WO1998044351A1 - Aufbereitung von blutproben für die homocystein- und/oder folatbestimmung - Google Patents

Aufbereitung von blutproben für die homocystein- und/oder folatbestimmung Download PDF

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Abstract

Offenbart wird ein Verfahren und ein Blutabnahmegefäß zur Aufbereitung von Blutproben für die Homocystein- und/oder Gesamt-Folat-Bestimmung, dadurch gekennzeichnet, daß man die Blutprobe mit: (a) wenigstens einem Reagenz zur Lyse der Blutzellen, (b) wenigstens einem Inhibitor der Homocystein-bildenden und -abbauenden Enzyme und gegebenenfalls mit (c) wenigstens einer Säure in Verbindung bringt.

Description

AUFBEREITUNG VON BLUTPROBEN FÜR DIE HOMOCYSTEIN- UND/ODER FOLATBESΗMMUNG
5 Beschreibung
Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und ein 0 Blutabnahmegefäß zur Aufbereitung von Blutproben für die Homocystein- und/oder Gesamt-Folatbestimmung. Unter "Aufbereitung" wird hier insbesondere die Stabilisierung der Blutproben für die Homocysteinbestimmung und die Lyse der Erythrocyten zur Vorbereitung der Gesamt- 5 FolatbeStimmung verstanden. Unter "Gesamt-Folat " wird im Zusammenhang mit dieser Erfindung die Summe von Erythrocyten- und Plasma-Folat verstanden.
Stand der Technik 0
Homocystein, eine schwefelhaltige Aminosäure, kommt im Organismus nur als Zwischenprodukt im Methionin-Cystein- Glutathion-Stoffwechsel-Kreislauf vor und wird nicht in Proteine eingebaut. Durch verschiedene erbliche Defekte der
25 Schlüsselenzyme Cystathionin-ß-Synthetase und Methylen-
Tetrahydrofolat-Reduktase (MTHFR) bzw. durch einen Mangel an entsprechenden Vitamin-Kofaktoren (B12, B6 , Folat) wird Homocystein nicht ausreichend abgebaut und tritt somit in erhöhten Konzentrationen im Plasma auf (K. Berg et al . ,
30 Clin. Genet. (1992) 41:315-321; P. Goyette et al . , Am. J. Hum. Genet. (1995) 56:1052-1059). Zahlreiche klinische Studien der letzten Jahre konnten diese Hyper- Homocysteinämie als einen vom Lipidstoffwechsel unabhängigen Risikofaktor für atherosklerotische
35 Erkrankungen und deren thromboembolische Folgen erkennen. 30-40% der Patienten, die frühzeitig einen Herzinfarkt (R. Clarke et al . , N. Engl . J. Med. (1991) 324: 1149-1154) oder einen Apoplex (B. Israelsεon et al . , Scand. J. Clin. Lab. Invest. (1993) 53: 465-469) erleiden, an Angina pectoris oder peripherer arterieller Verschlußkrankheit (L. Brattström et al . , Atherosclerosis (1990) 81: 51-60) erkranken, weisen einen erhöhten Homocysteinspiegel auf.
Die Prävalenz des homozygoten MTHFR-Defektes, der mit einem erhöhten Homocystein-Spiegel einhergeht, wird mit 5% (Goyette et al . , loc.cit) angegeben, dies liegt in der Größenordnung der Prävalenz von Diabetes mellitus in der kaukasischen Gesamtpopulation.
Die Messung von Homocystein erfolgt derzeit mit Hilfe der HPLC (Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie) aus EDTA- Plasma und kann mit guter Genauigkeit durchgeführt werden. Es ist jedoch notwendig, die Präanalytik der
Homocysteinbestimmung zu optimieren, da die in vitro Freisetzung dieser Aminosäure aus den Blutzellen, welche auch nach der Blutabnahme im Abnahmegef ß weiter Homocystein produzieren und dieses durch einen aktiven Transportprozess aus den Zellen freisetzen, die Bestimmung im Plasma stark verfälschen kann. Bisher mußte man dazu sofort nach der Blutabnahme die Zellen durch Zentrifugation vom Plasma trennen. Die Homocystein-Konzentration im Plasma ist dann mindestens 48 Stunden stabil (T. Fiskerεtrand et al., Clin. Chem. (1993) 39/2: 263-271). Dieses aufwendige Procedere kann jedoch im gängigen Stationsbetrieb bzw. vom niedergelassenen Arzt nicht routinemäßig durchgeführt werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher in einem Teilaspekt das Problem der Vermeidung einer signifikanten Homocysteinerhöhung im Vollblut zugrunde, die natürlicherweise innerhalb von ein bis zwei Stunden nach der venösen Blutabnahme auftritt (Figur 1) . Durch die vorliegende Erfindung kann die bisher notwendige, zeitkritische Abtrennung der Blutzellen vom Plasma vermieden und die Stabilisierung der Homocystein- Konzentration im resultierenden lysierten Blut über 48 Stunden erreicht werden.
Es ist bereits bekannt, Blutproben durch Zusatz bestimmter Reagenzien (NaF, EDTA, Citrat) vor Gerinnung zu schützen und gegen enzymatische Abbauprozesse zu stabilisieren. Durch die Verwendung dieser Reagenzien in gängigen Blutabnahmegefäßen wird aber keine Stabilisierung der Homocystein-Konzentration erreicht, da diese Enzyminhibitoren nicht in die Blutzellen aufgenommen werden und somit eine intrazelluläre Inhibition des Homocystein- bildenden Enzymes nicht erreicht werden kann (Figur 1) . Der derzeit gültige Grenzwert von 15 μmol/1 (K. Rasmussen et al . , Clin. Chem. (1996) 42:4 630-636), oberhalb welchem das Atherosklerose-Risiko signifikant ansteigt, wird daher innerhalb von 2 Stunden bereits überschritten bzw. von Proben mit sehr niedriger Ausgangskonzentration nahezu erreicht. Dies geht aus Figur 1 hervor, die den signifikanten Anstieg unterschiedlicher Homocystein- Ausgangskonzentrationen im NaF- und EDTA-behandelten Blut bei Raumtemperatur und bei 4°C zeigt. Dieser Anstieg kann innerhalb von 6 Stunden bis zu 100% betragen.
Wie oben angegeben, korreliert die Homocystein- Konzentration häufig invers mit der Folatkonzentration, da Folat ein Kofaktor für das Homocystein-abbauende Enzym MTHFR ist. Deshalb wird häufig Folat gegeben, um eine pathologisch erhöhte Homocystein-Konzentration wieder in den Normalbereich zu bringen. Eine Bestimmung des basalen und aktuellen Folatspiegels neben dem Homocysteinspiegel ist daher diagnostisch sinnvoll. Da Folat hauptsächlich (ca. 98 %) in den Erythrocyten vorliegt und wirkt, ist die Bestimmung des Erythrocyten-Folats bzw. des Gesamt-Folats aussagekräftiger als die übliche Bestimmung des Plasma- bzw. Serum-Folats . Der vorliegenden Erfindung liegt daher das weitere Problem zugrunde, eine Blutprobe so aufzubereiten, daß die Gesamt-Folat-Konzentration ohne weiteres neben oder anstelle der Homocystein-Konzentration bestimmt werden kann.
Darstellung der Erfindung
Erfindungsgemäß werden die obigen Aufgaben gelöst durch ein Verfahren zur Aufbereitung von Blutproben für die Homocystein- und/oder Gesamt-Folat-Bestimmung, bei dem man die Blutprobe während oder unmittelbar nach der Blutentnahme mit a) wenigstens einem Reagenz zur Lyse der Blutzellen und b) wenigstens einem Inhibitor der Homocystein-bildenden und -abbauenden Enzyme in Verbindung bringt. Besonders bevorzugt wird die Blutprobe außerdem mit c) einer oder mehreren Säuren in Verbindung gebracht .
Des weiteren richtet sich die Erfindung auf ein Blutabnahmegefäß zur Aufbereitung von Blutproben, insbesondere für die Homocystein- und/oder Gesamt-Folat- Bestimmung, enthaltend a) wenigstens ein Reagenz zur Lyse der Blutzellen und b) wenigstens einen Inhibitor der Homocystein-bildenden und -abbauenden Enzyme und vorzugsweise außerdem c) eine oder mehrere Säuren.
Bevorzugte weitere Ausführungsfor en sind Gegenstand der Unteransprüche .
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Fig. 1 zeigt den zeitlichen Verlauf der Homocystein- Konzentration in Blutabnahmegefäßen nach dem Stand der Technik. Fig. 2 zeigt den zeitlichen Verlauf der Homocystein- Konzentration in Blutabnahmegefäßen gemäß der vorliegenden Erfindung.
Fig. 3 zeigt die Korrelation der Plasma- und Lysat- Homocystein-Konzentrationen .
Bester Weg zur Ausführung der Erfindung
Das Reagenz zur Lyse der Blutzellen a) kann insbesondere ein Detergens sein, aber auch z.B. Ascorbinsäure. Verwendbar ist ein anionisches Detergens, z.B. Natriumdodecylsulfat (SDS) , aber bevorzugt wird ein nichtionisches Detergens verwendet, z.B. Nonidet P40 (Octylphenol-Ethylenoxid-Kondensat mit durchschnittlich 9 mol Ethylenoxid pro mol Phenol) oder Triton X. Als besonders praktisch haben sich flüssige Detergenzien erwiesen. Besonders bevorzugt wird das Detergens unverdünnt, wie vom Hersteller geliefert, verwendet. Mischungen von zwei oder mehr Detergenzien können ebenfalls verwendet werden.
Als Inhibitor der Homocystein-bildenden und -abbauenden Enzyme b) kommen vor allem Reagenzien in Frage, die Chelatkomplexe mit Calcium bilden. Hierzu gehören u.a. Citrate und andere Chelatbildner, z.B. Di- oder Polycarbonsäuren, Aminocarbonsäuren oder Phosphonocarbonsäuren und deren Salze, insbesondere die Alkalisalze. Bevorzugt ist Ethylendiamintetraessigsäure- Dinatriumsalz (EDTA) , das besonders bevorzugt in Form einer hochkonzentrierten wäßrigen Lösung knapp unterhalb der Sättigungsgrenze verwendet wird.
Erfolgt die Lyse der Blutzellen mit Hilfe eines hochkonzentrierten Detergens unter gleichzeitiger
Inhibition der freigesetzten Enzyme durch EDTA sofort nach der Blutabnahme, verhindert dies das Ansteigen der Homocystein-Konzentration. Allerdings wurde in diesem Fall eine Abnahme der Homocystein-Konzentration um ca. 10% im Verlaufe von 24 Stunden beobachtet, die das Ergebnis ebenfalls etwas verfälscht.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß auch diese geringfügige Verfälschung durch die Zugabe einer Säure, insbesondere einer Säure, die eine Absenkung des pH-Wertes um mindestens 2 Einheiten bewirkt, verhindert werden kann. Als solche Säuren kommen u.a. Ascorbinsäure, Essigsäure, Salzsäure und bevorzugt Zitronensäure in Frage. Letztere wird besonders bevorzugt als hochkonzentrierte wäßrige Lösung eingesetzt. In einer Kombination von Nonidet P40 und EDTA führt die Zitronensäure zu einer nahezu perfekten Stabilisierung der Homocystein-Konzentration im Lysat über 48 Stunden (Figur 2) . Im Rahmen der analytischen Intra- Assay-Impräzision konnte weder ein Anstieg noch ein Abfall der Homocystein-Konzentrationen festgestellt werden. Figur 2 zeigt den Zeitverlauf verschieden hoher Homocystein- Konzentrationen im stabilisierten Lysat über 48 Stunden. Es zeigte sich, daß diese Konzentrationen innerhalb von ±2% konstant blieben.
Zusätzlich kann aus derselben Probe im erfindungsgemäßen Blutabnahmegefäß mit einem Immuno-Assay-System (z.B. Fa.
Sanofi Diagnostics Pasteur) die Gesamt-Folat-Konzentration bestimmt werden. Aus Beispiel 2 wird ersichtlich, daß die Gesamt-Folat-Konzentrationen, die im direkt während der Abnahme stabilisierten Lysat gemessen wurden, vergleichbar mit den Folat-Konzentrationen sind, die herkömmlicherweise im Labor nach Einbringen eines Aliquot eines EDTA- Vollblutes in vorgelegtes Lysereagenz gemessen wurden. Der Zeitpunkt der Lyse des Vollbluts wirkt sich also nicht auf die Gesamt-Folat-Konzentration aus. Nach dem Stand der Technik war aber in der Regel die Abnahme zweier Blutproben erforderlich, um sowohl die Homocystein- als auch die Gesamt-Folat-Konzentration zu bestimmen, weil die Homocystein-Probe sofort zentrifugiert werden mußte. Hier schafft die vorliegende Erfindung eine Erleichterung für Arzt und Patienten.
Die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens und
Blutabnahmegefäßes zur Probenaufbereitung für gängige HPLC- Analysenmethoden, ohne diese modifizieren zu müssen, erleichtert dem Analytiker im Labor eine verläßliche Werte- Interpretation, da eine falsche präanalytische Behandlung der Proben (zu lange Standdauer des Vollblutes) ausgeschlossen werden kann. Des weiteren kann die sofortige Zentrifugation des Probenmaterials, die auf klinischen Stationen bzw. bei niedergelassenen Ärzten meist nicht möglich ist, entfallen.
Die Bestimmung falsch hoher Homocystein-Werte im Labor, welche ggf . Folgekosten durch weiterführende Untersuchungen nach sich ziehen bzw. den Patienten verunsichern, wird somit ausgeschlossen. Bei der hohen Prävalenz (5% bei MTHFR-Defekt) von pathologisch erhöhten Plasma-Homocystein- Konzentrationen in der kaukasischen Gesamtpopulation und der Möglichkeit einer einfachen Behandlung dieses Risikofaktors mit Folsäure ist mit einem hohen Probenaufkommen zu rechnen (J. B. Ubbink et al . , Am. J. Clin. Nutr. (1993) 57:47-53). Die Vermeidung der
Notwendigkeit einer aufwendigen und störanfälligen Präanalytik (zeitkritische Zentrifugation) könnte so hohe Folgekosten im Gesundheitswesen sparen.
Besonders bevorzugt werden die Reagenzien in handelsüblichen Blutabnahmegefäßen, z.B. einer Monovette® (Fa. Sarstedt) oder einem Vacutainer® (Fa. Becton Dickinson) , vorgelegt. Bereits im Handel erhältlich sind z.B. Monovetten® mit EDTA-, NaF-, Heparin- u.a. Füllungen. Es ist ohne weiteres möglich, einen entsprechenden Behälter mit den erfindungsgemäßen Reagenzien zu befüllen, so daß ein erfindungsgemäßes Blutabnahmegefäß zur Verfügung gestellt wird. Der Probenbehälter kann z.B. aus Polyethylen oder einem anderen geeigneten Kunststoff bestehen und in der Form einer Spritze vorliegen. Mit Hilfe eines Stempels wird das Blut aus der Vene durch Erzeugung eines Unterdrucks über eine Injektionsnadel in das
Blutabnahmegefäß überführt. Alternativ kann ein vorevakuiertes Gefäß mit Injektionsnadel verwendet werden. Unter "Blutabnahmegefäß" im Sinne der Erfindung wird auch ein Kapillarblutentnahmesystem, z.B. eine Glaskapillare, in Kombination mit einem Gefäß verstanden, in dem das
Kapillarblut bis zur Aufarbeitung zur Messung aufbewahrt wird. Solche Systeme sind bereits auf dem Markt. Die erfindungsgemäße Reagenzienkombination liegt in diesem Fall gewöhnlich im Aufbewahrungsgefäß dieses Kapillarblutentnahmesystems vor.
Die bevorzugte Kombination Nonidet P40, EDTA und Zitronensäure ist auch dadurch vorteilhaft, daß sie aus preiswerten Komponenten besteht, die einzeln bereits im klinisch-chemischen Bereich verwendet werden. Die
Reagenzien sind in ihrer Kombination bei Raumtemperatur stabil und behalten ihre Wirkung.
Um die Korrelation der Homocystein-Konzentrationen von Lysat- und Plasmaproben zu überprüfen, wurden diese parallel vermessen. Die Homocystein-Konzentrationen im Lysat sind erwartungsgemäß niedriger, da die Homocystein- Konzentration in den Blutzellen, verglichen mit dem gleichen Plasma-Volumen, niedriger ist. Jedoch kann eine sehr gute Korrelation zwischen Plasma- und Lysat-
Homocystein-Konzentrationen gefunden werden (Figur 3 , R2 = 0.92). Dies ermöglicht die Zuordnung eines Lysat cut-offs von 11 μmol/1, der mit dem in der Literatur beschriebenen cut-off im Plasma von 15 μmol/1 (K. Rasmussen et al . , Clin. Chem. (1996) 42:4 630-636) vergleichbar ist. Mit der oben beschriebenen Methode gelingt es, mit gängigen, billigen und stabilen Reagenzien die Stabilisation der Homocystein-Konzentration im lysierten Blut zu erzielen und somit die Verläßlichkeit der Atherosklerose-Risiko-Vorhersage zu erhöhen. Aufgrund der zunehmenden Wertigkeit dieses Parameters durch Auswertungen von Studien der letzten Jahre wird zukünftig ein hohes Probenaufkommen erwartet. Die speziell präparierten Blutabnahmegefäße helfen dem Arzt und dem medizinischen Personal, Zeit zu sparen, und dem Analytiker im Labor verläßliche Homocystein-Werte zu bestimmen.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend anhand zweier Ausführungsbeispiele erläutert.
Beispiel 1
Eine EDTA-Monovette® (Volumen 2,7 ml, EDTA = ca. 1 mg/ml Blut) , Fa. Sarstedt, wird mit 25 μl Nonidet P40 (unverdünnt), 50 μl EDTA (c = 70g/l, 1,3 mg/ml Blut) und 25 μl Zitronensäure (c = 0,6 g/ml , 5,6 mg/ml Blut) befüllt. In diese Monovette werden 2,7 ml Vollblut gegeben und geschüttelt. Anschließend wird der Behälter bei Raumtemperatur stehengelassen und die Homocystein- Konzentration intervallweise (Oh, 24h, 48h) durch HPLC bestimmt. Aus Figur 2 geht hervor, daß sich die Homocystein-Konzentration zeitlich so gut wie nicht ändert. Diese Vorschrift stellt die gegenwärtig beste Ausführungsweise der Erfindung dar.
Zum Vergleich wurden EDTA- bzw. NaF-Monovetten® (Volumen 2,7 ml) mit 2 , 7 ml Vollblut gefüllt und mehrere Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Figur 1 zeigt, daß sich die Homocystein-Konzentration im Vollblut ohne das erfindungsgemäße Stabilisierungsverfahren signifikant erhöht . Beispiel 2
Aus einer wie im Beispiel 1 aufgeführten, erfindungsgemäß präparierten EDTA-Monovette® wird mit einem "Access Immuno- Assay-System" der Fa. Sanofi Diagnostics Pasteur die Gesamt-Folat-Konzentration bestimmt. Die resultierenden Werte werden mit den Gesamt-Folat-Konzentrationen von Blutproben verglichen, die durch nachträgliche Lyse von EDTA-Blut im Labor mit einem vorgelegten Lysereagenz der oben genannten Firma aufbereitet wurden. Die nachstehende Tabelle 1 zeigt die gute Korrelation der Folat- Konzentrationen .
Tabelle 1
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Aufbereitung von Blutproben für die Homocystein- und/oder Gesamt-Folat-Bestimmung, dadurch gekennzeichnet, daß man die Blutprobe während oder unmittelbar nach der Blutentnahme mit a) wenigstens einem Reagenz zur Lyse der Blutzellen und b) wenigstens einem Inhibitor der Homocystein- bildenden und -abbauenden Enzyme in Verbindung bringt .
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Blutprobe während oder unmittelbar nach der Blutentnahme außerdem mit c) einer oder mehreren Säuren in Verbindung bringt .
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz zur Lyse der Blutzellen a) ein Octylphenol-Ethylenoxid-Kondensat mit durchschnittlich 9 mol Ethylenoxid pro mol Phenol ist .
4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, daß als Inhibitor der
Homocystein-bildenden und -abbauenden Enzyme b) EDTA verwendet wird.
5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Säure c) Zitronensäure verwendet wird.
6. Blutabnahmegefäß zur Aufbereitung von Blutproben, enthaltend
a) wenigstens ein Reagenz zur Lyse der Blutzellen und b) wenigstens einen Inhibitor der Homocystein- bildenden und -abbauenden Enzyme.
7. Blutabnahmegefäß nach Anspruch 6, enthaltend außerdem c) eine oder mehrere Säuren.
8. Blutabnahmegefäß nach Anspruch 6 oder 7 , dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz zur Lyse der Blutzellen a) ein Octylphenol-Ethylenoxid-Kondensat mit durchschnittlich 9 mol Ethylenoxid pro mol Phenol ist .
9. Blutabnahmegefäß nach mindestens einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Inhibitor der Homocystein-bildenden und -abbauenden Enzyme b) EDTA verwendet wird.
10. Blutabnahmegefäß nach mindestens einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Säure c) Zitronensäure verwendet wird.
11. Blutabnahmegefäß nach mindestens einem der Ansprüche 6 bis 10, in dem ein Octylphenol-Ethylenoxid-Kondensat mit durchschnittlich 9 mol Ethylenoxid pro mol Phenol, EDTA und Zitronensäure vorgelegt sind.
12. Blutabnahmegefäß nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß Octylphenol-Ethylenoxid-Kondensat mit durchschnittlich 9 mol Ethylenoxid pro mol Phenol unverdünnt und EDTA und Zitronensäure in Form hochkonzentrierter wäßriger Lösungen vorgelegt sind.
13. Verwendung eines Blutabnahmegefäßes nach mindestens einem der Ansprüche 6 bis 12 zur Aufbereitung von Vollblut für die Homocystein- und/oder Gesamt-Folat- Bestimmung.
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