saccharides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 충전된 에어로졸 검출기 (CAD) 또는 질량 분광계 (MS)와 커플링된 친수성 상호작용 초-성능 액체 크로마토그래피 (HILIC-UPLC)를 이용하여, 폰다파리눅스 소듐을 포함하는, 폴리-황산화 올리고당을 검출하고 정량하는 분석 방법을 기재한다. 이러한 분석 방법은 분리, 정량 및 질량 확인에 의해 고도 황산화 올리고당의 총 합성에서 인-프로세스 제어를 제공한다. 상기 방법을 활용한 시스템 및 조건이 또한 제공된다.

Description

황산화 올리고당을 검출하기 위한 분석 방법{ANALYTICAL METHOD FOR DETECTING SULFATED OLIGOSACCHARIDES}
관련 출원의 전후-참조
해당사항 없음
발명의 배경
헤파노이드 (헤파린 및 헤파란 설페이트)는 다수의 중요한 생물학적 공정에서 널리 공지된 조절 매개체이다. 저분자량 헤파린(LMWH)인 헤파노이드 및 이의 유도체는 수술 및 신장 투석 동안 임상적 항응고 약물로서 이용되어 왔다. 예를 들어, 폰다파리눅스(Fondaparinux) 소듐 (CAS 114870-03-0)은 화학명이 O-[2-데옥시-6-O-설포-2-(설포아미노)-알파-D-글루코피라노실]-(1--4)-O-(베타-D-글루코피라누로소닐)-(1--4)-O-[2-데옥시-3,6-디-O-설포-2-(설포아미노)-알파-D-글루코피라노실]-(1--4)-O-(2-O-설포-알파-L-이도피라누로소닐)-(1--4)-O-[2-데옥시-1-O-메틸-6-O-설포-2-(설포아미노)-알파-D-글루코피라노시드] 데카소듐 염인 올리고당/헤파린의 구성원이고, Choay, S.A.에 의해 개발되었다 (미국특허 4,818,816호를 참조하라). 화합물은 정형외과 수술을 받은 환자에서 심부정맥 혈전증(deep vein thrombosis)의 예방 뿐만 아니라 심부정맥 혈전증 및 폐 색전증(pulmonary embolism)의 치료를 위해 항응고 약물로서 이용되는 합성 오당류 인자 Xa 억제제이다. 상품명 Arixtra™으로 판매되는, 폰다파리눅스 소듐은 2001년에 미국 식품의약 관리국에 의해 승인되었다. 폰다파리눅스 소듐은 피하 투여된다.
헤파린 및 헤파란 설페이트에 대한 분석 방법은 전통적으로 역상 크로마토그래피 및 질량 분광계 (MS) 기법을 수반하였으나, 높은 극성, 구조적 다양성, 및 헤파란 설페이트의 설페이트 불안정성으로 인한 제약이 있다. 예를 들어, MS를 이용한 합성 폴리-황산화 올리고당의 정량은 폴리-황산화 올리고당의 이온화가 설페이트기의 손실과 함께 다양한 유형의 단편 및 금속 양이온-커플링된 부가물을 형성시키는 경향이 있으므로 제한적이다. 이는 더 큰 스펙트럼 복잡성 및 신호 분할로 이어진다. 또한, 분석 동안 설페이트 기의 손실 정도를 입증하기는 어려운데, 그 이유는 이것이 황산화 올리고당의 농도 및 전하 상태에 의존적이기 때문이다. 폴리-황산화 올리고당에 대한 개선된 분석 방법은 수많은 연구진의 표적이 되어 왔다.
문헌들[Catalin et al. (Anal. Chem. 2009, 81, 3485) and Tatiana et al. (Anal. Chem. 2006, 78, 1774)]은 각각 전자분무 이온화 질량 분광분석법 (ESI-MS) 및 기질-보조 레이저 탈착 및 이온화 질량 분광분석법 (MALDI-MS)을 이용함에 의한 폴리-황산화 올리고당의 특성규명을 기재하였다. 그러나, 액체 크로마토그래피 (LC)와 질량 분광분석법의 커플링을 이용한 현행 방법은 피크의 온라인 인-프로세스(in-process) 해상도/분리를 제공하지 않으므로 합성 폴리-황산화 올리고당의 생성 동안 구조 관련 불순물의 확인 및/또는 폴리-황산화 올리고당의 정량이 확립될 수 없다.
문헌[Imanari et al. (J. Chromatogr., A 1996,720, 275.) and Rice et al. (J. Anal. Biochem. 1985, 150, 325.)]은 강한 음이온 교환 크로마토그래피 (SAX)에 의한 폴리-황산화 올리고당의 분석 방법을 예시하였다. 상기 방법은 전하 밀도의 차이를 통해 고도 황산화 올리고당을 분리하는 것으로 보이나, 이동상 조성물에서 비휘발성 염의 이용으로 인해 SAX를 MS와 같은 검출 방법에 직접 커플링시키는 것은 여전히 곤란하다.
또한 폴리-황산화 올리고당에 대한 분석 방법과 관련된 다른 문제는 전통의 UV 검출기의 사용을 제한할 수 있는, 폴리-황산화 올리고당의 비-발색단 특징 (매우 낮은 UV 흡수) 때문이다. 굴절율 (RI) 및 증발 광 산란 (ELSD)과 같은 다른 범용 검출기는 또한 폴리-설페이트 올리고당에 대한 충분한 검출 감도가 부족하다.
폴리-황산화 올리고당의 몇몇 검출 방법이 기재되었으나, 많은 제약이 남아 있다. 따라서, 폴리-황산화 올리고당의 분리, 정량 및 질량 확인을 위한 개선된 방법이 계속 요구되고 있다. 본원에 기재된 안정하고, 민감한 인-프로세스 제어 (IPC) 방법은 이러한 필요 및 그 밖의 필요를 다룬다.
발명의 간단한 개요
충전된 에어로졸 검출기 (CAD) 또는 질량 분광계 (MS)와 커플링된 친수성 상호작용 초-성능 액체 크로마토그래피 (HILIC-UPLC)를 이용하여, 폴리-황산화 올리고당을 검출하는 방법이 본원에 제공된다. 본원에 제공된 방법은 개선된 피크 해상도를 허용하여, 샘플 중 폴리-황산화 올리고당 및/또는 불순물의 후속적인 정량이 가능하다.
HILIC의 이용은 매우 극성인 올리고당을 유지하고 분리하는 도전을 극복한다. HILIC의 체류 메커니즘은 매우 복잡하며 액체-액체 분배, 흡착, 이온성 상호작용 및 소수성 상호작용의 멀티-모달 조합이다. 따라서, HILIC는, 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC)에 비해, 독특한 선택성 및 체류 특성을 제공한다.
본원에 제공된 대로, HILIC 컬럼에 이용된 정지상은, 한 그룹의 구체예에서, 아미드-결합된 정지상이다.
또 다른 구체예에서, HILIC 컬럼에 이용된 이동상은 염을 포함한다. 한 그룹의 구체예에서, 염은 암모늄 포르메이트이다. 암모늄 포르메이트의 이용은, 피리디늄 포르메이트 및 암모늄 아세테이트에 비해, 더욱 양호한 체류 성능, 선택성 및 낮은 노이즈 수준 기준선을 제공한다.
일부 구체예에서, 염의 농도는 50 mM 보다 높다. 일부 선택된 구체예에서, 농도는 100 mM 보다 높다. 전형적으로, 이동상 조성물에서 염 부가물의 몰 강도는 크로마토그래피 체류, 선택성 및 감도에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 염 부가물의 몰농도가 증가함에 따라. 이동상 및 용질의 이온 강도는 이온 교환 효과보다는 체류 메커니즘을 지배하는 액체-액체 분배 상호작용에 의해 제압된다. 그러나, 폴리-황산화 올리고당과 같은 산성 분석물의 경우, 체류는 염 부가물의 몰농도가 증가함에 따라 향상됨이 현재 발견되었다. 특히, 피크의 해상도는 염 농도가 50 mM에서 약 200 mM으로 증가함에 따라 추가로 개선된다.
한 그룹의 구체예에서, HILIC 컬럼에 이용되는 이동상의 용매는 아세토니트릴이다.
일부 구체예에서, 폴리-황산화 올리고당의 정량에 이용되는 검출기는 충전된 에어로졸 검출기 (CAD)이다. CAD를 이용한 분석 동안, 에어로졸 입자에 이온화된 기체 (전형적으로 질소)가 충전된다. 고-이동성 입자 (주로 과량의 N2 이온)의 제거 후에, 에어로졸 입자는 이어서 전기적으로 측정된다. 가장 중요하게는, 상기 방법은 분석물의 특성과 무관하게 비휘발성 분석물에 대해 균일한 반응을 제공하는 것이 입증되었다. 따라서, (1) HILIC, 또는 HILIC-UPLC를 활용한 분리 기법, 및 (2) MS 또는 CAD와 같은 검출 기법의 조합은 폴리 황산화물의 검출, 동정 및/또는 정량을 가능하게 하여, 합성 폴리-황산화 올리고당의 분석에 효과적인 방법을 제공한다.
본 발명의 한 선택된 구체예에 따르면, 본원에 기재된 방법에 의해 검출 및/또는 정량되는 폴리-황산화 올리고당은 폰다파리눅스 소듐이다.
도 1(a)는 Merck, Sequant Zic®-Hilic (3.5um 2.1×250mm)을 이용한 폰다파리눅스 소듐에 대한 HILIC-CAD의 크로마토그램을 제공한다.
도 1(b)는 Merck, Sequant Zic®-pHilic (5um 4.6×150mm)을 이용한 폰다파리눅스 소듐에 대한 HILIC-CAD의 크로마토그램을 제공한다.
도 1(c)는 Phenomenex, Synergi 극성-RP (4um 4.6×250mm)을 이용한 폰다파리눅스 소듐에 대한 HILIC-CAD의 크로마토그램을 제공한다.
도 1(d)는 Phenomenex, Synergi 융합-RP (4um 4.6×150mm)을 이용한 폰다파리눅스 소듐에 대한 HILIC-CAD의 크로마토그램을 제공한다.
도 1(e)는 Sepax 극성-피리딘 (1.8um 2.1×150mm)을 이용한 폰다파리눅스 소듐에 대한 HILIC-CAD의 크로마토그램을 제공한다.
도 1(f)는 ES, Epic Diol (1.7um 2.1×150mm)을 이용한 폰다파리눅스 소듐에 대한 HILIC-CAD의 크로마토그램을 제공한다.
도 1(g)는 Waters, Acquity BEH HILIC (1.7um 2.1×150mm)을 이용한 폰다파리눅스 소듐에 대한 HILIC-CAD의 크로마토그램을 제공한다.
도 1(h)는 Waters, Acquity BEH 아미드 (1.7um 2.1×150mm)를 이용한 폰다파리눅스 소듐에 대한 HILIC-CAD의 크로마토그램을 제공한다.
도 2는 Waters, BEH 아미드 컬럼 (a) 실제 크기(full scale) 및 (b) 확장된 규모(expanded scale)를 이용한 폰다파리눅스 소듐에 대한 크로마토그램을 제공한다.
도 3은 상이한 유형의 염인 (a) 50 mM 암모늄 포르메이트 (b) 100 mM 암모늄 포르메이트 (c) 100 mM 피리디늄 포르메이트 및 (d) 50 mM 암모늄 아세테이트를 이용하여 분석된 약물 물질의 확장된 규모의 크로마토그램을 제공한다.
도 4는 다양한 농도의 암모늄 포르메이트 (확장된 규모)인 (a) 50 mM (b) 100 mM (c) 125 mM (d) 150 mM (e) 175 mM 및 (f) 200 mM을 이용하여 분석된 약물 물질의 확장된 규모의 크로마토그램을 제공한다.
도 5는 이동상이 되는 상이한 유기 용매인 (a) 이동상 A: 200 mM 암모늄 포르메이트; 이동상 B: 아세톤 및 아세토니트릴, 1/1 (b) 이동상 A: 200 mM 암모늄 포르메이트; 이동상 B: 아세토니트릴을 이용하여 분석된 약물 물질의 확장된 규모의 크로마토그램을 제공한다.
발명의 상세한 설명
I. 개괄
분리, 정량 및 질량 확인에 각각 HILIC-UPLC, CAD 및 MS를 이용하는 것을 포함하는 폴리-황산화 올리고당에 대해 개발된 간단한 인-프로세스 분석 방법이 본원에 제공된다. 제조 동안 인-프로세스 제어 (IPC)는 고도 황산화 올리고당의 총 합성에서 품질 제어를 보장하는 열쇠이다. 본원에 기재된 분석 방법은 IPC 방법으로 사용될 수 있다. 유리하게는, 본원에 기재된 분석 방법은 안정하고, 사용하기 쉬우며, 민감하고, 예상된 수율 내에서 품질 화학적 물질의 생성을 보장한다.
II. 발명의 구체예
상기의 관점에서, 샘플 중 하나 이상의 폴리-황산화 올리고당을 검출하고 정량하는 방법으로서,
(a) 상기 샘플을 충전된 에어로졸 검출기 (CAD) 또는 질량 분광계 (MS)와 커플링된 친수성 상호작용 초-성능 액체 크로마토그래피 (HILIC-UPLC) 컬럼 상에서 크로마토그래피 처리하는 단계로서, HILIC 컬럼에 이용된 정지상이 아미드-결합된 정지상인 단계; 및
(b) 샘플 중 폴리-황산화 올리고당의 양을 결정하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
본 방법에 이용된 샘플은 전형적으로 폴리-황산화 올리고당의 합성 생성 방법의 결과물이다. 결과적으로, 반응 혼합물의 분취량을 선택함에 의해 합성 절차의 최종 단계의 샘플이 본 방법에 따라 분석될 수 있다. 반응 혼합물의 샘플링은 불순물 및/또는 폴리-황산화 올리고당의 검출 및/또는 확인 및/또는 정량을 가능하게 한다. 반응 혼합물의 샘플링은 또한 반응 완료 정도의 결정을 허용한다. 대안적으로, 최종 생성물은 추가 정제가 필요한 지를 결정하기 위해 본 방법으로 처리될 수 있다.
친수성 상호작용 초-성능 액체 크로마토그래피를 이용한 크로마토그래피에 대한 조건은 비제한적으로 컬럼 선택 (크기, 길이 및 정지상) 뿐만 아니라 이동상 및/또는 이동상의 pH를 포함하는, 당업자에게 공지된 조건들을 일반적으로 포함할 것이다.
컬럼의 선택은 일반적으로 Waters, ThermoFisher, Merck, Phenomenex, Shodex, Nucleosil, 및 Sepax로부터 이용가능한 것들과 같은 상업용으로 제조된 컬럼으로부터의 선택을 포함할 것이다. 한 그룹의 구체예에서, 컬럼은 중성 전하의 정지상 (예컨대, 디올상 또는 아미드상), 충전된 정지상 (예컨대, 실리카상 또는 아미노프로필상), 또는 쌍성이온 정지상을 지닌다. 한 선택된 그룹의 구체예에서, 정지상은 아미드-결합된 정지상이다. 실시예 1-10은 본원에 기재된 방법을 이용하여 다양한 정지상의 이용으로부터 수득된 결과를 예시한다.
당업자는 유동률이 또한 수득되는 분리 및 해상도에 영향을 미침을 이해할 것이다.
이동상에 이용된 용매는 일반적으로 극성, 비양자성 유기 용매 또는 극성, 비양자성 유기 용매들의 혼합물이다. 한 그룹의 구체예에서, HILIC 컬럼에 이용된 이동상의 용매는 아세토니트릴, 아세톤 또는 아세토니트릴과 아세톤의 혼합물이다. 실시예 13a-13d는 본원에 기재된 방법을 이용한 폴리-황산화 올리고당의 검출 및/또는 정량에서 다양한 용매 및/또는 용매의 혼합물의 효과를 예시한다.
다른 구체예에서, 이동상은 또한 염, 일반적으로 암모늄 포르메이트, 피리디늄 포르메이트 및 암모늄 아세테이트로부터 선택되는 염, 및 이들의 혼합물을 포함할 것이다. 특정한 선택된 구체예에서, 이동상은 암모늄 포르메이트를 포함할 것이다. 추가 그룹의 구체예에서, 이동상은 암모늄 시트레이트 및/또는 암모늄 옥살레이트로부터 선택되는 염을 포함한다. 실시예 11a-11d는 본원에 기재된 방법을 이용한 폴리-황산화 올리고당의 검출 및/또는 정량에서 이동상 중 다양한 염의 효과를 예시한다.
이동상에 이용된 염의 농도는, 일부 최적의 결과가 염이 50 내지 약 200 mM의 농도로 이동상에 존재할 때 발견되긴 하지만, 일반적으로 25 내지 약 400 mM일 것이다. 일부 구체예에서, 염은 이동상에 약 50-100 mM, 약 100-200 mM, 및 약 75 내지 175 mM의 농도로 존재한다. 실시예 12a-12d는 본원에 기재된 방법을 이용할 때, 암모늄 포르메이트를 염으로서 이용함에 의해, 폴리-황산화 올리고당의 검출 및/또는 정량 동안 피크 해상도 및 피크 너비에 대한 다양한 염 농도의 효과를 예시한다.
특수한 구체예에서, 상기 기재된 방법은 하기 구조를 갖는 폴리-황산화 올리고당 폰다파리눅스의 검출 및/또는 정량에 유용하다:
Figure pct00001
.
또 다른 양태에서, 샘플 중 폰다파리눅스를 검출하고 정량하는 방법으로서,
(a) 상기 샘플을 충전된 에어로졸 검출기 (CAD) 또는 질량 분광계 (MS)와 커플링된 친수성 상호작용 초-성능 액체 크로마토그래피 (HILIC-UPLC) 컬럼 상에서 크로마토그래피 처리하는 단계로서, HILIC 컬럼에 이용된 정지상이 아미드-결합된 정지상이고, 상기 크로마토그래피에 이용된 이동상이 아세토니트릴이며, 이동상이 약 100 mM 내지 약 200 mM 농도의 암모늄 포르메이트를 포함하는 단계; 및
(b) 샘플 중 폰다파리눅스의 양을 결정하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
상기 및 본원에서 사용되는, 샘플 중 폰다파리눅스의 양의 "결정", 또는 "폰다파리눅스의 정량"은 당업자가 용이하게 이용가능한 하나 이상의 방법으로 수행된다. 일반적으로, UPLC-MS - 및/또는 CAD를 위한 기계가 샘플 중 물질의 상대적인 양을 계산할 수 있는 프로그램 및/또는 알고리즘이 사전-설치되어 판매된다 (예컨대, 피크아래면적을 계산하고/거나 피크의 상대 강도를 측정함에 의해). 기계의 반응 및 일련의 외부 표준의 농도에 따라, 통상적인 회귀 분석을 이용하여 외부 교정 곡선이 수득될 수 있다. 이어서 샘플 농도를 외부 교정 곡선에 의해 결정할 수 있다. 상기 및 본원에서 사용되는, 샘플 중 "검출" (예컨대, 폰다파리눅스 및/또는 불순물의)은, 예시적인 구체예에서, 본원에 기재된 방법을 이용한 (예컨대, HILIC-UPLC의 이용에 의한) 크로마토그램의 기록 및 CAD 또는 MS와 같은 커플링된 기법을 이용한 피크 확인, 이에 의해 샘플 중 폰다파리눅스 및/또는 불순물의 존재 또는 부재를 확인 (검출)하는 것을 포함한다.
III. 실시예
하기 실시예는 본 발명을 더 상세히 기재하기 위해 제공된다. 그러나, 본 발명은 본원에 기재된 특수한 구체예로 제한되지 않는다.
기계
UPLC-MS 연구에 수반된 기계는 Thermo Fisher Dionex 및 Bruker Daltonics에 의해 각각 제조된 Ultimate 3000 (UPLC) 및 micrOTOF-Q II™ (MS)이다. UPLC-CAD에 수반된 기계는 Waters Corporation 및 Thermo Fisher Dionex에 의해 각각 제조된 ACQUITY UPLC® System 및 Thermo Scientific Dionex Ultra CAD이다.
파라메터
분석을 위한 조건은 하기에 개시된다.
1. 아미드-HILIC 타입 컬럼이 폴리-설폰화 올리고당을 분석하기 위한 분석 컬럼으로서 사용된다.
2. 이동상에 이용된 암모늄 포르메이트의 농도는 100 mM 또는 100 mM 초과이다.
3. 암모늄 포르메이트의 부피 비율: 이동상 조성물 중 아세토니트릴은 95% - 5% : 5% - 95%의 범위이다.
4. 하기 실시예에 이용된 유동률의 범위는 0.4 mL/min - 1 mL/min이다.
5. 본원에 기재된 방법에 이용된 컬럼 온도의 범위는 10℃ - 70℃이다.
6. 이러한 방법에 이용된 충전된 에어로졸 검출기의 분무(nebulization) 온도의 범위는 10℃ - 30℃이다.
7. 시험 샘플의 농도는 15 μg/mL 내지 30 mg/mL이다.
8. 시험 샘플의 주입 부피는 1 μ 내지 5 μL이다.
샘플 제조
샘플은 물과 아세토니트릴의 혼합물 (1:1; 30mg/mL)에 용해된다.
실시예 1-10 상이한 유형의 HILIC 컬럼 및 일반적인 LC 조건의 비교
상기대로 제조된 샘플을 표 1에 제시된 상이한 유형의 HILIC 컬럼에 의해 분석한다. 다양한 컬럼을 이용하여 기록된 크로마토그램이 도 1(a)-(h)에 도시되고 폰다파리눅스의 피크 식별은 LC-MS에 의해 확인되었다.
표 1
Figure pct00002
실시예 1-10의 대부분에서, 폰다파리눅스의 피크는, Waters BEH 아미드 컬럼의 경우를 한 가지 예외로 하고, 불순물로부터의 불충분한 분리와 비대칭인 것으로 밝혀졌다. Waters BEH 아미드에 대한 LC 조건은 최적화되었고 전형적인 크로마토그램은 도 2에 도시된다. 이러한 연구는 아미드 유형의 HILIC 컬럼이 다양한 유형의 HILIC 컬럼 중에 이러한 합성 폴리-황산화 오당류의 분석에 비교적 나은 선택을 제공함을 입증한다.
실시예 11a-11d 다양한 염의 효과
3개의 상이한 염인 암모늄 포르메이트, 피리디늄 포르메이트 및 암모늄 아세테이트를 비교하였다. 분석 조건은 표 2에 제시된다. 결과를 도 3에 도시한다.
표 2
Figure pct00003
체류, 선택성 및 낮은 노이즈 수준 기준선에 관해 최상의 크로마토그래피 성능은 50 mM 및 100 mM 농도 수준 둘 모두에서 (각각 도 3a 및 3b) 암모늄 포르메이트 염을 함유하는 이동상이었다. 피리디늄 포르메이트 (도 3c) 및 암모늄 아세테이트 (도 3d)는 관심 분석물에 대해 더 높은 기준선 노이즈 및 낮은 체류를 나타내었다. 연구에 기반하여, 암모늄 포르메이트가 이동상 조성물에서 염 부가물로 선택되었다.
실시예 12a-12f 염 농도의 효과
LC 조건을 최적화하기 위해 다양한 농도의 암모늄 포르메이트 염을 함유하는 이동상 조성물을 연구하였다. 실시예 12a-12f에 대한 암모늄 포르메이트의 농도가 표 3에 제공된다. 대표적인 크로마토그램은 도 4에 도시된다.
표 3
Figure pct00004
불순물 프로파일은 50 mM 및 100 mM 염 농도로 수득된 크로마토그램과 매우 유사한 것으로 밝혀졌다 (도 4a 및 4b). 염 농도가 증가함에 따라, 주요 피크, 폰다파리눅스의 바로 앞에 작은 피크 (어두운 삼각형으로 표시됨, 도 4d, 4e 및 4f 참조)가 관찰되었다. 주요 피크로부터 이러한 새로운 피크의 해상도는 150 mM으로부터 200 mM로 암모늄 포르메이트의 염 농도가 증가함에 따라 더 개선되었다. 또한, 염 농도가 175 mM로 증가했을 때 주요 피크의 대역폭이 좁아졌음이 명백하였다; 염 농도가 175 mM을 넘어 증가했을 때 해상도 및 피크 형태에 대한 추가 개선은 관찰되지 않았다.
실시예 13a-13b 용매의 효과
실시예 13a 및 13b는 본 발명에 따른 폰다파리눅스 소듐을 분석하기 위한 이동상의 용매로서 아세토니트릴과 아세톤의 혼합물 및 아세토니트릴을 각각 이용한다. 비록 도 5에 도시된 결과가 아세토니트릴 시스템 및 혼합물 (아세토니트릴 및 아세톤) 시스템 간에 선택성에서의 명백한 차이를 나타내지는 않지만, 아세토니트릴 시스템보다 아세톤/아세토니트릴 혼합물을 포함하는 시스템에서 더 높은 배압(back pressure)이 관찰되었다.
전술한 발명은 명확한 이해를 목적으로 예시 및 실시예에 의해 일부 상세히 기재되었으나, 당업자는 첨부된 청구항의 범위 내에서 특정한 변화 및 변형이 실행될 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 본원에 제공된 각각의 참고문헌은 각각의 참고문헌이 개별적으로 참조에 의해 포함되는 것과 동일한 한도로 그 전문이 참조로서 본원에 포함된다. 본 출원과 본원에 제공된 참고문헌 간에 충돌이 있는 경우, 본 출원이 우선할 것이다.

Claims (10)

  1. 샘플 중 하나 이상의 폴리-황산화 올리고당을 검출하고 정량하는 방법으로서,
    (a) 상기 샘플을 충전된 에어로졸 검출기 (CAD) 또는 질량 분광계 (MS)와 커플링된 친수성 상호작용 초-성능 액체 크로마토그래피 (HILIC-UPLC) 컬럼 상에서 크로마토그래피 처리하는 단계로서, HILIC 컬럼에 이용된 정지상이 아미드-결합된 정지상인 단계; 및
    (b) 샘플 중 폴리-황산화 올리고당의 양을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제 1항에 있어서, HILIC 컬럼에 이용된 이동상이 염을 포함하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 염이 암모늄 포르메이트, 피리디늄 포르메이트 및 암모늄 아세테이트로부터 선택되는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 염이 암모늄 포르메이트인 방법.
  5. 제 3항에 있어서, 염이 암모늄 포르메이트이고, 이동상에 약 50 mM 내지 300 mM의 농도로 존재하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 이동상 중 암모늄 포르메이트의 농도가 약 100 mM 내지 200 mM인 방법.
  7. 제 1항에 있어서, HILIC 컬럼에 이용된 이동상의 용매가 아세토니트릴, 아세톤 또는 아세토니트릴과 아세톤의 혼합물인 방법.
  8. 제 1항에 있어서, HILIC 컬럼에 이용된 이동상이 아세토니트릴인 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 폴리-황산화 올리고당이 하기 구조를 갖는 폰다파리눅스인 방법:
    Figure pct00005
    .
  10. 샘플 중 폰다파리눅스를 검출하고 정량하는 방법으로서,
    (a) 상기 샘플을 충전된 에어로졸 검출기 (CAD) 또는 질량 분광계 (MS)와 커플링된 친수성 상호작용 초-성능 액체 크로마토그래피 (HILIC-UPLC) 컬럼 상에서 크로마토그래피 처리하는 단계로서, HILIC 컬럼에 이용된 정지상이 아미드-결합된 정지상이고, 상기 크로마토그래피에 이용된 이동상이 아세토니트릴이며, 이동상이 약 100 mM 내지 약 200 mM 농도의 암모늄 포르메이트를 포함하는 단계; 및
    (b) 샘플 중 폰다파리눅스의 양을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
KR1020167003059A 2013-07-11 2013-07-11 황산화 올리고당을 검출하기 위한 분석 방법 KR20160030963A (ko)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/US2013/050147 WO2015005928A1 (en) 2013-07-11 2013-07-11 Analytical method for detecting sulfated oligosaccharides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20160030963A true KR20160030963A (ko) 2016-03-21

Family

ID=52280428

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167003059A KR20160030963A (ko) 2013-07-11 2013-07-11 황산화 올리고당을 검출하기 위한 분석 방법

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP3019861A4 (ko)
JP (1) JP6208866B2 (ko)
KR (1) KR20160030963A (ko)
CN (1) CN105431733B (ko)
AU (1) AU2013393832B2 (ko)
CA (1) CA2917460A1 (ko)
IL (1) IL243405A0 (ko)
WO (1) WO2015005928A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200097239A (ko) * 2017-09-06 2020-08-18 상하이 그린벨리 파머수티컬 주식회사 중량평균 분자량 및 산성 당의 가용성 염의 함량 측정방법

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2016017317A (es) 2014-06-26 2017-08-24 Regeneron Pharma Metodos y composiciones para modificaciones geneticas dirigidas y metodos de uso.
JP6706497B2 (ja) * 2015-12-24 2020-06-10 昭和電工株式会社 親水性化合物の分離分析方法
CN105628820A (zh) * 2016-01-08 2016-06-01 东营天东制药有限公司 一种低分子肝素生产过程中游离硫酸根离子快速检测方法
US11166915B2 (en) 2016-09-16 2021-11-09 Leukocare Ag Method for obtaining efficient viral vector-based compositions for vaccination or gene therapy
EP3512496A1 (en) 2016-09-16 2019-07-24 Leukocare Ag A novel method for producing low viscous and highly concentrated biopharmaceutical drug products in liquid formulation
CN110709696B (zh) * 2017-06-22 2022-01-04 昭和电工株式会社 寡核苷酸的混合物的分离分析方法
CN109254101B (zh) * 2017-07-13 2021-07-09 中国科学院大连化学物理研究所 一种母乳酸性寡糖净化和分析方法
CN112005110B (zh) * 2018-07-24 2022-11-29 深圳市海普瑞药业集团股份有限公司 一种达肝素钠亚硝酸降解产物的分析方法及其应用
WO2020020145A1 (zh) * 2018-07-26 2020-01-30 深圳市海普瑞药业集团股份有限公司 低分子肝素糖链分布的分析方法及其应用
CN111239311A (zh) * 2018-11-28 2020-06-05 中国科学院大连化学物理研究所 一种婴幼儿排泄物中酸性糖及酸性糖衍生物的分析方法
CN109633003A (zh) * 2018-12-26 2019-04-16 成都普思生物科技股份有限公司 一种测定远志中远志口山酮ⅲ和3,6，-二芥子酰基蔗糖含量的方法
CN110161147A (zh) * 2019-06-19 2019-08-23 北京三元食品股份有限公司 乳中游离低聚糖的高通量定量测定方法
JP7487987B1 (ja) 2023-12-21 2024-05-21 伊那食品工業株式会社 アガロオリゴ糖の分析方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090162938A1 (en) * 2005-11-08 2009-06-25 Suomen Punainen Risti,Veripalvelu Novel Carbohydrate Profile Compositions From Human Cells and Methods for Analysis and Modification Thereof
US9091695B2 (en) * 2007-06-01 2015-07-28 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods and systems for quantification of peptides and other analytes
US8696917B2 (en) * 2009-02-09 2014-04-15 Edwards Lifesciences Corporation Analyte sensor and fabrication methods
EP2306199A1 (en) * 2009-09-29 2011-04-06 Academisch Ziekenhuis Leiden Acting Under The Name Leiden University Medical Center Reductive amination and analysis of carbohydrates using 2-picoline borane as reducing agent
CN102101875A (zh) * 2009-12-16 2011-06-22 中国科学院大连化学物理研究所 一种寡糖纯化分离方法
AU2010332797B2 (en) * 2009-12-18 2015-05-28 Catalent Pharma Solutions Gmbh Pharmaceutical oral dosage form containing a synthetic oligosaccharide
MX2012007662A (es) * 2010-01-07 2012-08-23 Polymedix Inc Compuestos anti-heparina.
CN102759596B (zh) * 2012-07-09 2014-08-20 山东大学 一种低分子肝素的离子对反相色谱质谱联用检测方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200097239A (ko) * 2017-09-06 2020-08-18 상하이 그린벨리 파머수티컬 주식회사 중량평균 분자량 및 산성 당의 가용성 염의 함량 측정방법
US11366086B2 (en) 2017-09-06 2022-06-21 Shanghai Green Valley Pharmaceutical Co., Ltd. Method for determining weight-average molecular weight and content of soluble salt of acidic carbohydrates

Also Published As

Publication number Publication date
AU2013393832B2 (en) 2017-11-30
EP3019861A1 (en) 2016-05-18
CA2917460A1 (en) 2015-01-15
JP6208866B2 (ja) 2017-10-04
EP3019861A4 (en) 2017-02-22
WO2015005928A1 (en) 2015-01-15
CN105431733A (zh) 2016-03-23
JP2016524166A (ja) 2016-08-12
CN105431733B (zh) 2019-01-22
AU2013393832A1 (en) 2016-02-04
IL243405A0 (en) 2016-02-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6208866B2 (ja) 硫酸化オリゴ糖を検出する分析法
Chaves et al. Microextraction in packed sorbent for analysis of antidepressants in human plasma by liquid chromatography and spectrophotometric detection
Vlčková et al. Current state of bioanalytical chromatography in clinical analysis
CN107941936B (zh) 分离测定利伐沙班及其杂质的方法及应用
Zhao et al. The determination of patulin from food samples using dual-dummy molecularly imprinted solid-phase extraction coupled with LC-MS/MS
CN110441449B (zh) 盐酸法舒地尔原料或注射剂中有关物质的检测方法
Song et al. A capillary liquid chromatographic/tandem mass spectrometric method for the quantification of γ-aminobutyric acid in human plasma and cerebrospinal fluid
US9441053B2 (en) Analytical method for detecting sulfated oligosaccharides
Wei et al. A rapid ion chromatography column-switching method for online sample pretreatment and determination of L-carnitine, choline and mineral ions in milk and powdered infant formula
KR20160108315A (ko) 디안히드로갈락티톨 중의 불순물의 ｈｐｌｃ 분석
Falck et al. Determination of ciclosporin A and its six main metabolites in isolated T-lymphocytes and whole blood using liquid chromatography–tandem mass spectrometry
Werner et al. Simultaneous determination of creatine, uric acid and creatinine by high-performance liquid chromatography with direct serum injection and multi-wavelength detection
Ito et al. Quantification of intact carboplatin in human plasma ultrafitrates using hydrophilic interaction liquid chromatography–tandem mass spectrometry and its application to a pharmacokinetic study
KR20190087900A (ko) 도네페질 및 메만틴의 동시 분석방법
Yaroshenko et al. Chromatographic determination of sildenafil in blood plasma using spectrophotometric and mass-spectrometric detection
Yu et al. Determination of myriocin in natural and cultured Cordyceps cicadae using 9-fluorenylmethyl chloroformate derivatization and high-performance liquid chromatography with UV-detection
RU2529814C1 (ru) Способ определения подлинности и количественного содержания бензэтония хлорида в лекарственных препаратах
Natishan Recent developments of achiral HPLC methods in pharmaceuticals using various detection modes
Wang et al. Application of solvent demulsification dispersive liquid–liquid microextraction for nicotine and cotinine measurement in human urine combined with hydrophilic interaction chromatography tandem mass spectrometry
Moon et al. Determination of tiapride in human plasma using hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry
Farshad et al. Preconcentration and determination of cabergoline using the green practical solvent bar liquid phase microextraction technique in biological fluids
Hussain et al. Fast Analysis of Third-generation cephalosporins in human plasma by SPE and HPLC methods
Cai et al. Quantification of salsolinol enantiomers by stable isotope dilution liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection
Pereira dos Santos et al. Microextraction by packed sorbent of N‐nitrosamines from Losartan tablets using a high‐throughput robot platform followed by liquid chromatography‐tandem mass spectrometry
CN114062555B (zh) 一种膳食补充剂类产品中nmn含量的测定方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application