EP0250991A2 - Verfahren zur spezifischen Bestimmung des Serumfructosamingehalts sowie hierfür geeignetes Reagenzgemisch - Google Patents
Verfahren zur spezifischen Bestimmung des Serumfructosamingehalts sowie hierfür geeignetes Reagenzgemisch Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a method for the specific determination of the serum fructosamine content in blood or blood-derived samples, in which disruptive sample components are removed before the fructosamine content is measured.
- Serum fructosamine content means the total content of non-enzymatically glycosylated serum proteins. These arise because serum glucose forms Schiff bases with free protein amino residues via their carbonyl group. These are then converted into fructosamines with a stable ketoamine bond by Amadori rearrangement.
- the reaction mechanism was e.g. B. by E. Schleicher and OH Wieland in J. Clin. Chem. Clin. Biochem. (l98l) l9 , 8l - 87 examined in more detail.
- fructosamine formation is proportional to the blood glucose level. As is known, this can be subject to strong fluctuations in connection with pronounced pathological phenomena in diabetics, particularly in the case of inadequate dietary and medicinal metabolic adjustment.
- the blood glucose determination only gives the doctor information about the metabolic status at the time of blood collection.
- a long-term control of the metabolic status of the last 120 days is possible with the determination of glycosylated hemoglobin (HbA1).
- HbA1 glycosylated hemoglobin
- fructosamine in hyperlipemic sera.
- a sample / reagent volume ratio of 0.1 is required.
- the resulting turbidity of the test batch has a negative effect on the photometric measurement. The determination of fructosamine is made considerably more difficult or even prevented.
- the object of the present invention was to provide such a method.
- the method according to the invention for the specific determination of the serum fructosamine content in blood or samples derived from blood by reaction with a suitable color reagent and measurement of the color change caused thereby is characterized in that sample components which have a non-specific reducing effect and / or cause haze at an approximately neutral pH value before the color reaction be eliminated, then a pH value between 10 and 12 is set and the color reagent is added.
- the sample is mixed with one or more enzymatic and / or non-enzymatic oxidizing agents.
- Ascorbate oxidase, bilirubin oxidase or / and uricase are advantageously used as enzymatic oxidizing agents and hypochlorite or a hypochlorite-providing compound is used as non-enzymatic oxidizing agent.
- N-chloro-p-toluenesulfamide (chloramine T) is particularly suitable as the hypochlorite-providing compound.
- the compound slowly releases hypochlorous acid on contact with water.
- the latter is an effective oxidizing agent in acid to neutral, but not in alkaline. It has proven particularly advantageous if additional peroxidase and / or catalase are added.
- Catalase if any, is used primarily to remove excess hydrogen peroxide.
- a suitable detergent advantageously a cationic detergent, for example oxyethylalkylammonium phosphate (e.g. Dehyquart®SP from Henkel)
- the oxidative effect can surprisingly be increased.
- a mixture of enzymatic and / or non-enzymatic oxi is particularly effective dating agents if it contains chloramine T and at the same time a cationic detergent, for example oxyethylalkylammonium phosphate (e.g. Dehyquart®SP).
- the concentration of cationic detergent ranges from 0.5 to 4% by volume.
- the preferred concentration range for Dehyquart®SP has turned out to be 1 to 2% by volume.
- lipase if appropriate, to the oxidizing agent (s), optionally together with one or more detergents and / or salts of strong acids.
- oxidizing agent s
- detergents and / or salts of strong acids With the help of such a mixture it is possible to eliminate substances that cause turbidity to such an extent that the subsequent color measurement is no longer impaired.
- a solution containing the enzymatic or / and non-enzymatic oxidizing agent as well as optionally one or more detergents and / or salts of strong acids in a suitable one contains non-reducing buffer.
- All buffer substances which do not themselves have a reducing effect and whose buffering effect is at approximately neutral pH are suitable for the preparation of this solution.
- a pH range of pH 6-9, preferably pH 7-8.5, very particularly preferably pH 7.5-8.0, has proven to be advantageous.
- the buffer concentration is preferably 10-100 mmol / l, very particularly preferably 20-70 mmol / l.
- Aqueous potassium phosphate buffer has proven to be particularly advantageous.
- the concentration of the added enzymes depends on the concentration of the interfering compounds to be removed. These enzyme concentrations are usually between 0.01 and 10 000 U / ml. Preferred concentration ranges are, for example Uricase 1-15 U / ml Bilirubin oxidase 0.05 - 5 U / ml Ascorbate oxidase 2 - 20 U / ml Lipase 0.5 - 5 U / ml Peroxidase 0.5 - 5 U / ml Catalase 100 - 10,000 U / ml Particularly preferred concentration ranges for these enzymes are for Uricase 2 - 10 U / ml Bilirubin oxidase 0.1-1 U / ml Ascorbate oxidase 5 - 15 U / ml Lipase 1 - 3 U / ml Peroxidase l - 3 U / ml Catalase 500 - 2000 U / ml.
- the concentration of the added hypochlorite or the hypochlorite-providing compounds also depends on the concentration of the interfering compounds to be removed.
- Hypochlorite and hypochlorite-providing compounds are usually used in concentrations of 50 to 600 ⁇ mol / l, preferably 150 to 300 ⁇ mol / l.
- detergents can also be anionic or nonionic detergents.
- Alkali or alkaline earth metal salts of bile acids and their conjugates are preferred as anionic detergents.
- Advantageous concentrations of anionic detergents are between 2 and 10 mmol / l.
- Sodium cholate in concentrations of 4 to 6 mmol / l has proven to be particularly favorable.
- a wide range of detergents is available as a nonionic detergent.
- Linear or branched chain alkyl or alkylaryl alcohol polyglycol ethers with 8 to 20 carbon atoms in the alcohol part and 4 to 15 glycol units per molecule have proven to be particularly suitable.
- a particularly advantageous activating effect is exerted by linear and branched-chain alkyl alcohol polyglycol ethers with 8 to 12 carbon atoms in the alcohol part and 4 to 8 glycol units per molecule.
- nonionic detergents are suitable which can be uniform with regard to the structure of the alcohol part or a mixture of several polyglycol ethers which differ with respect to the structure of the alcohol part.
- a mixture of an isodecanol polyglycol ether with an average of four glycol units per molecule (Oxetal® ID 104 from Zschimmer & Schwarz, Lahnstein) and an n-decanol polyglycol ether with an average of 6 glycol units per molecule (product RT 240® from Zschimmer & Schwarz, Lahnstein) is particularly preferred ).
- the concentration of nonionic detergent which is used according to the invention to remove nonspecificly reducing or / and turbidity-causing sample components ranges from 0.05 to 15% by weight.
- concentration range for Oxetal® ID 104 0.1 to 1% has proven to be particularly advantageous 0.2 to 0.5%.
- Product RT 240® can be used in concentrations of 1 to 10%, particularly advantageously 2 to 5%.
- the haze-eliminating effect can be enhanced by higher ionic strengths in the reaction solution.
- Additions of salts of strong acids, which remain in solution even in the alkaline pH range, have proven to be favorable for this.
- Alkali or alkaline earth metal salts of hydrochloric or sulfuric acid are preferred.
- Potassium or sodium chloride is particularly preferably used.
- the concentration of the salts of strong acids ranges from 20 to 100 mmol / l. Salts in a concentration of 40 to 60 mmol / l are particularly preferably added.
- Non-specific reducing or / and turbidity-causing sample components are removed at temperatures between 25 and 40 ° C., preferably at 37 ° C. over a period of 1 to 15 minutes, preferably 2 to 6 minutes.
- the time period to be selected for the incubation depends on the amount of nonspecifically reducing and turbidity-causing sample components and the amount of enzymatic and / or non-enzymatic oxidizing agents used to remove them.
- the incubation for the removal of nonspecifically reducing or / and turbidity-causing sample components is carried out at an approximately neutral pH value due to the pH optimum of the enzymes used, but the color reaction between the color reagent and fructosamine takes place at a pH value between 10 and 12, it is required to rebuffer after incubation.
- the pH value is increased by means of a buffer, the pH value of which is slightly above the pH value to be set.
- a buffer with a pH between pH l0.5 and l2.5, particularly preferably between pH l0.7 and l2.2, is particularly useful.
- a carbonate buffer is advantageously used, the concentration of which is 150 to 300 mmol / l, particularly preferably 180 to 220 mmol / l.
- the reducing effect of the fructosamine can be made visible by adding a color reagent in the alkaline range.
- a tetrazolium salt is preferably used for this, the formazan dye formation of which can be monitored visually or photometrically.
- Preferred tetrazolium salts are those which are described in "Methods of Enzymatic Analysis” (HU Bergmeyer, ed., 3rd edition, Verlag Chemie Weinheim 1983, Volume I, page 200). Nitrotetrazolium blue (NBT) or 3- (4 ⁇ , 5 ⁇ -dimethylthiazolyl-2 -) - 2,4-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) are particularly suitable.
- the color reagent can be added to the test mixture both after the buffering and simultaneously with the buffer. For this purpose, it has proven to be advantageous to dissolve the color reagent in the buffer required for the buffering. Concentrations of 0.2 to 2 mmol / l have proven to be favorable for tetrazolium salts, and 0.4 to 1.5 mmol / l have proven particularly favorable.
- the pH of the test batch has a pH between 10 and 12, preferably 10.3 to 10.6, in the presence of the color reagent.
- the buffered solution is incubated at temperatures between 25 and 40 ° C, preferably at 37 ° C.
- the color change based on the reduction of the color reagent is monitored photometrically in a defined time interval, preferably 1 to 15 minutes after buffering.
- a first measurement is made 1 to 10 minutes after the buffering and a last measurement 2 to 15 minutes after the buffering.
- two or more measurements can be carried out.
- the time intervals between two measurements are variable. They can be selected depending on the equipment, and can range from a few seconds to a few minutes.
- Suitable standard solutions are known.
- the method described by Johnson et al. in Clin. Chim. Acta (l982) l27 , 87-95 standard can be used, which is based on a matrix of human albumin with defined additions of a synthetic fructosamine.
- L-Deoxy-l-morpholino-fructose (DMF) is used as the synthetic fructosamine.
- the determined serum fructosamine concentration in the sample is given in DMF units when using this standard.
- the method according to the invention also allows the sample / reagent volume ratio of 0.1 to be determined by the method of Johnson et al. It is customary to reduce significantly without the measurement signal with a defined amount of a fructosamine analog used as a sample being significant compared to the same measurement interval and incubation at the same temperature by Johnson et al. described method becomes smaller. Is used as fructosamine analog z. B. DMF used, the sample / reagent volume ratio can be reduced to 0.02 in this case without reducing the sensitivity of the measurement.
- the method according to the invention for determining fructosamine in blood or blood-derived samples, non-specific reducing or / and turbidity-causing sample components being eliminated with the aid of one or more enzymatic and / or non-enzymatic oxidizing agents and optionally one or more detergents and / or salts do not just perform in solution. It can also be easily transferred to determination methods using dry chemical test carriers.
- the one or more enzymatic and / or non-enzymatic oxidizing agents and optionally one or more detergents and / or salts, possibly with further auxiliaries are applied to solid carriers in a manner known per se. Suitable solid supports and methods for applying these substances or mixtures of substances to such supports are known to the person skilled in the art. All possible absorbent materials, such as paper, nonwovens, etc., are suitable as carrier materials.
- the substances to be applied can be taken up in one or more impregnation solutions.
- the carriers are impregnated or sprayed with these solutions. It is then dried.
- oxidizing agent s
- optionally detergents and / or salts possibly other auxiliary substances
- the substances or substance mixtures for. B. processed according to methods according to DE-PS l 598 l53 or DE-OS 2 9l0 l34 to reagent films.
- the sample to be measured is first brought into contact with a carrier which contains the oxidizing agent (s) and optionally one or more detergents and / or salts. After sufficient contact, the pretreated sample is transferred to a layer which contains the other reaction components required for the color reaction.
- the color change caused is photometric, for. B. measured by reflectometry.
- Another object of the invention is a reagent mixture for the specific determination of the serum fructosamine content in blood or blood-derived samples, which is characterized in that it consists of a reagent for the removal of nonspecifically reducing and / or turbidity-causing sample components, a re-buffering reagent with a buffer, the one pH in the range of l0.5 - l2.5 and a color reagent for the detection of fructosamine.
- This reagent mixture contains all the components necessary for carrying out the method according to the invention.
- the reagent for eliminating nonspecifically reducing or / and turbidity-causing sample components in blood or blood-derived samples consists of one or more enzymatic and / or non-enzymatic oxidizing agents and optionally peroxidase and / or catalase or / and lipase and optionally one or more detergents and / or salts of strong acids and, if appropriate, customary additives in a buffer with an approximately neutral pH.
- Enzymatic oxidizing agents are, in particular, ascorbate oxidase, bilirubin oxidase and uricase, and non-enzymatic oxidizing agents are to be understood in particular as hypochlorite and hypochlorite-providing compounds.
- the sample components contained in the reagent according to the invention for eliminating nonspecificly reducing or / and causing haze in blood or in detergents possibly contained in blood-derived samples can be anionic or nonionic. While the preferred anionic detergents are alkali or alkaline earth salts of bile acids and their conjugates, a wide range of detergents is available for nonionic detergents. Linear or branched-chain alkyl or alkylaryl alcohol polyglycol ethers with 8-20 C atoms in the alcohol part and 4 to 15 glycol units per molecule have proven to be particularly suitable. However, the detergents added can additionally also be cationic detergents, such as, for example, oxyethylalkylammonium phosphate (for example Dehyquart®SP from Henkel).
- a mixture of enzymatic and / or non-enzymatic oxidizing agents is particularly effective if it contains chloramine T and at the same time a cationic detergent, for example Dehyquart®SP.
- Alkali or alkaline earth metal salts of hydrochloric or sulfuric acid have been found to be suitable as salts of strong acids for the reagent according to the invention.
- Potassium or sodium chloride are particularly preferred.
- the buffer required to achieve an approximately neutral pH of the reagent according to the invention has a pH in the range from pH 6-9, preferably pH 7-8.5, very particularly preferably pH 7.5-8.0.
- the buffer concentration is preferably 10-100 mmol / l, very particularly preferably 20-70 mmol / l.
- Aqueous potassium phosphate buffer has proven to be particularly advantageous.
- the concentration in the sample is given in "l-deoxymorpholinofructose units" (DMF units).
- the calibration standard from the fructosamine test from Roche, Basel, Switzerland was used for calibration.
- FIG. 1 A representation of the course of extinction in the test mixture using the method according to the invention (curve 1) in comparison to the method of Johnson et al., Clin. Chim. Acta (l982) l27 , 87-95 (curve 2), the calibration standard from the fructosamine test from Roche, Basel, Switzerland serving as sample material, is shown in Fig. 1.
- the change in extinction / minute is linearly proportional to the DMF concentration in the sample up to at least 10 mmol / l.
- a human serum with bilirubin was gradually increased up to a concentration of 12 mg / dl and the test was carried out as described in Example 1.
- the measurement signal generated by DMF in the sample is tested in the Johnson et al. very much reduced with increasing protein concentrations, while in the test according to the method according to the invention it is practically unaffected by the amount of protein up to at least 100 g RSA / l.
- the concentrations of fructosamine were determined analogously to example 1 as DMF units and plotted in mmol / l on the ordinate in FIG. 5a. These results were plotted against the measured values obtained by measuring furosin with the HPLC reference method (J. Clin. Chem. Clin. Biochem. L9 (l98l), pp. 8l-87). Relative peak area units were used in each case as HPLC measured values.
- Fig. 5c gives the measurement results for an analog fructosamine determination, in which an additional 250 ⁇ M chloramine T is contained in reagent I.
- Fig. 5d finally gives the measurement results for an analog fructosamine determination, whereby both 1.2% Dehyquart®SP and 250 ⁇ M chloramine T are additionally contained in reagent I.
- Diagrams 5a-d show that the combination of chloramine T and Dehyquart®SP in particular significantly reduces the intercept.
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Abstract
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur spezifischen Bestimmung des Serumfructosamingehalts in Blut oder von Blut abgeleiteten Proben, bei dem störende Probenbestandteile vor Messung des Fructosamingehaltes beseitigt werden.
- Unter Serumfructosamingehalt versteht man den Gesamtgehalt an nichtenzymatisch glycosilierten Serumproteinen. Diese entstehen dadurch, daß Serumglucose über ihre Carbonylgruppe mit freien Proteinaminoresten Schiff'sche Basen bildet. Diese gehen anschließend durch Amadori-Umlagerung in Fructosamine mit stabiler Ketoamin-Bindung über. Der Reaktionsmechanismus wurde z. B. von E. Schleicher und O. H. Wieland in J. Clin. Chem. Clin. Biochem. (l98l) l9, 8l - 87 näher untersucht.
- Die Halbwertzeit des Serumfructosamins ist wegen der Stabilität der Ketoamin-Bindung praktisch identisch mit der der Serumproteine, deren Halbwertzeit im Durchschnitt ca. 2l Tage beträgt. Entsprechende Untersuchungen wurden von L. Y. Seng und M. J. Staley in J. Clin. Chem. (l986) 32, 560 veroffentlicht.
- Das Ausmaß der Fructosamin-Bildung ist proportional dem Blutglucose-Spiegel. Dieser kann bekanntermaßen bei Diabetikern, besonders bei ungenügender diätetischer und medikamentöser Stoffwechseleinstellung starken Schwankungen, verbunden mit ausgeprägten pathologischen Erscheinungen, unterliegen.
- Die Blutglucose-Bestimmung gibt dem Arzt nur Auskunft über die zum Zeitpunkt der Blutentnahme vorhandene Stoffwechsellage. Eine Langfristkontrolle über die Stoffwechsellage der letzten l20 Tage ist dagegen mit der Bestimmung des glycosilierten Hämoglobins (HbA₁) möglich. Die Messung des Serumfructosamins eignet sich nun gerade wegen dessen Halbwertzeit dazu, die Stoffwechselführung von Diabetikern durch Lebenshaltung und therapeutische Maßnahmen rückwirkend über einen mittelfristigen Zeitraum von ca. 3 Wochen zu ermitteln. In Verbindung mit den etablierten klinisch diagnostischen Parametern Blutglucose sowie glycosiliertes Hämoglobin (HbA₁) ließe sich deshalb mit einer zuverlässigen, spezifischen und praktikablen Methode zur Serumfructosamin-Bestimmung das Diagnosearsenal zur Überwachung von Diabetikern um einen wertvollen Mittelfristparameter erweitern.
- Ein vom Prinzip her einfach durchführbares Verfahren zur Serumfructosamin-Bestimmung wurde von Baker in EP-C 0 085 263 und von Johnson et al. in Clin. Chim. Acta (l982) l27, 87 - 95 beschrieben. Es beruht darauf, daß die Ketoaminform in wässrigem, alkalischem Medium in eine Enolform übergeht, die reduzierend auf Tetrazoliumsalze, wie z. B. Nitrotetrazoliumblau wirkt und dabei einen Formazanfarbstoff liefert. Das Ausmaß der in einem definierten Zeitintervall bei 37° C photometrisch gemessenen Farbstoffbildung ist der Menge an vorliegendem Fructosamin proportional.
- Dieser Test ist bei Verwendung von Serum als Probenmaterial störanfällig, denn naturliche Serumbestandteile, wie Bilirubin und Harnsäure, wirken ebenfalls auf Tetrazoliumsalze reduktiv. Auch Medikamente, wie z. B. α -Methyldopa, Medikamentabbauprodukte, wie z. B. Gentisinsäure, die ein Metabolit der Acetylsalicylsäure ist, sowie Ascorbinsäure führen je nach Konzentration im Serum zu verfälschten Meßergebnissen.
- Serumfructosamin-Bestimmungen leden bisher außerdem unter Storungen, die auf dem von Probe zu Probe variierenden Gesamtproteingehalt beruhen. Sie führen zu Meßwertschwankungen und verringern dadurch die Empfindlichket des Bestimmungsverfahrens. Diese Störungen sind als Matrixeffekte bekannt. Besonders bemerkbar macht sich dieser Effekt bei Zugabe zusätzlichen Proteins, wie dies z. B. bei der Herstellung von Standardlösungen üblicherweise der Fall ist. Steigende Proteinmengen verlangsamen die Reaktion zwischen Fructosamin und Farbreagenz (vergleiche E. J. Hindle et al., Ann. Clin. Biochem. 22 (l985), S. 84 - 89).
- Weitere Schwierigkeiten treten bei der Fructosamin-Bestimmung in hyperlipämischen Seren auf. Im allgemeinen ist, um ein auch bei niedrigen Fructosaminkonzentrationen in der Probe noch ausreichend großes Meßsignal zu erhalten, ein Probe-/Reagenzvolumenverhältnis von 0,l erforderlich. Bei überhöhten Triglyceridkonzentrationen macht sich jedoch bei einem so hohen Probenanteil die resultierende Trübung des Testansatzes negativ bei der photometrischen Messung bemerkbar. Die Fructosamin-Bestimmung wird erheblich erschwert oder sogar verhindert.
- Es besteht weiterhin Bedarf an einem Verfahren zur spezifischen Bestimmung des Serumfructosamingehaltes in Blut oder von Blut abgeleiteten Proben, das die oben genannten Nachteile nicht aufweist. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein solches Verfahren bereitzustellen.
- Gelöst wird diese Aufgabe durch die in den Patentansprüchen gekennzeichnete Erfindung. Das erfindungsgemäße Verfahren zur spezifischen Bestimmung des Serumfructosamingehaltes in Blut oder von Blut abgeleiteten Proben durch Umsetzung mit einem geeigneten Farbreagenz und Messung der dadurch bewirkten Farbänderung, ist dadurch gekennzeichnet, daß vor der Farbreaktion unspezifisch reduzierend wirkende oder/und trübungsverursachende Probenbestandteile bei ungefähr neutralem pH-Wert beseitigt werden, anschließend ein pH-Wert zwischen l0 und l2 eingestellt und das Farbreagenz zugegeben wird.
- Zur Beseitigung unspezifisch reduzierend wirkender Probenbestandteile wird die Probe mit einem oder mehreren enzymatischen oder/und nichtenzymatischen Oxidationsmitteln versetzt. Vorteilhaft werden als enzymatische Oxidationsmittel Ascorbat-Oxidase, Bilirubin-Oxidase oder/und Uricase und als nichtenzymatische Oxidationsmittel Hypochlorit oder eine hypochloritliefernde Verbindung eingesetzt. Als hypochloritliefernde Verbindung ist besonders N-Chlor-p-toluol-sulfamid (Chloramin T) geeignet. Die Verbindung spaltet bei Berührung mit Wasser langsam unterchlorige Säure ab. Letztere ist im Sauren bis Neutralen, nicht dagegen im Alkalischen, ein wirksames Oxidationsmittel. Besonders vorteihaft hat es sich erwiesen, wenn zusätzlich Peroxidase oder/und Katalase zugegeben werden.
- Überraschenderweise wurde festgestellt, daß durch Zusatz eines oder mehrerer enzymatischer oder/und nichtenzymatischer Oxidationsmittel zu der zu bestimmenden Probe, Störungen durch sämtliche störende reduzierend wirkende Bestandteile beseitigt werden, d. h. die oben genannten Oxidationsmittel oxidieren nicht nur Bilirubin, Harnsäure oder Ascorbinsäure, sondern sie beseitigen auch Störungen durch andere reduzierend wirkende Stoffe, wie z. B. Medikamente sowie deren Abbauprodukte. In Gegenwart des oder der Oxidationsmittel werden solche Substanzen im therapeutischen Konzentrationsbereich eliminiert oder ihre Konzentration auf ein analytisch nicht mehr ins Gewicht fallendes Ausmaß herabgesetzt. Eventuell vorhandene Peroxidase kann mit gegebenenfalls entstehendem Wasserstoffperoxid zusätzliche oxidative Abbauprozesse bewirken, was die Wirksamkeit des oder der Oxidationsmittel noch zusätzlich erhöht. Gegebenenfalls zugesetzte Katalase dient vor allem zur Beseitigung überschussigen Wasserstoffperoxids. Durch Zusatz eines geeigneten Detergens, vorteilhafterweise eines kationischen Detergens, beispielsweise Oxyethylalkylammoniumphosphat (z. B. Dehyquart®SP der Fa. Henkel) kann überraschenderweise die oxidative Wirkung erhöht werden. Ganz besonders wirksam ist ein Gemisch von enzymatischen oder/und nichtenzymatischen Oxi dationsmitteln, wenn es Chloramin T und gleichzeitig ein kationisches Detergens, beispielsweise Oxyethylalkylammoniumphosphat (z. B. Dehyquart®SP), enthält. Die Konzentration an kationischem Detergens reicht von 0,5 bis 4 Vol.-%. Als bevorzugter Konzentrationsbereich hat sich für Dehyquart®SP l bis 2 Vol-% erwiesen.
- Insbesondere für die Untersuchung lipämischer Proben hat es sich als zweckmäßig erwiesen, dem oder den Oxidationsmitteln gegebenenfalls Lipase, gegebenenfalls zusammen mit einem oder mehreren Detergentien oder/und Salzen starker Säuren zuzusetzen. Mit Hilfe eines solchen Gemisches gelingt es, trübungsverursachende Stoffe soweit zu eliminieren, daß die anschließende Farbmessung nicht mehr beeinträchtigt ist.
- Überraschenderweise werden mit Hilfe der vorgenannten Substanzen zur Beseitigung störender Bestandteile auch die als Matrixeffekte bekannten Meßwertschwankungen durch variierende Gesamtproteinmengen in der Probe weitgehend unterdruckt bzw. vollständig beseitigt.
- Zur Beseitigung unspezifisch reduzierend wirkender oder/und trübungsverursachender Probenbestandteile hat es sich als zweckmäßig erwiesen, die Probe mit einer Lösung zu inkubieren, welche das oder die enzymatischen oder/und nichtenzymatischen Oxidationsmittel sowie gegebenenfalls ein oder mehrere Detergentien oder/und Salze starker Säuren in einem geeigneten nichtreduzierenden Puffer enthält. Zur Herstellung dieser Lösung sind sämtliche Puffersubstanzen geeignet, die selbst nicht reduzierend wirken und deren Pufferwirkung bei ungefähr neutralem pH-Wert liegt. Vorteilhaft hat sich ein pH-Bereich von pH 6 - 9, vorzugsweise pH 7 - 8,5, ganz besonders bevorzugt pH 7,5 - 8,0, erwiesen. Die Pufferkonzentration beträgt vorzugsweise l0 - l00 mmol/l, ganz besonders bevorzugt 20 - 70 mmol/l. Als besonders vorteilhaft hat sich wässriger Kaliumphosphatpuffer erwiesen.
- Die Konzentration der zugesetzten Enzyme richtet sich nach der Konzentration der zu beseitigenden störenden Verbindungen. Üblicherweise liegen diese Enzymkonzentrationen zwischen 0,0l und l0 000 U/ml. Bevorzugte Konzentrationsbereiche sind beispielsweise für
Uricase l - l5 U/ml
Bilirubin-Oxidase 0,05 - 5 U/ml
Ascorbat-Oxidase 2 - 20 U/ml
Lipase 0,5 - 5 U/ml
Peroxidase 0,5 - 5 U/ml
Katalase l00 - l0 000 U/ml
Besonders bevorzugte Konzentrationsbereiche dieser Enzyme sind für
Uricase 2 - l0 U/ml
Bilirubin-Oxidase 0,l - l U/ml
Ascorbat-Oxidase 5 - l5 U/ml
Lipase l - 3 U/ml
Peroxidase l - 3 U/ml
Katalase 500 - 2000 U/ml. - Auch die Konzentration des zugesetzten Hypochlorits bzw. der hypochloritliefernden Verbindungen richtet sich nach der Konzentration der zu beseitigenden störenden Verbindungen. Ublicherweise werden Hypochlorit und hypochloritliefernde Verbindungen in Konzentrationen von 50 bis 600 µmol/l, vorzugsweise l50 bis 300 µmol/l eingesetzt.
- Detergentien können außer kationischen auch anionische oder nichtionische Detergentien sein. Als anionische Detergentien werden Alkali- oder Erdalkalisalze von Gallensäuren und ihrer Konjugate bevorzugt. Vorteilhafte Konzentrationen anionischer Detergentien liegen zwischen 2 und l0 mmol/l. Als besonders günstig hat sich Natriumcholat in Konzentrationen von 4 bis 6 mmol/l erwiesen.
- Als nichtionische Detergentien steht eine breite Palette von Detergentien zur Auswahl. Als geeignet haben sich vor allem lineare oder verzweigtkettige Alkyl- oder Alkylaryl-Alkohol-Polyglycoläther mit 8 bis 20 C-Atomen im Alkoholteil und 4 bis l5 Glycoleinheiten pro Molekül erwiesen. Eine besonders vorteilhafte aktivierende Wirkung üben lineare und verzweigtkettige Alkyl-AlkoholPolyglycoläther mit 8 bis l2 C-Atomen im Alkoholteil und 4 bis 8 Glycoleinheiten pro Molekül aus.
- Für das erfindungsgemäße Verfahren zur spezifischen Bestimmung des Serumfructosamingehaltes sind nichtionische Detergentien geeignet, die bezüglich der Struktur des Alkoholteils einheitlich oder ein Gemisch aus mehreren, hinsichtlich der Struktur des Alkoholteils unterschiedlichen Polyglycoläthern sein können. Besonders bevorzugt wird ein Gemisch aus einem Isodecanolpolyglycoläther mit durchschnittlich vier Glycoleinheiten pro Molekül (Oxetal® ID l04 der Firma Zschimmer & Schwarz, Lahnstein) und einem n-Decanolpolyglycoläther mit durchschnittlich 6 Glycoleinheiten pro Molekül (Produkt RT 240® der Firma Zschimmer & Schwarz, Lahnstein). Die Konzentration an nichtionischem Detergenz, die erfindungsgemäß zur Beseitigung unspezifisch reduzierend wirkender oder/und trübungsverursachender Probenbestandteile eingesetzt wird, reicht von 0,05 bis l5 Gew. %. Als bevorzugter Konzentrationsbereich hat sich für Oxetal® ID l04 0,l bis l %, als besonders vorteilhaft 0,2 bis 0,5 % erwiesen. Produkt RT 240® kann in Konzentrationen von l bis l0 %, besonders vorteilhaft 2 bis 5 %, eingesetzt werden.
- Die trübungsbeseitigende Wirkung kann durch höhere Ionenstärken in der Reaktionslösung noch verstärkt werden. Hierfür haben sich Zusätze von Salzen starker Säuren, die auch im alkalischen pH-Bereich in Lösung bleiben, als günstig erwiesen. Bevorzugt werden Alkali- oder Erdalkalisalze von Salz- oder Schwefelsäure. Besonders bevorzugt werden Kalium- oder Natriumchlorid eingesetzt. Die Konzentration der zugesetzten Salze starker Säuren reichen von 20 bis l00 mmol/l. Besonders bevorzugt werden Salze in der Konzentration von 40 bis 60 mmol/l zugesetzt.
- Die Beseitigung unspezifisch reduzierend wirkender oder/und trubungsverursachender Probenbestandteile erfolgt bei Temperaturen zwischen 25 und 40° C, vorzugsweise bei 37° C über einen Zeitraum von l bis l5 Minuten, vorzugsweise 2 bis 6 Minuten. Die zu wählende Zeitspanne der Inkubation ist abhängig von der Menge an unspezifisch reduzierend wirkenden und trübungsverursachenden Probenbestandteilen und der zu ihrer Beseitigung eingesetzten Menge an enzymatischen oder/und nichtenzymatischen Oxidationsmitteln.
- Da die Inkubation zur Beseitigung unspezifisch reduzierend wirkender oder/und trübungsverursachender Probenbestandteile wegen des pH-Optimums der verwendeten Enzyme bei ungefähr neutralem pH-Wert durchgeführt wird, die Farbreaktion zwischen Farbreagenz und Fructosamin aber bei einem pH-Wert zwischen l0 und l2 verläuft, ist es erforderlich, nach erfolgter Inkubation umzupuffern. Die Erhöhung des pH-Wertes erfolgt mittels eines Puffers, dessen pH-Wert etwas über dem einzustellenden pH-Wert liegt. Ein Puffer mit einem pH-Wert zwischen pH l0,5 und l2,5, besonders bevorzugt zwischen pH l0,7 und l2,2 ist besonders zweckmäßig. Vorteilhafterweise wird hierfür ein Carbonatpuffer eingesetzt, dessen Konzentration l50 bis 300 mmol/l, besonders bevorzugt l80 bis 220 mmol/l beträgt.
- In an sich bekannter Weise kann durch Zugabe eines Farbreagenzes im alkalischen Bereich die reduzierende Wirkung des Fructosamins sichtbar gemacht werden. Vorzugsweise wird hierfür ein Tetrazoliumsalz eingesetzt, dessen Formazanfarbstoffbildung visuell oder photometrisch verfolgt werden kann. Als Tetrazoliumsalze werden diejenigen bevorzugt, die in "Methods of Enzymatic Analysis" (H. U. Bergmeyer, Hrsg., 3. Ausgabe, Verlag Chemie Weinheim l983, Band I, Seite 200) beschrieben sind. Besonders geeignetz sind Nitrotetrazoliumblau (NBT) oder 3-(4ʹ,5ʹ-Dimethylthiazolyl-2-)-2,4-diphenyl-tetrazoliumbromid (MTT). Das Farbreagenz kann sowohl nach der Umpufferung als auch gleichzeitig mit dem Puffer dem Testansatz zugegeben werden. Hierfür hat es sich als vorteilhaft erwiesen, das Farbreagenz in dem für die Umpufferung benötigten Puffer zu lösen. Für Tetrazoliumsalze haben sich Konzentrationen von 0,2 bis 2 mmol/l als günstig, 0,4 bis l,5 mmol/l als besonders günstig erwiesen.
- Zur Umpufferung nach der Beseitigung unspezifisch reduzierend wirkender oder/und trübungsverursachender Probenbestandteile wird soviel Puffer zugesetzt, daß der pH-Wert des Testansatzes bei Anwesenheit des Farbreagenzes einen pH-Wert zwischen l0 und l2, vorzugsweise l0,3 bis l0,6 aufweist.
- Die umgepufferte Lösung wird bei Temperaturen zwischen 25 und 40° C, vorzugsweise bei 37° C inkubiert. Die Farbänderung beruhend auf der Reduktion des Farbreagenzes wird photometrisch in einem definierten Zeitintervall, vorzugsweise l bis l5 Minuten nach Umpufferung verfolgt. Eine erste Messung wird l bis l0 Minuten nach der Umpufferung und eine letzte Messung 2 bis l5 Minuten nach der Umpufferung durchgefuhrt. Je nach Erfordernis können zwei oder mehr Messungen durchgeführt werden. Die zeitlichen Abstände zwischen zwei Messungen sind variabel. Sie können je nach apparativer Ausstattung gewählt werden, wobei sie im Bereich weniger Sekunden als auch einiger Minuten liegen können.
- In manchen Fällen ist es zweckmäßig, die erhaltenen Meßwerte mit denen einer Standardlösung zu vergleichen. Geeignete Standardlösungen sind bekannt. Beispielsweise kann hierzu der von Johnson et al. in Clin. Chim. Acta (l982) l27, 87 - 95 beschriebene Standard verwendet werden, der auf einer Matrix aus Humanalbumin mit definierten Zusätzen eines synthetischen Fructosamins basiert. Als synthetisches Fructosamin wird l-Desoxy-l-morpholino-fructose (DMF) verwendet. Die ermittelte Serumfructosamin-Konzentration in der Probe wird bei Verwendung dieses Standards in DMF-Einheiten angegeben.
- Überraschenderweise erlaubt es das erfindungsgemäße Verfahren auch, das Probe-/Reagenzvolumenverhältnis von 0,l, das nach dem Verfahren von Johnson et al. üblich ist, stark herabzusetzen, ohne daß bei gleichem Meßintervall und Inkubation bei gleicher Temperatur das Meßsignal mit einer definierten Menge an einem als Probe eingesetzten Fructosaminanalogon signifikant im Vergleich zu der von Johnson et al. beschriebenen Methode kleiner wird. Wird als Fructosaminanalogon z. B. DMF verwendet, so kann in diesem Fall das Probe-/Reagenzvolumenverhältnis auf 0,02 herabgesetzt werden, ohne die Empfindlichkeit der Messung zu verringern.
- Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Fructosamin in Blut oder von Blut abgeleiteten Proben, wobei unspezifisch reduzierend wirkende oder/und trübungsverursachende Probenbestandteile mit Hilfe eines oder mehrerer enzymatischer oder/und nichtenzymatischer Oxidationsmittel sowie gegebenenfalls einem oder mehreren Detergentien oder/und Salzen beseitigt werden, läßt sich nicht nur in Lösung durchführen. Es ist auch ohne weiteres auf Bestimmungsverfahren mittels trockenchemischer Testträger übertragbar. Das oder die enzymatischen oder/und nichtenzymatischen Oxidationsmittel sowie gegebenenfalls ein oder mehrere Detergentien oder/und Salze eventuell mit weiteren Hilfsstoffen werden hierzu in an sich bekannter Weise auf feste Träger aufgebracht. Geeignete feste Träger sowie Verfahren zum Aufbringen dieser Stoffe bzw. Stoffgemische auf solche Träger sind dem Fachmann bekannt. Als Trägermaterialien eignen sich beispielsweise alle möglichen saugfähigen Materialien, wie beispielsweise Papiere, Vliese usw.. Die aufzubringenden Stoffe können in eine oder mehrere Imprägnierlösungen aufgenommen werden. Mit diesen Lösungen werden die Träger imprägniert oder besprüht. Anschließend wird getrocknet.
- Eine andere Möglichkeit wäre, das oder die Oxidationsmittel sowie gegebenenfalls Detergentien oder/und Salze sowie eventuell weitere Hilfsstoffe in Reagenzfilme einzubringen. Hierzu werden die Substanzen bzw. Substanzgemische z. B. entsprechend Verfahren gemäß DE-PS l 598 l53 oder DE-OS 2 9l0 l34 zu Reagenzfilmen verarbeitet.
- Zur Beseitigung störender unspezifisch reduzierend wirkender oder/und trübungsverursachender Probenbestandteile wird die zu messende Probe zunächst mit einem Träger in Verbindung gebracht, der das oder die Oxidationsmittel sowie gegebenenfalls ein oder mehrere Detergentien oder/und Salze enthält. Nach ausreichendem Kontakt wird die vorbehandelte Probe in eine Schicht überführt, welche die weiteren zur Farbreaktion erforderlichen Reaktionsbestandteile enthält. Die dabei bewirkte Farbänderung wird in bekannter Weise photometrisch, z. B. reflektometrisch gemessen. In Bezug auf die Zeitintervalle für die Vorreaktion und für die Farbreaktion gelten die oben gemachten Ausführungen.
- Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzgemisch zur spezifischen Bestimmung des Serumfructosamingehaltes in Blut oder von Blut abgeleitete Proben, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es aus einem Reagenz zur Beseitigung unspezifisch reduzierend wirkender oder/und trübungsverursachender Probenbestandteile, einem Umpufferungsreagenz mit einem Puffer, der einen pH-Wert im Bereich von l0,5 - l2,5 aufweist und einem Farbreagenz zum Nachweis des Fructosamins besteht. Dieses Reagenzgemisch enthält alle zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens notwendigen Bestandteile.
- Das Reagenz zur Beseitigung unspezifisch reduzierend wirkender oder/und trübungsverursachender Probenbestandteile in Blut oder von Blut abgeleiteten Proben besteht aus einem oder mehreren enzymatischen oder/und nichtenzymatischen Oxidationsmitteln sowie gegebenenfalls Peroxidase oder/und Katalase
oder/und Lipase sowie gegebenenfalls einem oder mehreren Detergentien oder/und Salzen starker Säuren
sowie gegebenenfalls üblichen Zusatzstoffen
in einem Puffer mit annähernd neutralem pH-Wert. - Unter enzymatischen Oxidationsmitteln sind insbesondere Ascorbat-Oxidase, Bilirubin-Oxidase und Uricase und unter nichtenzymatischen Oxidationsmitteln sind besonders Hypochlorit und hypochloridliefernde Verbindungen zu verstehen.
- Die in dem erfindungsgemäßen Reagenz zur Beseitigung unspezifisch reduzierend wirkender oder/und trübungsverursachender Probenbestandteile in Blut oder in von Blut abgeleiteten Proben gegebenenfalls enthaltenen Detergentien können anionisch oder nichtionisch sein. Während als anionische Detergentien vor allem Alkali- oder Erdalkalisalze von Gallensäuren und ihrer Konjugate bevorzugt werden, steht für nichtionische Detergentien eine breite Palette von Detergentien zur Auswahl. Als geeignet haben sich vor allem lineare oder verzweigtkettige Alkyl- oder Alkylaryl-Alkohol-Polyglycoläther mit 8 - 20 C-Atomen im Alkoholteil und 4 bis l5 Glycoleinheiten pro Molekül erwiesen. Die zugesetzten Detergentien können jedoch zusätzlich auch kationische Detergentien sein, wie beispielsweise Oxyethylalkylammoniumphosphat (z. B. Dehyquart®SP der Fa. Henkel).
- Ganz besonders wirksam ist ein Gemisch von enzymatischen oder/und nichtenzymatischen Oxidationsmitteln, wenn es Chloramin T und gleichzeitig ein kationisches Detergens, beispielsweise Dehyquart®SP enthält.
- Als Salze starker Säuren haben sich für das erfindungsgemäße Reagenz Alkali- oder Erdalkalisalze von Salz- oder Schwefelsäure als geeignet gezeigt. Besonders bevorzugt werden Kalium- oder Natriumchlorid.
- Der zur Erzielung eines annähernd neutralen pH-Wertes des erfindungsgemäßen Reagenzes erforderliche Puffer weist einen pH-Wert in dem Bereich von pH 6 - 9, vorzugsweise pH 7 - 8,5, ganz besonders bevorzugt pH 7,5 - 8,0 auf. Die Pufferkonzentration beträgt vorzugsweise l0 - l00 mmol/l, ganz besonders bevorzugt 20 - 70 mmol/l. Als besonders vorteilhaft hat sich wässriger Kaliumphosphatpuffer erwiesen.
- Erfindungsgemäßes Verfahren und Reagenzgemisch sind in den folgenden Beispielen weiter erläutert.
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Wellenlänge: 546 nm
Temperatur: 37° C
Schichtdicke: l0 mm (Halbmikroküvette)
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- Die Konzentration in der Probe wird in "l-Desoxymorpholinofructose-Einheiten" (DMF-Einheiten) angegeben. Zur Kalibrierung wurde der Eichstandard aus dem Fructosamin-Test der Fa. Roche, Basel, Schweiz (Art.-Nr. 07-ll2l-7) verwendet.
- Eine Darstellung des Extinktionsverlaufs beim Testansatz nach dem erfindungsgemäßen Verfahren (Kurve l) im Vergleich zur Methode von Johnson et al., Clin. Chim. Acta (l982) l27, 87 - 95 (Kurve 2), wobei der Eichstandard aus dem Fructosamintest der Fa. Roche, Basel, Schweiz als Probenmaterial diente, ist in Abb. l wiedergegeben.
- Zur Überprüfung der Linearität der Extinktionsänderung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde ein Humanserum mit l-Deoxy-l-morpholinofructose (DMF) stufenweise aufgestockt und der Test entsprechend Beispiel l durchgeführt.
- Wie aus Abb. 2 ersichtlich, ist die Extinktionsänderung/Minute bis mindestens l0 mmol/l linear proportional der DMF-Konzentration in der Probe.
- Zur Untersuchung des Einflusses von Bilirubin auf das Meßsignal im erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung von Fructosamin wurde ein Humanserum mit Bilirubin bis zu einer Konzentration von l2 mg/dl stufenweise aufgestockt und der Test wie in Beispiel l beschrieben durchgeführt.
- Wie aus Abb. 3 zu ersehen, führt bei der Fructosamin-Bestimmung nach dem Verfahren von Johnson et al., Clin. Chim. Acta (l982) l27, 87 - 95 (Kurve l), bereits eine Bilirubin-Konzentration von 2 mg/dl zu einem um ca. 40 % erhöhten Meßsignal, während es im erfindungsgemäßen Testverfahren (Kurve 2) bis zu mindestens l2 mg/dl Bilirubin völlig unbeeinflußt bleibt.
- Zur Bestimmung des Einflusses von Harnsäure auf das Meßsignal wurde Humanserum mit verschiedenen Mengen an Harnsäure aufgestockt und einmal nach dem Verfahren von Johnson et al., Clin. Chim. Acta (l982) l27, 87 - 95, zum anderen nach der erfindungsgemäßen Methode analog Beispiel l ein E/t-Diagramm aufgenommen.
- Während beim Test nach Johnson et al. bereits bei einer HarnsäureKonzentration von l3,7 mg/dl ein gegenüber dem Ausgangswert (6,9 mg Harnsäure/dl) um l3 % erhöhtes Signal gefunden wurde, bleibt der Test gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren von Harnsäure bis zu Konzentrationen von ca. 30 mg/dl praktisch unbeeinflußt.
- Zur Bestimmung des Einflusses von Ascorbinsäure auf das Meßsignal wurde Humanserum mit verschiedenen Mengen an Ascorbinsäure aufgestockt und einmal nach dem Verfahren von Johnson et al., Clin. Chim. Acta (l982) l27, 87 - 95, zum anderen nach der erfindungsgemäßen Methode analog Beispiel l ein E/t-Diagramm aufgenommen.
- Während beim Test nach Johnson et al. mit steigender Ascorbinsäurekonzentration die Wiederfindungsrate zunehmend sinkt, bleibt der Test gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren bis zu Konzentrationen von ca. 50 mg/l praktisch unbeeinflußt.
- Im Testansatz entsprechend Beispiel l wurde als Probe stark hyperlipämisches Serum (Triglyceride, 2000 mg/dl) eingesetzt.
- Wie aus Abb. 4 ersichtlich, wird im ersten Inkubationsschritt bereits nach 5 Minuten eine vollständige und dauerhafte Trübungsbeseitigung erreicht.
- Zur Bestimmung des Einflusses von Medikamenten auf das Meßsignal wurde Humanserum mit verschiedenen Mengen unterschiedlicher Medikamente oder Medikamentenabbauprodukten aufgestockt und nach dem Verfahren von Johnson et al., Clin. Chim. Acta (l982) l27, 87 - 95 sowie nach dem erfindungsgemäßen Verfahren analog Beispiel l ein E/t-Diagramm aufgenommen.
- Es wurden in einem Modellversuch Lösungen mit verschiedenen Konzentrationen an Rinderserumalbumin (RSA) in physiologischer Kochsalzlösung hergestellt, einmal ohne Zusatz von l-Deoxymorpholinofructose (DMF) für die Leerwertermittlung, zum anderen unter Zusatz einer konstanten Menge an DMF (2,5 mmol/l). Der Test wurde sowohl nach der Methode von Johnson et al., Clin. Chim. Acta (l982) l27, 87 - 95, als auch nach dem erfindungsgemäßen Verfahren entsprechend Beispiel l durchgeführt.
- Wie aus der Tabelle zu ersehen, wird das von DMF in der Probe erzeugte Meßsignal im Test nach Johnson et al. bei steigenden Proteinkonzentrationen sehr stark vermindert, während es im Test nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bis zu mindestens l00 g RSA/l praktisch unbeeinflußt von der Proteinmenge ist.
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- Die Tests wurden an einem Hitachi 704 Analysenautomaten durchgeführt. Wellenlänge: 546 nm
Temperatur: 37° C
Schichtdicke: l0 mm (Halbmikroküvette)
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- Die Konzentrationen an Fructosamin wurden analog zu Beispiel l als DMF-Einheiten ermittelt und in mmol/l auf der Ordinate der Abb. 5a aufgetragen. Diese Ergebnisse wurden gegen die Meßwerte aufgetragen, die durch Messen von Furosin mit der HPLC-Bezugsmethode (J. Clin. Chem. Clin. Biochem. l9 (l98l), S. 8l - 87) erhalten wurden. Als HPLC-Meßwerte wurden jeweils relative Peakflächeneinheiten verwendet.
- In Abb. 5b sind die Ergebnisse für eine analoge Fructosaminbestimmung dargestellt, wobei zusätzlich l,2 % Dehyquart®SP (Fa. Henkel) in Reagenz I enthalten ist.
- Abb. 5c gibt die Meßergebnisse wieder für eine analoge Fructosaminbestimmung, bei der zusätzlich 250 µM Chloramin T in Reagenz I enthalten ist.
- Abb. 5d schließlich gibt die Meßergebnisse wieder für eine analoge Fructosaminbestimmung, wobei sowohl l,2 % Dehyquart®SP als auch 250 µM Chloramin T in Reagenz I zusätzlich enthalten sind.
- Den Diagrammen 5a - d ist zu entnehmen, daß insbesondere die Kombination von Chloramin T und Dehyquart®SP den Achsenabschnitt deutlich reduziert.
Claims (17)
einem Umpufferungsreagenz mit einem Puffer, der einen pH-Wert im Bereich von l0,5 bis l2,5 aufweist und
einem Farbreagenz zum Nachweis des Fructosamins besteht.
oder/und Lipase sowie gegebenenfalls ein oder mehrere Detergentien oder/und Salze starker Säuren sowie
gegebenenfalls übliche Zusatzstoffe enthält.
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