DE69521925T2 - Analytisches Vielschichtelement zur Bestimmung von Salicylat - Google Patents
Analytisches Vielschichtelement zur Bestimmung von SalicylatInfo
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Description
- Die Bestimmung von Salicylsäure in biologischen Flüssigkeiten wie etwa menschlichem Serum ist von diagnostischer Bedeutung. Acetylsalicylsäure (Aspirin) wird als ein Schmerzmittel und als ein entzündungshemmendes Medikament bei Arthritis verwendet. Es hydrolysiert rasch zu Salicylat, welches den therapeutischen Effekt vermittelt und eine lange Halbwertzeit hat. Die therapeutische Dosis als Schmerrmittel beträgt bis zu 20 mg/dl. Zur Behandlung von Arthritis beträgt die Dosis bis zu 30 mg/dl. Bei höheren Salicylsäurekonzentrationen treten Probleme wie etwa Kopfschmerzen, Tinnitus, Hautrötungen und Hyperventilation auf, gefolgt von Ungleichmäßigkeiten des Säure-Base- Haushalts. Salicylsäurekonzentrationen über 60 mg/dl körnen letal wirken.
- U. S. Patent Nr. 4,416,983 legt ein Lösungsverfahren zur Bestimmung von Salicylsäure in Körperflüssigkeiten offen. Die Methode beruht auf den folgenden zwei chemischen Reaktionen:
- (1) Salicylsäure + NAD(P)H +
- O&sub2;-Salicylsäurehydroxylase (EC 1.14.13.1) → Pyrocatechol + CO&sub2; + H&sub2;O + NAD +
- (2) Pyrocatechol + Hydrazon +
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- Dieses Verfahren wird auf einem vielschichtigen Trockenelement, offengelegt im U.S. Patent Nr. 5,185,249, durchgeführt. Das Problem ist, daß Erlebnisse aus Tests auf Salicylsäure durch die Anwesenheit von Albumin in Serumproben beeinträchtigt werden. Indem Albumin an Salicylsäure bindet, wird seine Teilnahme an der oben beschriebenen Reaktion verhindert. Ein Ansatz, um Salicylsäure aus seiner Bindung an Albumin freizusetzen, besteht darin, den pH-Wert der Probe zu verringern. Dies ist in dem im U.S. Patent Nr. 5,185,249 offengelegten Trockentestelement nicht möglich, da das Element zugleich bei dem pH-Optimum der Enzyme funktionieren muß, die in dem Element verwendet werden.
- WO 83/00147 legt Analoga von 8-Anilin-naphthalin-1-sulfonsäure (ANS) und ihre Verwendung in Immuntests offen. Ein Einarbeiten der Analoga in eine Verteilungsschicht wird nicht nahegelegt.
- Orr et al. (Clin. Pharmacol. Ther. 31, 642-649, 1982) legt die Wechselwirkung zwischen Valproinsäure und Serumproteinen offen. Die Verwendung von Valproinsäure in einem Immmuntest wird nicht nahegelegt.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein analytisches Vielschicht-Element zur Verfügung, das einen Träger umfaßt, der in der folgenden Reihenfolge beschichtet ist, angegeben von oben nach unten zum Träger hin:
- a) eine Verteilungsschicht,
- b) eine Farbstoffschicht, die einem pH-Wert größer als 6,5 hat und die Tyrosinase und ein wasserunlösliches Hydrazon-Kopplungsmittels umfaßt,
- c) eine Sperrschicht, die ein Hindurchtreten von Molekülen mit einem Molekulargewicht von über 5,000 verhindert, und
- d) eine Reagenzschicht, die Salicylsäurehydroxylase und Nikotinamid-Adenin- Dinukleotid (NADH) umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß die Verteilungsschicht eine Verbindung umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Valproinsäure, 8- Anilin-1-naphthalinsulfonsäure (ANS) und dem Magnesiumsalz der 8-Anilin-1- naphthalinsulfonsäure.
- Die vorliegende Erfindung vermindert die Meßabweichung infolge Salicylsäurebindung, die bei Verwendung des im U.S. Patent 5,185,249 beschriebenen Elements auftritt, erheblich. Die reduzierte Meßabweichung stellt eine unerwartete Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik dar, insbesondere in Hinblick auf die hohe Meßabweichung, die auftritt, wenn 1) der Test auf dem Element des gerade erwähnten Patents aussgeführt wird und 2) Valproinsäure oder ANS dem Serum direkt zugesetzt werden.
- Mit dem oben beschriebenen Element kann der farbige Hydrazon-Katechol-Komplex aufgrund seines hohen Extinktionskoeffizienten leicht gemessen werden. Der Komplex wird innerhalb von 5 Minuten in ausreichendem Maß gebildet, um eine effective colorimetische Bestimmung der Salicylsäurekonzentration zu erlauben.
- Aufgrund der physikalischen Trennung der Salicylsäurehydroxylase von dem Hydrazon- Kopplungsagens ist die Stabilität des Elements während der Lagerung deutlich verlängert und die Empfindlichkeit ist erhöht. Die Verwendung einer mit TiO&sub2; pigmentierten Verteilungsschicht vermindert weiterhin viele spektral oder turbidimetrisch bedingten Interferenzen, die in Naßelement-Systemen beobachtet werden.
- In diesem Element werden die beiden oben im U.S. Patent 4,416,983, auf dem der Test beruht, beschriebenen Reaktionen nacheinander in getrennten Schichten des Elements durchgeführt. Die Sperrschicht erlaubt keinen Übertritt von Molekülen mit einem Molekulargewicht größer als 5,000. Das Molekulargewicht von Salicylsäurehydroxylase wird mit 91,000 beschrieben. Sie wird deshalb in der untersten Schicht unterhalb der Sperrschicht festgehalten. Das Hydrazon-Kopplungsagens ist als Hydrochlorid wasserlöslich, bei einem pH-Wert von mehr als 6,5 wird das Hydrochlorid entfernt und der Farbstoff präzipitiert aus der Lösung. In dem analytischen Element dieser Erfindung wird das Hydrazon- Kopplungsagens in einer ungepufferten Gelatineschicht bei pH 5,5 über eine auf pH 8 gepufferte Grenzschicht aufgetragen. Einmal beschichtet und getrocknet, beträgt der ph-Wert der oberen Grenzschicht aufgrund von Puffer, der aus der unteren Gelatineschicht nach oben diffindiert ist ebenfalls 8,0. Mit Ansteigen des pH-Werts fällt das 3-Methyl-2- benzothiazolinon-hydrazon-hydrochlorid (MBTH) aus der Lösung aus und wird kristallin. In dieser Form kann das MBTH des Hydrazon-Kopplungsreagenz nicht durch die dazwischenliegende Sperrschicht, die sie von der Salicylsäurehydroxylase trennt, nach unten diffundieren.
- Die vorliegende Erfindung legt auch ein Verfahren zur Untersuchung biologischer Flüssigkeiten aus Salicylsäure offen, das folgende Schritte umfaßt:
- a) Betropfen des oben beschriebenen analytischen Elements mit einer Probe, von der angenommen wird, Salicylsäure zu enthalten;
- b) Ermöglichen einer Inkubationszeit bis zu 5 Minuten oder mehr; und
- c) Durchführen einer colorimetrischen Bestimmung der in der Probe vorhandenen Salicylsäure.
- Das Element dieser Erfindung kann verwendet werden, um Salicylsäure qualitativ oder quantitativ in biologischen Flüssigkeiten von Tieren oder Menschen, bevorzugterweise jedoch von Menschen, zu bestimmen. Solche Flüssigkeiten beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Gesamtblut, Plasma, Seren, Lymphe, Galle, Urin, Spinalflüssigkeit, Sputum, Schweiß und derartiges ebenso wie Stuhlausscheidungen. Ebenfalls ist es möglich, flüssige Präparationen von menschlichem oder tierischem Gewebe wie etwa Skelettmuskulatur, Herz, Niere, Lungen, Gehirnen, Knochenmark, Haut und dergleichen zu bestimmen.
- Elemente dieser Erfindung können in verschiedenen Formen konfiguriert sein, einschließlich länglichen Bändern jeder gewünschen Breite, Blättern, Objektträger oder Chips.
- Die Elemente können bei manuellen oder automatisierten Untersuchungstechniken verwendet werden. Im allgemeinen wird bei Verwendung der Elemente eine Salicylsäurebestimmung durchgeführt, indem das Element von einer Vorratsrolle, aus einer Chip-Packung oder einer anderen Quelle genommen und physikalisch mit einer Probe (z. B. bis zu 200 ul) der zu testenden Flüssigkeit in Kontakt gebracht wird, so daß die Probe und Reagenzien innerhalb des Elements nacheinander miteinander reagieren können. Ein derartiger Kontakt kann auf jede geeignete Weise, z. B. durch Eintauchen des Elements in die Probe oder durch Untertauchen darin oder bevorzugterweise durch Betupfen des Elements von Hand oder maschinell mit einem Tropfen der Probe mithilfe eines geeigneten Spenders, herbeigeführt werden.
- Nach dem Probenauftrag wird das Element für eine Dauer von bis zu 5 Minuten oder mehr inkubiert, um die Farbentwicklung zu erleichtern. Mit Inkubation ist einfach gemeint, daß die Reagenzien für eine Dauer von bis zu 5 Minuten oder mehr miteinander in Kontakt gehalten werden, bevor Farbmessungen durchgeführt werden.
- Die analytischen Trockenelemente dieser Erfindung sind vielschichtig. Mindestens eine der Schichten ist bevorzugterweise eine poröse Verteilungsschicht. Die anderen Schichten beinhalten eine Reagenzschicht und eine Farbstoffschicht. Die Reagenzschicht beinhaltet eine Sperrzone und eine Reagenzzone. Alle vorangehenden Schichten sind auf einen Träger geschichtet. Die Schichten stehen im allgemeinen miteinander in Fließkontakt, was bedeutet, daß Flüssigkeiten und Reaktionsprodukte (z. B. Farbstoffe) übereinander angeordnete Regionen angrenzender Zonen passieren können oder dazwischen transportiert werden können. Jede Schicht kann abgegrenzt sein oder zwei oder mehrer Zonen können getrennte Bereiche in einer einzelnen Schicht des Elements bilden. Außer in den oben angesprochenen Referenzen werden geeignete Bestandteile des Elements auch z. B. in den U.S. Patenten Nr. 4,042,335 (erteilt am 16.08.1977 an Clement), 4,132,528 (erteilt am 02.01.1979 an Eikenberry et al.) und 4,144,306 (erteilt am 13.03.1979 an Figueras) beschrieben.
- Geeignete Verteilungsschichten können hergestellt werden, indem faserige Materialien, entweder gemischt mit einem geeigneten Bindematerial oder in ein Gewebe gewebt, wie beschrieben im U.S. Patent Nr. 4,292,272 (erteilt am 29.09.1981 an Kitajima et al.), polymere Zusammensetzungen oder partikuläre Materialien, z. B. ein blush-Polymer, wie im U.S. Patent Nr. 3,992,158 offengelegt, Körner, die mit oder ohne Bindeklebstoffe aneinander gebunden sind, wie in den U.S. Patenten Nr. 4,258,001 (erteilt am 24.03.1991 an Pierce et al.) und Nr. 4,430,436 (erteilt am 07.02.1984 an Koyama et al.) sowie in der Japanischen Patentveröffentlichung 57(1982)-101760 beschrieben, verwendet werden. Besonders geeignete Verteilungsschichten umfassen Bariumsulfat oder Titandioxid. Da die Probe im allgemeinen direkt auf die Verteilungsschicht aufgetragen wird, ist es wünschenswert, daß die Verteilungsschicht isotropisch porös ist, was bedeutet, daß die Porosität in jeder Richtung in der Schicht gleich ist, wie dies durch untereinander verbundene Räume oder Poren zwischen Partikeln, Fasern oder polymeren Strängen verursacht wird.
- Die Schichten können auf transparentem Trägermaterial wie etwa Poly(ethylenterephthalsäure) aufgetragen sein. Andere Trägermaterialien sind nach dem Stand der Technik bestens bekannt.
- Die Elemente dieser Erfindung können auch einen oder mehre andere Zusatzstoffe enthalten, die im allgemeinen in die Elemente aufgrund verschiedener Vorteile bei der Herstellung oder Funktion eingebracht werden. Solche Zusatzstoffe beinhalten oberflächenaktive Substanzen, Puffer, Lösungsmittel, Härter und andere Materialien, die nach dem Stand der Technik bekannt sind. Ein typisches Element der vorliegenden Erfindung wird unten dargestellt.
- Der Ansatz, der an der Lösung des Problems einer Meßabweichung bei Salicylsäurebestimmungen, verursacht durch die Gegenwart von Albumin, beteiligt war, war eine Verbindung zur Verfügung zu stellen, die Salicylsäure von dem Albumin freisetzen würde, ohne andere nachteilige Effekte auf den Test hervorzurufen. Dies wurde zunächst durch Vorbehandlung einer Patientenprobe mit ANS oder Valproinsäure untersucht. Die vorbehandelte Probe wurde dann auf das Element aus U.S. Patent 5,185,249 aufgetropft. In diesem Test wurde ANS oder Valproinsäure Serumproben mit konstanten Salicylsäurekonzentrationen, aber variierenden Albuminkonzentrationen zugesetzt. Den Vergleich der-Wiederfindungsraten der Salicylsäure auf dem Trockenelement zeigt Tabelle I. Tabelle I Wiederfindungsrate von vorbehandelten Proben (Salicylsäure-Vorraussage in mg/dl) Albumin-Konzentration (g/dl)
- Diese Untersuchung zeigte, daß sowohl Valproinsäure als auch 8-Anilin-1- naphthalinsulfonsäure (ANS) zu Patientenproben gegeben werden können, um die Albuminbedingte Meßabweichung bei einem Salicylsäuretest, der auf dem Trockenelement aus U.S. Patent 5,185,249 ausgeführt wird, zu reduzieren. Eine erhebliche Abweichung (10% Vorraussagefehler) ist bei einer Konzentration von 25 mM sowohl von Valproinsäure als auch von ANS allerdings noch immer vorhanden. Diese Ergebnisse zeigen, daß keine dieser Verbindungen die Salicylsäure-Meßabweichung in dem Element verhindern. Vorbehandlung von Patientenproben mit jeder dieser Verbindungen erfordert darüberhinaus einen zusätzlichen unerwünschten manuellen Schritt, verglichen mit einer jetzt automatisierten analytischen Funktionsweise.
- Tests auf Salicylsäure wurden auf dem Element der oben vorgestellten Erfindung unter Verwendung von ANS in der Verteilungsschicht durchgeführt. Die Ergebnisse wurden dann mit denen verglichen, die mit dem Ausgangselement ohne ANS erhalten wurden. Tabelle II Wiederfindungsrate von Salicylsäure vs. HPLC-Referenzmethode (vorgegebene Salicylsäure-Konzentration 25 mg/dl)
- Wenn ANS in der Verteilungsschicht vorhanden ist, wird die Meßabweichung infolge der Albumin-Salicylsäure-Bindung fast vollständig aufgehoben. Dies ist vollkommen unerwartet in Hinblick darauf, daß die Verwendung von ANS in einer Konzentration von 25 mmol/l bei der eine Vorbehandlungs-Methode des Element mit ANS Vergleichsbeispiels die Salicylsäure-Meßabweichung für Testzwecke nicht zufriedenstellen reduziert. Ein Durchschnittsfachmann würde lernen Ergebnisse mit der Vorbehandlungs-Methode zu erwarten, weil ANS mehr Zeit und Mobilität haben sollte das Salicylat von Albumin zu verdrängen. Einbeziehung von ANS in die Verteilungsschicht des Elements führt zu einer unerwarteten Verbesserung der Testabweichung verglichen mit der erwarteten geringfügigen Verbesserung, die man aus der Vorbehandlung von Serum mit ANS vorhergesagt hätte.
- Diese Verbesserung in der Leistung zeigt sich in einer allgemeinen Verbesserungen der Genauigkeit in tatsächlichen Patientenproben (deren Albumingehalt variiert), deren Messung auf dem erfindungsgemäßen Element ausgeführt wurde. Testergebnisse zeigten, daß die Meßabweichung in der Serumkonzentration im Bereich um 20 bis 30 mg/dl Salicylsäure bei gleichzeitig vielen Variationen in der Albuminkonzentration nahezu auf Null reduziert waren. Das verbesserte Element, mit ANS in der Verteilungsschicht, verhindert nahezu die Meßabweichung in diesem Bereich zwischen den beiden Methoden.
- In diesem Beispiel beinhaltet das erfindungsgemäße Element 1,0 g/m² Valproinsäure anstelle von ANS. Folgende Ergebnisse wurden dabei hervorgebracht. Tabelle III Wiederfindungsrate von Salicylsäure vs. HPLC-Referenzmethode (vorgegebene Salicylsäurekonzentration 25 mg/dl)
- Dieses Beispiel zeigt ebenfalls die Verminderung der Meßabweichung, wenn das erfindungsgemäße Element verwendet wird, im Vergleich zu 1) einem Element ohne Valproinsäure in der Verteilungsschicht und 2) dem entsprechenden Element plus Valproinsäure als einem Vorbehandlungsschritt, wie sie in dem Vorbehandlungsschritt des Vergleichsbeispiels verwendet wurde.
- Valproinsäure als einem Vorbehandlungsschritt, wie sie in dem Vorbehandlungsschritt des Vergleichsbeispiels verwendet wurde.
Claims (8)
1. Analytisches Vielschicht Element umfassend einen Träger, der in der folgenden Reihenfolge
beschichtet ist, angegeben von oben nach unten zum Träger hin: a) eine Verteilugsschicht b) eine
Farbstoffschicht mit einem pH größer als 6,5 und umfassend Tyrosinase und ein wasserunlösliches
Hydrazon-Kopphungsagens; c) eine Sperrschicht die den Übertritt von Molekülen mit einem
Molekulargewicht von über 5000 verhindert und d) eine Reagenzschicht, umfassend Salicylsäurehydroxylase und
Nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH) dadurch gekennzeichnet daß
die Veiteilungsschicht eine Verbindung umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
Valproinsäure, 8-Anilin-1-naphthalinsulfonsäure (ANS) und dem Magnesiumsalz der 8-Anilin-1-
naphthalinsulfonsäure.
2. Element nach Anspruch 1, wobei die Sperrschicht eine gehärtete Gelatine ist .
3. Element nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Farbstoffschicht, die Sperrschicht und die
Reagenzschicht jeweils gehärtete Gelatine umfaßt.
4. Element nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Verteilungsschicht Bariumsulfat umfaßt.
5. Element nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Verteilungsschicht Titanoxid umfaßt.
6. Element nach einen der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Hydrazon-Kopplungsagens 3-Methyl-2-
benzothiazolinon-hydrazon-hydrochlorid (MBTH) ist.
7. Element nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der ph-Wert der Spenschicht und der
Reagenzschicht ungefähr 8,0 ist.
8. Element nach einen der Ansprüche 1 bis 7, wobei eine oder mehrere Schichten im Element durch
Zonen ersetzt sind.
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