KR20190087900A - 도네페질 및 메만틴의 동시 분석방법 - Google Patents

도네페질 및 메만틴의 동시 분석방법 Download PDF

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Abstract

일 양상에 따른 도네페질 및 메만틴의 동시 분석방법은 한 번의 분석으로 생체 시료 내에 존재하는 도네페질 및 메만틴을 높은 정밀도와 정확도로 신속하게 동시에 분석할 수 있으며, 시료의 pH를 4 내지 5로 조절하는 단계; 고체상 추출법(Solid phase extraction: SPE)으로 상기 시료를 추출하는 단계; 및 상기 추출된 시료를 액체크로마토그래피 분석 컬럼으로 분리하는 단계를 포함한다.

Description

도네페질 및 메만틴의 동시 분석방법{Simultaneous determination method of donepezil and memantine}
생체 시료 내에 존재하는 도네페질 및 메만틴을 동시에 분석할 수 있는 분석방법에 관한 것이다.
급성 또는 만성 신경질환(neurological disease) 및 신경정신질환(neuropsychiatric disease)은 세계적으로 사망, 장애 및 경제적 소비의 주요 원인 중 하나가 되고 있다. 한국 통계청의 '2016년 사망원인통계' 분석 결과에 따르면 치매 질환으로 인한 사망자 수는 최근 10년 동안 2배 가까이 증가하였으며, 특히 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 환자 비중이 치매 사망자 중 28.4%에서 52.5%로 눈에 띄게 증가하였다. 이와 같은 결과는 급속한 고령화의 영향과 의료 기술의 발전으로 치매 판명을 받는 환자가 크게 늘었고, 서구식 식습관이 보편화 되면서 알츠하이머병이 증가하였기 때문으로 생각된다. 상기 질환의 치료 또는 완화를 위한 대표적인 약물로는 도네페질(Donepezil)(1-벤질-4- [(5,6-디메톡시-1-인다논-2-일)메틸]피페리딘)(한국에자이제약사의 아리셉트정, 도네페질 염산염으로서 1회 10mg, 1일 1회 복용) 및 메만틴(Memantine)(3,5-다이메틸-9-아미노아다만탄)(룬드벡사의 에빅사정, 메만틴 염산염으로서 1회 10 mg, 1일 2회 복용)이 있다. 상기 두 약물은 환자의 치료를 최적화하기 위해 병용될 수 있으며, 최근에는 환자의 복용 편의성을 향상시키기 위한 도네페질 및 메만틴의 복합제에 관한 연구도 활발하다.
또한, 치매 질환은 환자 개개인의 특성에 따라 매우 복합적인 양상을 나타내므로 혈중 약물 농도를 신속하게 정확하게 모니터링하여 맞춤 처방을 제공할 필요가 있다. 더욱이 도네페질은 생물학적 반감기가 70시간으로 매우 길고 단백 결합률이 96%로 매우 높으며, 다른 약물과 동시 투여 시 항콜린성 약물의 효능을 저해하고, 신경근육 차단제 또는 콜린성 제제의 작용을 상승시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 메만틴은 주로 신장 배설되는 약물로서 생물학적 반감기가 60 내지 100시간으로 매우 길며, 동일한 신장 양이온성 수송 시스템(renal cationic transport system)을 사용하는 약물 예컨대 시메티딘, 라니티딘, 프로카인아미드, 퀴니딘, 퀴닌, 니코틴과 같은 같은 약물과 함께 투여될 경우 메만틴의 혈장 농도가 증가될 수 있고(Clinical Interventions in Aging 2015:10 1457-1466), 다른 항정신병약물(narcoleptics), 바르비탈(barbital) 유도체, 항콜린성 약물 등과도 약물 상호작용(drug interaction)을 나타내는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이들 약물에 대한 혈중 약물 농도에 대한 모니터링이 중요하다.
그런데 생체 시료로부터 물리화학적 성질이 상이한 2 이상의 약물을 동시에 검출하는 것은 시간, 비용 및 노력 면에서 많은 제약이 따른다. 특허문헌 1은 기체크로마토그래피를 이용한 다성분 동시 분석법을 기재하고 있으나, 분석을 위해서 추출물의 유도체화 반응을 거쳐야 하므로 공정이 까다롭고 복잡하다. 또한, 액체-액체 추출법 또는 단백침전법은 검출을 위해 다량의 생체 시료가 필요한 점에서 제한이 있고, 특히 도네페질 및 메만틴을 분석하고자 할 경우 베이스라인의 상승으로 인하여 저농도의 메만틴까지 분석하기 어려운 문제점이 있다. 또한, 액체크로마토그래피와 질량분석기를 이용한 종래 분석법은 이동상 조성 변화에 따른 용량(capacity)에 제한을 받으므로 한 개의 시료에서 서로 다른 약물을 동시에 정량 분석하는 것이 어렵다.
이와 같은 상황에서 본 발명자들은 오랜 연구 끝에 제한된 생체 시료로부터 높은 정밀도와 정확도로 도네페질 및 메만틴을 동시에 신속하게 분석할 수 있는 분석방법을 개발하였다.
특허등록공보 제10-0927463호
일 양상은 고체상 추출법(Solid phase extraction: SPE) 및 액체크로마토그래피 분석 컬럼을 이용하여 도네페질 및 메만틴을 동시에 분석할 수 있는 방법을 제공한다.
일 양상은,
시료의 pH를 4 내지 5로 조절하는 단계;
고체상 추출법(Solid phase extraction: SPE)으로 상기 시료를 추출하는 단계; 및
상기 추출된 시료를 액체크로마토그래피 분석 컬럼으로 분리하는 단계를 포함하는, 도네페질 및 메만틴의 동시 분석방법을 제공한다.
일 양상에 따른 도네페질 및 메만틴의 동시 분석방법은, 한 번의 분석으로 생체 시료 내에 존재하는 도네페질 및 메만틴, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 높은 정밀도와 정확도로 분석이 가능하다. 또한, 분석 시간을 단축시키고 분석에 따른 비용을 절감할 수 있으며, 적은 양의 생체 시료로도 신속한 동시 정성 및 정량분석이 가능한 점에 장점이 있다. 또한, 생체 시료 분석을 통해 도네페질 및 메만틴 약물의 체내 흡수, 분포, 대사, 배설에 관한 신속한 약물동태학적 프로파일 확인이 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 양상에 따른 분석방법으로 검출하기 위한 (A) 메만틴 및 (B) 도네페질과 이들 각각의 내부표준물질인 (C) 메만틴-D6 및 (D) 아토목세틴의 구조식을 나타낸다.
도 2는 초고성능액체크로마토그래피(Ultra-Performance Liquid Chromatography: UPLC) 조건 최적화 실험을 통해 찾아낸 메만틴, 도네페질, 및 이들 각각의 내부표준물질(메만틴-D6, 아토목세틴)의 이동상 유량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 이중질량분석기 조건 최적화 실험을 통해 UPLC-MS/MS에서 다중반응검지법(Multiple reaction monitoring: MRM) 모드로 정량하여 찾아낸 메만틴, 도네페질, 및 내부표준물질들의 선구이온과 생성이온의 검출세기를 나타낸 그래프이다.
본 명세서에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 이하 기술된 과정은 본 발명에 따른 하나의 예시에 불과하며, 본 발명에서는 각 단계 중 일부가 생략되거나, 혹은 반복해서 수행될 수 있으며, 경우에 따라서는 각 단계의 순서가 적절히 변경될 수도 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 수치는 명시하지 않아도 "약"의 의미를 포함하는 것으로 간주한다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.
일 양상은,
시료의 pH를 4 내지 5로 조절하는 단계;
고체상 추출법(Solid phase extraction: SPE)으로 상기 시료를 추출하는 단계; 및
상기 추출된 시료를 액체크로마토그래피 분석 컬럼으로 분리하는 단계를 포함하는, 도네페질 및 메만틴의 동시 분석방법을 제공한다.
본 명세서에서 상기 시료를 추출하는 방법은 고체상 추출법(Solid phase extraction: SPE) 또는 고상 추출법에 의할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "고체상 추출법"은 시료가 통과하는 고체('고정상 또는 흡착제'라고도 함)에 대한 액체 중에 용해 또는 현탁된 용질('이동상'이라도도 함)의 친화성을 사용하여 혼합물을 원하는 성분과 원치 않는 성분으로 분리하는 화학적 분리 기술을 말한다. 이에 따라 시료 중의 원하는 관심 분석물 또는 원하지 않는 불순물 중 어느 하나가 흡착제 상에 남게 되고, 흡착제를 통과하는 부분은 원하는 분석물을 함유하는지 또는 원하지 않는 불순물을 함유하는지에 따라 수집되거나 폐기될 수 있다. 흡착제 상에 남아 있는 부분이 원하는 분석물을 포함하는 경우라면, 적절한 용리액을 사용하여 흡착제가 세정되는 추가 단계에서 수집을 위하여 흡착제로부터 제거될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "흡착제"는 특정 관능기가 결합되어 있는, 일반적으로는 예를 들어 실리카-기재인 입자를 말한다. 상기 흡착제는 통상적으로 긴 카트리지 몸체 내 2개의 다공성 매체 층들 사이에 충진됨으로써 "고체상 추출 (SPE) 카트리지"를 형성하며, 하나 이상의 SPE 카트리지가 자동화된 합성장치와 함께 사용하기에 적합한 카세트에 포함될 수 있다. 상기 흡착제는 예를 들어 10 ㎛내지 120 ㎛의 직경을 가지는 입자로 구성될 수 있다. 상기 흡착제 입자에 결합되는 관능기는 다양한 길이의 탄화수소 사슬들 예컨대 C2, C8, C18 또는 C30일 수 있다. 일 구체예에서 상기 카트리지는 비극성 충진물을 포함하는 C2, C8, C18 또는 C30 카트리지일 수 있다. 일 구체예에서 상기 카트리지는 C18 일 수 있다.
본 명세서에서 고체상 추출법은 생체 시료에 존재하는 다양한 기능기를 가진 두 종 이상의 약물을 동시에 분석하기 위한 시료의 전처리 과정에 해당할 수 있다. 시료 내의 분석물질이 고체상 추출법의 카트리지에 최적으로 상호작용하게 하고, 분석 방해물질들을 제거하기 위해서는 먼저 생체 시료의 pH를 적절히 조절하는 것이 바람직하다.
일 구체예에서 시료의 pH를 조절하는 것은 시료 중에 존재하는 분석 대상 약물의 추출율(회수율)을 높이기 위함이다. 또한, 이와 같은 단계를 포함하지 않을 경우 시료 중에 존재하는 약물의 회수율이 낮고 분리능이 감소하여 정량 분석이 어렵게 됨에 따라 도네페질 및 메만틴을 효율적으로 동시에 분석할 수 없다.
일 구체예에서 시료 중에 존재하는 약물의 추출율(회수율)은 시료의 pH에 따라 변화할 수 있다. 일 구체예에서 종래 방법으로는 추출율(회수율)이 낮은 메만틴 및 도네페질의 추출율(회수율)을 증가시키기 위하여 고체상 추출과정 처리단계에서 시료의 pH를 약산성 상태로 조절할 수 있다. 상기 추출율(회수율)을 증가시키기 위한 시료의 pH는 예를 들어 메만틴을 포함하는 시료의 경우 약 pH 5일 수 있고, 도네페질을 포함하는 시료의 경우 약 pH 4일 수 있다. 상기 pH는 시료에 포함된 물질의 물리화학적 성질을 고려하여 조절할 수 있다.
일 구체예에서 상기 시료의 pH는 약 4 내지 5로 조절될 수 있다. 이를 벗어나는 경우, 즉 시료의 pH가 약 4 내지 5 보다 낮거나 높을 경우 시료 중에 존재하는 약물의 추출율(회수율)이 감소한다. 일 구체예에서 시료의 pH를 약 4 내지 5로 조절할 경우 도네페질 및 메만틴의 회수율이 약 65% 이상이며, 일 구체예로서는 약 70% 내지 85%, 다른 구체예로는 약 74 내지 81%인 것과 비교하여, 동일한 조건에서 시료의 pH만을 달리 하였을 때 회수율은 이보다 크게 감소하였다. 구체적으로 시료의 pH를 2로 조절한 경우 회수율은 약 37 내지 43%이고, 시료의 pH를 7로 조절한 경우 회수율은 40 내지 50%로서 크게 감소하였다(실험예 1). 또한, 시료의 pH가 약 4 내지 5 보다 높을 경우 분석 시 피크 퍼짐(broad peaks)과 함께 분리능이 감소하여 효율적인 정량이 어렵다.
일 구체예에서 상기 시료의 pH를 약 4 내지 5로 범위로 조절하기 위하여 산성용액 또는 완충용액을 첨가할 수 있다. 상기 산성용액 또는 완충용액으로는 예를 들어 염산용액 또는 아세트산염 완충용액을 사용할 수 있으며, 상기 목적을 달성할 수 있는 통상적으로 사용하는 산성용액 또는 다른 완충용액으로 변경하여 사용할 수 있다. 일 구체예에서 시료의 pH 조절을 위해 염산용액, pH 2 내지 3에 해당되는 산성 조건의 아세트산암모늄(Ammonium acetate) 완충용액, 또는 이들의 혼합물을 첨가할 수 있다. 상기 염산용액의 농도는 0.05 내지 0.5N 일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "정제"는 원치 않는 화합물과 함께 원하는 화합물을 포함하는 혼합물로부터 원하는 화합물을 분리하는 공정을 의미한다. 용어 "세정" 또는 "세척"은 반응 혼합물로부터의 원치 않는 불순물의 제거를 위해 설계된 단계를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "용리"는 관심 화합물을 제거하지만, 세척 단계에 의해 제거되지 않은 소정의 불순물은 그대로 남겨두도록 설계된 단계를 지칭한다.
일 구체예에서 상기 고체상 추출법은 추출 컬럼을 이용하여 용리액(eluent)의 정제과정을 거쳐 매트릭스 효과(matrix effect: 정량하고자 하는 시료 또는 다른 매트릭스의 영향으로 실제보다 적게 검출되거나 그 반대로 많은 양이 있는 것처럼 나타나는 현상)를 줄이고, 추출조작을 자동화하여 절차를 간편하게 하여 운전을 용이하게 한 자동화된 고체상 추출법에 의할 수 있다.
이때 추출 컬럼으로는 크로마토그램(chromatogram) 상의 분석 대상의 피크(peak)의 모양이 대칭을 이루고 높은 회수율을 얻을 수 있는 추출 컬럼을 사용할 수 있고, 예를 들어 친수용성(hydrophilicity)과 친지용성(lipophilicity)을 모두 포함하는 컬럼을 사용할 수 있다. 이에 따라 시료의 매트릭스 효과가 감소하여 바람직한 정제 결과를 얻을 수 있고, 재현성이 높고, 일정한 머무름 시간을 가지고 정량분석을 할 수 있다.
일 구체예에서 상기 고체상 추출법은 친수성 및 친유성의 균형이 유지된 역상 흡착제를 사용할 수 있다. 상기 고체상 추출법에 사용되는 고체상 추출 카트리지는 친수성과 친유성의 균형을 유지하고 있는 역상 흡착제 예컨대 Oasis HLB 카트리지(워터스), Prep SepTM 카트리지(Thermo Fisher Scientific), EmporeTM SPE 카트리지(Supelco), 또는 HyperSepTM C18 카트리지(Thermo Fisher Scientific)를 사용할 수 있다.
상기 추출된 시료는 액체크로마토그래피 분석 컬럼으로 분리할 수 있다. 상기 액체크로마토그래피 분석 컬럼은 2 종류의 극성이 다른 이동상을 사용할 수 있다. 예를 들어 한 종류(이동상 A)는 완충용액을 사용하고, 다른 한 종류(이동상 B)는 유기 용매를 사용할 수 있다. 일 구체예에서 상기 액체크로마토그래피 분석 컬럼의 이동상은 아세트산암모늄(Ammonium acetate) 완충용액(이동상 A) 및 유기 용매(이동상 B)의 혼합물일 수 있다. 상기 이동상은 등용매(isocratic)로 진행할 수 있으며, 일 구체예에서 아세토니트릴 및 완충용액의 혼합물일 수 있다.
상기 이동상 A는 완충용액으로 pH를 산성으로 조절할 수 있으며, 일 구체예에서 약 pH 4.0 내지 6.0으로 조절할 수 있다. 일 구체예에서 상기 아세트산암모늄 완충용액의 pH는 약 4.0 내지 6.0, 예컨대 5.0 내지 6.0, 예를 들어 5.0 내지 5.5일 수 있다. 일 구체예에서 이동상의 pH를 상기 범위로 조절하는 단계를 포함하지 않을 경우 2 이상의 다성분을 효과적으로 분리할 수 없고, 도네페질 및 메만틴의 동시 분석이 어렵다. 일 구체예에서 완충용액(이동상 A)의 pH는 약 5.0 내지 5.5일 수 있으며, pH가 상기 범위보다 낮거나 높으면 시료의 이온화가 잘 되지 않아서 감도가 낮아지는 경향을 보인다. 따라서, 상기 범위로 완충용액(이동상 A)의 pH를 조절함에 따라 분석기기를 이용한 시료의 분석감도를 최적화할 수 있다.상기 이동상 A 예컨대 아세트산암모늄 완충용액의 pH는 아세트산, 포름산, 또는 이들의 혼합물과 같은 유기산 첨가에 의해 조절될 수 있다. 상기 이동상 A의 완충용액에 유기산을 첨가함으로써, 유기산을 첨가하지 않았을 경우에는 이온화되는 비율이 너무 낮아 검출할 수 없는 약물에 대해서도 효과적으로 검출할 수 있다. 또한, 유기산을 첨가하는 경우, 피크 모양의 왜곡이 감소되고 인텐서티(intensity)의 증가를 나타내어 정량 범위내의 직선성이 향상되고 분석감도가 개선될 수 있다.
일 구체예에서 이동상 A는 아세트산으로 pH를 5.0으로 조정한 10mM 아세트산암모늄을 사용할 수 있다. 일 구체예에서 이동상 B는 극성이 높은 유기 용매를 사용할 수 있고, 예를 들어 아세토니트릴을 사용할 수 있으나 이제 제한되는 것은 아니며 상기 목적을 달성할 수 있는 통상적으로 사용되는 유기 용매를 사용할 수 있다. 이동상의 유속은 0.15~0.25mL/min를 사용할 수 있으며, 일 구체예에서 0.2mL/min일 수 있다.
일 구체예에서 상기 혼합물 중의 아세트산암모늄 완충용액 및 유기 용매 예컨대 아세토니트릴의 혼합비(부피/부피(v/v))는 약 30:70 내지 70:30, 예컨대 약 40:60 내지 60:40 일 수 있다. 상기 범위로 혼합비를 조절함에 따라 매트릭스 효과(matrix effect)를 줄이고, 도네페질 및 메만틴 모두를 높은 분석감도 및 높은 재현성으로 정량분석할 수 있다. 상기 혼합비는 분석장비를 고려하여 적절하게 조정할 수 있다.일 구체예에서 액체크로마토그래피 분석 컬럼에 이동상으로 아세토니트릴(ACN) : 10mM 아세트산암모늄(pH 5.0) = 60 : 40을 사용할 수 있다. 일 구체예에서 상기 이동상은 등용매(isocratic)로 진행할 수 있으며, 일 구체예에서 아세토니트릴 및 완충용액의 혼합물일 수 있다.
상기 분석용 컬럼의 규격은 통상적으로 사용되는 범위 내에서 옥타데실실란(C18), 옥타실란(C8), 도데실란(C12) 등이 충전 물질로 사용할 수 있다. 일 구체예에서 상기 분석 컬럼은 선택된 물질로 충전된 역상 컬럼일 수 있다. 일 구체예에서 상기 분석용 컬럼은 역상 비극성 컬럼 예컨대 옥타데실실란(C18)으로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용할 수 있다. 이를 사용함에 따라 분리능(resolution)과 인텐서티의 증가를 이룰 수 있어 검출감도를 개선할 수 있다.
상기 컬럼은 길이 50~120mm, 내경은 2~5mm, 입자크기 1~3㎛인 것을 사용할 수 있으며, 예컨대 상기 컬럼의 규격은 길이 100mm, 내경 2.1mm, 입자크기 1.7㎛ 일 수 있다. 예컨대 CSH C18 (2.1 x 100mm, 1.7㎛) 컬럼(Waters사)에 시료를 5㎕씩 주입할 수 있다. 상기 컬럼의 온도는 기기상황에 따라 25~50℃ 내에서 적절하게 조정할 수 있다.
상기 액체크로마토그래피 분석 컬럼으로 분리한 시료를 질량분석기(Mass spectrometry: MS)로 분석할 수 있다. 상기 분석 방법은 액체크로마토그래피 분석 컬럼으로 분리한 시료를 질량분석기(MS)로 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구체예에서 고성능 액체크로마토그래피-질량분석기를 이용하여 시료를 분석하는 경우, 먼저 액체크로마토그래피의 분석 컬럼의 고정상과 이동상 사이에서 흡착성 또는 분배계수의 차를 이용하여 분리된 성분들은 머무름 시간의 차이를 두고 질량분석기로 도입될 수 있다. 도입된 시료는 이온화 장치에 의하여 이동상은 제거되고 분석물질들이 이온화될 수 있다.
상기 질량분석기를 이용한 분석은 분석물질 예컨대 도네페질 또는 메만틴에 대해 동위원소가 치환된 물질, 또는 분석물질과 pKa 값이 유사한 물질 예를 들어 분석물질 pKa 값의 약 ± 2.0의 pKa 값을 갖는 물질, 예컨대 도네페질 염산염(pKa = 8.9)의 내부표준물질로서 예컨대 약 pKa 7.9 내지 10.9인 물질, 또는 메만틴 염산염(pKa = 10.27)의 내부표준물질로서 예컨대 약 pKa 8.0 내지 12.0인 물질을 사용할 수 있다. 일 구체예에서 상기 도네페질 또는 메만틴의 내부표준물질로 각 분석물질에 대하여 수소가 동위원소 2H (중수소를 의미하는 'D'로도 나타냄)로 치환된 물질인 도네페질-D7 또는 메만틴-D6를 사용할 수 있다.
일 구체예에서 상기 도네페질과 pKa 값이 유사한 물질 예컨대 아토목세틴(pKa = 9.8), 디펜히드라민(pKa = 8.98), 갈란타민(pKa = 7.97), 또는 이들의 조합을 도네페질에 대한 내부표준물질로서 사용할 수 있다. 일 구체예에서 상기 메만틴과 pKa 값이 유사한 물질 예컨대 프로카인아마이드(pKa = 9.32), 아만타딘(pKa = 10.45), 또는 이들의 조합을 메만틴에 대한 내부표준물질로서 사용할 수 있다.
일 구체예에서 상기 분석법에서 내부표준물질은 도네페질-D7, 아토목세틴이나 디펜히드라민, 및 갈란타민 중에서 선택된 어느 하나의 도네페질에 대한 내부표준물질, 메만틴-D6, 프로카인아마이드, 및 아만타딘 중에서 선택된 어느 하나의 메만틴에 대한 내부표준물질, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구체예에서 상기 분석법에서 도네페질을 갈란타민의 내부표준물질로 사용하여 갈란타민을 메만틴과 함께 동시 분석할 수도 있다.
일 구체예에서 상기 분석법은 도네피질 및 메만틴의 동시 분석방법, 또는 도네페질의 약학적으로 허용가능한 염 및 메만틴의 약학적으로 허용가능한 염의 동시 분석방법을 포함할 수 있다.
일 구체예에서 상기 분석은 전자분무이온화(Electrospray ionization: ESI)로 연결되는 초고성능액체크로마토그래피-이중질량분석기(ESI UPLC-MS/MS)로 수행되는 것일 수 있다. 상기 초고성능액체크로마토그래피의 분석 컬럼을 통과하여 분리된 시료는 질량분석기로 도입하여 질량분석기에 장착된 전자분무(electrospray) 이온화장치를 이용하여 이온화될 수 있다.
일 구체예에서 상기 이중질량분석기에 의한 분석은 다중반응검지법(Multiple reaction monitoring: MRM)으로 정량될 수 있다. 상기 질량분석기로 분석하는 단계에서 정량분석시 질량분석기의 MRM 모드에서 정량함에 따라 신호대잡음비(signal to noise ratio)를 개선할 수 있다. 구체적으로 모 약물(parent drug)의 분자량에 해당하는 이온("선구이온(precursor ion)"이라고도 한다)을 첫 번째 사중극자(quadrupole)에서 선택적으로 통과시킨 후 이온을 충돌장치(collision cell)내에서 질소 가스와 충돌하여 생성되는 이온("생성이온(product ion)"이라고도 한다)을 두 번째 사중극자에서 검출하는 방식인 MRM 모드에서 분석이 수행될 수 있다. 이에 따라 같은 질량을 가진 이온이라도 한 번 더 깨지면 분자구조가 다른 경우 또다시 깨진 이온은 다른 경향을 나타내므로 이를 정량이온쌍으로 사용하면 백그라운드(back-ground)에서 방해되는 성분이 제거되어 한 층 더 깨끗한 크로마토그램 베이스라인(base-line)을 얻을 수 있으므로 분석감도가 개선되며 보다 높은 정확도로 도네페질 및 메만틴을 동시에 분석할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "최고혈중농도(Peak Plasma Concentration: Cmax)는 생체에 약물을 투여하고 얻은 혈중농도-시간 곡선에서 가장 높은 혈중농도를 말한다. 예를 들어 도네페질 5mg의 최고혈중농도(Cmax)는 34.1±7.3 ng/mL이고, 도네피질 10mg의 Cmax는 60.5±10.0 ng/mL으로 알려져 있다(Br J Clin Pharmacol. 1998 Nov;46 Suppl　1:13-8). 또한, 메만틴 10mg의 최고혈중농도(Cmax)는 37.3 ± 6.1ng/mL로 알려져있다(J. Appl. Biomed.6: 39-45, 2008). 검체검증 분석 가이드라인(식품의약품안전청 의약품안전국, 2013.3)에 따르면 검체검증 분석 대상 검체는 최고혈중농도(Cmax) 및 소실기 부근에서 무작위 추출될 수 있으며, 유럽의 'EMA, Guideline on bioanalytical method validation (2011)' 에 따르면 검체검증 분석 적합 판정 기준을 '두 값의 차이가 평균의 20% 이내'일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "최저정량한계(Lower Limit of Quantification: LLOQ)"는 적합한 정밀성과 정확성으로 정량적으로 실측될 수 있는 시료 내 분석물질의 최저량을 말한다. 상기 최저정량한계 미만으로 측정되는 시료는 반응의 선택성, 정밀성, 정확성, 생체시료효과 등을 신뢰할 수 없다. 일 구체예에 따른 분석 방법은 도네피질 및 메만틴의 최저정량한계(Lower Limit of Quantification: LLOQ)를 효과적으로 낮출 수 있으며, 이에 따라 종래 방법으로는 분석이 어려운 저농도의 분석 약물에 대해서도 정확한 분석이 가능하다.
일 구체예에 따른 분석 방법에서 신호대 잡음비(S/N ratio)를 5이상으로 하고 정확성 및 정밀성이 ± 20 % 이내로 하는 최저정량한계(LLOQ)는 도네페질에 대하여 약 0.04 내지 0.2ng/mL이고 메만틴에 대하여 약 0.04 내지 0.5ng/mL 일 수 있다. 상기 최저정량한계(LLOQ)는 사용한 시료량에 따라 달라질 수 있다. 일 구체예에 따른 분석 방법에서 상기 최저정량한계(LLOQ)는 혈장 50㎕을 사용했을 때 도네페질에 대하여 약 0.05 내지 0.2ng/mL 예컨대 0.1ng/mL이고, 메만틴에 대하여 약 0.2 내지 0.6 ng/mL 예컨대 0.4ng/mL 일 수 있다. 다른 일 구체예에 따른 분석 방법에서 상기 최저정량한계(LLOQ)는 혈장 500㎕을 사용했을 때 도네페질에 대하여 대하여 약 0.005 내지 0.02ng/mL 예컨대 0.01ng/mL이고, 메만틴에 대하여 약 0.02 내지 0.06 ng/mL 예컨대 0.04ng/mL 일 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 구체예는 상기 최저정량한계 이상의 범위의 저농도의 시료를 사용하여 분석할 수 있다.
이하 구체예를 들어 기술하는 과정은 본 발명에 따른 하나의 예시에 불과하며, 본 발명에서는 상기 각 단계 중 일부가 생략되거나, 혹은 반복해서 수행될 수 있고, 경우에 따라서는 각 단계의 순서가 적절히 변경될 수도 있다.
일 구체예에서 상기 분석방법은,
도네페질 표준품, 메만틴 표준품, 각각의 내부표준물질을 각각 메탄올에 녹여 준비하는 제 1 단계;
시료에 내부표준물질과 묽은 염산 용액을 첨가하여 혼합하는 제 2 단계;
고상 추출(solid phase extraction: SPE) 카트리지를 메탄올과 물로 활성화 시키는 제 3 단계;
상기 활성화된 카트리지에 시료를 로딩하는 제 4 단계;
상기 카트리지를 물과 메탄올로 세척하는 제 5 단계;
상기 제 5 단계에서 얻은 시료를 질소 하에서 건조하여 농축시키는 제 6 단계;
상기 제 6 단계에서 얻은 시료를 재용해시키는 제 7 단계;
상기 제 7 단계에서 얻은 시료를 원심분리하여 상층액을 얻고 이것을 전자분무이온화로 연결되는 초고성능액체크로마토그래피(UPLC-ESI MS/MS) 분석용 컬럼에 주입시키는 제 8 단계; 및
상기 UPLC-ESI MS/MS 분석용 컬럼에 이동상을 흘려주어 도네페질 표준품, 메만틴 표준품, 각각의 내부표준물질을 분리하는 제 9 단계;를 포함할 수 있다.
본 명세에서 "내부표준물질법(Internal Standard method)"은 정량분석법 중 하나로서, 외부표준물질법과는 달리 각 성분들과 완전히 분리되는 제3의 물질을 내부표준물질(IS)로서 일정량 첨가하여 혼합 표준용액을 조제하는 방법을 말한다. 검출기 감응과 성분의 농도 사이에 영점을 지나면서 직선적인 비례관계를 이루는 농도범위 안에서는 한가지 농도의 표준용액만을 사용하여도 정량 계산이 가능하며, 그러지 못한 경우에는 한가지 농도의 표준용액보다 농도를 달리한 세 가지 이상의 표준용액을 사용하여 검량선을 작성한 후 정량분석을 수행하면 더욱 정확한 정량이 가능하다. 표준용액의 농도 범위는 예측한 시료농도가 포함되도록 결정할 수 있다.
일 구체예에서 상기 제 1 단계에서의 내부표준물질은 도네페질 및 메만틴의 각 표준품에 대한 방사성동위원소(예컨대 도네페질-D7, 메만틴-D6)를 사용할 수 있고, 또는 도네페질을 위한 내부표준물질로 예컨대 아토목세틴, 디펜히드라민, 갈란타민, 또는 이들의 조합을 사용할 수 있으며, 메만틴을 위한 내부표준물질로는 예컨대 프로카인아마이드, 아만타딘, 또는 이들의 조합을 사용할 수 있다. 상기 제 1 단계에서의 표준품 용액의 농도는 0.01 내지 500ng/mL 일 수 있다.
상기 제 2 단계에서 사용되는 묽은 염산의 농도는 0.05 내지 0.5N 일 수 있다. 상기 제 2 단계에서 시료는 혈장 또는 혈청일 수 있다.
상기 제 3 단계에서 사용하는 고상 추출(SPE) 카트리지는 C18, C8, 또는 C2 카트리지를 사용할 수 있으며, 일 구체예에서 C18을 사용할 수 있다. 상기 제 3 단계에서 고상 추출(SPE) 카트리지는 예컨대 100% 메탄올 1mL 및 증류수 1mL를 차례로 흘려주어 활성화시킬 수 있다.
상기 제 4 단계에서 시료는 예컨대 준비한 혈장샘플을 차례로 흘려주어서 고상 추출(SPE) 카트리지에 로딩할 수 있다.
상기 제 5 단계에서 시료 중에 존재하는 혈장 단백질 또는 혈장 내 불순물들을 제거하기 위하여 카트리지를 물과 메탄올도 세척할 수 있다. 예컨대 시료에 5% 메탄올 1mL을 흘려준 다음 모두 버리고 새로운 유리튜브에 놓고 100% 메탄올을 1mL 흘려주어서 용액을 얻을 수 있다.
상기 제 6 단계에서 예컨대 40 ℃ 히팅블록에 놓고 질소를 흘려주어 건조시킴에 따라 시료를 농축시킬 수 있다.
상기 제 7 단계에서 앞서 농축하여 얻은 시료에 예컨대 50% 아세토니트릴 150㎕을 넣고 재용해시킬 수 있다.
상기 제 8 단계에서 앞서 얻은 시료를 원심분리하여 상층액을 얻을 수 있다. 상기 상층액을 전자분무이온화로 연결되는 초고성능액체크로마토그래피(UPLC-ESI MS/MS) 분석용 컬럼에 주입할 수 있다. 상기 분석용 컬럼의 규격은 통상적으로 사용되는 범위 내에서 옥타데실실란(C18), 옥타실란(C8), 도데실란(C12) 등이 충전 물질로 사용 가능하며, 일 구체예에서 옥타실란(C8)을 사용할 수 있다. 일 구체예에서 상기 분석용 컬럼은 선택된 물질로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용할 수 있다. 일 구체예에서 상기 분석용 컬럼은 옥타실란(C8)으로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용할 수 있다. 상기 컬럼은 길이 50 내지 120mm, 내경은 2 내지 5mm, 입자크기 1 내지 3㎛인 것을 사용할 수 있으며, 예컨대 상기 컬럼의 규격은 길이 100mm, 내경 2.1mm, 입자크기 1.7㎛ 일 수 있다. 예컨대 CSH C18 (2.1 x 100mm, 1.7㎛) 컬럼(Waters사)에 시료를 5㎕씩 주입할 수 있다. 상기 컬럼의 온도는 기기상황에 따라 25 내지 50℃ 내에서 적절하게 조정할 수 있다.
상기 제 9 단계에서 UPLC-ESI MS/MS 분석용 컬럼에 이동상 예컨대 아세토니트릴(ACN) : 10mM 아세트산암모늄(pH5.0) = 60 : 40을 흘려줌에 따라 도네페질 표준품, 메만틴 표준품, 각각의 내부표준물질을 분리할 수 있다.
일 구체예에서 상기 초고성능액체크로마토그래피(Ultra-Performance Liquid Chromatography: UPLC) 분석은 하기 조건에서 수행될 수 있다.
(1) 이동상 조성: 이동상 A (100% 아세토니트릴), 이동상 B (10mM의 아세트산암모늄 완충용액), 이동상 A : B의 혼합비 (60:40) ; 및
(2) 이동상 속도:0.15 내지 0.3 mL/분.
일 구체예에서 상기 전자분무이온화로 연결되는 초고성능액체크로마토그래피-이중질량분석기(UPLC ESI MS/MS)를 이용한 분석의 이온화는 하기 조건에서 수행될 수 있다.
(1) 소스(source) 온도 : 100 내지 200℃ ;
(2) 이온 분무 전압 : 2000 내지 4000V ;
(3) 이온화 방법 : 양이온 모드에서의 전자분무 이온화법 ;
(4) 다중반응검지법(Multiple reaction monitoring: MRM) 정량 분석에 사용된 도네페질에 선택성을 가진 이온 : 선구이온(Q1) - m/z 380, 생성이온(Q3) - m/z 91 ;
(5) MRM 정량 분석에 사용된 메만틴에 선택성을 가진 이온 : 선구이온(Q1) - m/z 180, 생성이온(Q3) - m/z 163
(6) MRM 정량 분석에 사용된 도네페질에 대한 내부표준물질인 아토목세틴에 선택성을 가진 이온 : 선구이온(Q1) - m/z 256, 생성이온(Q3) - m/z 44 ; 및
(7) MRM 정량 분석에 사용된 메만틴에 대한 내부표준물질인 메만틴-D6에 선택성을 가진 이온 : 메만틴 선구이온(Q1) - m/z 186, 생성이온(Q3) - m/z 169
일 구체예에서 상기 전자분무이온화로 연결되는 초고성능액체크로마토그래피-이중질량분석기(UPLC ESI MS/MS)를 이용한 질량 분석은 하기 조건 (1) 및 (2)에서 수행될 수 있다.
(1) 사용 가스 ; 및
① Neulizer gas (CAD gas) : 7.0 Bar
② Cone gas : 150 L/시
③ Desolution gas : 800 L/시
④ Collision gas : 0.15 mL/분
상기 조건은 분석기기에 따라 최적화될 수 있다.
(2) 전기 조건 및 전압 파라미터
① 도네페질 - Cone(V) : 10, Collision(V) : 20
② 아토목세틴 - Cone(V) : 10, Collision(V) : 10
③ 메만틴 - Cone(V) : 20, Collision(V) : 15
④ 메만틴-D6 - Cone(V) : 30, Collision(V) : 15
상기 조건은 분석기기에 따라 최적화될 수 있다. 상기 파라미터는 오차범위(± 5~10)를 고려하여 조절될 수 있다. 예를 들어, 상기 도네페질, 아토모세틴, 메만틴, 메만틴-D6의 전기 조건 및 전압 파라미터는 하기 범위를 나타낼 수 있다.
(2') 전기 조건 및 전압 파라미터
① 도네페질 - Cone(V) : 10 내지 15, Collision(V) : 15 내지 25
② 아토목세틴 - Cone(V) : 10 내지 15, Collision(V) : 10 내지 15
③ 메만틴 - Cone(V) : 15 내지 25, Collision(V) : 10 내지 25
④ 메만틴-D6 - Cone(V) : 25 내지 35, Collision(V) : 10 내지 25
[실시예]
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서 사용된 용어　"내지"는 범위의 종점 및 이들 사이의 모든 중간점을 포함한다. 이 기술분야의 기술자는 수치적 양의 편차가 가능하다는 것을 이해할 것이다. 그러므로, 명세서 또는 청구의 범위에서 수치가 언급될 때마다, 그러한 수치 또는 대략 이러한 수치에 관한 부가적인 값 또한 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 이해된다.
실시예 1: 표준 용액 및 분석용 시료의 제조 및 시료의 전처리
도네페질 및 메만틴과 이에 대한 내부표준 물질인 아토목세틴 및 메만틴-D6을 모두 100% 메탄올에 녹여서 1000ppm이 되도록 저장용액(stock solution)을 만들었다. 모든 용액은 조제 후 냉동보관(-20℃ 이하) 하였다. 도 1은 본 발명의 일 양상에 따른 분석방법으로 검출하기 위한 (A) 메만틴 및 (B) 도네페질과 이들 각각의 내부표준물질인 (C) 메만틴-D6 및 (D) 아토목세틴의 구조식을 나타낸다.
이어서 혈장 검량선에 사용할 작동용액(working solution)을 만들기 위해 메만틴 저장용액을 100% 메탄올로 4, 8, 40, 80, 400, 800, 4000, 8000ppb가 되도록 희석하였고, 도네페질 저장용액을 50% 메탄올로 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 2000ppb가 되도록 희석하였다. 또한, 50% 메탄올로 각각 희석하여 내부표준물질인 메만틴-D6는 20ppb가 되도록 하였고, 아토목세틴은 50ppb가 되도록 하였다. 각각의 작동용액 10㎕씩을 혈장 50㎕와 혼합하여 최종 10배로 희석되도록 준비한 다음 여기에 내부표준물질을 각각 20㎕씩 넣고 0.1N HCl 용액 100㎕를 혼합하여 시료의 pH를 4 내지 5로 조절하였다.
비교예 1 및 2: 분석용 시료의 제조
실시예 1에서 최종 혼합 용액의 pH만을 달리하는 분석용 시료를 제조하였다. 구체적으로 비교예 1은 실시예 1에서 0.1N HCl 용액 100㎕ 대신에 1N HCl 용액 100㎕를 첨가하여 최종 혼합 용액의 pH를 2로 조절하였다. 비교예 2는 실시예 1에서 0.1N HCl 용액 100㎕ 대신에 10mM 암모늄아세테이트 100㎕를 첨가하여 최종 혼합 용액의 pH를 7로 조절하였다.
실험예 1: 고상 추출(solid phase extraction: SPE)에 따른 회수율(%) 측정
고상 추출 카트리지에 100% 메탄올 1mL 및 증류수 1mL을 차례로 흘려주어 카트리지를 활성화 시킨 다음, 앞서 실시예 1 및 비교예 1, 2에서 제조한 혈장시료를 차례로 흘려주었다. 그 다음 혈장 단백질 또는 혈장 내 불순물을 제거하기 위하여 5% 메탄올 1mL을 흘려준 다음 모두 버렸다. 새로운 유리튜브를 놓고 100% 메탄올을 1mL 흘려주어 얻은 용액을 40℃ 히팅블록에 놓고 질소를 흘려주어 건조시켰다. 완전히 건조된 유리튜브에 50% 아세토니트릴을 150㎕ 넣고 재용해시킨 다음 15000rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 이어서 하기 조건에서 분석하였다.
상기 고상 추출에 따른 회수율(추출율)(%)를 하기 표 1에 나타내었다.
pH 회수율(%)
비교예 1 2 37 내지 43%
실시예 1 4 내지 5 74 내지 81%
비교예 2 7 40 내지 50%
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 전처리 과정에서 시료의 pH를 약 4 내지 5로 조절한 실시예 1과 비교하여, 시료의 pH를 2 또는 7로 조절한 비교예 1 및 2는 실시예 1보다 낮은 회수율(%)을 보였으며, 이에 따라 약물의 동시 분석 및 정량이 어려웠다.
실험예 2: 초고성능액체크로마토그래피(UPLC) 분석
분석 기기로 초고성능액체크로마토그래피(ultra performance liquid chromatography: UPLC)(Waters사)를 사용하여 하기 조건에서 시료를 분석하였다.
기기명 Waters AcQuity UPLC
컬럼 CSH C18 (2.1 x 100mm, 1.7㎛)
컬럼온도 35℃
유속 0.2mL/min
주입량 5㎕
이동상 ACN : 10mM 아세트산암모늄(pH 5.0) = 60 : 40
도 2는 UPLC 조건 최적화 실험을 통해 찾아낸 메만틴, 도네페질, 및 내부표준물질들의 이동상 유량을 나타낸 그래프이다. 본 발명에 따른 분석 방법에 의해 메만틴 및 도네페질의 동시 분석이 가능함을 알 수 있다.
실험예 3: 전자분무이온화 이중질량분석(ESI MS/MS)
분석 기기로 전기분무 이온화(electrospray ionization:　ESI)로 연결되는 이중질량분석기(MS/MS)(Waters사의 Xevo TQ-s)를 사용하여 하기 조건에서 시료를 분석하였다. 최저정량한계(Lower Limit of Quantification: LLOQ)는 혈장 50㎕을 사용했을 때 도네페질 0.1ng/mL, 메만틴 0.4ng/mL 이었다.
<이온화 조건>
(1) 소스(source) 온도 : 100~200℃
(2) 이온 분무 전압 : 2000~4000V
(3) 이온화 방법 : 양이온 모드에서의 전자분무 이온화법
(4) 다중반응검지법(multiple reaction monitoring: MRM) 정량 분석에 사용된 도네페질에 선택성을 가지는 이온 : 선구이온(Q1) - m/z 380, 생성이온(Q3) - m/z 91
(5) MRM 정량 분석에 사용된 메만틴에 선택성을 가지는 이온 : 선구이온(Q1) - m/z 180, 생성이온(Q3) - m/z 163
(6) MRM 정량 분석에 사용된 도네페질의 내부표준물질인 아토목세틴에 선택성을 가지는 이온 : 선구이온(Q1) - m/z 256, 생성이온(Q3) - m/z 44
(7) MRM 정량 분석에 사용된 메만틴의 내부표준물질인 메만틴-D6에 선택성을 가지는 이온 : 선구이온(Q1) - m/z 186, 생성이온(Q3) - m/z 169
<질량분석 조건>
(1) 가스 흐름(gas flow)
① Nebulizer(CAD gas) : 7.0 Bar
② Cone gas : 150 L/hr
③ Desolution gas : 800 L/hr
④ Collision gas : 0.15 mL/min
(2) 전기 조건 및 전압 파라미터
Cone(V) Collision(V)
도네페질 10 20
아토목세틴 10 10
메만틴 20 15
메만틴-D6 20 15
도 3은 이중질량분석기 조건 최적화 실험을 통해 UPLC-MS/MS에서 MRM 모드로 정량하여 찾아낸 메만틴, 도네페질, 및 내부표준물질들의 선구이온과 생성이온의 검출세기를 나타낸 그래프이다. 본 발명에 따른 분석 방법에 의해 메만틴 및 도네페질의 동시 분석이 가능함을 알 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 상기 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (16)

  1. 시료의 pH를 4 내지 5로 조절하는 단계;
    고체상 추출법(Solid phase extraction: SPE)으로 상기 시료를 추출하는 단계; 및
    상기 추출된 시료를 액체크로마토그래피 분석 컬럼으로 분리하는 단계를 포함하는, 도네페질 및 메만틴의 동시 분석방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 염산용액, pH 2 내지 3에 해당되는 산성 조건의 아세트산암모늄(Ammonium acetate) 완충용액, 또는 이들의 혼합물의 첨가에 의해 상기 시료의 pH를 조절하는 것인 분석방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 고체상 추출법은 친수성 및 친유성의 균형이 유지된 역상 흡착제를 사용하는 것인 분석방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 액체크로마토그래피 분석 컬럼은 아세트산암모늄(Ammonium acetate) 완충용액 및 유기 용매의 혼합물을 이동상으로 사용하는 것인 분석방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 아세트산암모늄 완충용액의 pH는 5 내지 5.5인 것인 분석방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 아세트산암모늄 완충용액의 pH는 아세트산, 포름산, 또는 이들의 혼합물의 첨가에 의해 조절하는 것인 분석방법.
  7. 청구항 4에 있어서, 상기 아세트산암모늄 완충용액 및 유기 용매의 혼합비가 40:60 내지 60:40인 것인 분석방법.
  8. 청구항 4에 있어서, 상기 유기 용매는 아세토니트릴인 것인 분석방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 분석방법은 액체크로마토그래피 분석 컬럼으로 분리된 시료를 질량분석기(Mass spectrometry: MS)로 분석하는 단계를 더 포함하는 것인 것인 분석방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 질량분석기를 이용한 분석은 분석물질에 대해 동위원소가 치환된 물질 또는 pKa 값이 분석물질 pKa 값의 ± 2.0 인 물질을 내부표준물질로 사용하여 정량하는 것인 분석방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 내부표준물질은 도네페질-D7, 아토목세틴이나 디펜히드라민, 및 갈란타민 중에서 선택된 어느 하나의 도네페질에 대한 내부표준물질, 메만틴-D6, 프로카인아마이드, 및 아만타딘, 중에서 선택된 어느 하나의 메만틴에 대한 내부표준물질, 또는 이들의 조합인 것인 분석방법.
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 분석은 전자분무이온화(Electrospray ionization: ESI)로 연결되는 초고성능액체크로마토그래피-이중질량분석기(UPLC-ESI MS/MS)로 수행되는 것인 분석방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 이중질량분석기에 의한 분석은 다중반응검지법(Multiple reaction monitoring: MRM)으로 정량하는 것인 분석방법.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 초고성능액체크로마토그래피(Ultra-Performance Liquid Chromatography: UPLC)는 하기 조건에서 수행되는 것인 분석방법:
    (1) 이동상 조성: 이동상 A (아세토니트릴), 이동상 B (10mM의 아세트산암모늄 완충용액), 이동상 A : B의 혼합비 (60:40) ; 및
    (2) 이동상 속도:0.15 내지 0.3 mL/분.
  15. 청구항 12에 있어서, 상기 전자분무이온화로 연결되는 초고성능액체크로마토그래피-이중질량분석기(UPLC-ESI MS/MS)를 이용한 분석은 하기 조건에서 이온화가 수행되는 것인 분석방법:
    (1) 소스(source) 온도 : 100 내지 200℃ ;
    (2) 이온 분무 전압 : 2000 내지 4000V ;
    (3) 이온화 방법 : 양이온 모드에서의 전자분무 이온화법 ;
    (4) 다중반응검지법(Multiple reaction monitoring: MRM) 정량 분석에 사용된 도네페질에 선택성을 가진 이온 : 선구이온(Q1) - m/z 380, 생성이온(Q3) - m/z 91 ;
    (5) MRM 정량 분석에 사용된 메만틴에 선택성을 가진 이온 : 선구이온(Q1) - m/z 180, 생성이온(Q3) - m/z 163
    (6) MRM 정량 분석에 사용된 도네페질에 대한 내부표준물질인 아토목세틴에 선택성을 가진 이온 : 선구이온(Q1) - m/z 256, 생성이온(Q3) - m/z 44 ; 및
    (7) MRM 정량 분석에 사용된 메만틴에 대한 내부표준물질인 메만틴-D6에 선택성을 가진 이온 : 메만틴 선구이온(Q1) - m/z 186, 생성이온(Q3) - m/z 169.
  16. 청구항 12에 있어서, 상기 전자분무이온화로 연결되는 초고성능액체크로마토그래피-이중질량분석기(UPLC-ESI MS/MS)를 이용한 질량 분석은 하기 조건에서 수행되는 것인 분석방법.
    (1) 사용 가스 ; 및
    ① Neulizer gas (CAD gas) : 7.0 Bar
    ② Cone gas : 150 L/시
    ③ Desolution gas : 800 L/시
    ④ Collision gas : 0.15 mL/분

    (2) 전기 조건 및 전압 파라미터
    ① 도네페질 - Cone(V) : 10 내지 15, Collision(V) : 15 내지 25
    ② 아토목세틴 - Cone(V) : 10 내지 15, Collision(V) : 10 내지 15
    ③ 메만틴 - Cone(V) :15 내지 25, Collision(V) : 10 내지 25
    ④ 메만틴-D6 - Cone(V) :25 내지 35, Collision(V) : 10 내지 25
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