DE2247608A1 - Mittel und verfahren zur enzymatischen bestimmung von glucose - Google Patents

Description

Merck Patent Gesellschaft 21. September 1972

mit beschränkter Haftung
Darmstadt

Mittel und Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Glucose

Die wichtigste Routineanalyse im klinischen Laboratorium ist die Blutzuckerbestimmung. Sie dient zur Erkennung und zur Therapiekontrolle des Diabetes mellitus und zur Diagnose einiger anderer Stoffwechselkrankheiten.

Zur quantitativen Bestimmung des Blutzuckers benötigt man spezifische Methoden. Die ältesten Bestimmungsarten basieren auf dem Reduktionsvermögen der Glucose, wobei Stoffe wie Kaliumhexacyanoferrat(III), Pikrinsäure oder Kupfer(II)-ionen in alkalischer Lösung, als Oxidationsmittel verwendet werden. Da aber bei Einsatz von Körperflüssigkeiten alle anderen reduzierenden Stoffe wie Kreatin, Kreatinin, Harnsäure, Ascorbinsäure und Glutathion ebenfalls erfaßt werden, genügt die Spezifität nicht mehr den heutigen Ansprüchen.

4098U/0721

Eine andere Gruppe von Bestimmungsmethoden beruht auf der Bildung von Furanderivaten aus Glucose unter dem wasserabspaltenden Einfluß von konzentrierten Säuren; die Furane reagieren anschließend mit aromatischen Aminen wie z. B. o-Toluidin zu Farbstoffen. Obwohl die Methode als Routinebestimmung weit verbreitet ist, läßt ihre Spezifität zu wünschen übrig, da neben Glucose alle anderen Aldosen ebenfalls reagieren. Eine empfindliche Störung dieses Tests tritt bei der Glucosebestimmung im Serum bei Patienten auf, welche Infusionen von Plasma-Expandern auf Dextran-Basis erhielten, da hierbei im Testgemisch Trübungen entstehen. Außerdem macht ,das zur Kondensation erforderliche Kochen mit Säure die Bestimmung lästig und zeitraubend.

Neben dieser sogenannten o-Toluidin-Methode sind vor allem zwei enzymatische Verfahren zur Bestimmung von Glucose gebräuchlich: Die Glucoseoxidase-Methode und die Hexokinase-Methode.

Bei der Glucoseoxidase-Methode wird die Glucose unter Glucoseoxidase-Katalyse durch Sauerstoff zu Gluconsäure oxidiert, wobei Wasserstoffperoxid entsteht, das seinerseits in einer katalysierten Folgereaktion ein farbloses Chronogen zu einem Farbstoff oxidiert. Als Katalysator der Folgereaktion kann z. B. Peroxidase dienen; ein häufig verwendetes Chromogen ist o-Dianisidin. Die Glucoseoxidase ist weitgehend spezifisch für Glucose, jedoch wird die Folgereaktion durch Stoffe gestört, die Wasserstoffperoxid verbrauchen. In Körperflüssigkeiten stören insbesondere Harnsäure, Ascorbinsäure und Katalase. Weitere Nachteile sind die lange Analysendauer und die Tatsache, daß das Chromogen o-Dianisidin medizinisch nicht unbedenklich ist.

409814/0721

Als die Glucosebestimmung mit der höchsten Spezifität wird die enzymatisch^ Bestimmung mit Hexokinase/Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase angesehen. Hierbei -wird die Glucose mit Adeno'sintriphosphat/Hexokinase phosphoryliert und das gebildete Glucose-6-phosphat mit Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase zu Gluconat-6-phosphat dehydriert, -wobei der Wasserstoff auf Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat (NADP) übertragen wird; das reduzierte Coenzym wird photometrisch bestimmt. Wegen der zentralen Stellung von Glucose-6-phosphat im Kohlenhydratßtoffwechsel ist der Test anfällig gegen Störungen durch Fremdenzyme wie Phosphoglucose-Iso- ; merase, Phosphoglucomutase und Gluconat-6-phosphat-Dehydrogenase. Es wird daher empfohlen, die Störreaktionen durch Extrapolation zu eliminieren. (H. U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, 2. Auflage, S. 1166, 1970, Verlag Chemie, Weinheim). Dadurch wird jedoch die Bestimmungsmethode unsicher, umständlich und zeitraubend (ca. 20 bis 30 Minuten für eine Einzelbestimmung).

Es wurde nun gefunden, daß die Nachteile der bisher in der Praxis angewandten Methoden zur Glucosebe.stimmung ..vermieden, werden können, wenn man ein neues enzymatisches Mittel anwendet.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein neues Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose mittels Glucosedehydrogeiiase, einem Pyridin-Goenzym und Puffersubstanzen unter Bildung von Gluconsäure und reduziertem Pyridin-Coenzym, das gekennzeichnet ist durch einen Gehalt an mutarotationsbeschleunigenden Substanzen und gegebenenfalls Inhibitoren für Oxidasen von reduzierten Pyridinöoenzymen und/oder Alkalichlorid.

0 9 8 1 A/072.1

Ferner umfaßt der Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Glucose, das darin besteht, daß man das vorstehend genannte und im folgenden, näher beschriebene Mittel auf die zu untersuchende glucosehaltige Probe

einwirken läßt und den Gehalt an gebildetem reduziertem Pyridin-Coenzym in an sich bekannter Weise spektrophotometrisch oder fluorimetrisch mißt.

Das neue Mittel nach der Erfindung zeichnet sich gegenüber der vorbekannten Glueoseoxidase-Methode dadurch aus, daß es spezifisch den Glucosegehalt mißt und nicht durch andere Oxidations- oder Reduktionsmittel gestört wird. Gegenüber der vorbekannten Hexokinase-Methode hat das neue Mittel den Vorteil, daß bei seiner Anwendung nur eine einstufige Reaktion verwendet wird, wobei anstelle von zwei Enzymen bei der Hexokinase-Methode hier nur ein Enzym erforderlich ist. Da keine Indikatorreaktion nötig ist, ist auch eine dadurch bedingte mögliche Störung ausgeschaltet, was einen wesentlichen Vorteil gegenüber der GOD- und Hexokinase-Methode bedeutet.

Die Bestimmung benötigt in einer bevorzugten Ausführungsform etwa 5 Minuten, womit sie bereits doppelt so schnell wie die zur Zeit schnellste enzymatische Glucosebestimmung (Hexokinase-Methode ohne Extrapolation der Störreaktion) ist. Die Umsatzzeit läßt sich durch Erhöhung der Enzymaktivitäten im Test noch wesentlich herabsetzen, so daß neben der Spezifität auch die Einfachheit und Schnelligkeit des erfindungsgemäßen Tests von keiner anderen Glucose-Bestimmung erreicht wird.

4098U/07Z1

Yor längerer Zeit wurde vorgeschlagen, Glucose durch eine Indikatorfarbreaktion mit Hilfe von Glucosedehydrogenase (GDH) und Nicotinamid-adenin-dinucleotid (HAD), insbesondere in Gegenwart von Diaphorase oder Xanthinoxidase zu bestimmen (kanadische Patentschrift 745 087), jedoph ohne Mutarotationsbeschleuniger. In der Praxis ist Glucosedehydrogenase noch nie für diesen Zweck verwendet worden.

Aus der einschlägigen Literatur (Methods of Enzymology, Vol. IX, 92-111, Acad. Press lew York, London, 1966; R. P. Metzger u. a., J. Biol. Chem. ,238, 1769 - 1772 (1964) und 240, 2767 - 2771 (1965) und Ή. G. Brink, Acta chem. Scand. 7,, 1081 - 1088 (1953)) war bekannt, daß die Glucosedehydrogenase _ eine Reihe von ungünstigen Eigenschaften besitzt, die einer analytischen Verwendung entgegenstehen. So sind z. B. häufig die Glucosedehydrogenasen an Partikel gebunden und/oder erweisen sich als nicht UAD- bzw. KADP-abhängig. Ferner ist bekannt, daß Glucosedehydrogenase eine geringe Aktivität und/oder eine zu geringe Stabilität aufweist. Die Michaelis-Konstanten der Glucosedehydrogenase zur Glucose betragen lediglich 0.007 - 2, d. h. erst in einer 0.007 molaren Lösung ist das Enzym zur Hälfte mit Substrat gesättigt. Bei der üblichen Blutzuckeranalyse stehen jedoch nur etwa 0.0000001 Mol Glucose zur Verfugung. Es bestand demnach ein erhebliches Vorurteil in der einschlägigen Literatur gegen die Verwendung von Glucosedehydrogenase für die enzymatische Glucosebestimmung.

•Mit der vorliegenden Erfindung ist es gelungen, erstmals ein Mittel und Verfahren zur enzymatischen Glucosebestimmung mit Hilfe von Glucosedehydrogenase zur Verfügung zu stellen, das bei einfacher Handhabung rasche und zuverlässige Ergebnisse liefert.

4098U/072

Im folgenden wird die Erfindung näher beschrieben:

Die im Mittel nach der Erfindung enthaltene Glucosedehydrogenase muß möglichst rein sein. Die im Test verwendeten Aktivitäten der Glucosedehydrogenase richten sich vor allem nach der Zeit, innerhalb der der Endpunkt der Reaktion erreicht sein soll. Die Enzymaktivität kann dabei zweckmäßigerweise in einem Bereich von etwa 2 - 200 U/ml Testlösung variiert werden. Vorzugsweise verwendet man 4-20 U/ml Testlösung zusammen mit dem Enzym Mutarotaae.

Die Herstellung der verwendeten Glucosedehydrogenase erfolgt aus Mikroorganismen, vorzugsweise aus Mikroorganismen der Gattung Bazillus, wobei das mikrobielle Ausgangsprodukt eine Glucosedehydrogenase-Aktivität von mindestens 5 U/ml Rohextrakt enthält. Die weitere Aufreinigung erfolgt z. B. analog der in The Spores III, 97 (1965) beschriebenen Methode. Auf diese Weise sind lyophilisierte Glucosedehydrogenase-Präparate erhältlich, die mehr als 2 U/mg Trockensubstanz enthalten und deren gute Löslichkeit die Herstellung von Lösungen mit mehr als 200 U/ml erlaubt; die störende NADH₂-Oxydase-Aktivität beträgt weniger als 1 /oo der Glucosedehydrogenase-Aktivität. Die im Vergleich mit früher beschriebenen Präparaten um Größenordnungen bessere Qualität des Enzyms ermöglichte erst seinen Einsatz in der enzymatischen Glucosebestimmung.

Die im erfindungsgemäßen Mittel enthaltenen Pyridin-Coenzyme sind vorzugsweise Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) oder Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat (NADP), insbesondere NAD. Die Coenzymkonzentration kann in den Grenzen von

409814/072 1

2.0 mM bis 5.0 mM variiert -werden, ohne daß die Reaktionsgeschwindigkeit beeinflußt -wird. In einer bevorzugten Ausfuhr ungs form beträgt die Endkonzentration im Test etwa 2,8 mM FAO. Anstelle von NAD und BADP können auch andere NAD-aktive Substanzen wie z. B. TMo-NAD oder Thio-NADP verwendet werden.

Da die Glucosedehydrogenase spezifisch für ß-Glucose ist, muß die im Gleichgewicht stets vorliegende α-Glucose zunächst mutarotieren, bevor sie von der Glucosedehydrogenase umgesetzt wird, d. h. bei hoher Glucosedehydrogenase-Aktivität reagiert die im Reaktionsgemisch vorhandene ß-Glucose schnell ab, was sich im steilen Extinktionsanstieg zu Beginn der Reaktion zeigt. Die langsame Mutarotation der α-Glucose zu ß-Glucose manifestiert sich in der verzögerten NADEU-Bildung, die erst nach mehr als 30 Minuten abgeschlossen ist. Das erfindungsgemäße Mittel enthält deshalb mutarotationsbeschleunigende Substanzen, insbesondere Mutarotase. Die Beschleunigung der Mutarotation durch das Enzym Mutarotase ist zwar für die Glucosebestinramng mit Glucoseoxidase· bekannt (J. Okuda, I. Miwa, Anal. Biochem. 43, 312 (1971))·, es war jedoch nicht naheliegend, daß bei Zusatz von Mutarotase zum Glucosedehydrogenase/NAD-System ebenfalls eine sehr effektive Beschleunigung eintritt. Eine Mutarotase-Menge von zahlenmäßig 8 $ der Glucosedehydrogenase-Aktivität ist bereits ausreichend für die optimale Reaktionsbeschleunigung; der Mutarotase-Anteil kann jedoch beliebig erhöht werden, ohne daß sich ein negativer Einfluß auf das Testsystem bemerkbar mächt.

4098 14/0721

In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Glucosebestimmung beträgt das Verhältnis der Mutarotase-Aktivität zur Glucosedehydrogenase-Aktivität etwa 10 : 0,25 - 1. Einen quantitativen Reaktionsablauf innerhalb von 5 Minuten (was einer mehr als sechsfachen Beschleunigung gegenüber dem analogen Testsystem ohne Mutarotase entspricht) erreicht man z. B. mit Aktivitäten von 4 U Glucosedehydrogenase und 0,4 Einheiten Mutarotase pro ml Meßansatz.¹ Bei 20 U Glucosedehydrogenase und 2 Einheiten Mutarotase pro ml Testlösung beträgt die Umsatzzeit z. B. weniger als eine Minute. Bei Einsatz von mehr als 100 U Glucosedehydrogenase und 10 Einheiten Mutarotase pro ml Testlösung können Umsatzzeiten in der · Größenordnung von 10 Sekunden erreicht werden. Allerdings müssen in diesem Fall die Enzyme höher aufgereinigt werden oder die störenden Nebenaktivitäten müssen unterdrückt werden.

Die Mutarotase kann auch durch Substanzen ersetzt werden, die eine mutarotationsbeschleunigende Wirkung auf α-Glucose ausüben. Verwendet man z. B. einen Phosphatpuffer in der Konzentration von 200 mM, so nützt man die mutarotationsbeschleunigende Wirkung des Phosphats voll aus und kann dadurch mehr als 60 # der Mutarotaseaktivität einsparen. Als weitere mutarotationsbeschleunigende Substanzen kommen z. B. Histidin, Imidazol, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder a-Hydroxy-pyridin infrage. Sie werden vorzugsweise in einer Konzentration von 20 - 100 mM im Test eingesetzt und beeinflussen in diesem Konzentrationsbereich die Aktivität der Glucosedehydrogenase nicht wesentlich. Bevorzugt wird jedoch Mutarotase verwendet.

A098U/0721

Zur Erzielung eines schnellen und quantitativen Glucoseumsatzes, zur Beseitigung "bzw. Unterdrückung störender Nebenaktivitäten und zur Stabilisierung der Glucosedehydrogenase enthält das Mittel nach, der Erfindung gegebenenfalls noch •weitere Bestandteile, wie Inhibitoren für Oxidasen von reduzierten Pyridin-Coenzymen und/oder Alkalichlorid.

Um den pH-Wert des Bestimmungsansatzes in einem Bereich zwischen etwa 6,5 und 8,5, vorzugsweise 7 bis 8 zu halten, enthält das Mittel einen Puffer. Der Puffer wird vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 50 bis 200 mM verwendet. Niedrigere oder höhere Konzentrationen stören grundsätzlich nicht, sofern die Löslichkeit der verschiedenen Bestandteile nicht herabgesetzt wird und die Pufferkapazität ausreicht, um den angegebenen pH-Bereich, d. h. den optimalen Bereich der Enzymaktivität im Meßansatz, aufrechtzuerhalten. Als Puffer kommen die üblicherweise eingesetzten Verbindungen infrage, die das Gemisch auf dem genannten pH von etwa 6,5 8,5 halten, wie z. B. Phosphat, Trishydroxymethylaminomethan, Diäthanolamin, Triäthanolamin·, Collidin, Borat usw., vorzugsweise Phosphat- und Trispuffer.

Pur Messungen mit hohen Genauigkeitsanforderungen, wie sie die Bestimmung der Glucose in Körperflüssigkeiten stellt,jmacht sich auch der Einfluß eines geringen Anteils an Oxidasen von reduzierten Pyridin-Coenzymen bemerkbar. Sie bewirken, daß das gebildete reduzierte Pyridin-Ooenzym wieder oxidiert wird. Die als Meßgröße dienende Extinktion bleibt daher nicht konstant, sondern fällt nach Erreichen eines Maximalwertes wieder ab.,Hinzu kommt, daß die gemessene maximale Extinktion geringer ist als der unter Zugrundelegung des Extinktionskoeffizienten von z. B. HADHp errechnete Wert (ca; 3 % - 5 $ zu niedrig bei 1 °/oo KADH₂-OXidase). Aus diesem Grunde ist es vorteilhaft, wenn das Mittel nach der Erfindung gegebenenfalls Inhibitoren für Oxidasen von reduzierten Pyridin-Coenzymen enthält.' ■

4098U/0721

Da sich die präparative Anreicherung der in der Glucosedehydrogenase noch vorhandenen Reste von NADH₉-0xidase als zu aufwendig erwies, ist es zweckmäßig, den Störeffeiet durch Einsatz von spezifischen Inhibitoren zu unterdrücken. Es wurde nun überraschenderweise eine Reihe von Inhibitoren gefunden, die in bereits relativ geringen Konzentrationen das Störenzym wirksam hemmen, ohne die Aktivitäten von Glucosedehydrogenase oder Mutarotase wesentlich zu beeinflussen. Es handelt sich dabei vor allem um Pyridin-, Purin- und Hydroxybenzoesäurederivate.

Geeignet sind Pyridinderivate, die in 2- und/oder 3- und/oder 4-Stellung durch niederes Alkyl, Phenyl, niederes Hydroxyalkyl, niederes Halogenalkyl, Carboxy, niederes Acyl, Benzoyl, Carbonamid und Amino substituiert sind, wobei in 5»6-Stellung ein Benzolkern ankondensiert sein kann, wie z. B. Nicotinsäure, Nicotinsäureamid, 2-Amino-4--methyl-pyridin, 2-Methyl-3-(ß-hydroxyäthyl)-pyridin, 3-Hydroxymethyl-pyridin, 2-Hydroxymethyl-pyridin, 2-Benzoyl-pyridin, Chinolinsäure-amethylester, 3-Acetylchinolin, Chinaldinsäure, Chinolyl-2-chlormethan, Chinaldin, 2-Phenyl-chinolinsäureamid und/oder Atophan. Vorzugsweise verwendet man 3-Acetylchinolin, Nicotinsäure, Chinolyl-2-chlorroethan, Chinaldinsäure und/oder Nicotinsäureamid, insbesondere 3-Acetylchinolin.

Geeignete Purinderivate sind z. B. Harnsäure, Coffein, Theophyllin oder Purine, die in 2- und/oder 6-Stellung Hydroxy- und/oder Aminogruppen und in 7-Stellung einen Ribose- oder Desoxyriboserest tragen, wie z. B. Xanthosin, 2-Desoxyguanosin, Inosin usw. Besonders geeignet aus dieser Gruppe sind Xanthosin und/oder Harnsäure.

4098U/0721

Geeignete Hydroxybenzoesäurederivate sind solche, die in 2- oder 3-Stellung eine freie oder acylierte Hydroxygruppe tragen und die zusätzlich durch eine Sulfonsäuregruppe substituiert sein können, wobei die Carboxylgruppe auch als Amid vorliegen kann, wie z. B. m-Hydroxybenzoesäure, Salicylsäure, Acetylsalicylsäure, Salicylamid und/oder Sulfosalicylsäure, vorzugsweise 3-Acetylchinolin und Sulfosalicylsäure. Als gut geeignet erwies sich auch 1-(p-Chlorphenylsulfonyl)-3-propy!harnstoff. Insbesondere ist die .Anwendung von Sulfosalicylsäure wegen der starken NADH_?-Oxidase-Hemmung, der guten Löslichkeit, der relativ geringen Beeinflussung von Glucosedehydrogenase und Mutarotase, der leichten Zugänglichkeit und der unproblematischen Handhabung bevorzugt.

Der Gehalt an NADHp-Oxidase-Hemmer im Testsystem ist variabel, er richtet sich von Fall zu Pail' nach der vorliegenden Aktivität des Störenzyms in der GDH-Präparation. Die Inhibitoren werden vorteilhaft in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 100 mM (Endkonzentration im Meßansatz), insbesondere von etwa 10-50 mM zugesetzt.

Gegebenenfalls kann das Mittel nach der Erfindung noch Alkalichlorid wie Lithium-, Natrium- und/oder Kaliumchlorid enthalten, insbesondere Natriumchlorid. Es ist bekannt, daß die 'Hitzestabilität von gelöster Glucosedehydrogenase durch Natriumchlorid-Zusatz erhöht w/erden kann. Glucosedehydrogenase-Lösungen mit einem Natriumchloridgehalt von 3 M sind bei Kühlschranklagerung monatelang haltbar. Da das Enzym bei pH 8,2, dem pH-Wert des Testansatzes zur Aktivitätsbestimmung, bei Natriumchlorid-Konzentrationen> 0,8 M durch das Salz gehemmt wird, müssen gelagerte Lösungen, die 3 M Natriumchlorid enthalten, in der Aktivitätsbestimmung verdünnt werden. Hierbei zeigte sich der überraschende Effekt, daß Präpara-

40981 A/0721

tionen, deren Aktivität bereits stark abgesunken war, durch das Salz wieder reaktiviert wurden. Im Extremfall konnte ein Aktivitätsverlust von 86,4 $> wieder rückgängig gemacht werden. Für die Reaktivierung des Enzyms ist es erforderlich, die Natriumchlorid-Konzentration in der Enzymlösung mindestens eine Stunde lang auf 3 Mol/l zu halten und anschliessend zu verdünnen. Um die maximale Reaktivierung der Glucosedehydrogenase zu erreichen, stellt man die Konzentration zweckmäßigerweise zwischen 0,05 und 0,1 M Natriumchlorid -ein. Vorzugsweise verwendet man ein Glucosedehydrogenase-Konzentrat, das 2 bis 5, insbesondere 3 molar an Natriumchlorid ist. Für die Glucosebestimmung verdünnt man das Konzentrat so, daß die Konzentration an Natriumchlorid im Meßansatz 0,05 0,1 molar ist. Auf diese Weise wird sowohl die optimale Stabilität des Enzyms bei der Lagerung als auch die optimale Aktivität im Testansatz erreicht.

Das Mittel nach der Erfindung kann zusätzlich weitere Bestandteile enthalten, die üblicherweise für ein diagnostisches Reagenz verwendet werden. Zur Verhinderung der Bildung von störenden Luftbläschen in der Meßküvette oder zur schnelleren Lösung der Festsubstanzen empfiehlt sich z. B. die Zugabe eines Detergens in einer Konzentration zwischen 0,01 und 0,1 Gew.96. Als Detergentien kommen z. B. äthoxyliertes Glycerin-Monooleat oder langkettige Polyglykoläther infrage.

Die Stabilität der verwendeten Enzyme und Reagenzien erlaubt die Konfektionierung des Testsysteme, wobei das Nicotinamidadenin-dinucleotid zweckmäßigerweise gefriergetrocknet wird und die Enzyme Glucosedehydrogenase und Mutarotase entweder gefriergetrocknet oder in Lösung vorliegen können. Die

4098 U/0 7 21

Enzyme können vorgemischt oder getrennt sein, der Puffer kann als Lösung mit dem NADHp-Oxidase-Inhibitor und dem Detergens in der Testpackung enthalten sein. In dieser Form ist das Testsystem "bei Kühlschranklagerung mindestens ein Jahr haltbar.

Zur Durchführung des Tests werden die in trockener I¹Orm vorliegenden Bestandteile zweckmäßigerweise erst kurz vor Gebrauch durch Zuga"be der entsprechenden Menge Lösungsmittel wieder in Lösung gebracht. Das Verfahren nach der Erfindung wird durchgeführt, indem man das vorstehend beschriebene Mittel auf die zu untersuchende glucosehaltige Probe einwirken läßt und den Gehalt an gebildetem reduziertem Pyridin-Coenzym spektrophotometrisch oder fluorometrisch mißt. Dazu wird die Pufferlösung, das Enzymgemisch aus Glucosedehydrogenase und Mutarotase sowie die Probe in einer Küvette gemischt und die Extinktion E₁ bzw. E^ (τνΜν,ΓΠ ^gelesen, sobald keine Extinktionsänderung mehr auftritt. Die Blindprobe enthält anstelle der Probelösung destilliertes Wasser. Anschließend wird die Reaktion durch Zugabe der Coenzymlösung gestartet. Wenn die Extinktion konstant geworden ist, wird E_? bzw. Ep C-K-I₁- _η*\ abgelesen und aus den erhaltenen Meßwerten der Glucosegehalt der Probe nach Bücher (Hoppe-Seyler/Thierfeider, Handbuch der physiologisch- und pathologisch-chemischen Analyse, 1.0. Auflage, Springer-Verlag Berlin/Göttingen/Heidelberg/lTew York, S.' 292 ff) berechnet.

Die Meßtemperatur ist nicht kritisch. Es empfiehlt sich,"die Bestimmung bei etwa 20 -40° C durchzuführen, vorzugsweise b Raumtemperatur. Die Extinktionsmessungen erfolgen im UV-

A098U/0 72 1

Bereich zwischen 300 und 400 nm, vorzugsweise bei 366 nro. Anstelle der Extinktionsroessung im UV-Bereich kann die p Konzentration auch fluorimetrisch bestimmt v/erden. Hierzu wird bei 366 nro oder bei 313 und 366 nm angeregt und die Fluoreszenz-Emission oberhalb 420 nm gemessen; die Eichung erfolgt mit Glucoselösungen bekannten Gehalts.

Bei der Bestimmung von Glucose in Körperflüssigkeiten, wie z. B. Blut, Serum oder Plasma oder in anderen eiweißhaltigen Proben empfiehlt sich eine vorausgehende Enteiweißung mit den üblichen Enteiweißungsmitteln wie z. B. Trichloressigsäure, Perchlorsäure oder Uranylacetat/Natriumchlorid. Eine Enteiweißung von Serum oder Plasma ist jedoch nicht unbedingt erforderlich.

Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung läßt sich auch an Analysenautomaten durchführen. Dazu werden die zu bestimmenden Proben über einen Probesammler einem Analysensysteo zugeführt, in welchem den einzelnen Proben die Bestandteile des Mittels nach der Erfindung zugegeben werden. Nach Mischung und Reaktionsablauf wird die Reaktionslösung einem Spektrophotometer zugeführt und gemessen.

Das erfindungsgemäße Mittel kann auch auf saugfähige Träger aufgebracht werden. Als saugfähige Träger können alle verwendet werden, die üblicherweise für Schnelltests in Gebrauch sind. Am weitesten verbreitet ist die Verwendung von Filterpapier, jedoch können auch andere saugfähige Cellulose- oder Kunststoffprodukte eingesetzt werden. Die saugfähigen Träger, vorzugsweise Filterpapier, werden in an sich bekannter Weise mit einer oder mehreren Tränklösungen imprägniert, die Glucosedehydrogenase, FAD und ein Puffersystern enthalten;

4098U/0721

auf die Mutarose kann verzichtet -werden. Als Maß für. den Glucosegehalt der zu untersuchenden Lösung kann man die UV-Fluoreszenz des gebildeten IADH₂ verwenden, oder man kann eine NADH_?-anzeigende Farbreaktion nachschalten. Zweckmäßigerweise -wird hierzu die Hydrierung eines Tetrazoliumsalzes zu dem entsprechenden farbigen Formazan unter dem Einfluß von Diaphorase verwendet. Als geeignet erwiesen sich die Tetrazoliumsalze 2-(p-Jodphenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumchlorid (INT) und 3-(4,5-Dimethylthiazolyl-1-2)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid (MTT).

Neben der Bestimmung von Glucose in "biologischen Flüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Harn usw., ist das erfindungsgemäße Mittel und Verfahren auch für die Industrie, insbesondere die Lebensmittelindustrie von großer Bedeutung. Glucosebestimmungen sind z. B. von Interesse bei der Analyse von Honig, Früchten, Marmeladen, Süßwaren, Obstsäften, Restsüße im Wein usw. sowie in der Zuckerfabrikation.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1 _v ' -

0,1 ml Serum werden mit 1 ml 3 $iger Trichloressigsäurelösung enteiweißt. 0,2 ml des Überstandes werden zu 2 ml 0,1 M Trispuffer (pH 8,5), der 0,5 mM 3-Acetylcholin enthält, in eine Küvette gegeben. Anschließend werden 0,1 ml Enzymgemisch zupipettiert, das 120 U GDH/ml und 12 Einheiten Mutarotase/ml in 0,05 M Citratpuffer (pH 6,5)/3 M Natriumchlorid enthält. Die Blindprobe enthält anstelle der Probelösung 0,2 ml des Enteiweißungsmittels. Analysenprobe und Blindprobe werden durchgemischt, und die Extinktionen bei 366 nm abgelesen, sobald keine Extinktionsänderungen mehr auftreten (ca. 1 - 2 Minuten).

409814/0721

Die Reaktion wird dann durch Zugabe von 0,02 ml der wäßrigen Coenzymlösung gestartet, die 0,58 M NAD enthält. Nach etwa 5 Minuten ist die Reaktion beendet und die Extinktionen werden abgelesen. Aus der gemessenen Extinktionsdifferenz /\p = 0,326 bei 366 nm errechnet sich ein Glucosegehalt von 227 mg/100 ml Serum.

Die gleichen Ergebnisse werden erhalten wenn man eine 0,1 M Trispufferlösung verwendet, die anstelle von 0,5 mM ; 3-Aoetylcholin 45 mM Nicotinsäure, 1,6 mM Nicotinsäureamid, 0,4 niM Ohinaldinsäure oder 0,13 mM Chinolyl-2-chlormethan enthält.

Die im Test angegebenen Mutarotase-Einheiten wurden wie folgt festgelegt:

In eine Küvette werden 3 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7), enthaltend 100 U Peroxidase/ml Puffer, 0,05 ml o-Dianißidinlösung (10 mg/ml Wasser), 0,1 ml Glucoseoxidaselösung (600 U/ml Wasser) und 0,05 ml Mutarotaselösuhg unbekannter Aktivität pipettiert. Durch Zugabe von 0,1 ml frisch bereiteter a-GlucoselÖsung (0,3 mg/ml Wasser) wird die Reaktion gestartet. Bei 25⁰C und 436 nm wird die Extinktionszunähme pro Minute registriert. In gleicher Weise wird ein Blindwert bestimmt, wobei anstelle der Mutarotaselösung Wasser eingesetzt wird. Die für Blindwert und Meßwert erhaltenen Extinktionszunahmen pro Minute /\E bzw. Δ&νΜ . werden in folgende Berechnungsformel eingesetzt:

Mutarotase-Einheiten/ml Enzymlösung =

0,05

4098U/07

Beispiel 2

0,02 ml Serum werden dire.kt in die Reaktion eingesetzt. Die Durchführung der Bestimmung erfolgt analog Beispiel 1, wobei folgende Bestandteile in der Reihenfolge ihrer Zugabe verwendet werden:

2 ml 0,2 M Irispuffer (pH 7,3),enthaltend 3 mM Coffein, 0,02 ml Serum "bzw. Wasser bei der Blindprobe,

0,1 ml Enzymgemiscn, hergestellt durch Lösen eines Lyophilisats in Gl tratpuff er (pH 6,5), so daß 120 U GDH/ml und 12 Einheiten Mutarotase/ml vorliegen,

0,02 ml wäßrige Coenzymlösung, enthaltend 0,32 M FAD.

Nach Ablauf der Reaktion (ca. 5 Minuten) errechnet sich aus der gemessenen Extinktionsdifferenz ^E = 0,164 ein Glucosegehalt von 96 mg/100 ml Serum.

Die gleichen Ergebnisse werden erhalten, wenn man eine Pufferlösung verwendet, die anstelle von. j5 mM Coffein 0,35 mM . Harnsäure, 21 mM Theophyllin, 2,6 mM Desoxyguanosin, 30 mM Inosin oder 50 mM Xanthosin enthält.

Verwendet man anstelle der obigen Enzyme ein hochgereinigtes Enzymgemisch mit 2500 U GDH/ml und 250 Einheiten Mutarotase/ml, so ist die Reaktion bereits nach 10 Sekunden beendet. Das Ergebnis ist das gleiche wie oben.,

Beispiel 3

Urin wird mit bidestilliertem HpO im Verhältnis 1 : 11 verdünnt und 0,2 ml der erhaltenen Probelösung in die Reaktion eingesetzt. Die Durchführung der Bestimmung erfolgt analog Beispiel 1, wobei folgende Bestandteile in der Reihenfolge ihrer Zugabe verwendet werden:

409814/0721

2 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,5), enthaltend 40 mM SuIfosalicylsäure,

0,2 ml verdünnter Urin bzw. Wasser bei der Blindprobe, 0,1 ml Enzymgemisch, enthaltend 300 U GDH/ml und 30 Einheiten Mutarotase/ml, gelöst in 0,05 M Citratpuffer (pH 6,5), der 3 M an Natriumchlorid ist, 0,02 rol wäßrige Coenzymlösung, enthaltend 0,23 M NAD.

Nach etwa zwei Minuten ist die Reaktion abgelaufen. .Die errechnete Extinktionsdifferenz ^E = 0,305 ergibt einen Glucosegehalt von 212 mg/100 ml Harn.

Die gleichen Ergebnisse werden erhalten, wenn man eine Pufferlösung verwendet, die anstelle von 40 mM SuIfosalicylsäure

1 mM m-Hydroxybenzoesäure, 0,5 mM Salicylsäure, 0,7 mM Acetylsalicylsäure, 10 mM Salicylamid oder 50 mM 1-(p-Chlor— phenylsulfonyl)-3-propylharnstoff enthält.

Beispiel 4

Eine Probe von 54,0 mg Honig wird in bidestilliertem Wasser gelöst, auf 100 ml aufgefüllt und 0,2 ml hiervon zur Glucosebestiraraung eingesetzt. Die Durchführung erfolgt analog Beispiel 1, wobei folgende Bestandteile in der Reihenfolge ihrer Zugabe verwendet werden: '

2 ml 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,3), enthaltend 40 mfTSulfo-

salicylsäure,
0,2 ml der zu untersuchenden Lösung bzw. Wasser bei der Blindprobe,

0,1 ml Enzymgemisch, enthaltend 300 U GDH/ml und 20 Einheiten Mutarotase/ml

0,02 ml wäßrige Coenzymlösung, enthaltend 0,32 M NAD oder die entsprechende Menge NADP.

A098U/0721

Nach Ablauf der Reaktion (ca. 2 Minuten) ergibt sich eine Extinktionsdifferenz von /\ß = 0,338. Daraus errechnet' sich ein Gehalt von 21,4 mg Glucose pro 100 ml Untersuchungslösung; der Honig enthält somit 39,6 $ Glucose.

Beispiel 5

Eine Testpackung zur enzymatischen Bestimmung von Glucose, ausreichend für etwa 90 Bestimmungen und 10 Blindwerte, enthält die folgenden Bestandteile:

1. 110 ml eines gebrauchsfertigen Enteiweißungsmittels, und zwar entweder eine 3 folge wäßrige Lösung von Trichloressigsäure oder eine 2 %ige wäßrige Lösung von Perchlorsäure.

2. 220 ml eines gebrauchsfertigen Puffers vom pH 7,3, und zwar entweder 200 mM Phosphatpuffer oder 100 mM Trishydroxymethylaminomethan.

3. 11 ml einer gebrauchsfertigen Lösung von GDH und Mutarotase in 50 mM Citratpuffer (pH 6,5)/3 M Natriumchlorid oder ein lyophilisiertes Enzymgemisch aus GDH und Mutarotase·, das zum Gebrauch in 11 ml 50 mM Citratpuffer gelöst wird, wobei" in beiden Fällen 120 U GDH/ml und 12 Einheiten Mutarotase/ml vorhanden sind.

4..Lyophilisiertes NAD oder NADP, das zum Gebrauch in 2,2 ml bidestilliertem Wasser gelöst wird, wobei sich eine Molari^ tat von 330 mM ergibt.

Die GlucosebeStimmung mit dieser lestpacküng wird wie in den obigen Beispielen beschrieben ausgeführt.

0 98 U /07 2.1

Beispiel 6

Zur Herstellung von Teststreifen zur halbquantitativen Glucosebestimmung werden

2150 U Diaphorase (bestimmt nach: H.U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, 2. Auflage, S. 406,

Verlag Chemie, Weinheim (197O)) 1200 U GDH
0,13 Millimol NAD
20 mg 2-(p-Jodphenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium-

chlorid (INT)
(bzw. 14 mg 3-(4,5-Dimethylthiazolyl-1-2)-2,5-diphenyl-

tetrazoliumbromid (MTT)) ·

in 20 ml 0,01 M Phosphatpuffer (pH 6,5) gelöst und der pH-Wert der Lösung gegebenenfalls auf 6,5 nachgestellt. Filterpapier (Schleicher und Schüll Nr. 14^0 CV) wird mit der Reagenzlösung getränkt und bei 25 C im luftstrom getrocknet. Das so erhaltene imprägnierte Filterpapier wird in kleine Quadrate von etwa 6 x'6 mm geschnitten-und auf Kunststoffstreifen von 6 χ 60 mm am unteren Ende aufgebracht. Es ist zweckmäßig, den saugfähigen Träger bereits vor dem Tränken auf eine Trägerfolie aufzusiegeln.

In Urinproben unterschiedlichen Glucosegehaltes werden die so hergestellten Teststäbchen genau 5 Sekunden eingetaucht und nach einer Minute die entstandene Farbe an Hand einer Farbskala beurteilt. Während bei Proben ohne Glucose keine Verfärbung auftritt, zeigen sich Glucosekonzentrationen von 50 - 100 mg $> durch schwache Rosafärbung (bzw. graublaue Verfärbung bei Verwendung von MTT), im Bereich von 250 mg # durch intensive Rosafärbung (bzw. Blaufärbung) und oberhalb 500 mg $ durch Rot- (bzw. Dunkelblau-) färbung an.

4098U/0721

Claims (11)

Patentansprüche

1. Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose mittels Giucosedehydrogenase, einem Pyridin-Coenzym und Puffer-Substanzen unter Bildung von Gluconsäure und reduziertem Pyridin-Coenzym, gekennzeichnet durch .einen Gehalt an mutarotationsbeschleunigenden Substanzen und gegebenenfalls Inhibitoren für Oxidasen von reduzierten Pyridin-Goenzymen und/oder Alkalichiorid.

2. Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Glucosedehydro- - genäse eine Aktivität von mindestens 2 U/ml Testlösung hat.

3. Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Pyridin-Coenzyme Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) oder Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat (NADP) sind,

4. Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose nach den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Puffersubstanzen einen pH-Wert von 6,5 - 8,5 aufrechterhalten.

5. Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose nach den Ansprüchen 1-4» dadurch gekennzeichnet, daß die mutaro,-tationsbeschleunigende Substanz Mutarotase ist.

6. Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis der Enzymeinheiten von Giucosedehydrogenase zu Mutarotase etwa 10 : 0,25-1 beträgt.

A098U/0721

7. Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose nach den Ansprüchen 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die gegebenenfalls enthaltenen Inhibitoren für Oxidasen von reduzierten Pyridin-Coenzymen Pyridin-, Purin- und/oder Hydroxybenzoesäurederivate sind.

8. Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose nach den Ansprüchen 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die gegebenenfalls enthaltenen Inhibitoren für Oxidasen von reduzierten Pyridin-Coenzymen 3-Acetylchinolin und/oder Sulfosalicylsäure sind.

9. Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose nach.den Ansprüchen 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß das gegebenenfalls enthaltene Alkalichlorid Natriumchlorid ist.

10. Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose, dadurch gekennzeichnet, daß ein saugfähiger Träger mit Glucosedehydrogenase, Nicotinamid-adenin-dinucleotid oder Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat, Diaphorase, einem Tetrazoliumsalz und einem Puffer imprägniert ist.

11. Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Glucose, dadurch gekennzeichnet, daß man das Mittel nach den Ansprüchen 1-9 auf die zu untersuchende glucosehaltige Probe einwirken läßt und den Gehalt an gebildetem reduziertem Pyridin-Coenzym spektrophotometrisch oder fluorimetrisch mißt.

A098U/0721

BAD ORlGtNAt