CN117214350A

CN117214350A - 多形态叶酸总含量的检测方法及试剂盒

Info

Publication number: CN117214350A
Application number: CN202311477701.XA
Authority: CN
Inventors: 孟庆石; 冯潇慧; 饶正华; 刘宇; 冯胜楠; 王玉娇; 王芙蓉; 张正杰
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2023-11-08
Filing date: 2023-11-08
Publication date: 2023-12-12
Anticipated expiration: 2043-11-08
Also published as: CN117214350B

Abstract

本公开提供一种多形态叶酸总含量的检测方法及试剂盒。具体地，检测方法，包括：对待测样品进行衍生处理，得到衍生产物；其中，所述衍生处理的溶液包括甲醛和还原剂；对所述衍生产物进行预处理，得到预处理产物；利用液相色谱法或液相色谱‑质谱法，检测得到所述预处理产物对应的多形态叶酸总含量。本公开实施例提供的总叶酸定量方法使用灵活，操作简单、对标准品的依赖度低，灵敏度高，重现性好，定量准确度高。

Description

多形态叶酸总含量的检测方法及试剂盒

技术领域

本公开涉及检测技术领域，尤其涉及一种多形态叶酸总含量的检测方法及试剂盒。

背景技术

叶酸（Folate，Folic acid，简写FA）是由喋啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸残基组成的一类水溶性B族维生素，是人体生长发育必需的微量元素之一,在胚胎发育、人体生长、新陈代谢等过程中发挥重要作用。目前的检测方法存在误差大、成本高等问题，难以满足准确、低成本检测食品中的多形态叶酸总含量的需求。

发明内容

有鉴于此，本公开的目的在于提出一种多形态叶酸总含量的检测方法及试剂盒。

基于上述目的，本公开提供了一种多形态叶酸总含量的检测方法，包括：

对待测样品进行衍生处理，得到衍生产物；其中，所述衍生处理的溶液包括甲醛和还原剂；

对所述衍生产物进行预处理，得到预处理产物；

利用液相色谱法或液相色谱-质谱法，检测得到所述预处理产物对应的多形态叶酸总含量。

基于同一发明构思，本公开实施例还提供了一种叶酸化合物的检测方法，包括：

对所述衍生产物进行预处理，得到预处理产物；

利用液相色谱法或液相色谱-质谱法，检测得到所述预处理产物对应的叶酸化合物含量；其中，所述衍生产物选自第一产物或第二产物；其中，所述第一产物包括5-甲酰-10-甲基四氢叶酸、5-甲酰-10-甲基四氢叶酸聚谷氨酸中的至少一者，所述第二产物包括5-甲基-10-甲酰四氢叶酸、5-甲基-10-甲酰四氢叶酸聚谷氨酸中的至少一者。

基于同一发明构思，本公开实施例还提供了一种多形态叶酸总含量的检测试剂盒，所述检测试剂盒应用于前述多形态叶酸总含量的检测方法或前述叶酸化合物的检测方法；其中，所述检测试剂盒包括所述甲醛、所述还原剂和多形态叶酸的标准品。

从上面所述可以看出，本公开提供的多形态叶酸总含量的检测方法及试剂盒，通过甲醛和还原剂对待测样品进行衍生处理，经过衍生处理的多形态叶酸具有良好的稳定性，从而可以有效提高叶酸总含量的定量准确性；此外，衍生处理可以使多种叶酸化合物形成相同的衍生产物，从而有助于减少标准品的购买成本，进而降低利用液相色谱法或液相色谱-质谱法检测多形态叶酸总含量的成本，同时由于衍生产物稳定性的提升也可以提供标准品的使用期限，进一步降低标准品成本。

附图说明

为了更清楚地说明本公开或相关技术中的技术方案，下面将对实施例或相关技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1示出了本公开实施例提供的四氢叶酸衍生前后的稳定性比较图；

图2示出了本公开实施例提供的5,10-次甲基四氢叶酸衍生前后的稳定性比较图；

图3示出了本公开实施例提供的5,10-亚甲基四氢叶酸衍生前后的稳定性比较图;

图4A示出使用13C,D2-甲醛和氘代氰基硼氢化钠的组合重标衍生后的5-甲酰四氢叶酸示意图；

图4B示出使用13C,D2-甲醛和氘代氰基硼氢化钠的组合重标衍生后的5-甲基四氢叶酸示意图；

图4C示出使用13C,D2-甲醛和氘代氰基硼氢化钠的组合重标衍生后的10-甲酰四氢叶酸示意图。

具体实施方式

为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开进一步详细说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。需要说明的是，除非另外定义，本公开实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本公开实施例中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由...构成”、或“由...构成”。“连接”或者“相连”等类似的词语并非限定于物理的或者机械的连接，而是可以包括电性的连接，不管是直接的还是间接的。

本公开实施例所用的缩写具有它们的在化学和生物领域内的常规含义。根据化学领域中已知的标准化合价规则构建本文阐述的化学结构和化学式。

为了便于理解本公开的技术方案，下面对本公开涉及的一些技术术语进行介绍。

液相色谱法就是用液体作为流动相的色谱法。液相色谱法的分离机理是基于混合物中各组分对两相亲和力的差别。根据固定相的不同，液相色谱分为液固色谱、液液色谱和键合相色谱。其中，高效液相色谱是基于物质吸附作用的不同而实现分离；其固定相是一些具有吸附活性的物质如硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。

液相色谱-质谱法是用液相色谱法分离与用质谱法定性相联用的分析方法，被广泛应用于药物侦查、医学微生物学、食品安全分析、环境分析等领域的分析检测方法。

内标法（Internal Standard Method）是将一定重量的纯物质作为内标物加到一定量的被分析样品混合物中，然后对含有内标物的样品进行色谱分析，分别测定内标物和待测组分的峰面积（或峰高）及相对校正因子，按公式即可求出被测组分在样品中的百分含量。

外标法是与内标法相对，指按梯度添加一定量的标准品（对照品）于空白溶剂中制成对照样品，与未知试样平行地进行样品处理并检测。不同浓度的标准品进样，以峰面积为值绘制成标准曲线，从而推算出未知试样中被测组分浓度的定量方法。

通常自然界中存在的天然叶酸，主要包括叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5,10亚甲基-四氢叶酸，5,10次甲基-四氢叶酸，5-甲酰四氢叶酸、10-甲酰四氢叶酸等多种还原状态的衍生物，这些衍生物的苯甲酰谷氨酸部分还能结合不同数量的谷氨酸，形成多聚谷氨酸叶酸（n=1-8）。

现有检测叶酸方法主要包括微生物法、高效液相色谱法、气相色谱法和液质联用法。微生物测定法是最敏感，被广泛接受的食品叶酸测定法，但它对所有生物活性叶酸形式的反应略有不同，并且校准范围窄、分析周期长，且无法区分不同叶酸形式。色谱法测定叶酸通常是检测叶酸一种化合物，其他叶酸以及多谷氨酸化的叶酸检测较少。若想对多种还原状态的叶酸均进行检测，则需要分别使用对应的标准品进行定量分析，而现有国内外市售的标准品种类有限，且价格非常昂贵。

此外，色谱检测步骤主要包扣叶酸提取、提取物的净化和液相或液质检测。由于四氢叶酸、5,10亚甲基-四氢叶酸，5,10次甲基-四氢叶酸等叶酸在提取过程中容易发生氧化，如四氢叶酸在溶液中的半衰期仅有30分钟；同时5,10次甲基-四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸和10-甲酰四氢叶酸三者之前存在非酶促的相互转化，导致最终定量结果不准确。由于部分形式的叶酸不稳定导致配置标准品母液难以储存，进一步增加检测成本。

本公开的发明人发现将甲醛和氰基硼氢化钠与不同类型叶酸反应，通过以下三种反应路线，可以分别得到式1所示的5-甲基-10-甲基四氢叶酸，式2所示的5-甲酰-10-甲基四氢叶酸和式3所示的5-甲基-10-甲酰四氢叶酸三类化合物；其中谷氨酸的聚合度为1-8。

具体地，路线一、路线二、路线三分别如下所示：

路线一；

路线二；

路线三。

从路线一可以看出，叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5，10-亚甲基四氢叶酸和5,10-次甲基四氢叶酸均可通过反应产生5-甲基-10-甲基四氢叶酸。基于此，对以上6种化合物总量进行测定时，可以准备其中1种化合物作为制备衍生定量所需的标准品。这样的技术方案，可以有效减少标准品的种类，从而降低标准品成本。具体地，由于各叶酸化合物可以结合不同数量的谷氨酸，按照相关技术的检测方式，需要为各聚合度叶酸化合物分别设置标准。也就是说，上述6中化合物按照聚合度1-8计算，需要48种标准品，而采用本公开实施例的方法，则仅需准备8种标准品，即可实现对不同叶酸化合物不同聚合度的总含量进行检测。

进一步地，发明人进一步对四氢叶酸、5,10-次甲基四氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸衍生前后的稳定性进行了测试，其结果如图1~图3所示。

如图1所示，四氢叶酸衍生前在溶液中20分钟的相对含量就降至60%以下，40分钟后的相对含量就降至40%以下，四氢叶酸的衍生物5-甲基-10-甲基四氢叶酸在120分钟的相对含量仍保持在95%以上。显然，通过对四氢叶酸进行衍生得到稳定性高的衍生物，借助对衍生物的检测，有助于得到准确可靠的多形态叶酸总含量。

如图2所示，5,10-次甲基四氢叶酸衍生前在溶液中20分钟的相对含量就降至80%以下，40分钟后的相对含量就降至60%以下，5,10-次甲基四氢叶酸的衍生物5-甲基-10-甲基四氢叶酸，在120分钟的相对含量仍保持在95%以上。显然，通过对5,10-次甲基四氢叶酸进行衍生得到稳定性高的衍生物，借助对衍生物的检测，有助于得到准确可靠的多形态叶酸总含量。

如图3所示，5,10-亚甲基四氢叶酸衍生前在溶液中20分钟的相对含量就降至90%以下，40分钟后的相对含量就降至80%以下，5,10-次甲基四氢叶酸的衍生物5-甲基-10-甲基四氢叶酸，在120分钟的相对含量仍保持在95%以上。显然，通过对5,10-亚甲基四氢叶酸进行衍生得到稳定性高的衍生物，借助对衍生物的检测，有助于得到准确可靠的多形态叶酸总含量。

由此可见，利用甲醛和氰基硼氢化钠衍生四氢叶酸、5,10-次甲基四氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸，可以有效解决三者在提取过程中容易发生氧化不稳定的问题。此外，叶酸化合物的标准品经衍生也能够提高保存期限，从而有助于进一步降低检测成本。

同时，5,10次甲基-四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸和10-甲酰四氢叶酸分别衍生为式1~式3，可以避免三者之间的非酶促转化，为准确检测多形态叶酸总含量提供保障。特别是，利用该衍生方法，有助于分别准确检测包括5-甲酰四氢叶酸的5-甲酰叶酸类和包括10-甲酰四氢叶酸的10-甲酰叶酸类的具体含量。

综上，利用衍生溶液对多形态的叶酸化合物进行衍生，可以生成化学性质稳定的三类衍生产物，可以有效避免提取过程中叶酸化合物的相互转化、氧化和降解，有助于准确检测多形态叶酸总量。

鉴于此，本公开实施例提供的一种多形态叶酸总含量的检测方法及试剂盒，通过甲醛和还原剂对待测样品进行衍生处理，经过衍生处理的多形态叶酸具有良好的稳定性，从而可以有效提高叶酸总含量的定量准确性；此外，衍生处理可以使多种叶酸化合物形成相同的衍生产物，从而有助于减少标准品的购买成本，进而降低利用液相色谱法或液相色谱-质谱法检测多形态叶酸总含量的成本，同时由于衍生产物稳定性的提升也可以提供标准品的使用期限，进一步降低标准品成本。

需要说明的是，多形态叶酸包括叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸、5,10-次甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸和10-甲酰四氢叶酸及各自谷氨酸聚合物中的至少一者。这里，谷氨酸聚合物的聚合度可以是1~8。

本公开的发明人利用标准品，例如5-甲基四氢叶酸的谷氨酸聚合物进行实验，发现本公开实施例提供的衍生方法对于不同的聚合度的衍生效果类似，无明显差异。

第一方面，所述检测方法，包括：

（1）对待测样品进行衍生处理，得到衍生产物；其中，所述衍生处理的溶液包括甲醛和还原剂。需要说明的是，待测样品可以是食品、微生物、植物、动物等，本公开对此不作限定。这里，利用甲醛和还原剂能够实现对待测样品中的多态叶酸化合物进行衍生。可选地，所述还原剂是温和还原剂。这里，还原剂可以是硼氢化钠衍生物，例如三乙酰氧基硼氢化钠。

氰基硼氢化钠是温和还原剂，其可以对多形态叶酸的部分基团进行还原。在一些实施例中，还原剂可以选自氰基硼氢化钠和三乙酰氧基硼氢化钠中的至少一者。

在一些实施例中，所述衍生处理的溶液还包括醇溶剂；其中，所述醇溶剂选自甲醇、乙醇中的至少一者。这里，醇溶剂可以抑制样品中谷氨酸水解酶对多聚谷氨酸链的水解。需要说明的是，相比于乙醇，甲醇的衍生效率和抑制效率较高。

在一些实施例中，所述衍生处理的溶液为酸性溶液，例如在衍生溶液中添加适量的甲酸。需要说明的是，酸性溶液有助于氰基硼氢化钠对多形态叶酸的部分基团进行还原。当然，若采用其他还原剂，例如三乙酰氧基硼氢化钠，则无需限制衍生溶液的酸碱性。

在一些实施例中，所述衍生处理的溶液包括0.5~1.5%甲酸、15~50 mmol/L氰基硼氢化钠、0.1~0.5%甲醛和50~95%甲醇中的至少一者。这里，衍生处理的溶液还可以包括水，例如去离子水、超纯水等，用于调整体积。需要说明的是，上述%是指体积%。采用这样的衍生溶液，能够对待测样品中的各种叶酸化合物及各自的谷氨酸聚合物进行高效的衍生，衍生效率超过90%。需要说明的是，将氰基硼氢化钠替换为三乙酰氧基硼氢化钠，具有类似的衍生效果，不再赘述。

示例性的，0.5~1.5%甲酸具体可以是0.5%、0.7%、1.0%、1.2%、1.5%。

示例性的，15~50 mmol/L氰基硼氢化钠可以是15 mmol/L、20 mmol/L、25 mmol/L、30 mmol/L、35mmol/L、45 mmol/L、50 mmol/L。

示例性的，0.1~0.5%甲醛可以是0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%。

示例性的，50~95%甲醇可以是50%、60%、65%、72%、80%、88%、90%、95%。

在一些实施例中，所述衍生处理的条件包括：温度为0~37℃，时间为15~90分钟。可选地，温度为0~30℃。

示例性的，衍生温度可以是0~5℃、2~10℃、2~10℃、5~10℃、8~15℃、10~18℃、15~25℃、20~25℃、25~35℃、30~37℃。

示例性的，衍生时间可以是15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、55分钟、68分钟、78分钟、85分钟、90分钟。

在一些实施例中，所述待测样品的质量和所述衍生处理的溶液体积的比例为1:5~1:10；其中，质量单位是克，体积单位是毫升。

在一些实施例中，所述衍生产物包括式1~式3中的至少一者；

、/>、/>。

这里，n=1-8是指谷氨酸的数量，示例性的，式1中的n=2，表明谷氨酸聚合度为2的5-甲基-10-甲基四氢叶酸。需要说明的是，式1指代8种不同谷氨酸聚合度的5-甲基-10-甲基四氢叶酸中任一者或多者。式2指代8种不同谷氨酸聚合度的5-甲酰-10-甲基四氢叶酸中任一者或多者。式3指代8种不同谷氨酸聚合度的5-甲基-10-甲酰四氢叶酸中任一者或多者。

本领域技术人员应该理解的是，由于待测样品的自身的差异，可能不包括全部的多形态的叶酸，因此衍生产物包括式1，可以表示衍生产物包括8个不同聚合度的一者或多者，并不表明衍生产品包括式1所示的全部8中聚合物。需要说明的是，这里的式1仅是示例性，式2、式3同理，不再赘述。

应当理解的是，植物中的叶酸化合物中可以结合多个谷氨酸，而动物中的叶酸化合物通常结合单谷氨酸，而较少结合多个谷氨酸。

本公开实施例的技术方案，对于待测样品直接衍生处理得到稳定的衍生产品，从而可以在接下来的预处理过程中避免氧化、转化和降解，能够极大的提高叶酸总含量的检测准确性。

（2）对所述衍生产物进行预处理，得到预处理产物。

在一些实施例中，预处理包括：将所述衍生产物和缓冲液充分混匀，离心取上清液；以及对所述上清液除杂。可选地，将衍生产物和缓冲液充分混匀之前，还可以包括：在4~37℃对衍生结束的溶液进行真空旋转蒸发，以去除剩余的甲醇、甲酸和甲醛等。

示例性的，缓冲液可以是PBS缓冲液。离心的条件可以是6000~14000转/分钟，时间可以是5~10分钟。

可选地，对于沉淀物，可以采用50-100%乙腈溶液重复提取两次，合并上清之后进行上清液除杂。通过重复提取，可以提高衍生产物的提取效率，降低提取损耗。

可选地，缓冲液、50~100%乙腈的加入量可以与衍生溶液的体积相同，也可以是衍生溶液体积的0.8~2倍，例如0.8倍、1倍、1.5倍，2倍。

可选地，在缓冲液中加入终浓度1.5-5 U/毫升的淀粉酶，30-35℃酶切30-60分钟，然后进行离心取上清液。这样的方式，有助于去除待测样品中的淀粉。当然，也可以在上清液中加入淀粉酶进行酶切，本公开对此不做限定。

可选地，在缓冲液中加入终浓度1.5-5 U/毫升的蛋白酶，30-37℃酶切30-60分钟，然后进行离心取上清液。这样的方式，有助于去除待测样品中的蛋白。当然，也可以在上清液中加入蛋白酶进行酶切，本公开对此不做限定。

需要说明的是，上述淀粉酶、蛋白酶可以根据待测样品中的淀粉、蛋白含量来确定是否加入以及加入的量。本领域技术人员可以根据需要对加入的量进行合理选择，本公开对此不做限定。

在一些实施例中，预处理还可以包括利用谷氨酸切割酶，将衍生产物中的多谷氨酸形式的5-甲基-10-甲基四氢叶酸、5-甲酰-10-甲基四氢叶酸、5-甲基-10-甲酰四氢叶酸酶切成单谷氨酸形式的5-甲基-10-甲基四氢叶酸、5-甲酰-10-甲基四氢叶酸、5-甲基-10-甲酰四氢叶酸。通过这样的方式，能够进一步降低标准品的种类和购买成本。示例性的，经过谷氨酸切割酶的处理，仅需三种标准品就能够实现对多形态叶酸总含量进行准确的检测。这样的方式，特别适合针对植物样品的检测，可以极大的降低检测的成本。

可选地，谷氨酸切割试剂可以是猪血清，猪血清含有谷氨酸切割酶，能够将实现上述的衍生产物中的谷氨酸切割。

接下来，可以对上清液进行除杂。

在一些实施例中，除杂包括在低温（例如0~4℃）下10~30分钟进行蛋白沉淀，再次6000~14000 转/分钟离心5-10分钟，再次取上清液，以去除蛋白。可选地，这里的上清液可以直接转移至容量瓶进行定容。这里，通过蛋白沉淀，不仅可以去除样品本身的蛋白质，而且可以去除前述步骤加入的各种酶解物质，降低杂质对液质联用分析的干扰。

可选地，采用固相萃取柱对定容后的溶液进行净化，以去除溶液中的脂肪。本领域技术人员应当理解的是，若待测样品中的脂肪的含量不高，则无需对过柱。

需要说明的是，根据待测样品中的淀粉、蛋白、脂肪的含量，可以灵活选择对应的除杂步骤。例如，待测样品中的淀粉、蛋白、脂肪的含量均较高，可以依次使用淀粉酶、蛋白酶和固相萃取柱进行处理。

对待测样品中淀粉、蛋白质和脂肪含量不同，分别采用相应的预处理措施，可以以提高叶酸的回收率，减少液质联用分析时复杂基质的背景对定量结果的干扰。

（3）利用液相色谱法或液相色谱-质谱法，检测得到所述预处理产物对应的多形态叶酸总含量。

在一些实施例中，将1-10毫升已定容的溶液进行低温真空旋转蒸干，干燥后的样品复溶在0.1~1毫升30-100%甲醇，或乙腈中进行液相色谱法或液相色谱-质谱法检测。

可选地，采用多重离子检测模式进行定量分析，并可以使用外表法和同位素内标法对叶酸总量进行测定。

在一些实施例中，对多形态叶酸的标准品进行衍生处理，得到标准品衍生产物，通过比较已知浓度标准品的式1，式2和式3三类化合物的色谱峰面积和待测样品中对应化合物的峰面积，基于外标法可以确定式1、式2和式3三类化合物的含量，并累加计算出叶酸总含量。

需要说明的是，这里的标准品可以是5-甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸和10-甲酰叶酸及各自谷氨酸聚合物。当然，与5-甲基四氢叶酸具有相同衍生产物的叶酸化合物，可以替换所述5-甲基四氢叶酸及对应的谷氨酸聚合物。

在一些可替换实施例中，还可以基于内标法确定式1、式2和式3三类化合物的含量，并累加计算出叶酸总含量。同位素内标法可进一步提高检测结果的重现性和定量结果的准确性。

具体地，包括：对多形态叶酸的标准品进行衍生处理，得到标准品衍生产物，用于通过液相色谱-质谱法的内标法确定所述多形态叶酸总含量；其中，衍生处理所述标准品的甲醛和还原剂至少一者为同位素标记化合物。

可选地，所述同位素标记化合物选自13C,D2-甲醛、D2-甲醛、13C-甲醛和氘代氰基硼氢化钠中的至少一者。

在一些实施例中，将衍生溶液的甲醛换成13C,D2-甲醛，或D2-甲醛，或13C-甲醛，或将氰基硼氢化钠换成氘代氰基硼氢化钠，则衍生产物中部分H和/或12C变成D和/或13C,使同位素标记产物的分子量增加1-10 Da，该同位素产物通过质谱可以实现与未同位素标记产物的区分。

示例性的，当使用5-甲基四氢叶酸作为反应底物，使用13C,2D-甲醛和氘代氰基硼氢化钠的组合进行衍生时，结构如附图4B所示，分子量相对增加4 Da。当使用5-甲酰四氢叶酸、10-甲酰四氢叶酸分别作为反应底物，其结构分别如图4A和图4C所示。当使用叶酸作为反应底物，使用13C,2D-甲醛和氘代氰基硼氢化钠的组合进行衍生时，分子量相对增加10Da。当使用5-甲基四氢叶酸作为反应底物，使用13C甲醛和氰基硼氢化钠的组合进行衍生时，分子量相对增加1Da。

由于同位素标记和未标记产物的化学和物理性质相同，在质谱检测时具有相同的离子化行为，这样可以有效避免基质效应引起的定量误差，同时在提取过程中同位素标记和未标记产物具有相同的回收率，因此可以进一步提高定量准确性。可选地，本公开实施例的内标法的检测线可以达到1 ng/g。

此外，本公开实施例的提供的同位素标记来自于衍生试剂-甲醛或氰基硼氢化钠，相比于购买重标叶酸化合物提供同位素标记，极大的降低了检测成本，经济效益显著。

进一步的，本公开的发明人优化了碰撞电压，离子对信息等液相色谱-质谱联用仪的检测参数，以提高叶酸化合物检测灵敏和通用性。具体参数见表1，同位素标记化合物的母离子和子离子的m/z，和未标记化合物的提取离子和特征离子相比增加1-10 Da。

表1 液相色谱-质谱联用仪的部分检测参数

第二方面，本公开实施例还提供一种多形态叶酸总含量的检测试剂盒，所述检测试剂盒应用于前述任一多形态叶酸总含量的检测方法；其中，所述检测试剂盒包括所述甲醛、所述还原剂和多形态叶酸的标准品。

在一些实施例中，所述检测试剂盒还可以包括甲酸、甲醇中的一者或多者。

采用本公开实施例提供的检测试剂盒，可以直接对待测样品进行叶酸检测，无需单独购买检测试剂，具有节约检测时间、提高检测效率等优势。

避免样品提取过程中的叶酸的降解和相互转化，提高定量准确性。

采用本公开实施例的技术方案，至少具有以下优势：（1）避免样品提取过程中的叶酸的降解和相互转化，提高定量准确性；（2）减少对叶酸标准品种类的依赖，解决因标准品稳定差不能长期保存问题，解决10-甲酰四氢叶酸和其他多聚谷氨酸叶酸标准品难以获取且成本高的问题；（3）提高叶酸在淀粉、高蛋白和高脂肪样本中的回收率，减少基质效应，提高定量准确性；（4）建立液相色谱和液质联用质谱对未知样本中叶酸的定量方法，提高定量准确度、灵敏度和精度。综上所述，本公开的总叶酸定量方法使用灵活，操作简单、对标准品的依赖度低，灵敏度高，重现性好，定量准确度高。

为了使得本公开的技术方案更加清楚、易于理解，下面结合具体实施例，对本公开提供的多形态叶酸总含量的检测方法进行详细说明。

实施例1

使用外标法测定玉米粒中总叶酸含量

1.1、分别取1mg 5-甲基四氢叶酸，5-甲酰四氢叶酸和10-甲酰叶酸，溶解在1ml的100mM的碳酸钠溶液中（pH=9.0）得1mg/ml的标准品溶液；

1.2 分别取100 μl三种标准品溶液液，加入700 μl衍生溶液（1.5%甲酸+ 50毫摩尔/升的氰基硼氢化钠+0.5%甲醛+80%的甲醇）0℃衍生1.5小时；

1.3 衍生结束后使用低温真空旋干仪除去剩余的甲醛、甲酸和甲醇，并复溶在100μl的50%的甲醇中，得1mg/ml的定量标准品混合母液。使用该母液分别配置1 ng/ml，10 ng/ml，25 ng/ml，50 ng/ml，100 ng/ml的标准品梯度溶液，用于定量标准曲线的绘制；

1.4精确称量0.1克三种不同品种的富叶酸玉米样品，加入1毫升衍生溶液（1.5%甲酸+ 50毫摩尔/升的氰基硼氢化钠+0.5%甲醛+80%的甲醇），使用钢珠研磨仪充分研磨后，在0℃条件下衍生反应90分钟，衍生结束后在37℃的温度下使用真空浓缩旋干仪旋干。向干燥后的样品加入5毫升PBS提取液充分混匀后10分钟，用14000转/分钟离心5分钟收集上清液，沉淀再加入5毫升PBS提取液后超声10分钟，使用14000转/分钟离心10分钟收集并合并两次上清液。向上清液中加入终浓度为3U/ml的淀粉酶，37℃孵育1小时。向酶解液中加入100微升猪血清，37摄氏度孵育1小时，将多谷氨酸形式的叶酸酶切成单谷氨酸形式的叶酸。酶处理结束后向酶解液中加入等体积的乙腈溶液，在0-4℃冰箱保持5分钟进行沉淀以去除蛋白。再次14000 转/分钟离心10分钟，取上清液使用液相色谱-质谱联用仪使用外表定量技术进行分析，最终所测高叶酸玉米中叶酸总量为143~162 微克/100克。

其中，液质条件如下：Waters Xevo TQ高效液相色谱仪串联Sciex 6500三重四极杆-线性离子阱质谱仪分析叶酸衍生物定量。色谱柱：Luna omega polar C18 1.6µm(2.1×100 mm)；流动相A：水，加入0.1% 甲酸；流动相B：乙腈,加入0.1%甲酸；梯度设置：如表2所示。

表2洗脱梯度

三重四级杆质谱条件：选择MRM扫描模式进行数据采集。离子源：ESI;反吹气：30psi；离子源电压：5500 v；加热温度：500℃；裂解气：Medium；离子源气体：50kpa；碰撞能：28eV；去簇电压：110 eV；入口电压：10 V；碰撞室输出电压：13V。离子对信息如表3所示。

表3离子对信息

实施例2：使用内标法测定鸡蛋中总叶酸含量的样品前处理

2.1、分别取1mg 5-甲基四氢叶酸，5-甲酰四氢叶酸和10-甲酰叶酸，溶解在1ml的100mM的碳酸钠溶液中（pH=9.0）得1mg/ml的标准品溶液；

2.2 分别取 100 μl三种标准品工作液，加入700 μl重标衍生溶液（1%甲酸+ 25mM氘代氰基硼氢化钠+0.2% 13C,D2-甲醛+90%的甲醇），37℃衍生15分钟；

2.3 衍生结束后使用低温真空旋干仪除去剩余的甲醛、甲酸和甲醛，并复溶在100μl的50%的甲醇中，得1mg/ml的定量混合内标母液，用50%的乙腈稀释1000倍，得1ug/ml的混合定量内标工作液。

2.4精确称量1克充分搅拌的鸡蛋液，按照1:10的比例加入轻标衍生溶液（1%甲酸+25mM氰基硼氢化钠+0.2%甲醛+90%的甲醇），同时加入100微升2.3描述的定量内标工作液，37℃衍生15小时；

2.5 衍生结束后使用低温真空旋干仪除去剩余的甲醛、甲酸和甲醛，并使用5ml的PBS 缓冲液充分提取两次，合并两次提取上清液体。向上清加入等体积的纯乙腈并混分混合，在4℃的条件下静置1小时，8000转/分钟离心5分钟,收集上清并定容至50ml。取5ml已定容提取液，使用3ml SPE-EMR固相萃取柱净化出去脂质，收集穿透液并进行低温真空旋干。干燥后的样本复溶在1毫升50%的甲醇中，使用内标定量方法进行叶酸含量分析。根据实验结果鸡蛋中总叶酸的含量为120~180微克/100克。

其中，液质条件如下：TSQ Altis^™Plus 三重四极杆质谱仪分析叶酸衍生物定量。Agilent Eclipse Plus C18 RRHD 1.8 µm(2.1×100mm)；流动相A：水，加入0.1%甲酸；流动相B:乙腈加入0.1%甲酸；梯度设置：如表4所示。

表4洗脱梯度

三重四级杆质谱条件：超快的选择性反应监测（SRM）扫描模式进行数据采集，离子源：HSI；喷雾电压 (+) 3500；离子传输管温度350 ℃；鞘气压力25 arb；辅助气压力 8arb；离子源温度380 ℃；碰撞气压力2 mTorr。离子对信息如表5所示。

表5 离子对信息

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围（包括权利要求）被限于这些例子；在本公开的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本公开实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本公开实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本公开实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims

1.一种多形态叶酸总含量的检测方法，其特征在于，包括：

对所述衍生产物进行预处理，得到预处理产物；

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述衍生产物包括式1~式3中的至少一者；

、/>、/>。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述多形态叶酸包括叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸、5,10-次甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸和10-甲酰四氢叶酸及各自谷氨酸聚合物中的至少一者；和/或

所述还原剂选自氰基硼氢化钠和三乙酰氧基硼氢化钠中的至少一者。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述衍生处理的溶液为酸性溶液；和/或

所述衍生处理的溶液还包括醇溶剂；其中，所述醇溶剂选自甲醇、乙醇中的至少一者。

5. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述衍生处理的溶液包括0.5~1.5%甲酸、15~50 mmol/L氰基硼氢化钠、0.1~0.5%甲醛和50~95%甲醇中的至少一者；和/或

所述衍生处理的条件包括：温度为0~37℃，时间为15~90分钟。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品的质量和所述衍生处理的溶液体积的比例为1:5~1:10；其中，质量单位是克，体积单位是毫升。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，还包括：

对多形态叶酸的标准品进行衍生处理，得到标准品衍生产物，用于通过液相色谱-质谱法的外标法或内标法确定所述多形态叶酸总含量；其中，

若采用内标法确定所述多形态叶酸总含量，则衍生处理所述标准品的甲醛和还原剂至少一者为同位素标记化合物。

8. 根据权利要求1或7所述的检测方法，其特征在于，所述同位素标记化合物选自13C,D2-甲醛、D2-甲醛、13C-甲醛和氘代氰基硼氢化钠中的至少一者；和/或

多形态叶酸的标准品包括5-甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸和10-甲酰叶酸；和/或

所述预处理包括：

将所述衍生产物和缓冲液充分混匀，离心取上清液；以及

对所述上清液除杂。

9.一种叶酸化合物的检测方法，其特征在于，包括：

对所述衍生产物进行预处理，得到预处理产物；

10.一种多形态叶酸总含量的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒应用于权利要求1~8任一项所述的多形态叶酸总含量的检测方法或权利要求9所述的叶酸化合物的检测方法；其中，所述检测试剂盒包括所述甲醛、所述还原剂和多形态叶酸的标准品。