CN115436540A - 一种同时测定血液中叶酸和同型半胱氨酸含量的方法及试剂盒 - Google Patents

一种同时测定血液中叶酸和同型半胱氨酸含量的方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN115436540A
CN115436540A CN202211176098.7A CN202211176098A CN115436540A CN 115436540 A CN115436540 A CN 115436540A CN 202211176098 A CN202211176098 A CN 202211176098A CN 115436540 A CN115436540 A CN 115436540A
Authority
CN
China
Prior art keywords
homocysteine
extraction
blood
folic acid
acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211176098.7A
Other languages
English (en)
Inventor
苏昭仑
张颖
李丹
贺瑞坤
张旭光
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BY Health Co Ltd
Original Assignee
BY Health Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BY Health Co Ltd filed Critical BY Health Co Ltd
Priority to CN202211176098.7A priority Critical patent/CN115436540A/zh
Publication of CN115436540A publication Critical patent/CN115436540A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/60—Construction of the column
    • G01N30/6052—Construction of the column body
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N2030/042—Standards
    • G01N2030/045—Standards internal
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/062—Preparation extracting sample from raw material

Abstract

本发明提供一种同时测定血液中叶酸和同型半胱氨酸含量的试剂盒，包括提取试剂；所述的提取试剂中包括：抗坏血酸、柠檬酸、氨水，二硫苏糖醇。通过本发明的试剂盒进行叶酸和Hcy含量测定，与现有技术相比，省去了繁琐的检测前处理，且能同时测定，即能达到准确测定血液中叶酸和同型半胱氨酸，该检测方法简单、快速、准确、检测成本低。

Description

一种同时测定血液中叶酸和同型半胱氨酸含量的方法及试 剂盒
技术领域
本发明属于血液检测领域，具体涉及一种同时测定干血斑中叶酸和同型半胱氨酸含量的方法和检测系统。
背景技术
同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是一种含硫氨基酸，它是蛋氨酸代谢的中间产物。随着Hcy体内代谢途径的确立，国内外学者围绕高Hcy与冠心病、周围血管疾病及脑血管疾病等多种疾病的关系进行了大量研究，认为血Hcy水平升高可导致并加重心衰，且其作用机制与冠心病无关，是对心肌的直接损害，是导致并加重心衰的独立危险因子。同时Hcy与神经管缺陷、肾病、老年痴呆症等多种疾病有关。血浆中约75％的Hcy与白蛋白结合，为结合态的Hcy，部分以二硫键结合的Hcy-Hcy、Hcy-半胱氨酸化合物形式存在，只有1％-2％以还原态Hcy存在于血浆中。
叶酸与Hcy的代谢过程紧密相关。国内外研究均显示，补充叶酸可以降低血Hcy水平。叶酸(folic acid)也称蝶酰谷氨酸，是一种核酸、胸苷酸、神经递质、磷脂以及激素合成必不可少的一种水溶性维生素，在体内作为一碳单位的载体，参与各种代谢反应，是细胞生长和繁殖所必需的物质。临床可用于预防神经管畸形，还可用于治疗慢性萎缩性胃炎、抑制支气管鳞状转化及防治高同型半胱氨酸血症引起的冠状动脉硬化症、心肌损伤与心肌梗塞等。研究表明叶酸还能抑制肿瘤细胞中癌基因的表达，从而阻断恶性肿瘤的进展，但有研究认为过量摄入叶酸可能会增加发生乳腺癌的风险。
目前常用的检测人体的叶酸和Hcy是采用血浆检测，血浆样本需要冷链运输，途中十分不便。目前叶酸和Hcy的检测主要有微生物测定法、放射免疫测定法、色谱分析法、液相色谱-质谱联用法等，这些方法在专属性、灵敏度等方面都存在一定的局限性，且样品用量比较大。按照现有技术，全血样本需处理成血清才能完成检测，否则叶酸的检测干扰较大，检测方法前处理步骤比较繁琐，检测时间长，检测成本高，难以适用于大样本的人群的疾病诊断和健康监测需要。
对于全血样本，同时检测叶酸和Hcy存在较大的技术难题，全血样本基质比血浆和血清复杂，基质干扰严重，叶酸无法准确定量，叶酸需要通过净化步骤，而且提取试剂中Hcy的稳定性很差，在较短时间内，大部分的Hcy已降解，严重影响检测结果的准确性，需要开发合适浓度的稳定剂，攻克这两大难题才能准确检测全血样本中叶酸和Hcy的含量。
发明内容
本发明基于干血斑技术，使用高效液相色谱-三重四极杆质谱联用(HPLC-MS/MS)建立了一种灵敏度高、重现性好、分析速度快，新型的同时测定叶酸和Hcy含量的方法。因此快速准确定量全血中叶酸和Hcy含量，可为大样本的人群的疾病的预防、诊断及治疗提供依据。
一方面，本发明提供了一种同时提取血液中叶酸和同型半胱氨酸的提取试剂。
所述的提取试剂中包括：抗坏血酸、柠檬酸、氨水、二硫苏糖醇。
所述的提取试剂的配制方法为：称取抗坏血酸，柠檬酸，加入水和氨水，溶解混匀后稀释，再加入二硫苏糖醇，溶解混匀，即得。
优选地，所述的提取试剂的配制方法为：称取10mg抗坏血酸，10mg柠檬酸，加入9.5mL水和0.5mL氨水，溶解混匀后，移取0.22mL，加入4.78mL水，加入215mg二硫苏糖醇，溶解混匀，即得提取试剂。
另一方面，本发明提供了一种提取试剂在制备同时提取血液中叶酸和同型半胱氨酸的提取试剂盒中的应用。
所述的提取试剂中包括：抗坏血酸、柠檬酸、氨水、二硫苏糖醇。
所述的提取试剂的配制方法为：称取抗坏血酸，柠檬酸，加入水和氨水，溶解混匀后稀释，再加入二硫苏糖醇，溶解混匀，即得。
优选地，所述的提取试剂的配制方法为：称取10mg抗坏血酸，10mg柠檬酸，加入9.5mL水和0.5mL氨水，溶解混匀后，移取0.22mL，加入4.78mL水，加入215mg二硫苏糖醇，溶解混匀，即得提取试剂。
再一方面，本发明提供了一种同时提取血液样本中叶酸和同型半胱氨酸的提取试剂盒。
所述的提取试剂盒中包括提取试剂；所述的提取试剂中包括：抗坏血酸、柠檬酸、氨水、二硫苏糖醇。
所述的提取试剂的配制方法为：称取抗坏血酸，柠檬酸，加入水和氨水，溶解混匀后稀释，再加入二硫苏糖醇，溶解混匀，即得。
优选地，所述的提取试剂的配制方法为：称取10mg抗坏血酸，10mg柠檬酸，加入9.5mL水和0.5mL氨水，溶解混匀后，移取0.22mL，加入4.78mL水，加入215mg二硫苏糖醇，溶解混匀，即得提取试剂。
又一方面，本发明提供了一种同时提取血液样本中叶酸和同型半胱氨酸的方法。
所述血液样本为干血斑血液样本。
所述的方法中包括：干血斑血液样本放入30kDa的离心过滤装置，加入提取试剂，涡旋提取约30S，避光静置15min，然后涡旋混匀约30S，再1000r/min、2000r/min、4000r/min、10000r/min逐步提高转速，每个转速各离心2min即得提取液。
所述的提取试剂中包括：抗坏血酸、柠檬酸、氨水、二硫苏糖醇。
所述的提取试剂的配制方法为：称取抗坏血酸，柠檬酸，加入水和氨水，溶解混匀后稀释，再加入二硫苏糖醇，溶解混匀，即得。
优选地，所述的提取试剂的配制方法为：称取10mg抗坏血酸，10mg柠檬酸，加入9.5mL水和0.5mL氨水，溶解混匀后，移取0.22mL，加入4.78mL水，加入215mg二硫苏糖醇，溶解混匀，即得提取试剂。
又一方面，本发明提供了前述提取试剂在制备同时测定血液中叶酸和同型半胱氨酸的检测试剂盒中的应用。
所述的试剂盒中包括前述的提取试剂。
所述检测试剂盒中还包括提同位素内标试剂。
所述的同位素内标试剂为同型半胱氨酸-D8同位素内标和叶酸-13C5,15N同位素内标。
所述的检测试剂盒中还包括高效液相色谱试剂；所述的高效液相色谱试剂包括0.1％甲酸水溶液、0.1％甲酸乙腈溶液。
所述的高效液相色谱的液相条件为色谱柱：Waters，HSS T3，100×2.1mm，2.5μm；柱温：40℃；进样体积：10μL；流速：0.25mL/min；流动相：A为0.1％甲酸水溶液，B为0.1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱。
所述的试剂盒为高效液相色谱-质谱联用试剂盒。
所述的质谱为MRM模式。
所述的试剂盒用于检测干血斑血液样本。
又一方面，本发明提供了一种同时测定血液样本中叶酸和同型半胱氨酸含量的检测试剂盒。
所述的试剂盒中包括前述的提取试剂。
所述检测试剂盒中还包括提同位素内标试剂。
所述的同位素内标试剂为同型半胱氨酸-D8同位素内标和叶酸-13C5,15N同位素内标。
所述的检测试剂盒中还包括高效液相色谱试剂；所述的高效液相色谱试剂包括0.1％甲酸水溶液、0.1％甲酸乙腈溶液。
所述的高效液相色谱的液相条件为色谱柱：Waters，HSS T3，100×2.1mm，2.5μm；柱温：40℃；进样体积：10μL；流速：0.25mL/min；流动相：A为0.1％甲酸水溶液，B为0.1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱。
所述的试剂盒为高效液相色谱-质谱联用试剂盒。
所述的质谱为MRM模式。
所述的试剂盒用于检测干血斑血液样本。
又一方面，本发明提供了一种同时测定血液样本中叶酸和同型半胱氨酸含量的检测方法。
所述的方法可以对血液或干血斑样本进行检测。
所述的血液样本需要先制备成干血斑样本进行检测。
所述检测包括如下步骤，将干血斑血液样本放入30kDa的离心过滤装置，加入提取试剂，涡旋提取约30S，避光静置15min，然后涡旋混匀约30S，再1000r/min、2000r/min、4000r/min、10000r/min逐步提高转速，每个转速各离心2min即得提取液；
所述提取液通过高效液相色谱—质谱联用分析，采用内标法定量；
所述分析中高效液相色谱的色谱条件为色谱柱：Waters，HSS T3，100×2.1mm，2.5μm；柱温：40℃；进样体积：10μL；流速：0.25mL/min；流动相：A为0.1％甲酸水溶液，B为0.1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱。
所述的质谱为MRM模式。
所述的提取试剂为前述的提取试剂。
叶酸和同型半胱氨酸含量的检测可以用于预判疾病的患病风险，但现有技术并未表明二者的检测结果能够直接用于疾病诊断，因此本申请的检测方法适用于大样本人群的健康监测及患病风险评估。
本发明的有益效果：
通过本发明的试剂盒进行叶酸和Hcy含量测定，与现有技术相比，省去了繁琐的检测前处理，且能同时测定，即能达到准确测定血液中叶酸和同型半胱氨酸，该检测方法简单、快速、准确、检测成本低。
附图说明
图1为文献方法的全血样本的色谱图。
图2为本发明的全血样本的色谱图。
图3为叶酸空白色谱图。
图4为同型半胱氨酸空白色谱图。
图5为叶酸对照色谱图。
图6为同型半胱氨酸对照色谱图。
图7为叶酸内标标准工作曲线。
图8为同型半胱氨酸内标标准工作曲线。
图9为干血斑中叶酸检出限。
图10为干血斑中同型半胱氨酸检出限。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1一种同时测定血液中叶酸和Hcy含量的方法
1、仪器
液相色谱-质谱联用仪：LC-30A型液相色谱仪(SHIMADZU，日本)串联QTRAP 4500型质谱仪(AB SCIEX，美国)；
XSE205DU型电子天平(Mettler Toledo，瑞士)。
2、试剂
试剂：一级用水；乙腈(LC-MS)；甲酸(LC-MS)；氨水(20-22％，LC-MS)；1,4-二硫苏糖醇(HPLC)；抗坏血酸(ACS)；柠檬酸(HPLC)。
对照品：
Figure BDA0003864445150000061
提取溶液：称取10mg抗坏血酸，10mg柠檬酸，加入9.5mL水和0.5mL氨水，溶解混匀后，移取0.22mL，加入4.78mL水，加入215mg二硫苏糖醇，溶解混匀，即得提取试剂。
0.1％甲酸水溶液：500mL水，加入0.5mL甲酸，混匀。
0.1％甲酸乙腈溶液：500mL乙腈，加入0.5mL甲酸，混匀。
3、分析方法
3.1仪器条件与参数
3.1.1液相条件
色谱柱：Waters，HSS T3，100×2.1mm，2.5μm；
柱温：40℃；
进样体积：10μL；
流速：0.25mL/min；
流动相：A为0.1％甲酸水溶液，B为0.1％甲酸乙腈溶液，按下表梯度洗脱：
Figure BDA0003864445150000062
Figure BDA0003864445150000071
3.1.2质谱条件
MRM模式：
CUR CAD IS TEM GS1 GS2 EP CXP
20 Medium 5500 450 50 50 10 10
Figure BDA0003864445150000072
*：定量离子对。
3.2对照品溶液的配制
3.2.1同位素内标溶液的配制
称取叶酸-13C5,15N同位素内标约1mg，置于10mL容量瓶中，加少量水和1μL氨水，超声溶解，加水定容，混匀，即得叶酸-13C5,15N同位素内标的储备标准液(100μg/mL)。
称取同型半胱氨酸-D8同位素内标约1mg，置于进样小瓶中，加入约10mg二硫苏糖醇，精密加入1mL水，超声溶解，混匀，即得同型半胱氨酸-D8同位素内标的储备标准液(1mg/mL)。
精密移取叶酸同位素内标的储备标准液10μL，置于10mL容量瓶中，加水定容，摇匀，即得叶酸-13C5,15N同位素内标的工作标准液(100ng/mL)。
精密移取同型半胱氨酸-D8同位素内标的储备标准液10μL，置于5mL容量瓶中，加入约50mg二硫苏糖醇，加水溶解定容，摇匀，即得同型半胱氨酸-D8同位素内标的工作标准液(2000ng/mL)。
精密移取叶酸同位素内标的工作标准液200μL，同型半胱氨酸-D8同位素内标的工作标准液200μL，提取溶液3.60mL，混匀，即得含同位素内标的提取溶液。
3.2.2标准溶液的配制
精密称取叶酸对照品10.86mg，置于500mL容量瓶中，加少量水和10μL氨水，超声溶解，加水定容，混匀，即得叶酸的储备标准液(21.46μg/mL)。
精密称取同型半胱氨酸对照品5.14mg，置于进样小瓶中，加入约10mg二硫苏糖醇，精密加入1mL水，超声溶解，混匀，即得同型半胱氨酸的储备标准液(5.14mg/mL)。
精密移取叶酸的储备标准液20μL，同型半胱氨酸的储备标准液40μL，置于50mL容量瓶中，加水定容，摇匀，即得叶酸和同型半胱氨酸的中间标准液(8.58ng/mL、4112ng/mL)。
分别精密移取适量中间标准液，置进样小瓶中，加提取试剂，加叶酸同位素内标的工作标准液，加同型半胱氨酸-D8同位素内标的工作标准液，混匀，即得工作标准液，见下表。可根据仪器响应和实际情况配制适当浓度的工作标准液。
Figure BDA0003864445150000081
3.3标准工作曲线绘制
精密吸取工作标准液10μL，注入液相色谱-质谱联用仪，建立内标法标准曲线方程。
3.4供试品制备
精密移取血液20μL滴于卡片固定的斑点范围内，避光干燥约3h制成干血斑卡片。用剪刀剪下干血斑卡片样本上2个斑点(相当于40μL血液)，放入30kDa的离心过滤装置(Amicon Ultra-0.5)中，精密加入200μL含同位素内标的提取溶液，涡旋提取约30S，避光静置15min，然后涡旋混匀约30S，再1000r/min、2000r/min、4000r/min、10000r/min逐步提高转速，每个转速各离心2min，即得试样溶液。精密吸取试样溶液10μL注入液相色谱-质谱联用仪，测定叶酸和同型半胱氨酸含量。
3.5结果计算：
通过包含样品稀释倍数的标准曲线方程，直接得出血液中叶酸和同型半胱氨酸的含量。
或者通过不包含样品稀释倍数的标准曲线方程，用以下公式计算得出血液中叶酸和同型半胱氨酸的含量：
Figure BDA0003864445150000091
式中：
X—试样中叶酸(同型半胱氨酸)的含量，ng/mL；
C—试样溶液中叶酸(同型半胱氨酸)的浓度，ng/mL；
M—试样的体积，μL；
V—试样稀释的体积，μL；
K—单位转换系数，K＝1。
4、方法学验证
4.1方法优化试验
4.1.1提取试剂净化的优化
全血样本基质比血浆和血清复杂，叶酸需要通过净化步骤才能准确检测，因此，净化步骤尤为关键。按照现有技术(专利号202110609367.3)的提取步骤，含0.1mol/L盐酸的5％异丙醇与20％三氯乙酸还有含有15μg/mL二硫苏糖醇的混合液处理全血样本，和本发明的提取步骤处理的提取试剂的色谱图做对比。文献方法的全血样本的色谱图如图1；本发明的全血样本的色谱图如图2。现有技术的全血样本的色谱图，基质干扰严重，叶酸无法准确定量，而本发明通过净化步骤后，无基质干扰，叶酸能准确定量。
4.1.2提取试剂中Hcy稳定剂的优化
全血样本基质比血浆和血清复杂，提取试剂中Hcy的稳定性很差，在较短时间内，大部分的Hcy已降解，严重影响检测结果的准确性，需要开发合适浓度的稳定剂。
按照现有技术方法的15μg/mL二硫苏糖醇(DTT)，无法使全血样本提取试剂的Hcy稳定，本发明试验了不同浓度的DTT，提取试剂在室温放置后，测定Hcy的峰面积。
Figure BDA0003864445150000101
根据上表得本发明优选的43mg/mL浓度的DTT，全血样本提取试剂的Hcy稳定最稳定。
4.1.3离心过滤装置和离心转速的优化
用于超滤的离心过滤装置，有不同的截留规格，选取合适的截留规格对于样本的净化效果尤为重要。本发明试验了3-100kDa截留规格超滤的离心过滤装置。全血样本基质复杂，3kDa和10kDa的离心过滤装置，滤液很难通过，滤液的得率较低；50kDa和100kDa的离心过滤装置，滤液的净化效果较差。
离心过滤装置的使用转速对于滤液的净化效果也有较大的影响。本发明试验了1000-10000r/min的离心转速。全血样本基质复杂，1000-4000r/min转速，滤液的得率较低；5000-10000r/min的转速，离心过滤装置的超滤膜会破，导致净化失败。
不同的离心装置和不同的离心转速所得的提取试剂，测定叶酸的峰面积。
Figure BDA0003864445150000102
根据上表得本发明优选了30kDa的离心过滤装置，兼顾了滤液的得率和滤液的净化效果；本发明优选了1000r/min、2000r/min、4000r/min、10000r/min逐步提高转速，解决了滤液得率低和超滤膜破损的问题。
4.1.4提取试剂成分的优化
提取试剂的成分的选择对于叶酸和Hcy同时提取的提取效率和提取试剂的稳定性影响较大，因此，选择合适的提取试剂尤为重要。本发明试验了抗坏血酸、BHT、柠檬酸、三氯乙酸、氨水、碳酸钠、二硫苏糖醇、巯基乙醇等试剂的配比。
不同成分配比所得的提取试剂，测定叶酸和Hcy的峰面积。
Figure BDA0003864445150000111
根据上表得本发明优选了抗坏血酸、柠檬酸、氨水、二硫苏糖醇，兼顾了叶酸和Hcy的得率，且提取试剂稳定性好。
4.2专属性试验(空白)
4.2.1试验方法
不加样品，按3.4试样制备方法处理空白，按3.1条件测定空白，与叶酸和同型半胱氨酸工作标准液的出峰时间对比。
4.2.2试验结果
见图3-6。图3为叶酸空白色谱图；图4为同型半胱氨酸空白色谱图；图5为叶酸对照色谱图；图6为同型半胱氨酸对照色谱图。
4.2.3试验结论：
空白在叶酸和同型半胱氨酸的出峰时间处均无峰，表明空白对测定结果基本无干扰。
4.3线性范围确认
4.3.1标准工作曲线图
绘制内标标准工作曲线如图7-8所示。
4.3.2线性试验结论
线性评价：叶酸、同型半胱氨酸相关系数R分别为0.99941、0.99974，所以用该方法测定叶酸、同型半胱氨酸呈现良好的线性。
4.4检出限和定量限
分析方法的检出限DL和定量限QL由信噪比(S/N)计算。DL定义为S/N＝3时对应的待分析浓度，QL定义为S/N＝10时对应的待分析浓度。结果见图9-10，干血斑中叶酸检出限为：0.17ng/mL，定量限为：0.53ng/mL。
干血斑中同型半胱氨酸：检出限为：9.5ng/mL，定量限为：29ng/mL。
4.5精密度试验
4.5.1试验方法
取12份样品，按3.4试样制备方法处理样品，测定样品叶酸、同型半胱氨酸含量，计算其RSD(％)。
4.5.2试验数据(见下表)【试验样品为：干血斑】
Figure BDA0003864445150000121
4.5.3试验结论
样品中叶酸、同型半胱氨酸含量的日内RSD为7.2％、1.1％，日间RSD为5.2％、3.5％，表明该方法有较好的精密度。
4.6耐用性试验(稳定性)
4.6.1干血斑卡稳定性试验：
4.6.1.1试验方法：
按5.4试样制备方法处理样品，干血斑卡片放入铝箔袋中密封，分别在室温、4℃、-20℃下放置0天、3天、6天、20天后，按3.1条件检测样品含量，绘制含量趋势图。
4.5.1.2试验数据：
Figure BDA0003864445150000131
4.6.1.3试验结论
干血斑卡片分别在室温、4℃、-20℃下放置0天、5天、10天、20天后，叶酸、同型半胱氨酸含量稳定性良好，表明干血斑卡片的叶酸、同型半胱氨酸在室温、4℃、-20℃的环境下20天内稳定性良好。
4.6.2样品溶液稳定性试验：
4.6.2.1试验方法：
将叶酸和同型半胱氨酸供试品溶液分别在室温下放置0h、1h、2h、4h、6h、8h后，按5.1条件测定浓度，计算其RSD(％)。
4.6.2.2试验数据：
Figure BDA0003864445150000132
4.6.2.3试验结论
叶酸和同型半胱氨酸供试品溶液分别在室温下放置0h、1h、2h、4h、6h、8h后，叶酸和同型半胱氨酸浓度的RSD为5.9％、1.3％，表明叶酸和同型半胱氨酸供试品溶液在室温下8小时内的稳定性良好。
4.7准确度试验(回收率)
4.7.1试验方法
加标：精密移取血液适量的样品9份，分别精密加入叶酸和同型半胱氨酸标准液。按3.4试样制备方法处理样品。
4.7.2试验数据如下【试验样品为：干血斑】
回收率试验结果表
Figure BDA0003864445150000141
Figure BDA0003864445150000142
回收率(％)＝(测得值-本底值)/加标值×100％。
4.7.3试验结论
叶酸和同型半胱氨酸平均回收率分别为：92.3％、100.9％，RSD分别为6.3％、3.0％；表明该方法有较好的回收率，证明准确度良好。
对比例1文献方法与本发明干血斑测定(DBS-LC-MS)的方法对比试验
1、文献方法
同型半胱氨酸文献检测方法：用打孔器取3mm直径的DBS样本2片至96孔深孔板中，加入20μL 3.7μmol/L的homocystine-D8内标工作液、20μL500mmol/L还原剂(DTT)，振荡2min，常温下静置15min。homocystine-D8经DTT还原二硫键后，成为单体氘代标记同型半胱氨酸Hcy-D4。加入400μL的萃取剂(含体积分数为0.1％的FA、体积分数为0.05％的TFA的乙腈溶液)，振荡2min，以4000r/min的速度离心5min，吸取70μL上清液至96孔进样板中，用LC-MS/MS检测。
叶酸文献检测方法：待测血样100μL+20μL内标(10ng/mL)+300μL溶剂A，旋涡震荡2分钟。Oasis MAXμElution SPE流程：根据方案提取预处理后的标准品或血浆样品，洗脱液直接在SPE的正压装置上吹干大约15min后用80μL溶剂B(含抗坏血酸、柠檬酸和巯基乙醇各100μg/mL，加2％甲酸)复溶，然后在96孔板的恒温震荡仪上摇匀1min后进LC-MS/MS分析。
2、对比试验结果
名称 同型半胱氨酸 叶酸
单位 ng/mL ng/mL
文献方法 522.8 0.9509
本发明方法 510.3 0.9456
相对偏差％ 2.5 0.6
3、试验结论
通过对文献方法和本发明DBS-LC-MS方法测定血液中叶酸和同型半胱氨酸的含量的对比，两个方法的结果相对偏差＜5％，证明通过干血斑测定血液中叶酸和同型半胱氨酸的方法，准确度良好。

Claims (13)

1.一种同时提取血液中叶酸和同型半胱氨酸的提取试剂，其特征在于，包括：抗坏血酸、柠檬酸、氨水、二硫苏糖醇。
2.根据权利要求1所述的提取试剂，其特征在于，配制方法为：称取抗坏血酸，柠檬酸，加入水和氨水，溶解混匀后稀释，再加入二硫苏糖醇，溶解混匀，即得。
3.根据权利要求2所述的提取试剂，其特征在于，配制方法为：称取10mg抗坏血酸，10mg柠檬酸，加入9.5mL水和0.5mL氨水，溶解混匀后，移取0.22mL，加入4.78mL水，加入215mg二硫苏糖醇，溶解混匀，即得。
4.权利要求1-3任一项所述的提取试剂在制备同时提取血液中叶酸和同型半胱氨酸的提取试剂盒中的应用。
5.一种同时提取血液中叶酸和同型半胱氨酸的提取试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的提取试剂。
6.一种同时提取血液中叶酸和同型半胱氨酸的提取方法，其特征在于，将干血斑样本放入30kDa的离心过滤装置，加入提取试剂，涡旋提取约30S，避光静置15min，然后涡旋混匀约30S，再1000r/min、2000r/min、4000r/min、10000r/min逐步提高转速，每个转速各离心2min即得提取液。
7.如根据权利要求6所述的提取方法，其特征在于，所述提取试剂为权利要求1-3任一项所述的提取试剂。
8.权利要求1-3任一项所述的提取试剂在制备同时测定血液中叶酸和同型半胱氨酸的检测试剂盒中的应用。
9.一种同时测定血液中叶酸和同型半胱氨酸含量的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的提取试剂。
10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括同位素内标试剂；所述的同位素内标为同型半胱氨酸-D8同位素内标和叶酸-13C5,15N同位素内标。
11.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括高效液相色谱试剂；所述的高效液相色谱试剂包括0.1％甲酸水溶液、0.1％甲酸乙腈溶液。
12.一种同时测定血液中叶酸和同型半胱氨酸含量的检测方法，其特征在于，将干血斑血液样本放入30kDa的离心过滤装置，加入提取试剂，涡旋提取约30S，避光静置15min，然后涡旋混匀约30S，再1000r/min、2000r/min、4000r/min、10000r/min逐步提高转速，每个转速各离心2min即得提取液；所述提取液通过高效液相色谱—质谱联用分析，采用内标法定量；所述分析中高效液相色谱的色谱条件为色谱柱：Waters，HSS T3，100×2.1mm，2.5μm；柱温：40℃；进样体积：10μL；流速：0.25mL/min；流动相：A为0.1％甲酸水溶液，B为0.1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的提取试剂为权利要求1-3任一项所述的提取试剂。
CN202211176098.7A 2022-09-26 2022-09-26 一种同时测定血液中叶酸和同型半胱氨酸含量的方法及试剂盒 Pending CN115436540A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211176098.7A CN115436540A (zh) 2022-09-26 2022-09-26 一种同时测定血液中叶酸和同型半胱氨酸含量的方法及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211176098.7A CN115436540A (zh) 2022-09-26 2022-09-26 一种同时测定血液中叶酸和同型半胱氨酸含量的方法及试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115436540A true CN115436540A (zh) 2022-12-06

Family

ID=84249861

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211176098.7A Pending CN115436540A (zh) 2022-09-26 2022-09-26 一种同时测定血液中叶酸和同型半胱氨酸含量的方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115436540A (zh)

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998044351A1 (de) * 1997-03-27 1998-10-08 Reiner Probst Aufbereitung von blutproben für die homocystein- und/oder folatbestimmung
CN103748469A (zh) * 2011-06-16 2014-04-23 贝勒研究院 使用lc-ms/ms进行来自血浆分离装置（psd）的血浆中总高半胱氨酸和甲基丙二酸的分析
CN104111337A (zh) * 2014-05-07 2014-10-22 山东博科生物产业有限公司 抗干扰性强的同型半胱氨酸检测试剂盒
CN106442836A (zh) * 2016-10-09 2017-02-22 辽宁润生康泰生物医药科技有限公司 一种用于检测血浆中叶酸与含硫氨基酸含量的方法
CN106434847A (zh) * 2016-04-18 2017-02-22 北京中科唯新生物医学研究所有限公司 一种检测亚甲基四氢叶酸还原酶酶活性的试剂盒
CN110146628A (zh) * 2019-06-18 2019-08-20 上海可力梅塔生物医药科技有限公司 一种高效液相色谱串质谱技术检测血斑中叶酸的试剂盒
CN110146626A (zh) * 2019-06-18 2019-08-20 上海可力梅塔生物医药科技有限公司 一种高效液相色谱串质谱联用技术测定血斑中叶酸的方法
CN110967231A (zh) * 2019-11-22 2020-04-07 北京振东康远制药有限公司 一种叶酸含量的检测方法
CN112834677A (zh) * 2020-12-31 2021-05-25 质谱生物科技有限公司 一种同时检测同型半胱氨酸及其代谢相关物质的方法
CN113009033A (zh) * 2021-03-02 2021-06-22 广东南芯医疗科技有限公司 一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒及检测方法
CN114755354A (zh) * 2022-04-29 2022-07-15 北京豪思生物科技股份有限公司 一种检测叶酸的试剂盒以及全血样本中叶酸的检测方法
CN114935619A (zh) * 2022-06-13 2022-08-23 苏州帕诺米克生物科技有限公司 检测水溶性维生素的方法和试剂盒

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998044351A1 (de) * 1997-03-27 1998-10-08 Reiner Probst Aufbereitung von blutproben für die homocystein- und/oder folatbestimmung
CN103748469A (zh) * 2011-06-16 2014-04-23 贝勒研究院 使用lc-ms/ms进行来自血浆分离装置（psd）的血浆中总高半胱氨酸和甲基丙二酸的分析
CN104111337A (zh) * 2014-05-07 2014-10-22 山东博科生物产业有限公司 抗干扰性强的同型半胱氨酸检测试剂盒
CN106434847A (zh) * 2016-04-18 2017-02-22 北京中科唯新生物医学研究所有限公司 一种检测亚甲基四氢叶酸还原酶酶活性的试剂盒
CN106442836A (zh) * 2016-10-09 2017-02-22 辽宁润生康泰生物医药科技有限公司 一种用于检测血浆中叶酸与含硫氨基酸含量的方法
CN110146628A (zh) * 2019-06-18 2019-08-20 上海可力梅塔生物医药科技有限公司 一种高效液相色谱串质谱技术检测血斑中叶酸的试剂盒
CN110146626A (zh) * 2019-06-18 2019-08-20 上海可力梅塔生物医药科技有限公司 一种高效液相色谱串质谱联用技术测定血斑中叶酸的方法
CN110967231A (zh) * 2019-11-22 2020-04-07 北京振东康远制药有限公司 一种叶酸含量的检测方法
CN112834677A (zh) * 2020-12-31 2021-05-25 质谱生物科技有限公司 一种同时检测同型半胱氨酸及其代谢相关物质的方法
CN113009033A (zh) * 2021-03-02 2021-06-22 广东南芯医疗科技有限公司 一种测试人体叶酸代谢衍生物的液相串联质谱检测试剂盒及检测方法
CN114755354A (zh) * 2022-04-29 2022-07-15 北京豪思生物科技股份有限公司 一种检测叶酸的试剂盒以及全血样本中叶酸的检测方法
CN114935619A (zh) * 2022-06-13 2022-08-23 苏州帕诺米克生物科技有限公司 检测水溶性维生素的方法和试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111175394A (zh) 一种液相色谱串联质谱检测血浆儿茶酚胺及其代谢物的方法
Koike et al. Fluorescent analysis of α-keto acids in serum and urine by high-performance liquid chromatography
CN113533555B (zh) 一种高效液相色谱串联质谱检测全血中免疫抑制剂的检测试剂盒及其检测方法
Jenčo et al. Recent trends in determination of thiamine and its derivatives in clinical practice
CN111505132A (zh) 液相色谱串联质谱检测新型心血管疾病风险标志物的方法
CN105954453A (zh) 一种同时定量检测烟酸、烟酰胺和泛酸的试剂盒
CN115980248A (zh) 检测甲氨蝶呤、叶酸、5-甲酰四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸的试剂套装
Nelson et al. Affinity extraction combined with stable isotope dilution LC/MS for the determination of 5-methyltetrahydrofolate in human plasma
CN115902048A (zh) 甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的方法
CN116148387A (zh) 一种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法及试剂盒
Chou et al. High performance liquid chromatography with fluorimetric detection for the determination of total homocysteine in human plasma: method and clinical applications
Şentürk et al. Analytical methods for determination of selective serotonin reuptake inhibitor antidepressants
CN111693616A (zh) 液相色谱串联质谱测定血液样本中b族维生素的方法
CN108414643B (zh) 一种冷鲜鸡中生物胺的液相色谱-三重四级杆质谱检测方法
Li et al. Improved and simplified LC–ESI-MS/MS method for homocysteine determination in human plasma: Application to the study of cardiovascular diseases
CN113917007A (zh) 检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒及测试方法
CN117250288A (zh) 一种血浆中儿茶酚胺代谢物的检测方法和应用
CN110333308B (zh) 一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中nnal和可替宁的方法
CN115436540A (zh) 一种同时测定血液中叶酸和同型半胱氨酸含量的方法及试剂盒
CN112362765B (zh) 一种多塞平及其代谢产物n-去甲多塞平固相萃取、检测方法及试剂盒
CN112611814B (zh) 一种干血片中1,5-脱水葡萄糖醇的测定方法
CN113820424A (zh) 一种同时测定人血浆中14种抗抑郁药浓度的hplc-ms/ms方法
CN112964808A (zh) 一种生物体液总同型半胱氨酸检测试剂盒和检测方法
CN108490086B (zh) 利用液相色谱-离子淌度差分质谱联用技术定量分析福大赛因同分异构体的方法
CN112964814A (zh) 一种生物体液总同型半胱氨酸的检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination