DE2633728C3 - NADH-Peroxidase, ihre Gewinnung und Verwendung - Google Patents

NADH-Peroxidase, ihre Gewinnung und Verwendung

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DE2633728C3 DE2633728A DE2633728A DE2633728C3 DE 2633728 C3 DE2633728 C3 DE 2633728C3 DE 2633728 A DE2633728 A DE 2633728A DE 2633728 A DE2633728 A DE 2633728A DE 2633728 C3 DE2633728 C3 DE 2633728C3
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Description

Die Erfindung betrifft eine neue NADH-Peroxidase aus Mikroorganismen, welche sich in verschiedenen Eigenschaften von der bekannten NADH-Peroxidase unterscheidet, das Verfahren zu ihrer Gewinnung sowie die Verwendung dieses neuen Enzyms zur Bestimmung von H2O2, insbesondere in gekoppelter Reaktion in Gegenwart einer spezifischen Oxidase.
Zahlreiche wichtige Substanzen, wie Glucose, Harnsäure, Cholesterin, Aminosäuren, Alkohole u.dgl., werden enzymatisch unter Verwendung von Oxidasen bestimmt, welche bei dieser Reaktion H2O2 bilden. Letzteres wird anschließend rrach verschiedenen Methoden, wie Oxidation eines Chromogens, Oxidation von Alkoholen mit Katalase (Hantzsche Reaktion), mit Aldehyd-Dehydrogenase u. a., gemessen. Alle diese bekannten Indikatorreaktionen weisen Nachteile auf.
So wird die Peroxidation von Chromogenen durch Pharmaka gestört, der Nachweis unter Verwendung der Hantzschen Reaktion benötigt eine sehr lange Reaktionszeit die Reaktionsführung über die Aldehyd-Dehydrogenase ist umständlich, und das Enzym ist sehr unstabil u. dgl. Es besteht daher ein Bedarf nach einer einfachen Nachweismethode für H2O2, welche diese Nachteile nicht aufweist und sich insbesondere auch in Kombination mit spezifischen Oxidasen einsetzen läßt.
Ideal wäre es, die zur Bildung von H2O2 führende spezifische Oxidasereaktion mit der für enzymatische Bestimmungen bevorzugt eingesetzten NADH-Reaktion (NADH = Nicotin-amid-adenin-dinucleotid in reduzierter Form) kuppeln zu können. Eine NADH-Peroxidase, welche die Reaktion
NADH — POD
NADH + H+ + H2O,
NAD+ + 2 H7O
katalysiert, ist bereits bekannt: ABB, 55,415 (1955); JBC, 225, 557 (1957). Dieses Enzym mit der EC-Nr. 1,11.1.1 wurde in Streptococcus faecalis IOC 1 und in Lactobacillus casei gefunden und zeichnet sich durch ein pH-Optimum bei 5,4 sowie durch Michaelis-Konslanten KMfUrH2O2 von 2 · 10-* und für NADH von 1,4 · ΙΟ-5 aus. Da für viele Oxidasen nur pH-Werte im alkalischen Bereich geeignet sind, die bekannte NADH-Pero>;idase aber bei pH 7,0 bereits praktisch inaktiv ist (Arch. Biochem. Biophys. 111, 535 [1965]) sowie aufgrund der ungünstigen Michaelis-Konstanten eignet sich das Enzym in der Praxis nicht für die H2O2-Bestimmi.ing in gekoppelter Reaktion mit einer spezifischen Oxidase.
Nunmehr wurde eine weitere NADH-Peroxidase gefunden, welche die Nachteile der bekannten NADH-Peroxidase von der sie sich klar unterscheidet, nicht aufweist und die sich vorzüglich zur Verwendung bei der enzymatischen H2O2-Bestimmung, insbesondere in gekoppelter Reaktion mit einer spezifischen Oxidase, eignet. Ein Erfindungsgegenstand ist daher eine NADH-Peroxidase, welche NADH mit H2O2 zu NAD und H2O oxidiert und gekennzeichnet ist durch eine Michaelis-Konstante KM gegenüber H2O2 von 2,8 · 10-5M und gegenüber NADH von 1,7 · 10"5M,
gemessen bei 25° C in 0,2 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanpuffer pH 6,0, enthaltend 0,1 M Kaliumacetat.
Das neue Enzym eignet sich wegen seiner niedrigen Km wesentlich besser als das bekannte Enzym für eine H2O2-Bestimmung. Je höher nämlich die KM ist, desto höher muß bei einer Bestimmung auch die H2O2-Konzentration im steady state sein. Je höher aber die H:O2-Konzentration ist, desto größer ist auch der Einfluß der Katalase, die im Probenmaterial in der Regel vorhanden ist. Durch die Konkurrenz der Katalase um das H2O2 werden aber die Resultate verfälscht.
Das neue Enzym der Erfindung ist wie das bekannte Enzym ein Flavoprotein und daher gelblich gefärbt. In Glycerin/Wasser 1:1 ist dac Enzym bei +40C monatelang stabil. NADPH kann NADH nicht ersetzen im Gegensatz zum bekannten Enzym, welches mit NADPH etwa 8% der Reaktionsgeschwindigkeit gegenüber NADH aufweist.
Das Enzym weist in Trispuffer in Gegenwart von Acetat- oder Propionat-lonen ein pH-Optimum bei 6,0 auf, die Aktivität in Natriumacetatpuffer bei pH 5,4, also unter den optimalen Bedingungen des bekannten Enzyms, liegt etwa 20% niedriger. Bei pH 9,0 beträgt die Aktivität noch etwa 20% des Optimums.
Erfindungsgemäß wird das neue Enzym aus Streptococcus faecalis ATCC 8043 gewonnen. Die Gewinnung erfolgt durch Aufschluß oder durch Behandlung des Mikroorganismus mit einem oberflächenaktiven Mittel unter Freisetzung des Enzyms, welches dann aus der Lösung isoliert werden kann. Geeignete Aufschlußmethoden sind beispielsweise Ultraschalleinwirkung, Zerreiben mit Glasperlen, Einwirkung hoher Scherkräfte u. dgl. Alle die·:«* Aufschlußmethoden sind bekannt und für Mikroorganismen üblich. Die Behandlung mit einem oberflächenaktiven Mittel erfolgt vorzugsweise bei erhöhter Temperatur zwischen 25 und 60°C. Bevorzugt wird eine Behandlung bei 45 bis 55° C bei schwach sauren pH-Werten zwischen etwa 4,5 und 6,0. In der Regel reichen 15 bis 30 Minuten aus, diese Einwirkungsdauer kann jedoch ohne Nachteil erheblich überschritten werden. So werden selbst bei dreistündiger Einwirkung bei 55° C noch sehr gute Ausbeuten erzielt. Die Behandlung mit oberflächenaktiven Mitteln wird bevorzugt, da hierbei weniger Verunreinigungen in Lösung gehen als bei mechanischen Aufschlußrnethoden und daher von vornherein ein reineies Enzym gewonnen wird. Unter den oberflächenaktiven Mitteln werden die nichtionogenen bevorzugt. Besonders bevorzugt werden Polyäthylenglycolester, z. B. Alkylarylpolyäthylenglycolester wie p-Isooctylphenyläthylenglycoläther mit durchschnittlich 8 bis 9 Äthylenglycoleinheiten. Ein besonderer Vorzug dieser Aufschlußmethode besteht auch darin, daß der Gehalt an störender NADH-Oxidase hierbei besonders gering ist. so
Zur Gewinnung des Enzyms werden die Lösungen von den ungelösten Stoffen befreit, z. B. durch Zentrifugieren, und aus dem gewonnenen klaren Überstand kann die das Enzym enthaltende Eiweißfraktion gefällt werden. Zur Fällung eignen sich die hierfür η in der Biochemie üblichen Mittel wie Aussalzen, z. B. mit Ammoniumsulfat, Fällung durch organische Lösungsmittel wie Aceton oder Methanol, Fällung mit Polyionen wie Polyäthylenimin u.dgl. Eine weitere Aufreinigung des rohen Lnzympräparats kann beispielsweise durch Chromatographie an Adsorbentien wie Carboxymethylcellulose, vernetztem Dextran, Ionenaustauschern u. dgl. erfolgen. Außerdem zeigt es sich, daß das Enzym auch durch Säurebehandlung von Begleitsubstanzen befreit werden kann. Zweckmäßig erfolgt die Säurebehandlung bei pH-Werten zwischen 4,2 und 4,8 während 10 bis 25 Minuten.
Eine bevorzugte Reinigungsmethode besteht daher in einer Einstellung der wäßrigen Enzymlösung auf pH 4,2 bis 4,8, Abtrennung des Unlöslichen und Fraktionierung M des im Überstand befindlichen Enzyms mit Polyäthylenimin.
Es versteht sich, daß alle Schritte des Gewinnungsverfahrens in gepufferter Lösung durchgeführt werden. Besonders geeignete Puffer sind dabei Phosphatpuffer, >ί TRIS-Puffer und Acetatpuffer. Aber auch die anderen üblichen Puffer wie Glycinpuffer, Borat-Citratpuffer u. dgl. sind brauchbar.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der neuen NADH-Peroxidase zur Bestimmung von H2O2 in einfacher oder in gekoppelter Reaktion mit einer spezifischen Oxidase. Die Bestimmung erfolgt zweckmäßig bei pH-Werten zwischen 6,0 und 9,0. Auf diese Weise gelingt es, die spezifische Oxidasereaktion mi» der Messung der NADH-NAD- b5 Reaktion zu koppeln. Letztere Reaktion läßt sich bekanntlich besonders einfach durch Bestimmung der Extinktionsänderung, die der Änderung der NADH-Konzentration proportional ist, verfolgen.
Unter »spezifischer Oxidase« werden im Rahmen der Erfindung Enzyme verstanden, welche mit bestimmten Substraten und O2 unter Bildung von H2O2 reagieren.
Als spezifische Oxidasen werden im Rahmen der Erfindung bevorzugt Glucoseoxidase, D-Aminosäureoxidase, L-Aminosäureoxidase, Cholesterinoxidase, Alkoholoxidase, Uricase und Xanthinoxidase verwendet. Dementsprechend lassen sich in der gekoppelten Reaktion Glucose, D-Aminosäuren wie D-Alanin, L-Aminosäuren wie L-Leucin, Cholesterin und Cholesterinester, niedere Alkohole^Harnsäure, Xanthin und Hypoxanthin bestimmen. In einfacher Reaktion kann H2O2 selbst bestimmt werden, also nicht nur als Zwischenprodukt wie in Gegenwart des Oxidasesystems.
Die Messung der NADH-Peroxidase der Erfindung läßt sich vorteilhaft nach folgendem Test durchführen:
2,68 ml TRIS-Kaliumacetatpuffer iO,2 M TRIS + 0,15 M Kaliumacetat): 2,42 g TRIS + 1,42 g Kaliumacetat in 70 ml H2O lösen, mit 2 N Essigsäure auf pH 6,0 einstellen, mit H2O ad 100 ml auffüllen.
0,20 ml NADH (6 mM): 5 mg NADH mit 1 ml H2O lösen.
0,02 ml Probe NADH-POD.
Mischen, bei 365 nm, d = 1 cm, 25° C Vorlauf registrieren ΔΕ/m'in. Dieser Vorlauf (Extinktionsabnahme) dient zur Berechnung der »NADH-Oxidase«. Start mit
0,10 ml H2O2 (40 mM (0,05 ml 3O°/oiges H2O2 werden mit 10 ml H2O verdünnt)).
Mischen, Extinktionsänderung/min messen (ΔΕ/mm). Vor Berechnung der NADH-POD-Aktivität wird von ΔΕ/m'm der NADH-Oxidase-Vorlauf abgezogen.
Bevorzugt wird TRIS-Acetat-Puffer verwendet, doch ist die Anwendung der NADH-POD nicht auf dieses Puffersystem beschränkt. Die Bestimmung von H2O2 mit NADH-POD kann u. a. durchgeführt werden mit:
Natriumacetat, Piperazin, Kaliumphosphat, Kaliumdiphosphat, Borat/Citrat, Glycyl-Glycin, Triäthanolamin.HCI oder HEPES (N-2-Hydroxyäthylpiperazin-N-äthan-sulfonsäure) als Puffersystem.
In entsprechender Weise kann auch die H2O2-Bestimmung durchgeführt v/erden, wobei NADH-POD im Überschuß zugegehen und die H2O2-Menge bestimmt wird, die der Extinktionsänderung entspricht. Die Messung kann nach der Endpunktmethode oder kinetisch, d. h. durch Messung der Extinktionsdifferenz innerhalb eines bestimmten kurzen Zeitraumes, erfolgen. Präzision und seitlicher Verlauf der HjOj-Bestimmung bei pH 8,0 im oben beschriebenen TRIS-Kalium acetatpuffer und bei den oben angegebenen Meßbedingungen zeigt die Zeichnung. In dieser stellt dar:
Fig. 1 eine E.chkurve, in der die H2O2-Menge (Abszisse) gegen die Extinktionsdifferenz (Ordinate) aufgetragen ist,
F i g. 2 die Extinktionsabnahme mit der Zeit bei 25°C. Am Start wurden 0,4 μΜοΙ Η2θ2 zugesetzt.
Die beiden Figuren der Zeichnung lassen die Brauchbarkeit des erfindungsgemäßen Enzyms für die quantitative H2O2-Bestimmung erkennen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Beispiel 1
Gewinnung und Reinigu..6 des Enzyms
Streptococcus faecalis ATCC 8043 Biomasse wird mit einer l%igen Lösung von p-Isooctylphenyläthylenglycoläther mit durchschnittlich 8 bis 9 Äthylenglycoleinheiten in 0,02 M Kaliumphosphatpuffer pH 5,0 30 Minuten auf 550C erhitzt. Dann wird auf 40C abgekühlt und das Unlösliche abgetrennt. Man erhält eine wäßrige Lösung mit einer Aktivität von 1,77 U/ml und einer spezifischen Aktivität von 0,77 U/mg.
Der erhaltenen Lösung wird Ammonsulfat zugesetzt, bis sich die gesamte enzymatische Aktivität im Niederschlag befindet. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Phosphatpuffer pH 5,0 aufgenommen und durch Molekularsiebpassage entsalzt Die so erhaltene Enzymlösung knnn direkt oder nach vorheriger Konzentrierung durch Lyophilisieren und Aufnehmen in 3.0 M Ammoniumsulfat-Lösung, pH ca. 7, für den H)Oj-TeSt verwendet werden.
Zweckmäßig erfolgt eine weitere Aufreinigung der Ausgangslösung ohne vorherige Abtrennung des Enzym? durch Ammonsulfatfällung wie folgt:
Die Lösung wird mit Essigsäure auf pH 4.4 eingestellt und 20 Minuten stehengelassen. Dann wird vom Unlöslichen abfiltriert. Dem Überstand wird Polyäthy-'■ ninlösung portionsweise zugesetzt und vom jeweils auftretenden Unlöslichen filtriert. Die -.': · mizym enthaltende Fraktion wird erneut in Puffer gelöst und über Diäthylaminoäthylcellulose Chromatographien. Anschließend erfolgt eine Entsalzung über vernetztcs Dextran. Man erhält so ein Präparat mit ca. 45 U/mg.
Beispiel 2
Abhängigkeit der Aktivität der NADHPOD
vom im Test verwendeten Puffer
Gemessen wird in 0.1 M Puffern (1 mM H2O . 0.4 mM NADH).
Tabelle 1
Enzymaktivitäten bei pH 7,5 in % in verschiedener Puffern, bezogen auf die Aktivität in Natriumacct;i! Puffer (= 100%)
Puffer
Natriumacetat
TRIS · Acetat
TRA · Acetat
Piperidin · HCI
HEPES
Kaliumphosphat
Kaliumdiphosphat
Borat/Citrat
TRA - ί ri^tharwiUm
100
!01
10(1
100
63
61
25
Beispiel 3
Einfluß des pl 1-Wertes im Testsystem auf die Aktivität Jtr NADHPOD.
Gemessen wird in 0,1 M TRIS.Acetat-Puffcr (I mM l:Ojund0.4 mM NADH).
Tabelle 2
pH-Abhängigkeit der iin/.ymaktiviiät in
pll '.
5.0 67
5.4 98
6.0 100
7.(1 88
7.5 56
8.0 37
9.0 19
Beispiel 4 Harnsäurebüstimmungmit Uricase
Die Bestimmung erfolgt gemäß folgender Gleichung:
ricase
; H,O - Harnsäure -
Uricase, NADHiOD gemäß Erfindung und NADH wurden in 02 M TRIS.Acetat-Puffer unterschiedlichen pH-Wertes, welcher jeweils 0.15 M Kaliumacetat enthielt gelöst. Dann wurde eine 0.2 μΜοΙ Harnsäure enthaltende wäßrige Lösung zum Start zugesetzt. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:
Tabelle 3
En7ymmenge
im Test
NADH-POD
Endablaufzeit in min
Uricase
■-. Wiederfindung,
bezogen auf
L'V-test = !00'-.
J ) 8 * Allantoin • H, C), - CO2 ".. Wieder-
pll 9 hn/>mmenge I n'.lahhiul- llndung.
'<· 9 im Test /eit in min. bezogen auf
10 l;\ -lest = KMV
Rif/T NADII-POD l.'ri-
_.ise 100
O.I 1 5 96.5
0.1 1 16 96,5
0.1 2 IO 98
0.2 0.2 10 rn! und H. U.
PHTm^thrrli. P Sch eibe. E. Be
0.1
0.!
■6
K)
95.5
99 Bergmeyer in U.U. Bergmeyer - Methoden der enzymatisch^ Analyse. Bd. II. 3. Aufl.. S. 1999. (1974).
Tabelle 4
Wiederfindung Harnsäure in %, bei 0,2 μ,ΜοΙ Harnsäure/Testansatz (Testbedingungen: 0,2 M TRIS ■ Acetat. 0,15 M Kaliwrrr.cetat, 0.4 μΜοΙ NADH, 0,1 U NADH-POD. I U Uricase aus Aspergillus flavus, 3 ml I e«! olumen, 25 C, 365 nm), bezogen auf 5 min Reaktionsablauf bei pH 8 - 100%
PH 71
6.0 95
",Γι KX)
Ii,ί) 98
8,5 76
9.0 69
!".0
Die Durchführung erfolgie bei pH-Werten zwischen 7,5 und 8,0 in TRIS.Acetat-Puffer 0,2 M, v/elcher 0,15 M Acetat enthält. Bei Zusatz von 0,2 U NADH-POD gemäß Erfindung und 0,7 U L-AOD im Test betrug die Wiederfindung etwa 100%. Bei einer Konzentration von 0,2 μΜοΙ L-Leucin betrug die Reaktionsdauer ca. 20 Minuten. Referenzmethode: nicht bekannt.
Beispiel 8
Cholesterinester-Bestimmung mit Cholesterinoxidase und Cholesterinesterase
Die Bestimmung erfolgt gemäß nachstehenden Gleichungen:
Beispiel 5
Glucosebestimmung mit Glucoseoxidase (GOD)
Die Bestimmung erfolgt nach folgender Gleichung:
D-Glucose + 11,0 + O,
GOD
Glueonat
II, O,
Die Bestimmung wurde bei pH 7,0 unter Einsatz von 210 U GOD, 0.2 U NADH-POD und 60 U Mutarotase durchgeführt. Die Bestimmung der Glucose im Harn ergab 100% des mit der Referenzmethode GOD-Perid R (DBPS 1648 840 und H. U. Bergmeyer. Bd. II, 3. Aufl., S. 1257 [1974]) erhaltenen Wertes.
Beispiel 6
Bestimmung von
D-Alanin mit D-Aminosäureoxidase (D-AOD)
Die Bestimmung erfolgt gemäß folgender Gleichung: D-Alanin + O, + Ιι,Ο
D-AOD
Pvruvat -L- NH, + H,O,
Die Bestimmung wurde bei pH 8,5 unter Einsatz von 0.25 U NADH-POD, 20 U D-AOD. 5 U Lactatdehydrogenase bei 25° C durchgeführt. Bei 20minütiger Inkubation bei 25° C betrug die Wiederfindung 100%.
Referenzmethode: M. G r a ß 1 in H. U. B e r g m e y er. Bd. II. 3. Aufl., S. 1731(1974).
Beispiel 7
Bestimmung von L-Leucin mit L-Aminosäureoxidase
(L-AOD) aus Crotalus terrificus
Die Bestimmung erfolgt nach folgender Gleichung:
L-Leucin + O2 + H2O
L-AOD
Ketoisocapronsäure + H2O2
I. C'holeslcrinesier + H2O
(hol. listerase
Cholesterin + Fettsäure
2. Cholesterin + O,
("hol. Oxid.
C'holestenon + H2O,
Es wurden handelsübliche Cholesterin-Standardlösungen und Serum verwendet. Die Wiederfindung bei einer handelsüblichen Standardlösung mit 0,2 μΜοΙ Cholesterin betrug 98 bis 102% bei pH-Werten zwischen 6,0 und 9,0 innerhalb von 9 bis 12 Minuten. Eingesetzt wurden 0,1 U NADH-POD, 2 U Cholesterinoxidase in 3 ml Testvolumen.
Die Cholesterinbestimmung im Serum unter Verseifung des veresterten Cholesterinanteils mit äthanolischer KOH ergab Wiederfindungswerte zwischen 95 und 105%.
Referenzmethode: P. Roeschlau, E. Bernt und W. Gruber, H. U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, Bd. II, 3. Aufl. S. 1938 (1974).
so B e i s ρ i e 1 9
Bestimmung von Alkoholen mit Methanol-Oxidase (MOD)
Die Bestimmung erfolgt gemäß folgender Gleichung:
MOD
Methanol +- O,
Formaldehyd + H2O2
Die Bestimmung wurde bei pH-Werten zwischen 9,0 und 9,5 in Glycin-Na-Pyrophosphatpuffer unter Zusatz von Semicarbazid durchgeführt. Die eingesetzten Enzyuimengen waren 03 Li NADH-POD und 8 LJ MOD. Die Wiederfindung bei 0,2 μΜοΙ Methanol und Äthanol lag um 100%. Auch mit Isopropanol konnte die Bestimmung durchgeführt werden.
Beispiel 10
Bestimmung von Xanthin und Hypoxanthin mit Xanthinoxidase (XOD)
Die Bestimmung erfolgt gemäß folgenden Gleichungen:
XOD Hypoxanthin -f H2O + O2 ' Xanthin + H2O2
10
XOD
Xanthin + H,O + O2
Harnsäure + HiO,
Die Bestimmung erfolgte bei pH 8,0 mit TRIS-Puffer wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben. Die Wiederfindung betrug 100% Xanthin bzw. Hypoxanthin. Als Referenzmethode wurde die in B e r g m e y e r, »Methoden der enzymatischen Analyse«, 3. Aufl., Bd. II, S. 1988 (1974) beschriebene Methode verwendet.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

Patentansprüche:
1. NADH-Peroxidase, welche NADH mit H5O2 zu NAD und H2O oxidiert, gekennzeichnet durch eine Michaeliskonstante Km gegenüber H2O2 von 2,8 · ΙΟ"5 M und gegenüber NADH von 1,7 · ΙΟ-5 M, gemessen bei 25°C in 0,2 M Trispuffer pH 6,0, enthaltend 0,1 M Kaliumacetat
2. Verfahren zur Gewinnung der NADH-Peroxidase von Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym aus Streptococcus faecalis ATCC 8043 durch Aufschluß oder Behandlung mit einem oberflächenaktiven Mittel freigesetzt und aus der
Lösung gewonnen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymlösung auf einen pH-Wert von 4,2 bis 4,8 eingestellt, Unlösliches abgetrennt und im Filtrat eine Fraktionierung mit Polyäthylenimin durchgeführt wird.
4. Verwendung des Enzyms von Anspruch 1 zur Bestimmung von H2O2 in einfacher oder in gekoppelter Reaktion mit einer spezifischen Oxidase.
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US05/811,422 US4186052A (en) 1976-07-27 1977-06-29 NADH Peroxidase for hydrogen peroxide determination
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GB31143/77A GB1528309A (en) 1976-07-27 1977-07-25 Peroxidase
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2806371A1 (de) * 1978-02-10 1979-08-23 Guenther Kohlbecker Verfahren zur enzymatischen bestimmung von oxalat mittels oxalat-oxidase
GB2015532B (en) * 1978-02-27 1982-06-16 Yamasa Shoyu Kk -lysine -oxidase
ES481444A1 (es) * 1978-06-12 1980-02-01 Cetus Corp Un metodo para la fabricacion de epoxidos o glicoles a par- tir de olefinas.
DE2965849D1 (en) * 1978-08-18 1983-08-18 Kyowa Hakko Kogyo Kk Method and test composition for the determination of a substrate for xanthine-oxidase, including a novel xanthine-oxidase and method for the preparation thereof
US4341868A (en) 1978-08-18 1982-07-27 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method and test composition for the determination of the substrate for xanthine oxidase
DE3477812D1 (en) * 1983-01-12 1989-05-24 Alcoholism & Drug Addiction Rapid analysis of ethanol in body fluids
DE3313178A1 (de) * 1983-04-12 1984-10-18 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur enzymatischen bestimmung von sulfit
JPS59205999A (ja) * 1983-05-10 1984-11-21 Wako Pure Chem Ind Ltd 還元型補酵素の定量方法
JPS6131097A (ja) * 1984-07-23 1986-02-13 Toyo Jozo Co Ltd 新規な高感度酵素的測定法
JPS62140999A (ja) * 1985-12-16 1987-06-24 川鉄機材工業株式会社 重量物懸吊装置
DE3725851A1 (de) * 1986-08-12 1988-02-18 Takara Shuzo Co Nad(p)h-oxidase, verfahren zu ihrer isolierung und anwendung
US5385827A (en) * 1989-09-20 1995-01-31 Clark; John R. Method of geochemical prospecting
CA2965481C (en) * 2014-10-31 2023-03-21 Rohm And Haas Company Oxidative esterification process for making methyl methacrylate

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT986838B (it) * 1972-05-12 1975-01-30 Sclavo Inst Sieroterapeut Complesso di reagenti per la deter minazione enzimatica del glucosio sistema glucosio ossidasi perossi dasi con metodo manuale e automati co con lettura a termine o in cinetica

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