DE2633728A1 - Nadh-peroxidase, ihre gewinnung und verwendung - Google Patents
Nadh-peroxidase, ihre gewinnung und verwendungInfo
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Classifications
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-
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Description
Patentanwälte Dipl-Ing. H.¥;;.ickmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke
Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Citem. B. Huber
2S3212.B
8 MÜNCHEN 86, DEN
POSTFACH 860 820 HT
MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22
BOEHRIKaER MANNHEIM GMBH 6800 Mannheim 31, Sandtiofer Str. 112-132
NADH-Peroxidase, ihre Gewinnung und Verwendung
Die Erfindung betrifft eine neue NADH-Peroxidase aus Mikroorganismen, welche sich in verschiedenen Eigenschaften
von der bekannten NADH-Peroxidase unterscheidet, das Verfahren zur ihrer Gewinnung sowie die Verwendung
dieses neuen Enzyms zur Bestimmung von HpOp,
insbesondere in gekoppelter Reaktion in Gegenwart einer spezifischen Oxidase.
Zahlreiche wichtige Substanzen, wie Glucose, Harnsäure, Cholesterin, Aminosäuren, Alkohole und dergleichen,
werden enzymatisch unter Verwendung von Oxidasen bestimmt, welche bei dieser Reaktion H2Op bilden. Letzteres
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2833728
wird anschließend nach verschiedenen Methoden, wie Oxidation eines Chromogens, Oxidation von Alkoholen mit
Katalase (Hantz'sche Reaktion), mit Aldehyd-Dehydrogenase
u.a., gemessen. Alle diese bekannten Indikatorreaktionen weisen Nachteile auf. So wird die Peroxidation von Chromogenen
durch Pharmaka gestört, der Nachweis unter Verwendung der Hantzrsehen Reaktion benötigt eine sehr lange
Reaktionszeit, die Reaktionsführung über die Aldehyd-Dehydrogenase ist umständlich und das Enzym ist sehr unstabil
und dergleichen. Es besteht daher ein Bedarf nach einer einfachen Nachweismethode für H2O2, welche
diese Nachtelle nicht aufweist und sich insbesondere auch in Kombination mit spezifischen Oxidasen einsetzen läßt.
Ideal wäre es, die zur Bildung von H2O2 führende spezifische
Qxidasereaktion mit der für enzymatische Bestimmungen bevorzugt eingesetzten NADH-Reaktion (NADH — Nicotinamid-adenin-dinucleotid
in reduzierter Form) kuppeln zu können. Eine NADH-Peroxidase, welche die Reaktion
NADH + H+ + H0O0 NAD+ + 2 H0O
katalysiert, ist bereits bekannt: ABB, 55., 415 (1955);
JBC, 225« 557 (1957). Dieses Enzym mit der EC-Nr.
1.11.1.ΐ wurde in Streptococcus faecalis 10 C I und in
Lactobacillus casei gefunden und zeichnet sich durch ein
pH-Optimum bei 5,4, sowie durch Michaelis-Konstanten K™
für H2O2 von 2 χ 10"4 und für NADH von 1,4 x 10~5 aus.
Da für viele Oxidasen nur pH-Werte im alkalischen Bereich geeignet sind, die bekannte NADH-Peroxidase aber bei pH 7,0
bereits praktisch inaktiv ist (Arch. Biochem. Biophys. 111, 535 (1965)), sowie aufgrund der ungünstigen Michaelis-Konstanten
eignet sich das Enzym in der Praxis nicht für
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die H202-Bestimmung in gekoppelter Reaktion mit einer
spezifischen Oxidase.
Nunmehr wurde eine weitere NADH-Peroxidase gefunden, welche
die Nachteile der bekannten NADH-Peroxidase von der sie sich klar unterscheidet, nicht aufweist und die sich
vorzüglich zur Verwendung bei der enzymatischen HpOp-Bestimmung, insbesondere in gekoppelter Reaktion mit einer
spezifischen Oxidase, eignet. Ein Erfindungsgegenstand ist daher eine NADH-Peroxidase, welche NADH mit H2Op zu
NAD und H9O oxidiert und gekennzeichnet ist durch eine Michaelis-Konstante KM gegenüber H0O9 von 2,8 χ 10 "Ή
-5 ο
und gegenüber NADH von 1,7 x 10 M, gemessen bei 25 C,
in 0,2M TRIS-(hydroxymethyl)-aminomethanpuffer pH 6,0,
enthaltend O,1M Kaliumacetat.
Das neue Enzym eignet sich wegen seiner niedrigen KM wesentlich
besser als das bekannte Enzym für eine H2O2-Bestimmung.
Je höher nämlich die K„ ist, desto höher muß bei einer Bestimmung
auch die !^(^-Konzentration im steady state sein.
Je höher aber die H202-Konzentration ist, desto größer ist
auch der Einfluß der Katalase, die im Probenmaterial in der Regel vorhanden ist. Durch die Konkurrenz der Katalase um
das H7O7 werden aber die Resultate verfälscht.
Das neue Enzym der Erfindung ist wie das bekannte Enzym ein Plavoprotein und daher gelblich gefärbt. In Glycerin/
Wasser 1 : 1 ist das Enzym bei +40C monatelang stabil.
NADPH kann NADH nicht ersetzen im Gegensatz zum bekannten Enzym, welches mit NADPH etwa 8$ der Reaktionsgeschwindigkeit
gegenüber NADH aufweist.
Das Enzym weist in Trispuffer in Gegenwart von Acetatoder
Propionat-Ionen ein pH-Optimum bei 6,0 auf, die Aktivität
in Natriumacetatpuffer bei pH 5,4, also unter den optimalen Bedingungen des bekannten Enzyms, liegt
etwa 20$ niedriger. Bei pH 9,0 beträgt die Aktivität
noch etwa 20$ des Optimums.
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. ε
Erfindungsgemäß wird das neue Enzym aus Streptococcus
faecalis ATCC 8045 gewonnen. Die Gewinnung erfolgt durch.
Aufschluß oder durch Behandlung des Mikroorganismus mit einem oberflächenaktiven Mittel unter Freisetzung des
Enzyms, welches dann aus der lösung isoliert werden kann. Geeignete Aufsehlußmethoden sind beispielsweise Ultraschalleinwirkung,
Zerreiben mit Glasperlen, Einwirkung hoher Scherkräfte und dergleichen. Alle diese Aufsehlußmethoden sind bekannt
und für Mikroorganismen üblich. Die Behandlung mit einem oberflächenaktiven Mittel erfolgt vorzugsweise bei erhöhter
Temperatur zwischen 25 und 60 C. Bevorzugt wird eine Behandlung
bei 45 bis 550C bei schwach sauren pH-Werten zwischen
etwa 4,5 und 6,0. In der Regel reiche^ 15 bis 30 Minuten aus,
dieae Einwirkungsdauer kann jedoch ohne Nachteil erheblich überschritten werden. So werden selbst bei dreistündiger Einwirkung
bei 55°C noch sehr gute Ausbeuten erzielt. Die Behandlung mit oberflächenaktiven Mitteln wird bevorzugt, da hierbei weniger Verunreinigungen in Lösung gehen als bei mechanischen
Aufsehlußmethoden und daher von vornherein ein reineres
Enzym gewonnen wird. Unter den oberflächenaktiven Mitteln werden die nichtionogenen bevorzugt. Besonders bevorzugt werden
.Polyäthylenglyc.olester, z.B. Alkylarylpolyäthylenglycolester
wie Triton X-100. Ein besonderer Vorzug dieser Aufschlußmethode besteht auch darin, daß der Gehalt an störender NADH-Oxidase
hierbei besonders gering ist.
Zur Gewinnung des Enzyms werden die Lösungen von den ungelösten Stoffen befreit, z.B. durch Zentrifugieren, und aus dem gewonnenen
klaren Überstand kann die das Enzym enthaltende Eiweißfraktion gefällt werden. Zur Fällung eignen sich die hierfür
in der Biochemie üblichen Mittel wie Aussalzen, z.B. mit Ammoniumsulfat, Fällung durch organische Lösungsmittel wie
Aceton oder Methanol, Fällung mit Polyionen wie Polyäthylenimin und dergleichen. Eine weitere Aufreinigung des rohen Enzympräparats
kann beispielsweise durch Chromatographie an Adsorbentien wie Carboxymethylcellulose, vernetztem Dextran,
Ionenaustauschern und dgl. erfolgen. Außerdem zeigt es sich, daß das Enzym auch durch Säurebehandlung von Begleitsubstan-
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zen befreit werden kann. Zweckmäßig erfolgt die Säurebehandlung bei pH-Werten zwischen 4,2 und 4|8 während 10 bis 25
Minuten.
Eine bevorzugte Reinigungsmethode besteht daher in einer Einstellung
der wäßrigen Enzymlösung auf pH 4,2 bis 4,8, Abtrennung des Unlöslichen und Fraktionierung des im Überstand befindlichen
Enzyms mit Polyäthylenimin.
Es versteht sich, daß alle Schritte des Gewinnungsverfahrens in gepufferter Lösung durchgeführt werden. Besonders geeignete
Puffer sind dabei Phosphatpuffer, IRIS-Puffer und Acetatpuffer.
Aber auch die anderen üblichen Puffer wie Glycinpuffer, Borat-Citratpuffer und dgl. sind brauchbar.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der neuen NADH-Peroxidase zur Bestimmung von HpOp in einfacher
oder in gekoppelter Reaktion mit einer spezifischen Oxidase. Die Bestimmung erfolgt zweckmäßig bei pH-Werten zwischen
6,0 und 9,0. Auf diese Weise gelingt es, die spezifische Oxidasereaktion mit der Messung der NADH-iTAD-Reaktion zu koppeln.
Letztere Reaktion läßt sich bekanntlich besonders einfach durch Bestimmung der Extinktionsänderung, die der Änderung
der KADH-Konzentration proportional ist, verfolgen.
Unter "spezifischer Oxidase" werden im Rahmen der Erfindung Enzyme verstanden, welche mit bestimmten Substraten und O2
unter Bildung von HgO2 reagieren.
Als spezifische Oxidasen werden im Rahmen der Erfindung bevorzugt Glueοseoxidase, D-Aminosäureoxidase, L-Aminosäureoxidase,
Cholesterinoxidase, Alkoholoxidase, Uricase und
Xanthinoxidase verwendet. Dementsprechend lassen sich in
der gekoppelten Reaktion Glucose, D-Aminosäuren wie D-Alanin,
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L-Aminosäuren wie L—Leucin, Cholesterin und Cholesterinester,
niedere Alkohole, Harnsäure, Xanthin und Hypoxanthin bestimmen. In einfacher Reaktion kann HpOp selbst bestimmt werden,
also nicht nur als Zwischenprodukt wie in Gegenwart des Oxidasesystems.
Die Messung der NADH-Peroxidase der Erfindung läßt sich vorteilhaft
nach folgendem Test durchführen:
2,68 ml !ERIS-Kaliumacetatpuffer (0,2 M TRIS + 0,15 M
Kaliumacetat): 2,42 g TRIS + 1,42 g Kaliumacetat in 70 ml H^O lösen, mit 2 N Essigsäure auf
pH 6,0 einstellen, mit HpO ad 100 ml auffüllen.
0,20 ml HADH (6 mM): 5 mg NADH mit 1 ml H2O lösen.
0,02 ml Probe NADH-POD.
Mischen, bei 365 mn, d = 1 cm, 25°C Vorlauf registrieren
ΔΕ/min. Dieser Vorlauf (Extinktionsabnahme} dient zur Berechnung der "NADH-Oxidase".
Start mit
0,10 ml H2O2 (40 mM (0,05 ml 30%iges H2O3 werden mit
l&ml H2O verdünnt})
Mischen, Extinktionsänderung/min messen (ÄE/min) .. Vor Berechnung der NÄDH-POD-Aktivität wird von
ΔΕ/min der NADH-Oxidase-Vorlauf abgezogen.
Bevorzugt wird TRIS-Acetat-Puffer verwendet, doch ist die Anwendung
der NADH-POD nicht auf dieses Puffersystem beschränkt. Die Bestimmung von H7O2 mit NADH-POD.kann u.a. durchgeführt
werden mit:
Natriumacetat, Piperazin, Kaliumphosphat, Kaliumdiphosphat,
Borat/Citrat, Glycyl-Glycin, Triethanolamin.HCl oder HEPES
(N-2- Hydroxyäthylpiperazin-N-äthan-sulfonsäure) als Puffersystem.
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In entsprechender Weise ka.... auch die HpOp-Bestimmung durchgeführt
werden, wobei NADH-POD im Überschuß zugegeben und die HpOp-Menge bestimmt wird, die der Extinktionsänderung
entspricht. Die Messung kann nach der Endpunktmethode oder kinetisch, d.h. durch Messung der Extinktionsdifferenz innerhalb
eines bestimmten kurzen Zeitraumes, erfolgen. Präzision und zeitlicher Verlauf der HgOp-BeStimmung bei pH 8,0 im oben
beschriebenen TRIS-Kaliumacetatpuffer und bei den oben angegebenen
Meßbedingungen zeigt die beigefügte Zeichnung. In dieser stellen dar:
Pig. 1 eine Eichkurve, in der die HgOg
(Abszisse) gegen die Extinktionsdifferenz (Ordinate) aufgetragen ist
Pig. 2 die Extinktionsabnahme mit der Zeit bei 25°C. Am
gesetzt.
gesetzt.
250C. Am Start wurden 0,4^MoI HoOp zu-
Die beiden Piguren der Zeichnung lassen die Brauchbarkeit des erfindungsgemäßen Enzyms für die quantitative HpOp-Bestimmung
erkennen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Gewinnung und Reinigung des Enzyms
Streptococcus faecalis ATCC 8043 Biomasse wird mit einer 1#igen Lösung von TRITON X 100 in 0,02 M Kaliumphosphatpuffer
pH 5,0 30 Minuten auf 55°C erhitzt. Dann wird auf 40C abgekühlt und das Unlösliche abgetrennt. Man erhält eine
wäßrige Lösung mit einer Aktivität von 1,77 U/ml und einer spezifischen Aktvität von 0,77 U/mg.
Die erhaltene Lösung wird Ammonsulfat zugesetzt, bis sich die gesamte enzymatische Aktivität im Niederschlag befin-
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det. Der Niederschlag wii'd ajfillrierb, mit Phosphatpuffer
pH 5,0 aufgenommen und dur :·:. Molekularsiebpassage entsalzt. Die so erhaltene Enzymlösuiv; kann direkt oder nach vorheriger
Konzentrierung durch Lyophilisieren und Aufnehmen in
3,0 M Ammoniumsulfat-Lösung, pH ca. 7 für den H2O3-TeSt verwendet
werden.
Zweckmäßig erfolgt eine weitere Aufreinigung der Ausgangslösung ohne vorherige Abtrennung des Enzyms durch Ammonsulfatfällung
wie folgt:
Die Lösung wird mit Essigsäure auf pH 4,4 eingestellt und
20 Minuten stehengelassen. Dann wird vom Unlöslichen abfiltriert. Dem Überstand wird Polyäthyleniminlösung portionsweise
zugesetzt und vom jeweils auftretenden Unlöslichen filtriert. Die das Enzym enthaltende Fraktion wird erneut in
Puffer gelöst und. über Diäthylaminoäthylcellulose chromatographiert.
Anschließend erfolgt eine Entsalzung über vernetztes Dextran. Man erhält so ein Präparat mit ca. 45· U/mg.
Abhängigkeit der Aktivität der NADH-POD vom im Test verwendeten Puffer.
Gemessen wird in 0,1 M Puffern (1 mM H3O2, 0,4 mM NADH).
Enzymaktivitäten bei pH 7,5 in % in verschiedenen Puffern, bezogen auf die Aktivität in Natriumacetat-Puffer (= 100%).
| Puffer | % |
| Natriumacetat | 100 |
| TRIS.Acetat | 101 |
| TRA.Acetat | 100 |
| Piperazin.HCl | 100 |
| HEPES | 89 |
| Kaliumphosphat | 63 |
| Kaliumdiphosphat | 61 |
| Borat/Citrat | 25 |
TRA = Triäthanolamin 70 9 8 85/0 T/B
BAD ORIGINAL
Einlfuß des pH-Wertes im Testsystem auf die Aktivität der NADH-POD.
Gemessen wird in 0,1 M TRIS.Acetat-Puffer (1 mM
0,4 mM NADH).
und
pH-Abhängigkeit der Enzymaktivität in %
| pH | % |
| 5,0 | 67 |
| 5,4 | 98 |
| 6,0 | 100 |
| 7,0 | 88 |
| 7,5 | 56 |
| 8,0 | 37 |
| 9,0 | 19 |
Beispiel 4
Harnsäurebestimmung mit uricase
Harnsäurebestimmung mit uricase
Die Bestimmung erfolgt gemäß folgender Gleichung:
2 HpO + Harnsäure + 0? Uricase >
Allantoin + H„0p + CO.
Uricase, EADH-POD gemäß Erfindung und NADH wurden in 0,2 MTRis,
Acetat-Puffer unterschiedlichen pH-Wertes, welcher jeweils 0,15 M Kaliumacetat enthielt, gelöst. Dann wurde eine 0,2
ytiMol Harnsäure enthaltende wäßrige Lösung zum Start zugesetzt.
Folgende Ergebnisse wurden erhalten:
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/11
| pH | Enzymmenge NADH-POD |
im Test _ Uricase |
ndablaufzeit | 95,5 |
| U | U | 99 | ||
| 6 | 0,1 | 1 | 16 | 100 |
| 7 | 0,1 | 1 | 10 | 96,5 |
| 8 | 0,1 | 1 | 5 | 96,5 |
| 9 | 0,1 | 1 | 16 | 98 |
| 9 | 0,1 | 2 | 10 | |
| 10 | 0,2 | 0,2 | 10 | |
Referenzmethode: "P. Scheibe, E. Bernt und H.U. Bergmeyer
in H.U. Bergmeyer - Methoden der enzymatischen Analyse,
Bd. II, 3. Aufl., S. 1999, (1974).
Bd. II, 3. Aufl., S. 1999, (1974).
Wiederfindung Harnsäure in %, bei 0,2 pMol Harnsäure/Testansatz
(Testbedingungen : 0,2 M TRIS.Acetat, 0,15 M Kaliumacetat,
0,4 jiMol NADH, 0,1 U NADH-POD, 1 U Uricase aus
Aspergillus flavus, 3 ml Testvolumen, 25°C, 365 nm), bezogen auf 5 min Reaktionsablauf bei pH 8 = 100 %.
Aspergillus flavus, 3 ml Testvolumen, 25°C, 365 nm), bezogen auf 5 min Reaktionsablauf bei pH 8 = 100 %.
| PH | % |
| 6,0 | 71 |
| 7,0 | 95 |
| 8,0 | 100 |
| 8,5 | 98 |
| 9,0 | 76 |
| 10,0 | 69 |
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Al
Beispiel 5 '<* 2633728
Glucosebestimmung mit Glueοseoxidase (GOD)
Die Bestimmung erfolgt nach folgender Gleichung:
D-Glucose + H2O + O2 ^^ Gluconat +
Die Bestimmung wurde "bei pH 7,0 unter Einsatz von 210 U GOD,
0,2 TJ NADH-POD und 60 ü Mutarotase durchgeführt. Die Bestimmung
der Glucose im Harn ergab 100$ des mit der Referenzmethode GOD-Perid R (DBPS 1648840 und H.U. Bergmeyer, Bd. II,
3. Aufl., S. 1257 (1974)) erhaltenen Wertes.
Bestimmung von D-Alanin mit D-Aminosäureoxidase (D-AOD)
Die Bestimmung erfolgt gemäß folgender Gleichung: D-Alanin + 0£ + H2O Pyruvat + NH5 + H2O2.
Die Bestimmung wurde bei pH 8,5 unter Einsatz von 0,25 U ΪΤΑΌΗ-POD, 20 U D-AOD, 5 U Lactatdehydrogenase bei 25°C
durchgeführt. Bei 20 minütiger Inkubation bei 250C betrug
die Wiederfindung 100$.
Referenzmethode: M. Graßl in H.U. Bergmeyer, Bd. IIf 3. Aufl.,
S. 1731 (1974).
Bestimmung von !-Leucin mit L-Aminosäureoxidase (L-AOD) aus
Crotalus terrificus)
Die Bestimmung erfolgt nach folgender Gleichung:
L—AOD
I-Leucin + O2 =·* Ketoisocapronsäure + H2O2.
I-Leucin + O2 =·* Ketoisocapronsäure + H2O2.
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Die Durchführung erfolgte bei pH-Werten zwischen 7,5 und 8,0 in TRIS.acetat-Puffer 0,2 M, welcher 0,15 M Acetat enthält.
Bei "Zusatz von 0,2 IT FlDH-POD gemäß Erfindung und 0,7 TJ L-AOD im Test betrug die Wiederfindung etwa 100$. Bei einer
Konzentration von 0,2^MoI L-Leucin betrug die* Reaktionsdauer
ca. 20 Minuten. Refernzmethode: nicht bekannt.
Cholesterinester-BestLmmung mit Cholesterinoxidase und Cholesterinesterase
Die Bestimmung erfolgt gemäß nachstehenden Gleichungen:
1) Cholesterinester + HpO ctlolesterln +
Fettsäure
2) Cholesterin + O2 Cholestenon + H2O2.
Es wurden handelsübliche Cholesterin-Standardlösungen und
Serum verwendet. Die Wiederfindung bei einer handelsüblichen Standardlösung mit 0,2^MoI Cholesterin betrug 98 bis
102$ bei pH-Werten zwischen 6,0 und 9,0 innerhalb von 9 bis
12 Minuten. Eingesetzt wurden 0,1 U NADH-POD, 2 II Choleaterinoxidase
in 3 ml Testvolumen.
Die CholesterinbeStimmung im Serum unter Verseifung des
veresterten Cholesterinanteils mit äthanolischer KOH ergab Wiederfindungswerte zwischen 95 und 105$.
Referenzmethode: P. Roeschlau, E. Bernt und W. Gruber,
H.U. Bergmeyer, Bd. II, 3. Aufl., S. 1938 (1974).
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Bestimmung von Alkoholen mit Methanol-Oxidase (MOD)
Die Bestimmung erfolgt gemäß folgender Gleichung:
Methanol + O2 WL·^ Formaldehyd + H2O2.
Methanol + O2 WL·^ Formaldehyd + H2O2.
Die Bestimmung wurde bei pH-Werten zwischen 9,0 und 9,5 in
Glycin-Ma-Pyrophosphatpuffer unter Zusatz von Semicarbazid
durchgeführt. Die eingesetzten Enzymmengen waren 0,3 U
NADH-POD und 8 U MOD. Die Wiederfindung bei 0,2/iMol Methanol und Äthanol lag um 100?£. Auch mit Isopropanol konnte die Bestimmung durchgeführt werden.
Glycin-Ma-Pyrophosphatpuffer unter Zusatz von Semicarbazid
durchgeführt. Die eingesetzten Enzymmengen waren 0,3 U
NADH-POD und 8 U MOD. Die Wiederfindung bei 0,2/iMol Methanol und Äthanol lag um 100?£. Auch mit Isopropanol konnte die Bestimmung durchgeführt werden.
Bestimmung von Xanthin und Hypoxanthin mit Xanthinoxidase (XOD)
Die Bestimmung erfolgt gemäß folgenden Gleichungen:
Hypoxanthin + H2O + O2 £°^->
Xanthin +
Xanthin + H2O + O2 1^-) Harnsäure + H2O2.
Die Bestimmung erolgte bei pH 8,0 mit TRIS-Puffer wie in den
vorhergehenden Beispielen beschrieben. Die Wiederfindung betrug 100?$ Xanthin bzw. Hypoxanthin. Als Referenzmethode
wurde die in Bergmeyer, "Methoden der enzymatischen Analyse», 3. Aufl., Band II, S. 1988 (1974) beschriebenen Methode verwendet.
wurde die in Bergmeyer, "Methoden der enzymatischen Analyse», 3. Aufl., Band II, S. 1988 (1974) beschriebenen Methode verwendet.
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Claims (5)
- -Paten «in.sprüche-Yi NADH-Peroxidase, welche NADH mit H2O2 zu NAD und H2O oxidiert, g e k e η η ζ e i c h η e t durch eine Michaeliskonstante KM gegenüber H2O2 von 2·, 8 * 10 J M- und gegenüber ITADH von 1,7 · IO"-5 M, gemessen bei 2JjC in 0,2 M Trispuffer pH 6,0, enthaltend 0,1 M Kaliumacetat.
- 2. Verfahren zur Gewinnung der NADH-Peroxidase von Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Enzym aus Streptococcus faecalie ATCC 8043 durch Aufschluß oder Behandlung mit einem oberflächenaktiven Mittel freigesetzt und aus der Lösung gewonnen wird.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymlösung auf einen pH-Wert von 4,2 bis 4,8 eingestellt, Unlösliches abgetrennt und im Piltrat eine Fraktionierung mit Polyäthylenimin durchgeführt wird.
- 4. Verwendung des Enzyms von Anspruch 1 zur Bestimmung von HpO2 in einfacher oder in gekoppelter Reaktion mit einer spezifischen Oxidase bei pH-Werten zwischen 6,0 und 9,O durch Messung der Extinktionsänderung, welche der Änderung der NADH-Konzentration proportional ist.
- 5. Verwendung des Enzyms von Anspruch 1 für den Zweck von Anspruch 5 in gekoppelter Reaktion mit Glueοseoxidase, D-Aminosäureoxidase, L-Aminosäureoxidase, Cholesterinoxidase, Alkoholoxidase,· Uricase oder Xanthinoxidase.709885/0178ORIGINAL INSPECTED
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