DE2247608C3 - Mittel und Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Glucose - Google Patents

Description

nis der Enzymeinheiten von Glucosedehydro- io mit aromatischen Aminen wie z. B. o-Tolui<ün zu "· 10:0^25—10-.!beträgt so- Farbstoffen. Obwohl die Methode als Routinebestim-

für Ogföasen v§n>. ^muug wje.it.>verb,reitet ist, läßt ihre Spezifität zu wünn nd/oder¹'Äali^^chen üBrig da neben Glucose alle anderen Aldosen

genäse

wie

reduzierten PyTfdin-Uöenzymen un< chlorid.

2. Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Glucosedehydrogenase eine Aktivität von mindestens 2 U ml fesüösung hat.

3. Mittel zur enzymatischen Bestimmung von

Ogföasen v§n. ^g .

d/oder¹'Äali-^^chen üBrig, da neben Glucose alle anderen Aldosen ebenfalls reagieren. Eine empfindliche Störung dieses Tests tritt bei der Glucosebestimmung im Serum bei Patienten auf, welche Infusionen von Plasma-Expandern auf Dextran-Basis erhielten, da hierbei im Testgemisch Trübungen entstehen. Außerdem macht das zur Kondensation erforderliche Kochen mit Säure

Glucose nach einem der Ansprüche 1 und 2, da- ao die Bestimmung lästig und zeitraubend.

durch gekennzeichnet, daß die Pyridin-Coenzyme Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) oder Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat (NADP) sind.

4. Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Puffersubstanzen einen pH-Wert von 6,5—8.5 aufrechterhalten.

Neben dieser sogenannten o-Toluidin-Methode sind vor allem zwei enzymatische Verfahren zur Bestimmung von Glucose gebräuchlich: Die Glucoseoxidase-Methode und die Hexokinase-Methode.

Bei der Glucoseoxidase-Methode wird die Glucose unter Glucoseoxidase-Katalyse durch Sauerstoff zu Gluconsaure oxidiert, wobei Wasserstoffperoxid entsteht, das seinerseits in einer katalysierten Folgereaktion ein farbloses Chromogen zu einem Farbstoff

5. Mittel zur enzymatischen Bestimmung von

Glucose nach einem der Ansprüche 1 bis 4, da- 30 oxidiert. Als Katalysator der Folgereaktion kann z. B.

durch gekennzeichnet, daß die gegebenenfalls ent- Peroxidase dienen; ein häufig verwendetes Chromo-

haltenen Inhibitoren für Oxidasen von reduzier- gen ist o-Dianisidin. Die Giucoseoxidase ist weit-

ten Pyridin-Coenzymen Pyridin-, Purin- und/oder gehend spezifisch für Glucose, jedoch wird die Folge-

Hydroxybenzoesäurederivate sind. reaktion durch Stoffe gestört, die Wasserstoffperoxid

6. Mittel zur enzymatischen Bestimmung von 35 verbrauchen. In Körperflüssigkeiten stören insbesonl d H Abiä d Kl Wi

Glucose nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die gegebenenfalls enthaltenen Inhibitoren für Oxidasen von reduzierten Pyridin-Coenzymen 3-Acetylchinolin unaV oder Sulfosalicylsäure sind.

7. Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das gegebenenfalls enthaltene Alkalichlorid Natriumchlorid ist.

dere Harnsäure, Ascorbinsäure und Katalase. Weitere Nachteile sind die lange Analysendauer und die Tatsache, daß das Chromogen o-Dianisidin medizinisch nicht unbedenklich ist.

Als die Glucosebestimmung mit der höchsten Spezifität wird die enzymatische Bestimmung mit Hexokinase/Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase angesehen. Hierbei wird die Glucose mit Adenosintriphosphat/ Hexokinase phosphoryliert und das gebildete

8. Verfahren zur enzymatischen Bestimmung 45 Glucose-6-phosphat mit Glucose-6-phosphat-Dehyvon Glucose, dadurch gekennzeichnet, daß man drogenase zu Gluconat-6-phosphat dehydiert, wobei ein Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7 auf
die zu untersuchende glucosehaltige Probe einwirken läßt und den Gehalt an gebildetem reduziertem Pyridin-Coenzym
oder fluorimetrisch mißt.

Die wichtigste Routineanalysc im klinischen Laboratorium ist die Blutzuckerbestimmung. Sie dient zur Erkennung und zur Therapiekontrolle des Diabetes mellitus und zur Diagnose einiger anderer Stoffwechselkrankheiten.

Zur quantitativen Bestimmung des Blutzuckers benötigt man spezifische Methoden. Die ältesten Bestiinmungsarten basieren auf dem Reduktionsvermögen der Glucose, wobei Stoffe wie Kaliumhexacyanoferrat(III), Pikrinsäure oder Kupfer(ll)-ionen in alkalischer Lösung als Oxidationsmittel verwendet werder Wasserstoff auf Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat (NADP) übertragen wird; das reduzierte Coenzym wird photometrisch bestimmt. Wegen der

spektrophotometrisch 50 zentralen Stellung von Glucose-6-phosphat im Koh-

lenhydratstoffwechsel ist der Test anfällig gegen Störungen durch Fremdenzyme wie Phosphoglucose-Isomerase, Phosphoglucomutase und Gluconat-6-phosphat-Dehydrogenase. Es wird daher empfohlen, die

Störreaktionen durch Extrapolation zu eliminieren (H. U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, 2. Auflage, S. 1166, 1970, Verlag Chemie, Weinheim). Dadurch wird jedoch die Bestimmungsmethode unsicher, umständlich und zeitraubend (ca.

20 bis 30 Minuten für eine Einzelbestimmung).

Es wurde nun gefunden, daß die Nachteile der bisher in der Praxis angewandten Methoden zur Glucosebestimmung vermieden werden können, wenn man ein neues enzymatisches Mittel anwendet.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein neues Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose mittels Glucosedehydrogenase, einem Pyridin-Coenzym und Puffersubstanzen unter Bildung

von Gluconsäure und reduziertem Pyridin-Coenzym, das gekennzeichnet ist durch einen Gehalt an MutajEfjtase, wobei das Verhältnis der Enzymeinheiten von Glucosedehydrogenase zu Mutarotase 10:0,25— 10:1 beträgt sowie gegebenenfalls Inhibitoren für Oxidasen tob reduzierten Pyridin-Goenzymen und/ oder Alkalichlorid.

Femer umfaßt der Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Glucose, das darin besteht, daß man das vorstehend genannte und im folgenden näher beschriebene Mittel auf die zu untersuchende glucosehaltige Probe einwirken läßt und den Gehalt an gebildetem reduziertem Pyridin-Coenzym in an sich bekannter Weise spektrophotometrisch oder fluorimetrisch mißt.

Das neue Mittel nach der Erfindung zeichnet sich gegenüber der vorbekannten Glucoseoxidase-Methode dadurch aus, daß es spezifisch den Glucosegehalt mißt und nicht durch andere Oxidations- oder Reduktionsmittel gestört wird. Gegenüber der vorbekannten Hexokinase-Methode hat das neue Mittel den Vorteil, daß bei seiner Anwendung nur eine einstufige Reaktion verwendet wird, wobei anstelle von zwei Enzymen bei der Hexokinase-Meithode hier nur ein Enzym erforderlich ist. Da keine Indikatorreaktion nötig ist, ist auch eine dadurch bedingte mögliche Störung ausgeschaltet, was einen wesentlichen Vorteil gegenüber der GOD- und Hexokinase-Methode bedeutet.

Die Bestimmung benötigt in einer bevorzugten Ausfuhrungsform etwa 5 Minuten, womit sie bereits doppelt so schnell wie die zur Zeit schnellste enzymatische Glucosebestimmung (Hexokinase-Methode ohne Extrapolation der Störreaktion) ist. Die Umsatzzeit läßt sich durch Erhöhung der Enzymaktivitäten im Test noch wesentlich herabsetzen, so daß neben der Spezifität auch die Einfachheit und Schnelligkeit des erfindungsgemäßen Tests von keiner anderen Glucose-Bestimmung erreicht wird.

Vor längerer Zeit wurde vorgeschlagen, Glucose durch eine Indikatorfarbreaktion mit Hilfe von GIucosedehydrogenase (GDH) und Nicotinamid-adenindinuoleotid (NAD), insbesondere in Gegenwart von D'aphorase oder Xanthinoxidase, zu bestimmen (kanadische Patentschrit 7 45 087), jedoch ohne Mutarotationsbeschleuniger. In der Praxis ist Glucosedehydrogenase noch nie für diesen Zweck verwendet worden.

Aus der einschlägigen Literatur (Methods in Enzymology, Vol. IX, 92—111, Acad. Press New York, London, 1966; R.P.Metzger u.a., J. Biol. Chem. 239, 1769—1772 [1964] und 240, 2767—2771 [1965] und NG. Brink, Acta chem. Scand. 7, 1081—1088 [1953]) wa> bekannt, daß die Glucosedehydrogenase eine Reihe von ungünstigen Eigenschaften besitzt, die einer analytischen Verwendung entgegenstehen. So sind z. B. häufig die Glucosedehydrogenasen an Partikeln gebunden und/oder erweisen sich als nicht NAD- bzw. NADP-abhängig. Ferner ist bekannt, daß Glucosedehydrogenase eine geringe Aktivität und/oder eine zu geringe Stabilität aufweist. Die Michaelis-Konstanten der Glucosedehydrogenase zur Glucose betragen lediglich 0,007—2, d. h., erst in einer 0,007molaren Lösung ist das Enzym zur Hälfte mit Substrat gesättigt. Bei der üblichen Blutzuckeranalyse stehen jedoch nur etwa 0,0000001 Moi Glucose zur Verfugung. Es bestand demnach ein erhebliches Vorurteil in der einschlägigen Literatur gegen die Verwendung von Glucosedehydrogenase Sir die eazymaiische Glucosebestimmung.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es gelungen,

erstmals ein Mittel und Verfahren zur enzymatischen Glucosebestimmung mit Hilfe von Glucosedehydrogenase zur Verfugung 7» stellen, das bei einfacher Handhabung rasche und zuverlässige Ergebnisse liefert.

ίο Im folgenden wird die Erfindung näher beschrieben: Die im Mittel nach der Erfindung enthaltene GIucosehydrogenase muß möglichst rein sein. Die im Test verwendeten Aktivitäten der Glucosedehydrogenase richten sich vor allem nach der Zeit, innerhalb

der der Endpunkt der Reaktion erreicht sein soll. Die Enzymaktivität kann dabei zweckmäßigerweise in einem Bereich von etwa 2—200 U/ml Testlösung variiert werden. Vorzugsweise verwendet man 4—20 U/ml Testlösung zusammen mit dem Enzym

ao Mutarotase.

Die Herstellung der verwendeten Glucosedehydrogenase erfolgt aus Mikroorganismen, vorzugsweise aus Mikroorganismen der Gattung Bazillus, wobei das mikrobielle Ausgangsprodukt eine Glucosedehy-

»5 drogtnabe-Aktivität von mindestens 5 U/ml Rohextrakt enthält. Die weitere Aufreinigung erfolgt z. B. analog der in The Spores III, 97 (1965) beschriebenen Methode. Auf diese Weise sind lyophilisierte Glucosedehydrogenase-Präparate erhältlich, die mehr als 2 U/mg Trockensubstanz enthalten und deren gute Löslichkeit die Herstellung von Lösungen mit mehr als 200 U/ml erlaubt; die störende NADH₂-Oxydase-Aktivität beträgt weniger als 1 ¹Vm der GIucosedehydrogenase-Aktivität. Die im Vergleich mit

früher beschriebenen Präparaten um Größenordnungen bessere Qualität des Enzyms ermöglichte erst seinen Einsatz in der enzymatischen Glucosebestimmung.
Die im erfindungsgemäßen Mittel enthaltenen

♦0 Pyridin-Coenzyme sind vorzugsweise Nicotinamidadenin-dinucleotid (NAD) oder Nicotinamid-adenindinucleotid-phosphat (NADP), insbesondere NAD. Die Coenzymkoiizentration kann in den Grenzen von 2,0 mM bis 5,0 mM variiert werden, ohne daß die Reaktionsgeschwindigkeit beeinflußt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Endkonzentration im Test etwa 2,8 NAD. Anstelle von NAD und NADP können auch andere NAD-aktive Substanzen wie z. B. Thio-NAD oder Thio-NADP verwendet werden.

Da die Glucosedehydrogenase spezifisch für /3-Glucose ist, muß die im Gleichgewicht stets vorliegende α-Glucose zunächst mutarotieren, bevor sie von der Glucosedehydrognase umgesetzt wird, d. h., bei hoher

Glucosedehydrogenase-Aktivität reagiert die im Reaktionsgemisch vorhandene /^-Glucose schnell ab, was sich im steilen Extinktionsanstieg zu Beginn der Reaktion zeigt. Die langsamze Mutarotation der α-Glucose manifestiert sich in der verzögerten NADH₂-Bildung, die erst nach mehr als 30 Minuten abgeschlossen ist. Das erfindungsgemäße Mittel enthält deshalb Mutarotase. Die Beschleunigung der Mutarotation durch das Enzym Mutarotase ist zwar für Clic Glucosebestimmung mit Glucoseoxidase bekannt

(J. Okuda, I. Miwa, Anal. Biochem. 43, 312 [1971]); es war jedoch nicht naheliegend, daß bei Zusatz von Mutarotase zum Glucosedehydrogenase/ NAD-System ebenfalls eine sehr effektive Beschleuni-

Ι |Sng eintritt. Aas H. U. Bergmeyer, Methoden Für Messwagen mit hohen Genauigkeiisanforde-

% #er enzymatisesen Analyse, 2. Auflage, S. 1172, rangen, wie sie die Bestimmung der Glucose in Kör-

'% 3970, Verlag Chemie, Weinheim, ist bekannt, daß perfiüssigkeiten stellt, macht" sieh auch der Einfluß

H₊-- hochgereinigte Glucoseoxidasepräparate meist noch eines geringen Anteils an Oxidasen von reduzierten

' l£utarotase enthalten. Es wild deshalb dort vor- 5 Pyridin-Coenzymen bemerkbar. Sie bewirken, daß

geschlagen, die Reaktionszeit so groß zn wählen, das gebildete reduzierte Pyridin-Coenzym wieder

-daß mit Sicherheit auch sämtliche o431ucose um- oxidiert wird. Die als Meßgröße dienende Extinktion

I" gesetzt wird. Bei der erfiadungsgemäßen Glucose» bleibt daher nicht konstant, sondern fällt nach Er-

bestimmupg mit Glucosedtfaydrogenase soll jedoch reichen eines Maximalwertes wieder ab. Hinzu §.-- die Reaktionszeit bis auf wenige Sekunden im Ex- io kommt, daß die gemessene maximale Extiaktion gelt; tremfall verkürzt werden. Daraus ergibt sich eine ringer ist als der unter Zugrundelegung des Extink- f enorme Zeiterspanis, wenn man bedenkt, daß in tionskoeffizienten von z. B. NADH₂ errechnete Wert S großen klinischen Laboratorien täglich tausende von (ca. 3—5«/o zu niedrig bei l*/©o NADIL/Oxidase).

I_I Glucosebesrimmungen durchgeführt werden. Es ist Aus diesem Grunde ist es vorteilhaft, wenn das Mit-X-. deshalb erforderlich, dem Mittel nach der Erfindung 15 tel nach der Erfindung gegebenenfalls Inhibitoren für relativ große Mengen an Mutarotase zuzusetzen. Da Oxidasen von reduzierten Pyridin-Coenzymen entjedoch selbst hochgereinigte Mutarotase stets uagün- hält

V ästige Nebenaktivitäten besitzt, war es überraschend, Da sich die präparaüve Abreicherung der in der

daß der erfindungsgemäße Mutarotaseumsatz keinen Glucosedehydrogenase noch vorhandenen Reste von

störenden Einfluß auf die Gesanvtreaktion hat. Eine ao NADH.-Oxidase als zu aufwendig erwies, ist es

Mutarotase-Menge von zahlenmäßig 8°/« der GIu- zweckmäßig, den Störeffekt durch Einsatz von spezi-

cosedehydrogenase-Aktivität ist bereits ausreichend fischen Inhibitoren zu unterdrücken. Es wurde nun

für die optimale Reaktionsbeschleunigung; der Mu- überraschenderweise eine Reihe von Inhibitoren ge-

tarotase-Anteil kann jedoch beliebig erhöht werden, runden, die in bereits relativ geringen Konzentra-

ohne daß sich ein negativer Einfluß auf das Test- 35 tionen das Störenzym wirksam hemmen, ohne die

system bemerkbar macht. Aktivitäten von Glucosedehydrogenase oder Mutaro-

Im erfindungsgemäßen Mittel zur Glucosebestim- tase wesentlich zu beeinflussen. Es handelt sich dabei

mung beträgt das Verhältnis der Glucosedehydro- vor allem um Pyridin-, Purin- und Hydroxybenzoe-

genase-Aktivität zur Mutarotase-Aktivität etwa säurederivate.

10:0,25—10:1. Einen qualitativen Reaktionsablauf 30 Geeignet sind Pyridinderivate, die in 2- und/oder

innerhalb von 5 Minuten (was einer mehr als sechs- 3- und/oder 4-Stellung durch niederes Alkyl, Phenyl,

fachen Beschleunigung gegenüber dem analogen niederes Hydroxyalkyl, niederes Haingenalkyl, Car-

Testsystem ohne Mutarotase entspricht) erreicht man oxy, niederes Acyl, Benzoyl, Carbonamid und Amino

ζ. B. mit Aktivitäten von 4 U Glucosedehydrognase substituiert sind, wobei in 5,6-Stellung ein Benzol-

und 0,4 Einheiten Mutarotase pro ml Meßansatz. Bei 35 kern ankondensiert sein kann, wie z. B. Nicotinsäure,

20 U Glucosedehydrogenase und 2 Einheiten Muta- Nicotinsäureamid, 2-Amino-4-methyl-pyridin, 2-Me-

rotase pro ml Testlösung beträgt die Umsatzzeit z. B. thyl-3-(/J-hydroxyäthyl)-pyridin, 3-Hydroxymethyl-

weniger als eine Minute. Bei Einsatz von mehr als pyridin, 2-Hydroxymethyl-pyridin, 2-Benzol-pyridin,

100 U Glucosedehydrogenase und 10 Einheiten Mu- Chinolinsäure-a-methylester, 3-Acetylchinolin, Cht-

tarotase pro ml Testlösung können Umsatzzeiten in 40 naldinsäure, Chinolyl-2-chllormethan, Chinaldin,

der Größenordnung von 10 Sekunden erreicht wer- 2-Phenyl-chinolinsäureamid und/oder Atophan. Vor-

den. Allerdings müssen in diesem Fall die Enzyme zugsweise verwendet man 3-Acetylchtnolin, Nicotin-

höher aufgereinigt werden oder die störenden Neben- säure, Chinolyl-2-chlormetham, Chinaldinsäure und/

akitivitäten müssen unterdrückt werden. oder Nicotinsäureamid, insbesondere 3-Acetylchino-

Zur Erzielung eines schnellen und qualitativen 45 lin.

Glucoseumsatzes, zur Beseitigung bzw. Unterdrük- Geeignete Purinderivate sind z. B. Harnsäure, Cof-

kung störender Nebenaktivitäten und zur Stabilisie- fein. Theophyllin oder Purine, die in 2- und/oder

rung der Glucosedehydrogenase enthält das Mittel 6-Stellung Hydroxy- und/oder Aminogruppen und

nach der Erfindung gegebenenfalls noch weitere Be- in 7-Stellung einen Ribose- oder Desoxyriboserest

standteile, wie Inhibitoren für Oxidasen von redu- 50 tragen, wie z. B. Xanthosin, 2-Desoxyguanosin, Ino-

zierten Pyridin-Coenzymen und/oder Alkalichlorid. sin usw. Besonders geeignet aus dieser Gruppe sind

Um den pH-Wert des Bestimmungsansatzes in Xanthosin und/oder Harnsäure.

einem Bereich zwischen etwa 6,5 und 8,5, Vorzugs- Geeignete Hydroxybenzoesäurederivate sind solweise 7 bis 8, zu halten, enthält das Mittel einen Puf- ehe, die in 2- oder 3-Stellung eine freie oder acylierte fer. Der Puffer wird vorzugsweise in einer Konzentra- 55 Hydroxygruppe tragen und die zusätzlich durch eine tion von etwa 50 bis 200 mM verwendet. Niedrigere Sulfonsäuregruppe substituiert sein können, wobei oder höhere Konzentrationen stören grundsätzlich die Carboxylgruppe auch als Amid vorliegen kann, nicht, sofern die Löslichkeit der verschiedenen Be- wie z. B. m-Hydroxybenzoesäure, Salicylsäure, Acestandteile nicht herabgesetzt wird und die Puffer- tylsäure, Salicylamid und/oder Sulfosalicylsäure, vorkapazität ausreicht, um den angegebenen pH-Be- 60 zugsweise 3-Acetylchinolin und Sulfosalicylsäure. Als reich, d. h. den optimalen Bereich der Enzymaktivität gut geeignet erwies sich auch l-(p-Chlorphenylsulim Meßansatz, aufrechtzuerhalten. Als Puffer korn- fonyl)-3-propylharnstoff. Insbesondere ist die Anmen die üblicherweise eingesetzten Verbindungen in wendung von Sulfosalicylsäure wegen der starken Frage, die das Gemisch auf dem genannten pH von NADH^Oxidase-Hemmung, der guten Löslichkeit, etwa 6,5—8,5 halten, wie z. B. Phosphat, Trishydroxy- 65 der relativ geringen Beeinflussung von GlucosedehymethyJaminomethan, Diethanolamin, Triethanolamin, drogenase und Mutarotase, der leichten Zugänglich-Collidin, Borat usw., vorzugsweise Phosphat- und keit und der unproblematischen Handhabung bevor-Trispuffer. zugt.

Der Gehalt an NADH.,-Oxidase-Hemmer im Testsystem ist variabel, er richtet sich von Fall zu Fall nach der vorliegenden Aktivität des Störenzyms in der GDH-Präparaüon. Die Inhibitoren werden vorteilhaft in einer Konzentration von etwa 0,1 bis S 100 tnM (Endkonzentration im Meßansatz), insbesondere von etwa 10—50 mM zugesetzt.

Gegebenenfalls kann das Mittel nach der Erfindung noch Alkalichlorid wie Lihtium-, Natrium- und/oder Kaliumchlorid enthalten, insbesondere Na- »o triumchlorid. Es ist bekannt, daß die Hitzestabilität von gelöster Glucosedehydrogenase durch Natriumchlorid-Zusatz erhöht werden kann. Glucosedehydrogenase-Lösungen mit einem Natriumchloridgehalt von 3 M sind bei Kühlschranklagerung monatelang haltbar. Da das Enzym bei pH 8,2, dem pH-Wert des Testansatzes zur Aktivitätsbestimmung, bei Natriumchlorid-Konzentrationen > 0,8 M durch das Salz gehemmt wird, müssen gelagerte Lösungen, die 3 M Natriumchlorid enthalten, in der Aktivitätsbe- ao Stimmung verdünnt werden. Hierbei zeigte sich der überraschende Effekt, daß Präparationen, deren Aktivität bereits stark abgesunken war, durch das Salz wieder reaktiviert wurden. Im Extremfall konnte ein Aktrvitätsverlust von 86,4» 0 wieder rückgängig ge- »5 macht werden. Für die Reaktivierung des Enzyms ist es erforderlich, die Natriumchlorid-Konzentration in der Enzymlösung mindestens eine Stunde lang auf 3Mol1 ζυ halten und anschließend zu verdünnen. Um die maximale Reaktivierung der Glucosedehydrogenase zu erreichen, stellt man die Konzentration zweckmäßigerweise zwischen 0.05 und 0,1 M Natriumchlorid ein. Vorzugsweise verwendet man ein Glucosedehydrogenase-Konzentrat, das 2- bis 5-, insbesondere 3molar an Natriumchlorid ist. Für die Glucosebestimmung verdünnt man das Konzentrat so, daß die Konzentration an Natriumchlorid im Meßansatz 0,05- bis 0.1 molar ist. Auf diese Weise wird sowohl die optimale Stabilität des Enzyms bei der Lagerung ah auch die optimale Aktivität im Testansatz erreicht.

Das Mittel nach der Erfindung kann zusätzlich weitere Bestandteile enthalten, die üblicherweise für em diagnostisches Reagenz verwendet werden. Zur Verhinderung der Bildung von störenden LuftWas- « eben in der Meßküvette oder zur schnelkren Lösung der Festsufcaanzen empfiehlt ««ich z. B. die Zugabe eines Detergem m einer Konzentration zwischen 0,01 aod O₁IGeW-*. AH Detergcnzien kommen z.B. iüwxyUertes Glycerin-Monoöleat oder taagkettige 5» Poty?Jyfcofäther m Frage

Die Stabilität der »dn Enzyme and Re-SQaaxa ertnrtn die KimfekrtowerBng des Testsy- «ens, wobei das Nkotwwnwd-adewii-dwiideotid zweckmä&gerwene gefriergetrocknet wird rad die $& Enzyme Gtacoeedehydrogenase and Mutarotase entweder gefriergetrocknet oder m Ldamg vorftegei

_ Werget

köno«.. Die Enzym können «orgeomdit oder getrennt mm, der Puffer kam afc Lfeang on* den NADH_t-0**i»e-iolHbrtor «nd dem Detergem ie fa der Testpacktmg enthalten «ein. In dieser Fen» ist da» Testsyjtem hei Kühhchrank!ager«ng mindestens ein Jahr haltbar

Zw DorcMtihrung de» Tests werden die fei^m*- tetia Form votfregewten Bestandteile zwerici- «5 wehe ent k«re vor ftebranch dwch Zugabe der ent· qxectetiden Menge \JmmpmKuA wieder β Löwnf «bracht Da» Verfahren nach der Erfindung wird durchgeführt, indem man das vorstehend beschriebene Mittel auf die zu untersuchende glucosehaltigc Probe einwirken läßt und den Gehalt an gebildetem reduziertem Pyridin-Coenzym spektrophotometrisch oder fiuorimetrisch mißt. Dazu wird die Pufferlösung, das Enzymgemisch aus Glucosedehydrogenase und Mutarotase sowie die Probe in einer Küvette gemischt und die Extinktion E, bzw. E_{1 Min},,, abgcgelescn, sobald keine Extinktionsänderung mehr auftritt. Die Blindprobe enthält anstelle der Probelösung destilliertes Wasser. Anschließend wird die Reaktion durch Zugabe der Coenzymlösung gestartet. Wenn die Extinktion konstant geworden ist, wird £_ä bzw. Ε,,,,,,,,,, abgelesen und aus den erhaltenen Meßwerten der Glucosegehait der Probe nach Bücher (Hcppe-SeylerThicrfelder. Handbuch der physiologisch- und pathologisch-chemischen Analyse. 10. Auflage, Springer-Verlag Berlin Göttingen Heidelberg/New York. S. 292 ff.) berechnet.

Die Meßtemperatur ist nicht kritisch. Es empfiehlt sich, die Bestimmung bei etwa 20—40' C durchzuführen, vorzugsweise bei Raumtemperatur. Die Extinktionsmessungen erfolgen im UV-Bereich zwischen 300 und 400 nm. vorzugsweise bei 366 nm. Anstelle der Extinktionsmessung im UV-Bereich kann die NADHj-Konzentration auch fluorimetrisch bestimmt werden. Hierzu wird bei 3f>6 nm oder bei 313 und 366 nm angeregt und die Fluoreszenz-Emission oberhalb 420 nm gemessen; die Eichung erfolgt mit Glucoselöwngen bekannten Gehalts.

Bei der Bestimmung von Glucose in Körperflüssigkeiten. wie z. B. Blut. Serum oder Plasma oder in anderen eiweißhaltigen Proben empfiehlt sich eine vorausgehende Emeiweißunp mit den üblichen I-.nteiweißungsrtitteln wie ζ Β Tnchloressigsäu.c, Perchlorsäure oder Uranvlacetat"Natriumchlorid. Eine Entetweißung von Serum oder Plasma ist jedoch nicht unbedingt erforderlich.

Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung läßt sich auch an Analysenautnmaten durchführen. Dazu werden die zu bestimmenden Proben über einen Probesarnmler einem AnalysensyMem zugeführt, in welchem den einzelnen Proben die Bestandteile des Mittels nach der Erfindung zugegeben werden. Nach Mischung und Reaktionsablauf wird die Reaktionstösang einem Spektrophotometer zugeführt und gentessen.

Neben der Bestimmung vonGhicroe τη biolognchen Ffißsigkeiten, wie BhM, Serwn. Plasma. Harn ««.. ist das erfindeagsgettiäee Mittel end Verfahren aach fSr die Industrie, insbesondere die Lebem*ntfetn*ättstne. ve» großer Be. Gtacmertestttiimmgiee sind z. B. von Interesse bei der Analyse «on Honig. Früchten. Marmeladen. Süßwaren. Obstsäften. Restsäße im Wem esw. sowie in der Zuckerfabrikatkm

Die Erfindung wwä deren dfe nacnfolfenden Be»- spnte näher eriewen:

Beispiel 1

O.t Kd Senan werden mit 1 mi J* «iger TrkMnrk iifk 02 l d Cb

gg teiweifk 0.2 ml des Cbcntandes werden zn 2 mi 0.1 M Trispuffer (pH 8.5). der 0.5 mM 3-Acetyh enttiält. in eine Kaveoe gegeben. AascMtefiend werden 0.1 ηΛ Enznnecmncfa zmpvttixn. da» 120U GDHnH and 12 Enfernen Mvtarotase tcA in 0.05 M Crtratpefier (pH 65) 3 M NatrieacWond entiiäfc. Die Β&αάρπΛκ embäk msteBe der Probetösmig 0.2 nrf des E

(ο

tels. Anälysenprobe und Blindprobe werden durchgemischt und die Extinktionen bei 366 nm abgelesen, sobald keine Extinktionsänderungen mehr auftreten (ca. 1—2 Minuten).

Die Reaktion wird dann durch Zugabe von 0,02 ml der wäßrigen Coenzymlösung gestartet, die 0,58 M NAD enthält. Nach etwa 5 Minuten ist die Reaktion beendet, und die Extinktionen werden abgelesen. Aus der gemessenen Exünktionsdifferenz Λ Ε = 0,326 bei 366 nm errechnet sich ein Glucosegehalt von 227 mg/100 ml Serum.

Die gleichen Ergebnisse werden erhalten, wenn man eine 0,1-M-Trispufferlösung verwendet, die anstelle von 0,5 mM 3-Acetylcholin 45 mM Nicotinsäure, 1,6 mM Nicotinsäureamid, 0,4 mM Chinaldinsäure oder 0,13 mM Chinolyl-2-chlormethan enthält.

10

Die im Test angegebenen Mutarotase-Einheiten wurden wie folgt festgelegt:

In eine Küvette werden 3 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7), enthaltend 100 U Peroxidase/ml Puffer,

0,05 ml o-Dianisindinlösung (10 mg/ml Wasser), 0,1 ml Glucoseoxidaselösung (600 U/ml Wasser) und 0,05 ml Mutarotaselösung unbekannter Aktivität pipettiert. Durch Zugabe von 0,1 ml frisch bereiteter a-Glucoselösung (0,3 mg/ml Wasser) wird die Reaktion gestartet. Bei 25° C und 436 nm wird die Extinktionszunahme pro Minute registriert. In gleicher Weise wird ein Blindwert bestimmt, wobei anstelle der Mutarotaselösung Wasser eingesetzt wird. Die für BHndwert und Meßwert erhaltenen Extinktionszunahmen pro Minute Λ E bzw. Δ E_b|_ind werden in folgende Berechnungsformel eingesetzt:

Mutarotase-Einheitea/mlEnzymlösung = ^

0,05

Beispiel 2

0,02 ml Serum werden direkt in die Reaktion eingesetzt. Die Durchführung der Bestimmung erfolgt analog Beisoiel 1, wobei folgende Bestandteile in der Reihenfolge ihrer Zugabe verwendet werden:

0,05 M Citratpuffer (pH 6,5), der 3 M an Natriumchlorid ist,

0,02 ml wäßrige Coenzymlösung, enthaltend 0,23 M NAD.

2 ml 0,2 M Trispuffer

3 mM Coffein,

0,02 ml Serum bzw. Wasser bei der Blindprobe, 0,1 ml Enzymgemisch, hergestellt durch Lösen eines Lyophilisats in Citratpuffer (pH 6,5), so daß 120U GDH/ml und 12 Einheiten Mutarotase/ml vorliegen,

0,02 ml wäßrige Coenzymlösung, enthaltend 0,32MNAD.

Nach etwa zwei Minuten ist die Reaktion abgelaufen. Die errechnete Extinktionsdifferenz Δ Ε — 0,305

(pH 7,3), enthaltend 30 ergibt einen Glucosegehalt von 212 mg/100 ml Harn.

Die gleichen Ergebnisse werden erhalten, wenn man eine Pufferlösung verwendet, die anstelle von 40 mM Sulfosalicylsäure 1 mM m-Hydroxybenzoesäure, 0,5 mM Salicylsäure, 0,7 mM Acetylsalicylsäure, 10 mM Salicylamid oder 50 mM l-(p-Chlorphenylsulfonyl)-3-propylharnstoff enthält.

Nach Ablauf der Reaktion (ca. 5 Minuten) errechnet sich aus der gemessenen Extinktionsdifferenz Δ E = 0,164 ein Glucosegehalt von 96 mg/100 ml Serum.

Die gleichen Ergebnisse werden erhalten, wenn man eine Pufferlösung verwendet, die anstelle von 3 mM Coffein, 0,35 mM Harnsäure, 21 mM Theophyllin 2,6 mM Desoxyguanosin, 30 mM Inosin oder 5OmM Xanthosin enthält.

Verwendet man anstelle der obigen Enzyme ein kochgereinigtes Enzymgemisch mit 2500 U GDH/ml end 250 Einheiten Mutarotase/ml, so ist die Reaktion bereits nach 10 Sekunden beendet. Das Ergebnis ist das gleiche wie oben.

Beispiel 3

Urin wird mit {»destilliertem H₂O im Verhältnis 111 verdünnt und 0,2 ml der erhaltenen Probelösung in die Reakfon eingesetzt. Die Durchführung der Bestimmung erfolgt analog Beispiel 1, wobei folgende Bestandteile in der Reihenfolge ihrer Zugabe verwendet werden:

Beispiel 4

Eine Probe von 54,0 mg Honig wird in bidestilliertem Wasser gelöst, auf 100 ml aufgefüllt und 0,2 ml hiervon zur Glucosebestimmung eingesetzt. Die Durchführung erfolgt analog Beispiel 1, wobei folgende Bestandteile in der Reihenfolge ihrer Zugabe verwendet werden:

45

55 2 ml 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,3), enthaltend 40 mM Sulfosalicylsäure,
0,2 ml der zu untersuchenden Lösung bzw. Wasser bei der Blindprobe,

0,1 ml Enzymgemisch, enthaltend 300 U GDH/ ml, und 20 Einheiten Mutarotase/ml, 0,02 ml wäßrige Coenzymlösung, enthaltend 0,32 M NAD, oder die entsprechende Menge NADP.

Nach Ablauf der Reaktion (ca. 2 Minuten) ergibi sich eine Extinktionsdifferenz von AE = 0,338. Daraus errechnet sich ein Gehalt von 21,4 mg Ghicost pro 100 ml Untersuchungslösung; der Honig enthäl somit 39,6 ⁴/o Glucose.

2 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,5), enthaltend Beispiel 5

40 mM Sulfosalicylsäure,

0,2 ml verdünnter Urin bzw. Wasser bei der 65 Eine Testpackung zur enzymatischen Bestimmunj

Blindprobe, von Glucose, ausreichend für etwa 90 Bestimmungei

0.1 ml Enzymgemisch, enthaltend 300U GDH.' and 10 Blindwerte, enthält die folgenden Bestand

ml, und 30 Einheiten Mutarotase/ml, gelöst in teils:

110 ml eines gebrauchsfertigen Enteiweißungsmittels, und zwar entweder eine 3%ige wäßrige Lösung von Trichloressigsäure oder eine 2°/oige wäßrige Lösung von Perchlorsäure.
220 ml eines gebrauchsfertigen Puffers vom pH 7,3, und zwar entweder 200 mM Phosphatpuffer oder 100 mM Trishydroxymethylaminomethan.

11 mi einer gebrauchsfertigen Lösung von GDH und Mutarotase in 50 mM Citratpuffer (ph 6,5)/ 3 M Natriumchlorid oder ein lyophilisiertes Enzymgemisch aus GDH und Mutarotase, das zum

Gebrauch in 11 ml 50 mM Citratpuffer gelöst wird, wobei in beiden Fällen 120 U GDH/ml und 12 Einheiten Mutarotase/ml vorhander sind.

4. Lyophilisiertes NAD oder NADP, das zum Gebrauch in 2,2 ml bidestilliertem Wasser gelösi wird, wobei sich eine Molarität von 330 mM ergibt.

Die Glucosebestimmung mit dieser Testpackung wird wie in den obigen Beispielen beschrieben ausgeführt.

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose mittels Glucosedehydrogenase, einem Pyridin-Coenzym und Puffersubstanzen unter Bildung von Gluconsaure und reduziertem Pyridin-Coenzym, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Mutaro tase, wobei das Verhältden. I>a aber bei Einsah von Körperflüssigkeiten alle ,anderen reduzierenden Stoffe wie Kreatin, Kreatinin,

* "Harnsäure^ Ascorbinsäure mid Glutathion ebenfalls erfaßt werden, genpgt die Spezifltät nicht mehr den

heutigen Ansprüchen.

Eine andere Gruppe von Bestimmungsmethoden beruht auf der Bildung von Furanderivaten aus Glucose unter dem wasserabspaltenden Einfluß von konzentrierten Säuren; die Furane reagieren anschließend