CN105431733B - 用于检测硫酸化寡糖的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了使用与电离子检测器(charged aerosol detector;CAD)或质谱仪(MS)偶联的亲水性相互作用超高效液相层析仪(HILIC‑UPLC)检测及定量多硫酸化寡糖(包括磺达肝素钠(Fondaparinux sodium))的分析方法。此分析方法通过分离、定量及质量(mass)鉴定在高度硫酸化寡糖的全合成中提供过程中控制。同时提供了使用该方法的系统及条件。

Description

用于检测硫酸化寡糖的分析方法
相关申请的交叉引用
不适用
背景技术
类肝素(肝素及硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate))是多个重要生物过程中已知的调节介质。类肝素及其衍生物低分子量肝素(low-molecular weight heparin,LMWH)已在外科手术及肾透析期间用作临床抗凝血药物。例如,磺达肝素钠(CAS114870-03-0)是化学名称为O-[2-脱氧-6-O-磺酸基-2-(磺酰胺基)-α-D-吡喃葡萄糖]-(1--4)-O-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(l--4)-O-[2-脱氧-3,6-二-O-磺酸基-2-(磺酰胺基)-α-D-吡喃葡萄糖]-(l--4)-O-(2-O-磺酸基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸)-(1--4)-O-[2-脱氧-1-O-甲基-6-O-磺酸基-2-(磺酰胺基)-α-D-葡萄吡喃糖苷]十钠盐的寡糖/肝素中的一员,由Choay,S.A.研发(参见美国专利第4,818,816号)。该化合物是一合成的戊多糖因子Xa抑制剂,其用作预防经骨外科手术的患者的深层静脉栓塞以及治疗深层静脉栓塞及肺栓塞的抗凝血药物。磺达肝素钠于2001年经美国食品药物管理局批准,以商品名ArixtraTM出售。磺达肝素钠为皮下用药。
肝素及硫酸乙酰肝素分析方法在传统上涉及逆相层析及质谱(MS)技术,但因硫酸乙酰肝素的高极性、结构多样性及硫酸盐不稳定性而存在限制。例如,使用MS对于合成的多硫酸化寡糖进行定量受到限制,因为多硫酸化寡糖离子化时易于形成多种类型硫酸根基团损失的片段及金属阳离子偶合加成物,这会导致更大的质谱复杂性及信号分裂。另外,在分析期间难以显示硫酸根基团的损失程度,因为其取决于硫酸化寡糖的浓度及电荷态。改良的多硫酸化寡糖分析方法是多组研究团队的目标。
Catalin等人(Anal.Chem.2009,81,3485)及Tatiana等人(Anal.Chem.2006,78,1774)已分别阐述了通过使用电喷洒游离质谱(ESI-MS)及基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)来表征多硫酸化寡糖。然而,目前使用液相层析(LC)与质谱偶联的方法无法提供在线过程内层析峰的解析/分离且因此在产生合成的多硫酸化寡糖期间无法建立结构相关杂质的鉴定和/或多硫酸化寡糖的定量。
Imanari等人(J.Chromatogr.,A 1996,720,275.)及Rice等人(J.Anal.Biochem.1985,150,325.)阐述了借助强阴离子交换层析(SAX)分析多硫酸化寡糖的方法。此方法使用电荷密度差异来分离高度硫酸化寡糖,但因在流动相组合物中使用非挥发性盐类,故仍难以直接将SAX与像MS的检测方法偶联。
与多硫酸化寡糖分析方法相关的另一些问题是因多硫酸化寡糖的非发色特性(极低UV吸收)所致,此会限制传统UV检测器的使用。其他通用检测器(例如折射率(RI)检测器及蒸发光散射检测器(ELSD))亦对多硫酸化寡糖缺乏足够检测灵敏度。
尽管已公开了一些多硫酸化寡糖检测方法,但仍存在多种限制。因此,仍需要改良用于多硫酸化寡糖的分离、定量及质量(mass)鉴定的方法。本文所公开的稳定、灵敏且过程中控制(in-process control,IPC)方法解决了此需要及其他需要。
发明概要
本文提供使用与电离子检测器(charged aerosol detector,CAD)或质谱仪(MS)偶联的亲水性相互作用超高效液相层析仪(HILIC-UPLC)检测多硫酸化寡糖的方法。本文所提供方法使得峰分辨率改良,因而允许样品中多硫酸化寡糖和/或杂质的后续定量。
HILIC的使用克服了滞留及分离极端极性寡糖的挑战。HILIC的滞留机制极为复杂且为液液分配、吸附、离子相互作用及疏水性相互作用的多模式组合。因此,与逆相液相层析(RPLC)相比,HILIC提供独特的选择性及滞留特性。
如本文所述,在一组实施例中,用于HILIC管柱中的固定相是酰胺键合固定相。
在另一实施例中,用于HILIC管柱中的流动相包含盐类。在一组实施例中,该盐类为甲酸铵。与甲酸吡啶鎓盐及乙酸铵相比,甲酸铵的使用对滞留、选择性提供更佳的性能及低噪声基线。
在一些实施例中,盐类浓度高于50mM。在一些所选实施例,浓度高于100mM。通常,流动相组合物中盐添加剂的摩尔强度会对层析滞留、选择性及灵敏度具有显著影响。随着盐添加剂的摩尔浓度增加,液液分配相互作用压制了流动相与溶质的离子强度,其支配了滞留机制而非离子交换作用。然而,现已发现在酸性分析物(例如多硫酸化寡糖)的情形下,滞留随着盐添加剂的摩尔浓度增加而增强。具体而言,峰分辨率由于盐浓度自50mM增加至约200mM而得以进一步改良。
在一组实施例中,用于HILIC管柱中的流动相的溶剂为乙腈。
在一些实施例中,用于定量多硫酸化寡糖的检测器是电离子检测器(CAD)。在使用CAD进行分析期间,用电离气体(通常为氮气)使雾化粒子带电。在去除高流动性粒子(主要为过量N2离子)后,对雾化粒子实施电测量。最重要的是,已证实该方法对非挥发性分析物提供独立于其性质的均一响应。因此,⑴HILIC或HILIC-UPLC的分离技术与(2)诸如MS或CAD的检测技术的组合使得多硫酸化的检测、鉴定和/或定量能够进行,因而提供用于分析合成多硫酸化寡糖的有效方式。
根据本发明的一个优选实施例,借助本文所述方法检测和/或定量的多硫酸化寡糖为磺达肝素钠。
附图说明
图1(a)提供使用Merck,Sequant(3.5um 2.1×250mm)的磺达肝素钠的HILIC-CAD色谱图。
图1(b)提供使用Merck,Sequant(5um 4.6×150mm)的磺达肝素钠的HILIC-CAD色谱图。
图1(c)提供使用Phenomenex,Synergi Polar-RP(4um 4.6×250mm)的磺达肝素钠之HILIC-CAD色谱图。
图1(d)提供使用Phenomenex,Synergi Fusion-RP(4um 4.6×150mm)的磺达肝素钠的HILIC-CAD色谱图。
图1(e)提供使用Sepax Polar-Pyridine(1.8um 2.1×150mm)的磺达肝素钠的HILIC-CAD色谱图。
图1(f)提供使用ES,Epic Diol(1.7um 2.1×150mm)的磺达肝素钠的HILIC-CAD色谱图。
图1(g)提供使用Waters,Acquity BEH HILIC(1.7um 2.1×150mm)的磺达肝素钠的HILIC-CAD色谱图。
图1(h)提供使用Waters,Acquity BEH Amide(1.7um 2.1×150mm)的磺达肝素钠的HILIC-CAD色谱图。
图2提供使用Waters,BEH Amide管柱(a)全图及(b)局部放大图的磺达肝素钠的色谱图。
图3提供了使用不同类型盐(a)50mM甲酸铵(b)100mM甲酸铵(c)100mM甲酸吡啶鎓盐及(d)50mM乙酸铵进行分析的药物成分的局部放大色谱图。
图4提供了使用不同浓度甲酸铵(以局部放大图表示)(a)50mM(b)100mM(c)125mM(d)150mM(e)175mM及(f)200mM进行分析的药物成分局部放大色谱图(以局部放大图表示)。
图5提供了对流动相使用不同有机溶剂(a)流动相A:200mM甲酸铵;流动相B:丙酮及乙腈,1/1(b)流动相A:200mM甲酸铵;流动相B:乙腈作为流动相进行分析的药物成分色谱图(以局部放大图表示)。
具体实施方式
I.槪述
本文提供针对多硫酸化寡糖研发的简明过程中分析方法,其涉及分别应用HILIC-UPLC、CAD及MS进行分离、定量及质量鉴定。在制造期间的过程中控制(in processcontrol,IPC)对于在高度硫酸化寡糖的全合成中确保质量控制至关重要。本文所述分析方法可用作IPC方法。有利地,本文所述分析方法稳定、易于使用、灵敏,且在期望产率内确保有质量的化学实体的制造。
II.本发明实施例
鉴于上文,本文提供用于检测及定量样品中一或多种多硫酸化寡糖的方法,该方法包含:
(a)在与电离子检测器(CAD)或质谱仪(MS)偶联的亲水性相互作用超高效液相层析仪(HILIC-UPLC)管柱上对该样品实施层析,其中用于HILIC管柱中的固定相为酰胺键合固定相;及
(b)测定该样品中多硫酸化寡糖的量。
用于本方法中的样品通常是多硫酸化寡糖的合成制造方法的产物。因此,可根据本方法借助选择反应混合物的试样来分析合成程序中最终步骤的样品。反应混合物的取样允许杂质和/或多硫酸化寡糖的检测和/或定性和/或定量。反应混合物的取样亦允许反应的完成程度的测定。可选地,可对最终产物实施本方法以确定是否需要进一步纯化。
使用亲水性相互作用超高效液相层析仪的层析条件将通常涉及本领域技术人员已知的那些条件,包括(但不限于)管柱选择(大小、长度及固定相)以及流动相和/或流动相的pH。
管柱的选择将通常涉及自市售管柱(例如那些购自Waters,ThermoFisher,Merck,Phenomenex,Shodex,Nucleosil,和Sepax)的选择。在一组实施例中,管柱具有电荷中性的固定相(例如,二醇相或酰胺相)、带电固定相(例如,二氧化硅相、胺基丙基相)或两性离子固定相。在一组所选实施例中,固定相是酰胺键合固定相。实例1至10说明使用本文所述方法通过使用不同固定相所获得的结果。
本领域技术人员应了解,流速亦会影响分离及所获得的分辨率。
用于流动相中的溶剂通常是极性非质子有机溶剂,或极性非质子有机溶剂的混合物。在一组实施例中,用于HILIC管柱中的流动相的溶剂是乙腈、丙酮或乙腈与丙酮的混合物。实例13a至13d说明在使用本文所述方法的多硫酸化寡糖的检测和/或定量中不同溶剂和/或溶剂混合物的影响。
在其他实施例中,流动相亦将包含盐类,通常选自甲酸铵、甲酸吡啶鎓盐及乙酸铵、及其混合物。在某些所选实施例中,流动相将包含甲酸铵。在另一组实施例中,流动相包含选自柠檬酸铵和/或草酸铵的盐类。实例11a至11d说明在使用本文所述方法的多硫酸化寡糖的检测和/或定量中流动相中的不同盐类的影响。
用于流动相中的盐的浓度将通常是25mM至约400mM,但当盐是以50mM至约200mM的浓度存于流动相中时发现了一些最佳结果。在一些实施例中,盐是以约50mM至100mM、约100mM至200mM及约75mM至175mM的浓度存于流动相中。实例12a至12d说明当使用本文所述方法,通过使用甲酸铵作为盐时,在多硫酸化寡糖的检测和/或定量期间不同盐浓度对峰分辨率及峰宽度的影响。
在特定实施例中,上文所述方法可用于具有以下结构的多硫酸化寡糖磺达肝素的检测和/或定量:
在另一方面,本文提供用于检测及定量样品中磺达肝素的方法,该方法包含:
(a)在与电离子检测器(CAD)或质谱仪(MS)偶联的亲水性相互作用超高效液相层析仪(HILIC-UPLC)管柱上对该样品实施层析,其中用于HILIC管柱中的固定相是酰胺键合固定相,用于该层析中的流动相是乙腈,且该流动相包含约100mM至约200mM浓度的甲酸铵;及
(b)测定该样品中磺达肝素的量。
如上文及此处所用,样品中磺达肝素的量的“测定”或“磺达肝素的定量”是以一或多种对于本领域技术人员而言现成的方式实施。通常,UPLC-MS-和/或CAD的仪器与设有预装的可计算样品中物质的相对量(例如,借助计算峰下方面积和/或测量峰的相对强度)的程序和/或演算法一同销售。根据仪器的响应及一系列外标的浓度,可通过常规的回归分析来获得外部校准曲线。然后可通过外部校准曲线来确定样品浓度。如上文及此处所用,在示例性实施例中,在样品中的“检测”(例如,磺达肝素和/或杂质的检测)包含使用本文所述方法(例如,通过使用HILIC-UPLC)记录色谱图及使用偶联技术(例如CAD或MS)鉴定峰,从而确认(检测)样品中存在或不存在磺达肝素和/或杂质。
III.实施例
给出以下实例以进一步详细阐述本发明。然而,本发明决不受限于本文所述特定实施例。
仪器
用于UPLC-MS研究的仪器是分别由Thermo Fisher Dionex及Bruker Daltonics制造的Ultimate 3000(UPLC)及micrOTOF-Q IITM(MS)。用于UPLC-CAD的仪器是分别由Waters公司及Thermo Fisher Dionex制造的ACQUITY系统及Thermo Scientific DionexUltra CAD。
参数
分析条件如下。
1.使用酰胺-HILIC型管柱作为用于分析多磺化寡糖的分析管柱。
2.用于流动相中的甲酸铵的浓度是100mM或高于100mM。
3.流动相组合物中甲酸铵:乙腈的体积比例在95%-5%:5%-95%范围内。
4.用于下文实例中的流速范围为0.4mL/min至1mL/min。
5.用于本文所述方法中的管柱温度范围为10℃至70℃。
6.用于此方法中的电离子检测器的雾化温度范围为10℃至30℃。
7.测试样品的浓度为15μg/mL至30mg/mL。
8.测试样品的注射体积为1μ至5μL。
样品制备
将样品溶解于水与乙腈的混合物(1:1;30mg/mL)中。
实例1至10不同类型HILIC管柱的比较及一般LC条件
通过如表1所显示的不同类型HILIC管柱来分析如上文制备的样品。使用不同管柱记录的色谱图显示于图1(a)至(h)中,且磺达肝素的峰鉴定通过LC-MS被证实。
表1
类型 商标
1 BEH-HILIC(-OH) Waters
2 BEH-Amide Waters
3 Accucore Thermo
4 Zic-Hilic Merck
5 Polar-RP Phenomenex
6 Fusion-RP Phenomenex
7 NH2P-50 Shodex
8 5-NH2 Nucleosil
9 Polar-Pyridine Sepax
10 Polar-Imidazole Sepax
在实施例1至10中的大多数中,发现磺达肝素的峰因与杂质的分离不良而不对称,只有一个例外,Waters BEH Amide管柱。对Waters BEH Amide的LC条件进行优化,典型层析图显示于图2中。此研究显示,在不同类型HILIC管柱中,酰胺型HILIC管柱对此合成多硫酸化五碳糖的分析提供了相对更佳的选择。
实例11a至11d不同盐的影响
比较三种不同的盐:甲酸铵、甲酸吡啶鎓盐及乙酸铵。分析条件显示于表2中。结果显示于图3中。
表2
就滞留、选择性及低噪声基线而言,层析表现最佳的是含有50mM及100mM浓度的甲酸铵盐的流动相(分别为图3a及3b)。甲酸吡啶鎓盐(图3c)及乙酸铵(图3d)对所关注分析物显示较高基线噪声及较少滞留。基于该研究,将流动相组合物中的盐添加剂选择为甲酸铵。
实例12a至12f盐浓度的影响
对含有不同浓度甲酸铵盐的流动相组合物进行研究以优化LC条件。实例12a至12f甲酸铵的浓度提供于表3中。各个层析图显示于图4中。
表3
实施例 12a 12b 12c 12d 12e 12f
甲酸铵浓度 50mM 100mM 125mM 150mM 175mM 200mM
发现使用50mM及100mM盐浓度获得的层析图(图4a及4b)中,杂质概况非常类似。随着盐浓度增加,观察到刚好位于主峰(磺达肝素)前面的小峰(用黑色三角形标记,参见图4d、4e及4f)。随着盐浓度自150mM甲酸铵增加至200mM甲酸铵,此新峰与主峰的分辨率得以进一步改良。另外,显然,当盐浓度增加至175mM时,主峰的带宽变窄;观察到当盐浓度增加超过175mM时对分辨率及峰形状无进一步改良。
实例13a至13b溶剂的影响
实例13a及13b分别使用乙腈与丙酮的混合物及乙腈作为用于分析本发明磺达肝素钠的流动相的溶剂。尽管显示于图5中的结果指示在乙腈系统与混合物(乙腈及丙酮)系统中的选择性无明显差异,但观察到在包含丙酮/乙腈混合物的系统中的背压比在乙腈系统中更高。
尽管出于清晰了解的目的已借助说明及实施例相当详细地阐述了上述发明,但本领域技术人员应了解,可在随附的权利要求书的范围内进行某些变化及修改。另外,本文所提供的每一篇参考文献的全部内容皆通过引用并入,其并入程度如同每一参考文献个别地通过引用并入一般。倘若本申请与本文所提供参考文献之间存在冲突,则应以本申请为准。

Claims (10)

1.一种用于检测及定量样品中一或多种多硫酸化寡糖的方法,所述方法包括:
(a)在具有酰胺键合固定相和流动相的亲水性相互作用超高效液相层析仪HILIC-UPLC管柱上对该样品实施层析;及
(b)使用电离子检测器(CAD),检测该样品中多硫酸化寡糖并定量。
2.如权利要求1所述的方法,其中用于HILIC-UPLC管柱中的流动相包含盐。
3.如权利要求2所述的方法,其中所述盐选自甲酸铵、甲酸吡啶鎓盐及乙酸铵。
4.如权利要求3所述的方法,其中所述盐是甲酸铵。
5.如权利要求3所述的方法,其中所述盐是甲酸铵且以50mM至300mM的浓度存于所述流动相中。
6.如权利要求5所述的方法,其中所述流动相中甲酸铵的浓度是100mM至200mM。
7.如权利要求1所述的方法,其中用于所述HILIC-UPLC管柱中的流动相的溶剂是乙腈、丙酮或乙腈与丙酮的混合物。
8.如权利要求1所述的方法,其中用于所述HILIC-UPLC管柱中的流动相的溶剂是乙腈。
9.如权利要求1所述的方法,其中所述多硫酸化寡糖是具有以下结构的磺达肝素:
10.一种用于检测及定量样品中磺达肝素的方法,该方法包含:
(a)在具有酰胺键合固定相和流动相的亲水性相互作用超高效液相层析仪HILIC-UPLC管柱上对所述样品实施层析,用于该HILIC-UPLC管柱中的流动相的溶剂是乙腈,且该流动相包含100mM至200mM浓度的甲酸铵;及
(b)使用电离子检测器(CAD),检测该样品中磺达肝素并定量。
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