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Verfahren zur Ausschaltung störender Begleit-
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reaktionen bei enzymatischen Analysenverfahren Die Erfindung bezieht
sich auf ein Verfahren zur Ausschaltung störender Begleitreaktionen bei störender
Begleitreaktionen bei der quantitativen Bestimmung von Substraten in flüssigen Medien,
insbesondere biologischen Flüssigkeiten oder etwa Abwässern, bei denen photometrisch
oder fluorimetrisch meßbare Nachweisreaktionen herangezogen werden.
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Nur für sehr wenige zu bestimmende Substanzen, die hier kurz als
Substrate bezeichnet sind, stehen direkte spezifische Nachweisreaktionen zur Verfügung,
in denen durch wenige Reaktionsschritte ein farbiges oder fluoreszierendes Substrat-in
ein farbloses bzw. nichtfluoreszierendes Produkt umgewandelt oder umgekehrt ein
farbloses oder nichtfluoreszierendes Substrat in ein farbiges bzw.
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fluoreszierendes Produkt übergeführt wird. In den meisten Fällen müssen
demgemäß an sich unspezifische Redoxreaktio-719x-2035-SF-Bk
nen
als Indikatorreaktionen herangezogen werden, wobei eine der Menge an Substrat äquivalente
Menge an einer Indikatorsubstanz hydriert oder dehydriert wird.
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Als Indikatorsubstanzen werden Stoffe verwendet, deren Hydrierung
bzw. Dehydrierung allgemein mit dem Auftreten oder Verschwinden oder einer Änderung
der Lichtabsorption farbe) oder Fluoreszenz verbunden ist.
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Zur Beschleunigung der Redoxreaktionen verwendet man neben Redoxkatalysatoren
wie zB mehrwertigen Metallionen, Jodid, Phenazinmethosulfat ua in der biochemischen
Analytik insbesondere spezielle Redoxenzyme (Dehydrogenasen, Oxidasen), die die
selektive und in der Regel spezifische Umsetzung eines Substrates ermöglichen.
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Nach den Redoxenzymen, die man ihrer Vorteile wegen bevorzugt einsetzt,
lassen sich die Indikatorreaktionen in folgende drei Gruppen einteilen: 1. Reversible
Indikatorreaktionen, an denen NAD(P)-abhängige Dehydrogenasen unter Umsetzung von
Pyridinnucleotiden als Indikatorcoenzymen beteiligt sind: Reaktionsprinzip: Substrat
(box) Substrat (red)
Produkt (red) Produkt (oxi. Beispiel: Pyruvat
2. Reversible Indikatorreaktionen, an denen Flavin-Dehydrogenasen
und
chrÖogekie:bzw. fluorogene Redoxsubstanzen beteiligt sind: Reaktionsprinzip: Substrat
(ox)
Produkt (red) Substrat (red)
Succinat
Fumarat PMS = Phenazinmethosul-fat 3. Irreversible Dehydrierungsreaktionen von Substraten
durch Flavin-Dehydrogenasen (Oxidasen)- unter Freisetzung von Hydroperoxid mit nachfolgender
Oxidation eines (reversiblen) Indikatorsystems durch Peroxidase, Katalase oder einen
Katalysator (zB Vanadat/Jodid): Reaktionsprinzip: Substrat (red) Indikator (red)
Produkt (ox) Indikator (ox) Beispiel: Glucose
Gluconsäure
4- (p-Benzochinonmonoimino)-phenazon Entsprechend der fundamentalen Bedeutung von
Dehydrierungen beim katabolen sowie andererseits von Hydrierungen beim anabolen
Stoffwechsel stehen für eine Vielzahl natürlicher Substrate solche direkte Nachweisreaktionen
zur Verfügung.
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In biologischen Flüssigkeiten wie zB im Serum liegen viele dieser
Redox-Substrate in höheren Konzentrationen vor, so daß zumeist Probenvolumina von
nur wenigen Mikrolitern erforderlich sind. Ihr Nachweis erfolgt typischerweise so,
daß die Probe einer Reaktionsiösung zugesetzt wird, in der - neben Puffersubstanzen
zur Einstellung eines- optimalen pH-Werts - die Indikatorsubstanz sowie die spezifische
Dehydrogenase (Oxidase) gelöst enthalten sind. Nach Ablauf der Reaktionszeit wird
die der umgesetzten Substratmenge entsprechende Änderung der Lichtabsorption bzw.
der Fluoreszenz gemessen Ein Beispiel für eine solche direkte Bestimmung ist die
Analyse von Cholesterin im Serum nach folgendem Reaktionsprinzip (Test-Combination
Cholesterin, CHOD-PAP-Methode; Boehringer Mannheim GmbH): Cholesterin
Cholestenon Phenol + Aminophenazon
Das Probenvolumen beträgt bei 2 ml Reaktionslösung 20 ,ul.
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In dieser einfachen Weise läßt sich eine Substratbestimmung jedoch
nur dann realisieren, wenn Enzyme hoher Spezifität zur Verfügung stehen und die
Substratkonzentration hoch ist, dadann die Geschwindigkeit der zur Bestimmung herangezogenen
Hauptreaktion gegenüber störenden Nebenreaktionen von Begleitsubstanzen besonders
groß ist.
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Die quantitative Bestimmung von Substraten geringerer Konzentration
erfordert hingegen in der Regel zusätzliche
Schritte zur Beseitigung
von Störungen.
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Störungen treten allgemein dadurch auf, daß in der Probe weitere
Enzyme enthalten sind oder als Verunreinigungen der zugesetzten Nachweisenzyme eingebracht
werden, die die Indikatorsubstanz oder das, Indikatorcoenzym in Nebenreaktionen
mit Substanzen der Probe umsetzen. Ähnlich störend wirken in der Probe enthaltene
Substanzen, die direkt ohne enzymatische Katalyse mit den Nachweissubstanzen reagieren
können.
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Durch derartige Större,aktionen werden im Einzelfall je nach Probe
und Nachweisreaktion höhere oder niedrigere Substratkonzentrationen vorgetäuscht
und damit die Analysenergebnisse oft in erheblichem Maße verfälscht.
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Bei der oben beispielhaft angeführten Bestimmung von Cholesterin
im Serum wird der Nachweis im wesentlichen nur durch reduzierende Substanzen wie
Ascorbinsäure, Cystein oder etwa Substanzen mit freien SH-Gruppen gestört, die den
Indikatorfarbstoff zum Leukofarbstoff reduzieren. Ihre Konzentration liegt jedoch
mit insgesamt ca 30 umol/'l gegenüber der Cholesterinkonzentration von ca 6 mmol/l
bei nur etwa 0,5 %.
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Bei Harnsäure hingegen, die in einer Konzentration von etwa 300 /umol/l
vorliegt und deren Bestimmung mit Uricase in analoger Weise möglich ist (vgl. Beispieln
1und 4), beträgt die Konzentration an störenden reduzierenden Substanzen entsprechend
etwa 10 %.
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Reduzierende Substanzen stören speziell die mit Flavinenzymen katalysierbaren
Indikatorrektionen, bei
denen als Indikatorsubstanz leicht reduzierbare
Redoxfarbstoffe verwendet werden, nicht jedoch - zumindest' in Abwesenheit von Transhydrogenasen
- die Indikatorreaktionen mit Pyridinnucleotiden, da diese gegen nichtenzymatische
Umsetzungen relativ beständig sind und nur durch ausgesprochen starke Oxidations-
oder Reduktionsmittel rasch umgesetzt werden.
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Die besondere Störanfälligkeit dieser Gruppe enzymatischer Reaktionen
liegt in der Vielzahl von Dehydrogenasen begründet, die in biologischen Medien neben
den von ihnen umsetzbaren Substanzen vorkommen.
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Ein besonderes Beispiel hierfür ist das Paar Lactatdehydrogenase
(LDH)/Pyruvat, das im Serum in relativ hoher Konzentration vorkommt (Pyruvat ca
60 ,umol/l; LDH ca 180 U/l) und mit NADH als Coenzym folgende Umsetzung ergibt:
Pyruvat
Lactat.
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Das Reaktionsgleichgewicht liegt weit auf der Seite des Lactats,
so daß Pyruvat bei Anwesenheit von NADH quantitativ zu Lactat hydriert wird. Dies
bedeutet, daß zum Nachweis zugesetztes oder bei der Nachweisreaktion gebildetes
NADH in zur Pyruvatkonzentration äquimolarer Menge verbraucht wird.
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Beispiele weiterer NADH- bzw. NADPH-verbrauchender Enzym/Substrat-Paare
sind Sorbitde,hydrogenasejFructose, Malatdehydrogenase/Oxalacetat und GlatamatdehydrogenaseX
X -Ketoglutarat + Uns4, Beispiele NADH- bzw. NADPH-liefernder Paare Glucose-6-phosphatdehydrogenase/Glucose-6-phosphat,
6-Phosphogluconatdehydrogenase/6-Phosphoglucona,t sowie
etwa IsocitratdehydrogenaseJIsocitrat.
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Wegen der relativ hohen Konzentration der störenden Substanzen und
der Vielfalt störender Reaktionen müssen Indikatorreaktionen mit NAD(P)-abhängigen
Dehydrogenasen generell 'entstört' werden. Bekannte Maßnahmen sind die Abtrennung
der Enzyme aus der Probe durch Eiweißfällung zB mit Perchlorsäure und nachfolgender
Zentrifugation (manuelle und teilautomatisierte Analysendurchführung) oder durch
Dialyse (vollautomatisierte Analysendurchführung, zB mit Automaten der Fa. Teohnikon).
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Der Nachweis erfolgt dann aus dem Filtrat bzw.
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Dialysat, wobei dieses oder ein aliquoter Teil hiervon mit den in
einem Puffer gelösten Nachweissubstanzen (Indikator + Dehydrogenase) versetzt wird
(vgl. H.U.
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Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, 3. Aufl. 1974, Bd.
2, Abschnitt D).
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Da bei dieser Verfahrensweise lediglich Eiweiße und damit Enzyme
entfernt werden, störende Substrate hingegen in der Lösung verbleiben, müssen besonders
reine und spezifische Nachweisenzyme eingesetzt werden.
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Nachteilig an dieser Entstörung sind bei manueller Durchführung der
hohe Zeit- und Arbeitsaufwand für die Enteiweißung und Zentrifugation sowie die
zur Enteiweißung benötigte hohe Säurekonzentration (0,6 bis 1 N), die einen zusätzlichen
Neutralisationsschritt erforderlich macht.
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Neben den oben erläuterten direkten Bestimmungsverfahren für Redoxsubstrate
wurde eine Vielzahl indirekter Bestimmungsverfahren für Nichtredoxsubstrate
entwickelt,
wobei das Substrat in einer oder mehreren (enzymatischen) Hilfareaktionen in eine
Redoxsubstanz umgewandelt wird, die ihrerseits wiederum einer der erwähnen Nachweisreaktionen
zugänglich ist.
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Ein Beispiel für ein solches mehrstufiges Verfahren ist die Bestimmung
von Glucose über Glucose-6-phosphat (G-6-P) mit Hexokinase (HK) und Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
(G-6-P-DH): Nach Abtrennung störender Eiweiße und Enzyme der Probe durch Eiweißfällung
und Zentrifugation bzw. durch Dialyse wird das Filtrat bzw. Dialysat oder ein aliquoter
Teil hiervon mit einer Reaktionslösung versetzt, die neben Puffersubstanzen das
Hilfsenzym HK, die Hilfssubstanz ATP, das Nachweisenzym G-6-P-DH sowie das Indikatorcoenzyln
NADP enthält. Hierbei laufen folgende Reaktionen gekoppelt ab: Hilfsreaktion: Glucose
Durch die hohe Substratkonzentration (5 mmol/l) und die hohe Spezifität und Reinheit
der G-6-P-DE ist diese Bestimmung bei entefweißten Proben nahezu stdrungsfrei.
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Bei anderen Substraten hingegen, die nur in geringer Konzentration
vorliegen und oftmals mehrere Hilfsreaktionen durchlaufen müssen, steigt die Störung
durch mitreagierende
Probensubstanzen, so daß die Störreaktionen
in vielen Fällen einen höheren Indikatorumsatz hervorrufen als die eigentliche Nachweisreaktion.
Hinzu kommt, daß die wegen der geringen Substratkonzentration erforderliche hohe
Probenmenge eine Enteiweißung in der Regel ausschließt, so daß die Genauigkeit der
Bestimmung sowohl durch anwesende störende Enzyme als auch durch mitreagierende
Substanzen der Probe erheblich beeinträchtigt ist.
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In diesen Fällen begrenzt man die Auswi,rkungen der Störreaktionen
auf die Bestimmung allgemein dadurch, daß man die Probe ohne zusätzliche Maßnahmen
zur Entstörung zunächst mit einer Teilreaktionslö,sung versetzt, die nur die Substanzen
der Indikatorreaktion und bei mehrstufigen Umsetzungen auch~die Substanzen der-
Zwischenreaktionen, nicht aber das das Substrat umsetzende 'Startenzym' enthält.
Hierdurch laufen zunächst die an die Substratumsetzung anschließenden Reaktionen
ab. Zugleich reagieren auch die Probenenzyme mit den Probensubstanzen, sofern ihnen
das hierzu benötigte Coenzym zur Verfügung steht.
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Durch Teilung des Ansatzes gewinnt man zwei identische Teilansätze,
von denen der eine als Probenleerwert, der andere nach Zusatz des 'Startenzyms'als
Hauptwert weitergeführt wird. Nach Ablauf einer bestimmten, zum quantitativen Umsatz
des Substrats benötigten Reaktionszeit werden dann beide Ansätze vermessen und aus
der Differenz der beiden Meßwerte der Anteil am Gesamtumsatz ermittelt, der durch
das Substrat bedingt wurde.
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Ein typisches Anwendungsbeispiel dieser Technik
ist
das enzymatische Verfahren zur Bestimmung von Creatinin im Serum (Durchschnittsgehalt
75 ,umol/l) (Fa. Boehringer, Mannheim GmbH), Hierbei dient das Produkt (ADP) eines
Cosubstrats (ATP) aus der Abbaureaktionskette des Substrats als Startsubstanz für
eine weitere Hilfsreaktion.
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Im einzelnen laufen folgende Reaktionen ab: 1. Hilfsreaktion: Creatinin
2. Hilfsreaktion: Creatin
3. Hilfsreaktion: Phosphoenolpyruvat
Indikatorreaktion:
Zum Nachweis wird die Probe 10,5 ml Serum) mit'2,5 ml Reaktionslösung versetzt,
die außer Glycin-Phosphat-Puffer das Indikatorenzym LDH, die Indikatorsubstanz NADH;
die Hilfsenzyme PK und CK sowie die HilfssubstanzSn PEP und PRP enthält. Nach Teilung
des Ansatzes wird dem zur Ermittlung des Hauptwerts dienenden Teil das Startenzym
Creatininase zugesetzt, worauf nach Ablauf der Reaktionszeit (30 min) der Hauptwert
gegen den Leerwert gemessen wird.
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In beiden Ansätzen tritt als Störreaktion Wntergrundreaktion') ein
NADS-Verbrauch aus der Umsetzung von Pyruvat (60 ,umol/l), ADP (5 /umol/l) und Creatin
(40 umol/l) der Probe auf. Hinzu kommt der NADH-Verbrauch aus der Hydrierung sonstiger
Redoxsubstanzen durch in der Probe enthaltene Dehydrogenasen bzw. durch die als
Indikatorenzym zugesetzte, nur wenig spezifische LDH.
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Ein weiterer NADH-Verbrauch resultiert aus der Spaltung von PEP durch
Phosphatxsen sowie der Umsetzung von ATP zu ADP durch ATP-asen und Kinasen. Besondere
Bedeutung besitzt hierbei die flexokinase (0,1 U/1), die bei Zellzerfall wie zB
Hämolyse in höheren Konzentrationen auftreten und durch Katalyse der Umsetzung von
ATP mit Glucose ( 5 mmol/l) zu ADP + Glucose-6-P erhebliche Verfälschungen des Analysenergebnisses
hervorrufen kann.
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Während die Umsetzung von Pyruvat, ADP und Creatin innerhalb weniger
Minuten vollständig ist, laufen die übrigen Störreaktionen während dieser Reaktionszeit
aus kinetischen Gründen nicht vollständig ab. Beide Teilansätze müssen deshalb unter
streng gleichen Bedingungen (Temperatur, Zeit) inkubiert und gemessen werden.
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Für photometrische Messungen besonders nachteilig ist jedoch der
Umstand, daß wegen des Umfangs möglicher Störungen besonders hohe Konzentrationen
an NADH vorgelegt werden müßten, während die niedrige Konzentration des Substrats
zugleich eine- möglichst hohe Probenmenge~ erfordert, um eine hinreichende Nachweisempfindlichkeit
zu erzielen.
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Eine Empfindlichkeit von 0,050 E/1 mg-% Creatinin (was dem diagnostisch
interessierenden Grenzwert zu pathologisch erhöhten Werten entspricht) erfordert
einen Probenanteil am Endvolumen der Meßlösung von 25 %. Die Eigenabsorption des
Serums sowie die Empfindlichkeit der Photometer limitieren damit die mögliche NADH-Konzentration
im Ansatz auf maximal etwa 190 /umol/l, was einer Substratkonzentration in der Probe
von ca 950 /umol/l entspricht.
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Die mögliche NADH-Konzentration liegt somit nur wenig über der NADH-Menge,
die erwartungsgemäß in der entsprechenden Hauptreaktion verbraucht wird, so daß
eine Erschöpfung des NADH-Vorrats in der zur Ermittlung des Hauptwerts dienenden
Probe noch während der Reaktionszeit eintreten kann, wodurch dann für das zu bestimmende
Substrat zu niedrige Werte ermittelt werden.
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Da die Eigenadsorption der Probe unbekannt bleibt und ein zusätzlicher
erumleerwert am erforderlichen Probenvolumen scheitert, wird derzeit als einzige
Möglichkeit der Ausschaltung dieser Unsicherheit das Antpfeln der Probe für den
Hauptwert mit Pyruvat auf einen hierdurch noch auslösbaren Extinktionsabfall angegeben
(vgl.di,e Arbeitsvorschrift Creatinin enz., Boehringer Mannheim GmbH).
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Ein solches Verfahren läßt sich zwar bei Einzelanalysen durchführen,
ist jedoch für Serienbestimmungen nicht geeignet.
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Die anhand der derzeit üblichen Bestimmung des Creatinins aufge2eigten
Probleme treten in gleicher Weise bzw. verstärkt auch bei anderen Substraten auf,
die
an sich nach dem gleichen Prinzip (Phosphorylierung mit einer
substratspezifischen Kinase und ATP) bestimmt werden könnten, deren Bestimmung jedoch
wegen noch geringerer Konzentration an dem dann noch ungünstigeren Mengenverhältnis
von Substrat zu Störsubstanzen und den entsprechend noch ungünstigeren Reaktionsverhältnissen
scheitert.
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Einen Ausweg zeigt das in der DE-AS 24 12 354 beschriebene Verfahren,
das den obigen Spezialfall der Bestimmung von Substraten durch Phosphorylierung
mit ATP durch spezifische Kinasen und die durch LDH katalysierte Indikatorreaktion
Pyruvat + NADH
Lactat + NAD betrifft. Hiernach wird die störende Katalysewirkung in der Probe enthaltener
Enzyme auf Substanzen, die von diesen Enzymen und den Nachweisenzymen in Gegenwart
von NADH umgesetzt werden, dadurch eliminiert, daß die Probe zunächst wie bei der
Differenzmessung mit den kompletten Nachweisreagentien außer dem Startenzym inkubiert
wird. Zusätzlich wird dem Reagentiengemisch jedoch ein NADH-regenerierendes System
aus Alkoholdehydrogenase (ADH) und Alkohol zugegeben, so daß ein durch Störreaktionen
bedingter NADH-Verbrauch durch sofortige Reduktion des hierbei gebildeten NAD zur
Ausgangssubstanz NADH kompensiert wird.
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Nach Ablauf einer gewissen Inkubationszeit werden dann alle im Ansatz
enthaltenen Enzyme, dh die NADH-regenerierende ADH, die Nachweisenzyme sowie die
Serumenzyme, durch Dialyse abgetrennt, wonach dem Dialysat dann die Nachweis enzyme
einschließlich Startenzym erneut zugesetzt werden.
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Hierdurch kann zwar eine Beeinflussung des Analysenergebnisses durch
störende Nebenreaktionen endogener, dh in der Probe enthaltener NADH-Verbraucher
vermieden werden, nicht jedoch eine Ergebnisverfälschung durch Nebenreaktionen von
Begleitenzymen
des Startenzyms mit dem Probenmaterial oder den
zugesetzten Nachweissubstanzen.
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Dieses Verfahren besitzt ferner den Nachteil, daß es nur auf hochentwickelten
Analysenautomaten, nicht aber auch manuell auf üblichen, einfachen Analysengeräten
durchgeführt werden kann.
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Für dehydrierende Indikatorreaktionen, bei denen die Nachweisreaktion
NADH liefert, während die Störreaktionen NADH verbrauchen, ist schließlich überhaupt
kein Entstörungsverfahren bekannt.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Ausschaltung
störender Begleitreaktionen durch im Probenmaterial enthaltene Enzyme und mitreagierende,
unerwünschte Substrate bei der quantitativen, ggfs enztischen Bestimmung von Substraten
niederer Konzentration in flüssigen Medien, insbesondere biologischen Flüssigkeiten
und Abwässern, bei denen photometrisch oder fluorimetrisch meßbare oder verfolgbare
Nachweis reaktionen herangezogen werden, anzugeben, das einfach ist und keine besonderen
Anforderungen an die Arbeitstechnik und den Zeitaufwand stellt, auf üblichen manuell
betriebenen wie auch automatischen Analysengeräten routinemäßig durchführbar st,
keine schwer zugänglichen oder teuren zusätzlichen Reagentien erfordert und zu erhöhter
Analysengenauigkeit führt. Das Verfahren soll zugleich auf alle oben gattungsmäßig
bezeichneten photometrischen oder fluorimetrischen enzymatischen Bestimmungsverfahren
anwendbar sein.
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Ferner sollen auf dieser Basis neue quantitative enzymatische Bestimmungsverfahren
für Substrate, die
aufgrund bisher nicht auszuschaltender störender
Reaktionen von Begleitenzymen oder Begleitsubstraten nicht bestimmt bar waren, sowie
Testkits angegeben werden, mit denen störungsfre quantitative Bestimmungen von Substraten
in flüssigen Medien durchgeführt werden können.
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Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Ausschaltung störender Begleitreaktionen
von im Probenmaterial enthaltenen Enzymen und unerwünschten Substraten bei der quantitativen,
ggfs enzymatischen Bestimmung von Substraten niederer Konzentration in flüssigen
Medien durch photometrisch oder fluorimetrisch gemessene oder verfolgte Bestimmungsreaktionen
ist gekennzeichnet durch Vornahme folgender Schritte vor der Durchführung der enzymatischen
Bestimmungsreaktionen an der zu untersuchenden flüssigen Probe: (a) Denaturierung
der in der Probe enthaltenen Proteine unter Inaktivierung der Proteine mit enzymatischer
Aktivität sowie inhibierender Proteine mit einem oder mehreren Denaturierungsmitteln
und/oder (b) Beseitung störender Begleitsubstrate durch Zusatz von einem oder mehreren
Reagentien, die die Bestimmungsreaktionen störende Begleitsubstrate zu diese nicht
störenden bzw. daran nicht teilnehmenden Produkten umsetzen, sowie gegebenenfalls
(c)
Einstellung des pH-Werts der resultierenden flüssigen Probe auf einen zur Durchführung
der anschließenden Bestimmungsreaktionen geeigneten Wert und/oder Beseitigung überschüssiger
Reagentien aus Schritt (a) bzw. (b) Erfindungsgemäß werden vor der Durchführung
der eigentlichen Bestimmungsreaktionen Proteine mit enzymatischer oder inhibierender
Wirkung nicht vom System abgetrennt, sondern in ihm durch Denaturierung unwirksam
gemacht und störende Begleitsubstanzen (Begleitsubstrate) durch gezielte Umsetzung
an funktionellen Gruppen durch Oxidation, Reduktion oder Kondensation mit Carbonylreagentien
dadurch von einer Teilnahme an den Bestimmungsreaktionen oder ihrer Beeinflussung
ausgeschlossen werden, daß sie von den zur Bestimmung herangezogenen Enzymen nicht
mehr als Substrate umgesetzt werden können.
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Die enzymatische Aktivität von Enzymen ist an das Vorliegen einer
bestimmten, nativen Tertiär- oder auch Quartärstruktur gebunden; Maßnahmen, die
eine Strukturänderung hervorrufen, führen deshalb prinzipiell zu einer Aktivitätsänderung
und im allgemeinen zu einem Aktivitätsverlust, Derartige Strukturänderungen sind
ferner nur innerhalb bestimmter Bereiche reversibel, außerhalb deren bleibende Denaturierung
eintritt.
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Die Denaturierung gemäß Schritt (a) wird erfindungsgemäß mit einem
oder mehreren Denaturierungsmitteln vorgenommen, hierfür kommen etwa Harnstoff,
grenzflächenaktive Mittel wie etwa Dodecylsulfat sowie beispielsweise
Säuren
oder, Basen in Frage; die Denaturierung kann ferner auch durch, gegebenenfalls kurzzeitige,
Temperaturerhöhung erfolgen.
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Die Denaturierung wird erfindungsgemäß vorzugsweise mit Säuren oder
Basen vorgenommen, da anschließend durch Neutralisation oder Pufferung in einfacher
Weise wieder für die nachfolgenden Bestimmungsreaktionen günstige pH-Werte eingestellt
werden können, ohne daß eine Abtrennung von Substanzen erforderlich ist.
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Enzyme verlieren beispielsweise bei pH-Verschiebung über einen bestimmten,
'physiologischen' Bereich hinaus rasch ihre enzymatische Aktivität und schließlich
bei extremen pH-Werten auch die Fähigkeit zur Rückbildung des nativen und aktiven
Zustands, d. h., sie werden bleibend inaktiviert und denaturiert. Analoges gilt
auch für den Einfluß der anderen oben genannten Denaturierungsmittel.
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Die Denaturierung durch pH-Verschiebung erfolgt wesentlich früher
und bei geringerer Konzentration des Denaturierunsmittels als der in bekannter Weise
zur Fällung von Proteinen zB durch Säurefäl2ung ausgenutzte Verlust der löslichkeit.
WRrenl der Verlust der Löslichkeit primär durch die Entladung von Proteinkationen
durch Säureanionen (Säurefällung) sowie von Proteinanionen durch Basenkatlonen (Basenfällung)
ausgelöst wird, wobei die Molektilgröße der Gegenionen (zB Perchlorationen, Trichloracetationen;
Schwermetallionen, quaternäre Ammoniumionen), nicht aber die Konzentration der H+-lonen
bzw. OH -Ionen im Vordergrund steht, basiert die pH-abhängige irreversible Inaktivierung
und Denaturierung primär auf der Konzentration der H+- bzw.
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OH -Ionen. So sind neben proteinfällenden Säuren (zB Trichloressigsäure)
und Basen (zB quaternären Ammoniumbasen3 auch Mineralsäuren (zB Salzsäure) und Alkalien
(zB Kalilauge) geeignet. Zur sicheren Ausschaltung störender Enzymaktivitäten in
der flüssigen Probe, zB im Serum, genügt die Zugabe und kurzzeitige Einwirkung der
doppelten Menge 0,1 N Säure oder Lauge, und zwar unabhängig davon, ob das Denaturierungsmittel
in höheren Xonzentrationen (5- bis 10-fach, zB Perchlorsäure und Trichloressigsäuren
proteinfällende Eigenschaften besitzt oder nicht.
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Der besondere Vorteil von Säuren und Laugen als Denaturierungsmittel
liegt darin, daß sie im neutralen und schwach alkalischen Bereich unwirksam sind,
ihre denaturisrende Wirkung also durch einfache Neutralisation aufgehoben werden
kann. Eine anschließende enzymatische Umsetzung bleibt somit in der Regel völlig
unbeeinflußt. Hinzu kommt, daß wegen der geringen erforderlichen Konzentration des
Denaturierungs'mittels keine separate Neutralisation erforderlich ist, da die zur
Denaturierung vorgelegte Säure bzw. Lauge durch Zusatz einer entsprechend bemessenen
Pufferlösung, in der zugleich die übrigen Nachweissubstanzen gelöst seinkönnen,
abgepuffert werden kann. Zur Ausschaltung der durch in der Probe enthaltene Begleitenzyme
bedingten Störungen genügt somit ein einziger zusätzlicher Pipettierschritt.
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Eine geeignete Pufferlösung, die in neutralem und schwach alkalischem
Bereich eine besonders hohe Pufferkapazität besitzt, ist zB ein Gemisch aus BICIN
(N,N'-Bis-(2-hydroxyäthgrl)-glycfn) und HEPES (N-2' -Hydroxyäthylpiperazin-2-äthansulfonsiure).
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So ergibt eine Pufferlösung aus 200 mmol/l BCIN 100 mmol/l HEPES
und 35 mmol/l KOH (pH = 7,1) bei Zusatz des gleichen Volumens 0,1 N KOH einen pH-Wert
von 8,0 und eine Pufferlösung-aus 200 mmol/l BICIN 100 mmol/l HEPES und 185 mmol/l
KOH -(pH = 8,3) bei Zusatz des gleichen Volumens 0,1 N HC1 einen pH-Wert von 7,5.
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Eine weitere, erfindungsgemäß besonders geeignete Puffersubstanz
ist HEPPS (Hydroxyäthylpiperazin-propansulfonsäure).
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Die Inaktivierung der in der Probe enthaltenen stören den Begleitenzyme
reduziert bei Bestimmungen von Substraten, die direkt durch NAD(P>,-abhängige
Dehydrogenasen umgesetzt werden können zugleich auch die Störung durch sonst mitreagierende
Begleitsubstanzen der Probe auf ein Minimum, da mangels Katalysator nur noch Umsetzungen
aus Nebenaktivitäten der Nachweisenzyme (geringe Spezifität! oder durch deren Begleitenzyme
(geringe Reinheit) möglich sind.
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Die erfindungsgemäße Ausschaltung störender Enzymaktiei täte durch
pH-abhängige Denaturierung entspricht demgemäß nicht den bekannten Verfahren der
Enteiweißung, bei denen ein Trennungsschritt erforderlich ist, ist demgegenüber
einfacher und ergibt eine höhere Analysenempfindlichkeit aufgrund der gegenüber
der Enteiweißung, Teilprobenentnahme und Neutralisation geringeren Verdünnung.
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Störende Begleitsubstrate werden erforderlichenfalls im erfindungsgemäßen
Verfahrensschritt (b) durch Zusatz
von Reagentien beseitigt, die
die unerwünschten Begleitsubstrate zu Produkten umsetzen, die an den Bestimmungsreaktionen
nicht teilnehmen bzw. diese nicht stören. Diese Umsetzung kann zugleich mit oder
unabhängig von der Denaturierung vorgenommen werden.
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Die Art der eingesetzten Reagentien hängt dabei vom jeweiligen Analysenverfahren
ab.
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In Schritt (b) werden erfindungsgemäß zur Beseitigung störender Begleitsubstrate
Oxidationsmittel, Reduktionsmittel oder Carbonylreagentien verwendet.
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Als Carbonylreagentien sind erfindungsgemäß prinzipiell alle bekannten
Carbonylreagentien anwendbar, beispielsweise Hydroxylamin, Hydrazin(e) und/oder
Semicarbazid(e); unter den Semicarbaziden ist Thiosemicarbazid besonders bevorzugt.
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Bei Bestimmungen, bei denen das Substrat beispielsweise durch FAD-Enzyme
umgesetzt wird, lassen sich die durch unerwünschte Enzyme in der Ausgangsprobe verursachten
Störungen durch die Denaturierung nach Schritt (a} ausschalten, jedoch stören hier
zusätzlich reduzierende Substanzen, da diese den Indikatorfarbstoff reduzieren und
so die erhaltenen Substratwerte erniedrigen. Diese störenden Begleitsubstrate werden
entsprechend erfindungsgemäß durch Zugabe eines Oxidationsmittels vor der Durchführung
der eigentlichen Bestimmung selektiv oxidiert
Das Oxidationsmittel
muß hierbei in Bezug auf die maximal mögliche Konzentration reduzierender Störsubstanzen
im Uberschuß zugegeben werden und nimmt mit dem nicht verbrauchten Anteil zB an
der Farbreaktion teil, so daß der Ansatz bereits eine Färbung aufweist. Zum Nachweis
wird dann der Ansatz geteilt und der zur Ermittlung des Hauptwerts dienenden Probe
die spezifische Dehydrogenase (Oxidase) zugesetzt.
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Ein besonders bevorzugtes Oxidationsmittel ist H202, da es in saurer
Lösung allgemein anwendbar ist und zudem mit Katalase leicht qwuantitativ aus dem
Reaktionsansatz wieder entfernt werden kann, so daß der Ansatz praktisch keine Vorfärbung
aufweist.
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Um eine Mitoxidation des Substrats zu vermeiden, muß das Redoxpotential
des verwendeten Oxidationsmittels unter dem des Substrats liegen.
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Ein Anwendungsfall und ein wegen der leichten Oxidierbarkeit dieses
Substrats zugleich besonders schwieriges Beispiel ist die Bestimmung von Harnsäure
zB mit Uricase: Beispiel t: Direktbestimmung von Harnsäure mit einem Redoxindikator
nach folgendem Reaktionsschema:
Das System ist in stark saurem Medium geqenkurzzeitige Einwirkung von H202 beständig;
erfindungsgemäß wird wie folgt verfahren: 1. Versetzen der Probe (zB Serum) mit
0,1 N Säure (zB Salzsäure) mit einem Gehalt von 0,2 mmol/I H202 2. Zugabe einer
Pufferlösung mit Katalase zur Entfernung von überschüssigem H2O2, 3. Zugabe der
Nachweissubstanzen (Redoxindikator, zB Phenol, Aminophenazon, Peroxidase), 4. Teilung,
des Ansatzes und Zugabe von Uricase zu der zur Bestimmung des Hauptwerts dienenden
Probe.
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Beispiel 2: Nichtenzymatische Harnsäurebestirnmung mit Folin-Denis-Reagens:
Die Reaktion mit Folin-Denis-Reagens (Hersteller Merk, Artikel 9022) ist seit langem
bekannt (erstes Harnsäure-Bestimmungsverfahren); aufgrund der durch
Störsubstanzen
bedingten, stets zu hohen Analysenwerte <Überwerte) wurde dieses Bestimmungsverfahren
jedoch aufgegeben.
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Die erfindungsgemäße Beseitigung der reduzierenden Störsubstanzen
erfolgt bei dieser an sich bekannten Verfahrensweise durch selektive Oxidation beispielsweise
in alkalischem Medium mit Komplexen des zweiwertigen Kupfers mit Äthylendiamintetraessigsäure
(EDTA), Triäthanolamin, Glycolen udgl. Im vorliegenden Fall wird Cu(II)-EDTA als
selektives Oxidationsmittel eingesetzt.
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Die erfindungsgemäße Entstörung der Bestimmungsreaktion ist so wirksam,
daß die Harnsäure zB im Serum mit hoher Spezifität durch eine nachgeschaltete stärkere
Oxidationsreaktion, hier mit Phosphorwolframsäure, als 'Restreduktion' quantitativ
erfaßt werden kann.
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Es wird folgende Reaktions-Pufferlösung verwendet: 0,3 mol/l Natriumcarbonat
0,2 mmol/l Cu(II,)-EDTA 0,15 % sek. Alkylsulfat (Teepol) 0,1 % Dodecylsulfat.
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Als Oxidationsmittel für die Nachweisreaktion bzw.
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Chromogen wird handelsübliches Folin-Denis-Reagens verwendet.
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Zum Nachweis werden beispielsweise 0,2 ml Serum mit 2,0 ml der obigen
Reaktions-Pufferlösung versetzt.
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Nach Ablauf einer Wartezeit von etwa 10 min wird die Probe in an
sich bekannter Weise vermessen (Leerwert), worauf anschließend durch Zugabe von
50 /ul Folin-Denis-Reagens die Farbreaktion ausgelöst wird.
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Gemessen wird die nach 1 min entstandene Färbung durch Extinktionsmessung
bei 578 nm (Hg) (Schichtdicke 10 mm, Extinktion x 40 = mg/100 ml).
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nahezu Die erzielbare Genauigkeit entspricht/der Genauigkeit bisher
üblicher enzymatischer Harnsäurebestimmungen, weist jedoch diesen gegenüber die
Vorteile einer erheblichen Zeit- und Arbetseinsparung auf.
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Besondere Bedeutung besitzen ferner diejenigen Oxidationsmittel, bei
denen der Oxidationsvorgang mit einem Verbrauch von H+-Ionen verbunden ist. Sie
besitzen den besonderen Vorteil, dafs ihr Oxidationsvermögen , das nur in saurem
Medium vorliegt, durch einfache Neutralisation bzw pH-Abstumpfung aufgehoben werden
kann. Zudem läßt sich ihr RedoxpotentiaL durch Veränderung des pH auf jeden beliebigen
Zwischenwert zwischen dem Höchstwert in stark saurem Bedium und dem Niedrigstwert
in alkalischem Medium einstellen.
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Ein Beispiel eines solchen Oxidationsmittels ist Dichromat/Chromat,
dessen Redoxpotential (Eo) zwischen + 1,36 V (pH = 0) und - 0,12 V (pH = 14) variiert
werden kann.
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Derartige Oxidationsmittel lassen sich somit optimal dem Substrat
bzw. dem Verwendungszweck anpassen So ist es beispielsweise möglich, im Neutralbereich
Ascorbat durch Chromat, das durch Komplexbildung zP, mit Titriplex IV aktiviert
wurde, zu oxidieren ohne das Indikatorsystem Phenol 4 Aminophenazon zu beeinflussen.
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SH-Verbindungen werden unter diesen milden Bedingungen jedoch nicht
mehr oxidiert, lassen sich jedoch problemlos durch Alkylierung, zB durch N-Äthylmaleinimid,
entstören.
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Allgemein wird also bei dieser Verfahrensweise ein Oxidationsmittel
und ein Alkylierungsmittel verwendet.
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Der entsprechende Testkit enthält dementsprechend neben der ggfs
erforderlichen Lösung zur Denaturierung gemäß Schritt (a) eine Lösung des Alkylierungsmittels
und des Oxidationsmittels, eine Aminophenazonlösung sowie eine Lösung des Startenzyms.
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Beispiel 3: Bestimmung von Harnsäure.
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Da Harnsäure gegen Chromat selbst in stärker saurem Medium beständig
ist, läj3t sich Harnsäure nach diesem Verfahren erstmals direkt im Serum mit Uricase
und Phenol-Aminophenazon-POD als Indikatorsystem störungsfrei nachweisen, was bislang
nur im Dialysat möglich war (Uricase-Papp-Methode für Technikon-Automaten).
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Reaktions-Pufferlösunq: 0,1 .M/1 Phosphatpuffer, zB 50 rnM/l KH2PO4
50-mM/l K21SP04 pII = 6 , 8 1 mM/l Chromat (als Titriplex-IV-Komplex) 25 mM/l Phenol
0,5 mM/l N-Athylmaleinimid 1 mM/1 Aminophenazon 3 kU/l POD 0,5 % Detergens, zB Thesit
(lydroxypolyäthoxydodecan), Triton X-100 (Octylphenolpolyäthylenglycoläther
)
Startenzym: 5 U/ml Uricase Zum Nachweis werden zB 0,2 ml Serum mit 2,0 ml Reaktions-Pufferlösung
versetzt.
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Nach Ablauf einer Wartezeit von mindestens 15 min wird die Probe zur
Ermittlung von Serum-Leerwert und Hauptwert geteilt und die Farbreaktion durch Zugabe
von 20 ul Enzymreagens zur Lösung für den Hauptwert ausgelöst.
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Gemessen wird die nach 45-60 min entstandene Farbe.
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Die Entstörung von Ascorbat läßt sich in elegantester Weise enzymatisch
durch Ascorbatoxidase vollziehen, wodurch bei Kopplung mit der Entstörung von SH-Verbindung
zB mit N-Äthylmaleinimid ideale Voraussetzungen für Substratnachweise mit Oxidasen
gegeben sind.
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Beispiel 4: Bestimmung von Harnsäure.
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Die obige Verfahrensweise läßt sich vorteilhaft zur H,arnsaurebestimmunq
heranziehen.
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Reaktions-Pufferlösung: 0,1 M/l Boratpuffer, zB 0,1M/lBorsäure 0,025M/l
Tris PH 7,1
25 mM/l Phenol 0,5 mM/l N-Äthylmaleinimid 1 mol Aminophenazon
3 kU/l POD 400 U/1 Ascorbatoxidase 0,5 % Detergens-, zB Thesit Startenzym: 5 U/ml
Uricase.
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Zum Nachweis werden 0,2 ml Serum mit 2,0 ml Reaktions-Pufferlösung
versetzt. Nach Ablauf einer Wartezeit von mindestens 10 min wird die Probe ausgemessen
zur Bestimmung von Serum-Leerwert und Hauptwert geteilt.
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Durch Zugabe von 40 /ul Enz ymreagens zum Gesamtansatz bzw 20 Zul
zur Lösung für den Hauptwert wird die Farbreaktion ausgelöst.
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Gemessen wird die nach 15-30 min entstandene Farbe.
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Ein Testkit zur Durchführung dieser Verfahrensweise mit Ascorbatoxidase
enthalt dieses Enzym aus Haltbarkeitsgrtinden in einer separaten Lösung.
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Während die Entstörung direkter Nachweisreaktionen darauf gerichtet
ist, lediglich die störenden Substanzen zu oxidieren, das Redoxsubstrat selbst hingegen
vor unbeabsichtigter Oxidation zu schützen, besteht bei indirekten Nachweisreaktionen,
bei denen das Substrat oder ein Reaktionspartner erst in eine Redoxsubstanz umgewandelt
werden muß oder deren Bildung auslöst, das Prinzip der erfindungsgemäßen Störungsbeseitigung
gerade darin, in der Probe vorliegende und von den Indikatorenzymen umsetzhare Redoxsubstanzen
einer chemischen Umsetzung zuzuführen.
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Ein prinzipieller erfindungsgemäßer Weg zur Entfernung solcher Substanzen
besteht in der Oxidation.
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Dies gilt insbesondere auch für die von MAD(P)-abhängigen Dehydrogenasen
umgesetzten Redoxsubstanzen, die sich allgemein folgenden Gruppen zuordnen lassen:
Alkohol Hydroxysäure Aldehyd
Aldehyd/Keton & -Ketosäure Carbonsäure Hierbei laufen die NAD(P)H-verbrauchenden
Umsetzungen Ketosäure ^ Hydroxysäure und Aldehyd e Alkohol sowie die NAD(P)H-liefernde
Umsetzung Aldehyd VCarbonsäure meist quantitativ ab, während die Gegenreaktion durch
Carbonylreagentien erzwungen werden muß. 7ur Entstorung liegen somit vorwiegend
Aldehyde und a -Ketocarbonsäuren vor, die durch stärkere Oxidationsmittel wie zB
Cer(IV), Hypochlorit, alkalisches H202 udgl meist glatt zu Carbonsäuren (w -Ketosäuren
unter Decarboxylierung) oxidiert werden.
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Das Verfahren der Oxidation hat den Vorteil, daß zugleich beide Partner
des störenden Redoxsystems entfernt werden können. Nachteile sind, daß das Substrat
eine hinreichende Oxidationsbeständigkeit besitzen und der Überschuß des Oxidationsmittels
durch Zugabe eines Reduktionsmittels aus dem Ansatz entfernt werden muß.
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Brauchbare Reduktionsmittel, gegen die NAD(P) stabil ist, sind zB
Thiosulfat und SH-Verbindungen wie Cystein oder Glutathion.
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Eine weitere erfindungsgemäße Möglichkeit zur Beseitigung von Aldehyden,
Ketonen und Ketosäuren, deren alleinige Entfernung in der Regel ausreicht, besteht
in ihrer Umsetzung mit Carbonylreagentien. Hierfür sind im Prinzip sämtliche Carbonyireagentien
geeignet, die
mit den zu beseitigenden, dh in nicht stö-rende Produkte
umzuwandelnden Substanzen im neutralen bis schwacli alkalischen pH-Bereich stabile
Verbindungen eingehen.
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Hierzu eignen sich beispielsweise auch die in bekannter Weise zur
Verschiebung von Reaktionsgle-ictlgearichten (etwa bei der Bestimmung von Gly-cerin,
Lactat, ethanol udgl,(vgl. H.U. Berqmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, 3.
Aufl. 1974, Bd. 2, S. 1448, 1538 bzw. 2098) als Carbonylfänger eingesetzten Verbindungen
Hydrazin und Semicarbazid, Wie bei den Oxidationsmitteln ist auch hier im allgemeinen
die Entfernung eines Reagentienüberschusses aus dem Ansatz erforderlich, um die
bei der'Nachweisreaktion entstehenden Carbonylverbindungen nicht der Indikatorreaktion
zu entziehen.
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Zur Entstörung besonders geeignet ist Thiosemicarbazid, das gegenüber
Carbonylverbindungen wie zB Pyruvat oder Acetaldehyd in saurem Medium ein sehr hohes,
inneutralem oder schwach alkalischem Medium hingegen ein nur sehr geringes Reaktionsvermögen
besitzt, so daß es auch bei großem Über schuß die Nachweisreaktion nicht beeinträchtigt,
also auch nicht entfernt werden muß. Hinzu kommt die besonders hohe Stabilität der
Reaktionsprodukte mit Thiosemicarbazid, Durch Zugabe von Thiosemicarbazid zur gemäß
Schritt (a) beispielsweise eingesetzten Säure läßt sich somit bei indirekten Nachweisreaktionen
mit NAD(P)-abhängigen Dehydrogenasen als Indikatorenzymen in einfachster Weise eine
kombinierte und umfassende Entstörung realisieren, wobei gegenüber der herkömmlichen,
gestörten -Verfahrensweise lediglich ein zusätzlicher Pipettierschritt, jedoch keine
Abtrennung von überschüssigem Thiosemicarbazid',
erforderlich ist.
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Beispiel 5: Bestimmung von Creatinin.
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Das Beispiel bezieht sich auf die Bestimmung von Creatinin, beispielsweise
im Serum. Als-Störsubstanzen liegen hierbei Ketone, hauptsächlich α -Retosäuren
bzw.
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Pyruvat, vor.
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Die erfindungsgemäße Creatinin-Bestimmung dient zugleich als Modellbeispiel
für die Bestimmung sämtlicher Substrate, die einer Phosphorylierung mit ATP zugänglich
sind.
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Verwendete Lösungen: 1. Denaturierungsmittel + Reagentien zur Beseitung
störender Begleitsubstanzen (= 'Entstörungsreagens'): 0,1 N HCl 0,5 mmol/l Thiosemicarbazid
0,5 % Detergens (zB Hydroxylpolyäthoxydodecan udgl).
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2. Neutralisations/Reaktions-Pufferlösung 400 mmol/ 1 Hydroxyäthylpiperazin-propansulfonsäure
(HEPPS) 455 mmol/l NaOH 5 mmol/1 Mg-acetat
300 /mol/1 NADH 1600
/mol/1 ATP 800 /umol/l PEP 16 kU/l CK 8 kU/l PK 16 kU/l LDH
vorzugsweise durch Auflösen einer entsprechenden Reagentientablette eingebracht
3. Creatininase 350 U/ml Zur Durchführung der Bestimmungsreaktion werden 400 /Ul
Serum mit 1000 /ul des obigen Entstörungsreagens versetzt.
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Nach 3 min oder später werden 1000 /ul der Neutrallsations/Reaktions-Pufferlösung
zugesetzt und gut gemischt.
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Zur Bestimmung des Hauptwerts werden dem Ansatz 1000 /ul entnommen
und mit 10 ul Creatininase versetzt.
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Nach 30 min wird der Hauptwert gegen den Leerwert (Restansatz) gemessen
(366 nm (Hg), 10 mm-Rüvette, x x 20,2 = mg/100 ml Creatinin).
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Gegenüber der bisherigen Verfahrensweise zur Creatinin-Bestimmung
tritt keine (beispielsweise hämolysebedingte) Störung durch NADH-Verbraucher mehr
auf, so daß eine entsprechend höhere Genauigkeit resultiert.
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In der Figur 1 sind Extinktions-Zeit-Kurven Eür die herkömmliche,
bisher übliche nicht entstörte Creatininbestimmung (Kurve A) sowie die erfindungsgemäße
Creatininbestimmung gemäß3 Beispiel 6 schematisch dargestellt: Die gestrichelte,
zur Abszisse parallele Kurve entspricht der Ausgangs-Extinktion der Probe.
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Bei der bisherigen Verfahrensweise (A) fällt die Extinktion zunächst
aufgrund der Umsetzung des vorhandenen Pyruvats mit NADH zu Lactat + NAD rasch ab,
der sich die langsamere Umsetzung von Creatin überlagert (Kurvenabschnitt A ); der
weitere Extinktions-0 abfall im Kurvenabschnitt A1 ist durch die in der Probe enthaltenen
störenden Enzyme bedingt (Proben-Leerwert).
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Der nach Zusatz von Creatininase als Startenzym (Zeit tl) gemessene
Extinktionsverla4(icurvenabschnitt A2, Proben-Hauptwert) ist zusätzlich durch die
Umsetzung des Creatinins zu Creatin und dessen Weiterreaktion hervorgerufen.
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Bei der erfindungsgemäßen Bestimmungsveise (B) fehlt aufgrund der
Entstörung der durch Pyruvat bedingte anfängliche starke Extinktionsabfall (Kurvenabschnitt
Bo) die gegenüber der Ausgangs-Extinktion zur Zeit t vorliegende Extinktionsdifferenz
entspricht detn in der Probe enthaltenen Creatin (Leerwert).
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Der Nach Zusatz der Creatininase (zur Zeit t1) resultierende Extinktionsabfall
(Kurvenabschnitt B7 (Hauptwert) gegenüber Kurvenabschnitt B1 (Leerwert) entspricht
dem in der Probe enthaltenen Creatinin.
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Aus Figur 1 ist unmittelbar ersichtlich, daß bei der herkömmlichen
Verfahrensweise wegen des permanenten Extinktionsabfalles aufgrund der Aktivität
der störenden Enzyme Haupt- und Leerwert unter standardisierten Zeit- und Temperaturbedingungen
gemessen werden müssen, während dies erfindungsgemäß aufgrund der praktisch gleichbleibenden
Extinktion des Leerwerts bei weitem nicht'in diesem Maße erforderlich ist, da sich
eine Temperaturdifferenz zwischen Hauptwert B2 und Leerwert B1 lediglich in einer
Verschiebung de.s Zeitpunkts der quantitativen Umsetzung des Creatinins äußert,
nicht aber in einer Verfälschung des xleí.werts.
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Beispiel 6: Bestimmung von Creatin.
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Es wird wie in Beispiel 5 verfahren, wobei die Creatininase (CK)
in der Neutralisations/Reaktions-Pufferlösung weggelassen und anstelle der Creatininase
als Startenzym eingesetzt wird.
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Beispiel 7: Bestimmung von Harnsäure unter Beseitigung störender
reduzierender Begleitsubstanzen Das Beispiel dient zur Erläuterung enzymatischer
Bestimmungsreaktionen, bei denen ein Aldehyd oder H202 entsteht.
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Reaktionsprinzip
Äthanol
Aceta ldehyd Katalase
Aldehyddehydrogenase Während sich das Beispiel auf die direkte Bestimmung des H202
mit einem Redoxindikator bezog, betrifft das vorliegende Beispiel die Beseitigung
störender reduzierender Begleitsubstanzen bei den Bestimmungsreaktionen.
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Verwendete Lösungen: 1. Denaturierungsmittel + Reagentien zur Beseitigung
störender Begleitsubstanzen (= Entstörungsreagens) 0,1 N HC1 0,5 mmol/l Thiosemicarbazid
Detergens (zB Hydroxylpolyäthoxydodecan udgl).
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2. Neutralisations/Reaktions-Pufferlösung 400 mmol/l HEPPS 400 mmol/l
NaOH 3 mol/l Äthanol
| 1850 kU/l Katalase vorzugs- |
| 650 U/1 Aldehyddehydrogenase weise durch |
| 650 U/l Aldehyddehydrogenase weise durch |
| 1,4 mmo1/l NAD einer |
| Lyöphilisat- |
| Re agens tab - |
| lette einge- |
| bracht |
3. Uricase Zum Nachweis werden 100 ul Serum mit 1000 /ul des obigen Entstörungsreagens
versetzt. Nach 3 min oder später werden 1000 /ul der Neutratisations/ Reaktions-Pufferlösung
zugesetzt und gut gemischt.
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Dem Ansatz werden 1000 pl zur Bestimmung des Hauptwerts entnommen
und mit 10 ul Uricase versetzt.
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Nach 15 min wird der Hauptwert gegenüber dem Leerwert (Restansatz)
bestimmt (366 nm (Hg), 10 mm-Küvette; bE x 102 = mg/100 ml).
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Bei der obigen Verfahrensweise werden im Gegensatz zu Beispiel 1
die störenden reduzierenden Begleitsubstanzen nicht selektiv durch Oxidation entfernt;
die Störungsbeseitigung erfolgt hier durch Anwendung eines hohen Alkoholüberschusses
und damit anstelle von reduzierenden Substanzen nunmehr Aldehyde (Uberwerte) sowie
NADH-verbrauchende Reaktionen, zfl Pyruvat-LDH (Unterwerte) stören.
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Bei der vorliegenden Verfahrensweise wird demgemäd auf der Ebene der
zweiten Reaktion (H202 + Alkohol) "entstört", Die zugrundeliegende Bestimmungsweise
ist an sich bekannt; herkömmlicherweise- wird der entstehende Aldehyd (Formaldehyd
aus Methanol) einer Kondensationsreaktion mit Acetylaceton unterworfen (60 min bei
37 °C, Extinktionsmessung des Kondensationsprodukts bei 405 nm); im Fall von Acetaldehyd
aus Äthanol wird der Aldehyd entweder mit NAD unter NADEI-Bildunq und Katalyse mit
Aldehyddehydrogenase (ALDH) zu Essigsäure aufoxidiert (10 - 15 min bei Raumtemperatur,
Extinktionsmessung bei 366 nm), oder mit NADH und Alkoholdehydrogenase (ADH) zum
Alkohol hydriert.
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Die herkömmlichen Verfahrensweisen mit ADH bzw. ALDLI sind im Gegensatz
zur oben erläuterten erfndungsgemäen Verfahrensweise durch mitreagierende Störsubstanzen
in ihrer Genauigkeit beeinträchtigt. Da diese Bestimmung insbesondere durch NADH-verbrauchende
Enzymreaktionen gestört wird, so daß die Konzentration des in äquimolarer Menge
zu Harnsäure gebildeten NADH ein Maximum durchläuft, liefert zB die Dehydrierung
des Aldehyds zur Säure dementsprechend lediglich bei sog. substratkinetischer Auswertung,
also bei Auswertung der Anfangssteigung der Extinktions-Zeit-Kurven bzw. der zugehörigen
Anfangsgeschwindigkeiten, einigermaßen qute Ergebnisse, während normale Konzentrationsmessungen
(PE) je nach Meßzeitpunkt und Aktivität
der Nachweisenzyme mehr
oder weniger stark ausgeprägte Unterwerte ergeben.
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Die Verhältnisse bei niedriger llarnsäurekonzentration und hoher Pyruvatkonzentration
sind schematisch in Figur 2 dargestellt, wobei Kurve A dem Extinktionsverlauf bei
der bisher üblichen Verfahrensweise und Kurve B dem Extinktionsverlauf nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren entsprechen.
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Während es bei der herkömmlichen Verfahrensweise (A) erforderlich
ist, zur Erzielung eines hinreichend genauen Analysenwertes über die Anfangsgeschwindigkeit
der Extinktionsänderung ( gestrichelte Linie) auszuwertenß was die zeitliche Venolgung
der Extinktion sowie den Einsatz einer hohen Konzentration an Aldehyddehydrogenase
relativ zur störenden LDH erfordert und praktisch nur auf Anajysenautomaten durchführbar
ist, genügt im erfindungsgemäßen Fall (B) eine Einzelmessung der Extinktion, da
sie unter entstarten Verhältnissen einen stabilen Endwert erreicht.
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Die erfindungsgemEße Entstörung führt entsprechend zu einer erheblich
verelnfachten und zugleich genaueren Bestimmung.
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Durch die erfindungsgemäße Entstörung resultiert bei geringerem Einsatz
an (teuren) Nachweisenzymen eine wesentlich höher analytische Bestimmungsgenauigkeit,
wobei die herkömmliche Verfahrensweise entsprechend völlig 'entstört' ist Durch
die erfindungsgemäße Verfahrensweise zur Beseitigung störender Begleitreaktionen
von im Probenmaterial enthaltenen Enzymen bzw. unerwünschten Begleitsubstraten werden
zahlreiche neue enzymatische Analysenverfahren zugänglich, die bisher aufgrund der
vorliegenden Störungen überhaupt nicht praktisch ausgenutzt werden konnten.
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Durch die erfindungsgemäße Verfahrensweise der Störungsbeseitigung
können ferner auch an die Spezifität wie auch die Reinheit der für den Bstimmungsreaktionen
eingesetzten Indikatorenzyme erheblich geringere Anforderungen gestellt werden,
was insbesondere bei neuen, bisher aufgrund vorliegender Störungen noch nicht zu
entsprechenden Bestimmungsreaktionen analytisch herangezogener Enzymsysteme von
besonderem Vorteil ist.
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L e e r s e i t e