CN111693616A

CN111693616A - 液相色谱串联质谱测定血液样本中b族维生素的方法

Info

Publication number: CN111693616A
Application number: CN201911404417.3A
Authority: CN
Inventors: 汤赟; 陈平; 康圆; 白洁; 徐希平
Original assignee: Fulette Shenzhen Precision Nutrition Food Group Co ltd; AUSA PHARMED Ltd
Current assignee: Fulette Shenzhen Precision Nutrition Food Group Co ltd; AUSA PHARMED Ltd
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2020-09-22

Abstract

本发明提供一种同时检测血液样本中维生素含量的高效液相串联质谱测定方法，具体涉及到B族维生素含量的测定。本发明首次实现了应用高效液相串联质谱技术对血液样本中8种B族维生素同时检测的目的，减少了基质干扰，操作简便，灵敏度高，检测范围宽，检测成本低,能够有效监测人体内B族维生素的水平，对临床维生素合理补充提供了重要的指导意义。

Description

液相色谱串联质谱测定血液样本中B族维生素的方法

技术领域

本发明属于生物分析的技术领域，具体涉及到一种液相色谱串联质谱同时测定血液样本中8种B族维生素的方法。

背景技术

B族维生素是一类水溶性维生素，他们协同作用调节机体新陈代谢，维持皮肤和肌肉的健康，增进免疫系统和神经系统的功能调节，促进细胞生长和分裂，是体内新陈代谢的重要一环，参与关键的代谢活动，通常以辅酶形式存在。B族维生素也叫乙族维生素，是一组不同结构的化合物，主要包括维生素B1、维生素B2、维生素B6和维生素B9。

维生素B1又称硫胺素，由真菌、微生物和植物合成，动物和人类则只能从食物中获取，是碳水化合物代谢及能量代谢所必需的酶，硫胺素在维持脑内氧化代谢平衡方面，如脂质过氧化产物水平和谷胱甘肽还原酶活性方面发挥重要作用。

维生素B2又称核黄素，为体内黄酶类辅基的组成部分，当缺乏时，就影响机体的生物氧化，使代谢发生障碍。

维生素B6又称吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛、吡哆酸及吡哆胺，在体内以磷酸酯的形式存在，是一种水溶性维生素维生素B6人体内某些辅酶的组成成分，参与多种代谢反应，尤其是和氨基酸代谢有密切关系。

维生素B9，一般指叶酸。叶酸是一种水溶性维生素，参与遗传物质和蛋白质的代谢；影响动物繁殖性能；影响动物胰腺的分泌；促进动物的生长；提高机体免疫力。L-5-甲基四氢叶酸是血清中叶酸的主要存在形式，叶酸，需要由亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)还原5，l0-亚甲基四氢叶酸为L-5-甲基四氢叶酸。

目前，常用的B族维生素检测方法主要包括化学荧光法、微生物法、分光光度计法、酶联免疫分析法、毛细管电泳法和高效液相色谱法等。微生物法具有良好的灵敏度，不过它的特异性不够，无法区分检测多种维生素，只能检测单一的维生素。荧光法和分光光度计法的灵敏度不够，无法在生物样本中B族维生素的检测中应用。免疫法检测不具有特异性，不能够识别其他维生素衍生物，结果重现性较差，难以满足临床检测需求。毛细管电泳法作为经典电泳技术与现代微柱分离有机结合的新兴分离技术，因其具有高分离性能以及消耗试剂少等特点在药品中B族维生素含量测定中得到了广泛的应用，在保证高分离性能的前提下，较高的电压会导致谱带展宽，从而降低分离效率。因而其常规分析的灵敏度不能适应痕量组分分析的需求，这在一定程度上限制了它的应用与推广。高效液相色谱法由于色谱柱良好的分离作用，能够区分检测出多种维生素，中国专利文献CN104749266、CN107271588均采用该方法测定维生素功能饮料、复合维生素片及维生素营养强化米中多种水溶性维生素，但存在检测时间长、检测限高及生物基质较为复杂等问题，难以满足临床样品检测需求。在过去的十年中，液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)被证明是一种越来越吸引人的技术。该方法具有高灵敏度、高分辨率、低检测限及重现性好等优点，广泛用于临床生物样品检测。

专利CN105424854公开了一种同时检测血液样品多种维生素的方法，检测的维生素主要包括：维生素B1、维生素B2、维生素B3(烟酰胺)、维生素B5(泛酸)、维生素B6(吡哆醇)、维生素B7(生物素)、维生素B9(叶酸)、维生素B12(氰钴胺)和维生素C，该方法维生素B2、B6及B12保留时间极为相近，难以实现分离，相应的维生素B3、B5及B7也难以在该方法中得到有效分离。L-5-甲基四氢叶酸作为血清中叶酸的主要活性代谢形式在该方案中没有得到分离与检测。此外，专利CN110133126公开了同时检测血样中5种维生素的检测方法，检测的项目主要包括：维生素B1、B2、B6(吡哆醇)、维生素B9(L-5-甲基四氢叶酸)维生素B12(氰钴胺)，该方法中维生素检测的线性范围较窄，难以满足血样样本的检测需求。

目前的液相色谱串联质谱法能够实现对血液样品中多种B维生素的检测，但仍然存在分离度低、检测周期长，操作复杂，检测结果重现性差、难以区分检测多种B族维生素等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性强、灵敏度高的液相色谱串联质谱同时测定血液样品中8种B族维生素的方法，为人体临床营养素的补充及疾病的预防提供有益的参考。技术方案：

配制不同浓度的B族维生素标准工作溶液及其内标工作溶液，人体血液样本进行预处理，采用液相色谱串联质谱法对样本进行检测，将检测结果代入标准曲线，回算出血液样本中8种B族维生素的含量。

在本发明中，血液样品是血浆或血清，优选血浆。

在本发明中，8种维生素包括维生素B1(硫胺素)、维生素B2(核黄素)、维生素B6(吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛、4-吡哆酸)、维生素B9(叶酸、L-5-甲基四氢叶酸)。

进一步的讲，8种B族维生素混合标准工作溶液浓度分别为：硫胺素5-100ng/mL，核黄素0.6-100ng/mL，吡哆醇0.6-100ng/mL，吡哆胺0.6-100ng/mL，吡哆醛0.6-100ng/mL，4-吡哆酸0.6-100ng/mL，叶酸0.12-20ng/mL，L-5-甲基四氢叶酸0.6-100ng/mL。

在本发明中，内标化合物为¹³C₃-硫胺素，¹³C₄，¹⁵N₂-核黄素，D₃-吡哆醇，D₃-吡哆胺、D₃-吡哆醛、D₃-4-吡哆酸，¹³C₅-叶酸，¹³C₅-5-甲基四氢叶酸。

在本发明中，标准工作溶液的制备：

精密称量8种B族维生素，其中硫胺素、吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛、4-吡哆酸用0.1mol/L HCl溶液溶解，核黄素用0.2％醋酸水溶液(含1％抗坏血酸)溶解，叶酸用氢氧化钠的乙醇溶液(0.01mol/L；乙醇溶液(20％，v/v))溶解，L-5-甲基四氢叶酸用20mmol/L磷酸盐溶液(含1％抗坏血酸)溶解，定容稀释，得到8种B族维生素的储备液，浓度均为1mg/mL，然后用1％抗坏血酸水溶液将储备液逐级稀释，得到8种B族维生素的标准工作溶液。

在本发明中，内标工作溶液的制备：

用50％乙醇水溶液(含1％抗坏血酸)溶解内标化合物，得到¹³C₃-硫胺素，¹³C₄，¹⁵N₂-核黄素，D₃-吡哆醇，D₃-吡哆胺、D₃-吡哆醛、D₃-4-吡哆酸，¹³C₅-叶酸，¹³C₅-5-甲基四氢叶酸的储备液浓度分别为4μg/mL、20μg/mL、8μg/mL、32μg/mL、32μg/mL、8μg/mL、40μg/mL、160μg/mL，然后将内标储备液用1％抗坏血酸乙腈溶液稀释，得到内标工作溶液。

在本发明中，标准曲线的制备：

吸取标准工作溶液制备的8种B族维生素的标准工作溶液200μL，加入600μL内标工作溶液，涡旋混匀5min，14000rpm离心10min，取上清液700μL置于洁净的离心管内，室温氮气吹干，加入100μL 0.5％甲酸水溶液复溶，得到B族维生素的校正标样；将校正标样进行液相质谱分析，以各分析物与内标的峰面积比值为纵坐标，各分析物浓度为横坐标，用加权(W＝1/X2)最小二乘法进行线性回归，得到各分析物的标准曲线。

在本发明中，待测血液样本的预处理：

精密吸取200μL血液样本置于2.0mL的离心管中，加入600μL内标工作溶液，涡旋混匀5min，14000rpm离心10min，取上清液700μL置于洁净的离心管内，室温氮气吹干，加入100μL0.5％甲酸水溶液复溶，得到待测血液样本。

在本发明中，待测血液样本的检测：

将待测血液样本进行液相质谱检测，将检测结果代入标准曲线，回算出血液样本中B族维生素的浓度。

本发明专利中液相色谱串联质谱的检测条件：

液相色谱检测条件为：色谱柱为ACE C18-PFP(2.1mm×150mm，3μm)，流动相A为0.5％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸甲醇溶液，流速为0.2-0.4mL/min，柱温为40℃，进样体积为10μL，运行时间为8min，洗脱方式为梯度洗脱。梯度洗脱条件见表1；

表1：梯度洗脱条件

时间(min)	流速(mL/min)	流动相A(％)	流动相B(％)
				0.0	0.2	90	10
2.6	0.2	90	10
				2.9	0.4	5	95
6.0	0.4	5	95
				6.5	0.4	90	10
7.0	0.2	90	10

串联质谱条件为：正离子电喷雾离子化的多离子反应(MRM)监测模式，离子喷雾电压为5500v，离子源温度为650℃，气帘气(CUR)为25psi，碰撞气(CAD)为medium，离子源雾化气(GS1)为50psi，离子源加热辅助气(GS2)为50psi，设置MRM detection window为50sec；Target Scan Time为0.3sec，MRM质谱参数见表2；

表2：MRM质谱参数

本发明的有益效果：本发明建立了基于液相色谱串联质谱法对多种B族维生素进行分离的检测方法，以同位素标记物为内标物，使目标分析物的识别更为准确，可对体内多种B族维生素进行较为精准的定性定量测定。本发明步骤简便快速，检测效率高，分析检测时间仅需8min。本发明首次区分检测了血液样本中维生素B6中的4种化合物和维生素B9中的叶酸及其代谢物，方法灵敏度高，检测限低，能实现对特定离子对的选择，检测不受血浆中其他物质的干扰，对指导人体B族维生素的精准补充具有显著意义。与此同时，对血液样品中多种维生素进行检测能够减少血液需求量，极大地减低了血液储存及运输成本。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的B族维生素总离子流色谱图；

图2是本发明实施例1提供的硫胺素的离子色谱图；

图3是本发明实施例1提供的核黄素的离子色谱图；

图4是本发明实施例1提供的吡哆醇的离子色谱图；

图5是本发明实施例1提供的吡哆胺的离子色谱图；

图6是本发明实施例1提供的吡哆醛的离子色谱图；

图7是本发明实施例1提供的4-吡哆酸的离子色谱图；

图8是本发明实施例1提供的叶酸的离子色谱图；

图9是本发明实施例1提供的L-5-甲基四氢叶酸的离子色谱图；

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和具体实施方式对本发明实施例中的技术方案进行进一步详细完整的说明，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，并不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的说明。

实施例1：

1.仪器与试剂

液相色谱串联质谱仪(QTRAP 4500，美国AB SCIEX公司)，氮吹仪(MD-200-2，杭州奥盛仪器有限公司)，离心机(H1750R，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，其他试剂均为分析纯。

2.样品的前处理

标准溶液制备：精密称量10mg的硫胺素、核黄素、吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛、4-吡哆酸、叶酸、L-5-甲基四氢叶酸粉末，其中硫胺素、吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛、4-吡哆酸用0.1mol/L HCl溶液溶解，核黄素用0.2％醋酸水溶液(含1％抗坏血酸)溶解，叶酸用氢氧化钠的乙醇溶液(0.01mol/L；乙醇溶液(20％，v/v))溶解，L-5-甲基四氢叶酸用20mmol/L磷酸盐溶液(含1％抗坏血酸)溶解，将各分析物定容于10mL的棕色容量瓶中，得到浓度为1mg/mL的各储备溶液，精密吸取一定量的各个分析物的母液，用50％乙醇水溶液(含1％抗坏血酸)溶解稀释，配制成浓度分别为5、2、2、2、2、2、0.4、2μg/mL的混合标准工作液，然后用1％抗坏血酸水溶液将储备液逐级稀释，得到B族维生素的标准工作溶液(硫胺素：5、10、20、30、40、50、60、100ng/mL；核黄素：0.6、1.2、3、6、12、24、60、100ng/mL；吡哆醇：0.6、1.2、3、6、12、24、60、100ng/mL；吡哆胺：0.6、1.2、3、6、12、24、60、100ng/mL；吡哆醛：0.6、1.2、3、6、12、24、60、100ng/mL；4-吡哆酸：0.6、1.2、3、6、12、24、60、100ng/mL；叶酸：0.12、0.24、0.6、1.2、2.4、4.8、12、20ng/mL；L-5-甲基四氢叶酸：0.6、1.2、3、6、12、24、60、100ng/mL)，用2.0mL棕色离心管进行分装，置于-20℃备用。

内标溶液的制备：用50％乙醇水溶液(含1％抗坏血酸)溶解内标化合物，得到内标¹³C₃-硫胺素，¹³C₄，¹⁵N₂-核黄素，D₃-吡哆醇，D₃-吡哆胺、D₃-吡哆醛、D₃-4-吡哆酸，¹³C₅-叶酸，¹³C₅-L-5-甲基四氢叶酸的储备液浓度分别为4μg/mL、20μg/mL、8μg/mL、32μg/mL、32μg/mL、8μg/mL、40μg/mL、160μg/mL。分别吸取20μL8种B族维生素的内标储备液于10mL容量瓶中，用1％抗坏血酸乙腈稀释定容至刻度线，得到浓度分别为8ng/mL、40ng/mL、16ng/mL、64ng/mL、64ng/mL、16ng/mL、8ng/mL、32ng/mL的内标工作溶液。

待测血液样本的预处理：精密吸取200μL血液样本置于2.0mL的离心管中，加入600μL内标工作溶液，涡旋混匀5min，14000rpm离心10min，取上清液700μL置于洁净的离心管内，室温氮气吹干，加入100μL0.5％甲酸水溶液复溶，得到待测血液样本。

3.方法学验证

(1)专属性与选择性

精密吸取空白血浆200μL，加入600μL乙腈，按待测血样预处理方法进行处理，得到空白血浆样品；精密吸取取空白血浆200μL，加入600μL内标工作液，按待测血样预处理方法进行处理，得到含内标的空白血浆样品。其样品的接收标准：空白血浆样品的干扰组分的响应低于分析物定量下限响应的20％，并低于内标响应的5％。

在本方法检测条件下，各分析物内标的色谱均有保留，峰形良好，血浆内源性物质的响应低于各分析物定量下限响应的20％，并低于内标响应的5％，故不干扰各分析物内标的含量测定，可以满足血浆样品的快速分析。

(2)标准曲线与定量限

吸取步骤2中混合标准工作溶液200μL，加入600μL内标工作溶液，涡旋混匀，室温氮气吹干，加入100μL 0.5％甲酸水溶液复溶，得到校正标样。

以分析物与内标物的峰面积比值(Y)为纵坐标，分析物的浓度(X)为横坐标，用加权(W＝1/X²)最小二乘法进行回归，得到各分析物的线性回归方程，并以3倍信噪比(S/N)作为检出限，10倍信噪比(S/N)作为定量限，结果见表1。数据结果表明，各标准品在线性范围内，峰面积比值与浓度呈现良好的线性关系，相关系数R²>0.995，满足临床检测需求。

表1线性回归方程、线性范围及检出限

(3)精密度与回收率

分别取8种维生素的标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率和精密度实验，按本实例方法进行测定，重复分析测定3次，计算批内及批间精密度。结果如表2所示，各分析物3种浓度样品的批内、批间精密度均小于15％。B族维生素在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率如表3所示，均在85％-115％之间。

表2批内、批间精密度

表3加样回收率

(4)残留

方法验证明间，在测定完标准曲线定量上限样品浓度后测定空白血浆样品，以空白血浆样品和定量下限样品中各分析物、内标峰面积比值计算百分比。各分析物的峰面积平均为定最下限的峰面积的2.1％，不超过20％，内标的平均残留为0.7％，不超过5％。表明本检测方法的残留不影响维生素B1、维生素B2、维生素B6及维生素B9的含量测定。

综合上述验证试验，本发明实施例的回收率，检测限和精密度等各项指标均符合要求，可同时测定血样中8种B族维生素，重现性良好，且加样回收率良好，从而提高检测结果的准确度，可消除系统误差。

4.血液样品的液相串联质谱检测

采用液相色谱串联质谱的方法对步骤2中制备的待测血液样本进行检测，将检测结果代入步骤3所得标准曲线，回算出血液样本中B族维生素的含量，结果见表4，各B族维生素的离子色谱图见图2-9。

表4血液样本中B族维生素的含量

本检测方法能够同时检测出血液样本中8种B族维生素，定量限低至pg。本发明对维生素B6中的4种化合物进行了良好区分与精准定量，对维生素B9中叶酸和5-甲基四氢叶酸也进行区分与定量，为维生素缺乏人群提供更加精准的诊断，能够很好的应用于临床检测。本发明分析时间仅8min，效率高，日通量可达上百例。

显然，上述实例仅是为清楚说明本发明的具体实施方式，但并非是对实施方式的限定。所属领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实例，都应当属于本发明的保护范围。应当指出的是，对于本技术领域的技术人员在不脱离本发明原理及实质范围的前提下所做出的各种修改及润饰，都应在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种液相色谱串联质谱测定血液样本B族维生素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)溶液的制备：

精密称量硫胺素、吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛、4-吡哆酸、核黄素、叶酸、L-5-甲基四氢叶酸8种B族维生素，其中硫胺素、吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛、4-吡哆酸用0.1mol/L HCl溶液溶解，核黄素用0.2％醋酸水溶液(含1％抗坏血酸)溶解，叶酸用氢氧化钠的乙醇溶液(0.01mol/L；乙醇溶液(20％，v/v))溶解，L-5-甲基四氢叶酸用20mmol/L磷酸盐溶液(含1％抗坏血酸)溶解，定容稀释，得到8种B族维生素的储备液，浓度均为1mg/mL，然后用1％抗坏血酸水溶液将储备液逐级稀释，得到8种B族维生素的标准工作溶液；

用50％乙醇水溶液(含1％抗坏血酸)溶解内标化合物，得到¹³C₃-硫胺素、¹³C₄、¹⁵N₂-核黄素、D₃-吡哆醇、D₃-吡哆胺、D₃-吡哆醛、D₃-4-吡哆酸、¹³C₅-叶酸、¹³C₅-L-5-甲基四氢叶酸的储备液浓度分别为4μg/mL、20μg/mL、8μg/mL、32μg/mL、32μg/mL、8μg/mL、40μg/mL、160μg/mL，然后将内标储备液用1％抗坏血酸乙腈溶液稀释，得到内标工作溶液；

(2)标准曲线的制备：

吸取步骤(1)制备的8种B族维生素的标准工作溶液200μL，加入600μL内标工作溶液，涡旋混匀5min，14000rpm离心10min，取上清液700μL置于洁净的离心管内，室温氮气吹干，加入100μL 0.5％甲酸水溶液复溶，得到B族维生素的校正标样；将校正标样进行液相质谱分析，以各分析物与内标的峰面积比值为纵坐标，各分析物浓度为横坐标，用加权(W＝1/X²)最小二乘法进行线性回归，得到各分析物的标准曲线；

(3)液相色谱串联质谱法检测：

液相色谱条件包括：色谱柱为ACE C18-PFP(2.1mm×150mm，3μm)，流动相A为0.5％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸甲醇溶液；洗脱方式：洗脱梯度程序如下：0-2.6min 90％(v/v),2.9-6min 5％(v/v),6.5-7.0min 90％(v/v),分析时间为8min；柱温为40℃，进样体积为10μL，流速为0.2-0.4mL/min；

串联质谱条件包括：采用电喷雾离子源ESI，正离子模式扫描，选择反应监测模式，离子喷雾电压为5500v，离子源温度为650℃，气帘气压力：25psi，碰撞气流速为medium，离子源雾化气压力为50psi，离子源加热辅助气压力为50psi；

(4)待测血液样本的预处理：

精密吸取200μL血液样本置于2.0mL的离心管中，加入600μL内标工作溶液，涡旋混匀5min，14000rpm离心10min，取上清液700μL置于洁净的离心管内，室温氮气吹干，加入100μL0.5％甲酸水溶液复溶，得到待测血液样本；

(5)待测血液样本的检测：

将步骤(4)制备的待测血液样本进行液相质谱检测，将检测结果代入步骤(2)所得标准曲线，回算出血液样本中B族维生素的浓度。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中8种B族维生素工作液的浓度范围：硫胺素为5-100ng/mL，核黄素为0.6-100ng/mL，吡哆醇为0.6-100ng/mL，吡哆胺为0.6-100ng/mL，吡哆醛为0.6-100ng/mL，4-吡哆酸为0.6-100ng/mL，叶酸为0.12-20ng/mL，L-5-甲基四氢叶酸为0.6-100ng/mL。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的血液样本是血浆或血液。