DE2506712A1 - Verfahren zur bestimmung von cholesterin - Google Patents

Description

• Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin und zwar von Gesamtcholesterin oder von gebundenem Cholesterin.
• Cholesterin liegt in biologischem Material, wie z.B. Serum und dgl., teils in freier Form, teils in gebundener Form als Ester vor. Zur Bestimmung von gebundenem Cholesterin oder des gesamten Cholesterins ist es erforderlich, das in gebundener Form vorliegende Cholesterin zuerst freizusetzen. Dies erfolgte bisher durch Verseifung unter alkalischen Bedingungen, beispielsweise mit alkoholischer Kalilauge. Nach der Verseifung kann das freigesetzte Cholesterin dann nach einer der bekannten Methoden, entweder chemisch oder enzymatisch, bestimmt werden.
• Die chemische Bestimmung kann beispielsweise nach dem Verfahren von Liebermann-Burchard erfolgen, die enzymatische Bestimmung kann mittels Cholesterinoxydase, Cholesterindehydrogenase oder Cholesterindehydrase erfolgen. Da bekannterweise die einzelnen Cholesterinester als auch das freie Cholesterin bei den chemischen Bestimmungsmethoden unterschiedliche Extinktionskoeffizienten haben, ist es erforderlich, die Cholesterinester durch alkalische Hydrolyse in freies Cholesterin überzuführen.
• In jedem Falle ist aber die alkalische Verseifung des gebundenen Cholesterins ein störender und zeitraubender Verfahrensschritt.
• Hinzu kommt, daß die verwendeten relativ aggressiven Reagentien zu einem Abbau des Cholesterins führen können. Um einen solchen Abbau und damit eine Verfälschung der Analysenergebnisse zu verhindern, muß unter relativ milden Bedingungen hydrolysiert werden, welche wiederum die erforderliche Zeitdauer für die Bestimmung unerwünscht vergrößern.
• Besonders nachteilig ist die alkalische Freisetzung des Cholesterins dann, wenn anschließend die Bestimmung des Cholesterins nach bevorzugten enzymatischen Methoden erfolgen soll.
• Da im stark alkalischen Medium bekanntlich die Enzyme inaktiviert werden, muß das Hydrolysat durch Zusatz von Säure auf pH 5 bis 8 gebracht werden, ehe mit der enzymatischen Bestimmung begonnen werden kann. All dies führt dazu, daß die Bestimmung des gesamten Cholesterins oder des gebundenen Cholesterins immer noch unerwünscht lange dauert und zu arbeitsaufwendig ist.
• Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Bestimmung von Gesamtcholesterin oder gebundenem Cholesterin zu schaffen, welches die oben erwähnten Nachteile beseitigt.
• Erfindungsgemäß gelingt dies durch ein Verfahren zur Bestimmung von Gesamtcholesterin oder gebundenem Cholesterin durch Freisetzung des gebundenen Cholesterins und anschließende Bestimmung des freigesetzten Cholesterins nach bekannten Methoden, welches sich dadurch auszeichnet, daß gebundenes Cholesterin mit Cholesterinesterase freigesetzt wird.
• Es wurde gefunden, daß mit Cholesterin-esterase eine rasche und quantitative Verseifung von gebundenem Cholesterin durchgeführt werden kann. Dieses Verfahren ist von ganz besonderem Vorteil dann, wenn auch die anschließende Bestimmung des freigesetzten Cholesterins enzymatisch, beispielsweise mit Cholesterinoxydase oder mit Cholesterindehydrase erfolgt. In diesem Falle ermöglicht das Verfahren der Erfindung die vollenzymatische Bestimmung des Cholesterins und damit eine entscheidende Verbesserung der medizinischen Routinediagnostik sowie eine leichte Adaption des Verfahrens auf die Durchführung in Analysenautomaten.
• Es war zwar bereits bekannt, daß in Pankreas, Leber und in Nocardia restrictus eine Cholesterinesterasewirksamkeit vorhanden ist. Hieraus konnte jedoch nicht entnommen werden, daß sich derartige Enzyme für die rasche vollständige Verseifung von Cholesterinestern im Rahmen eines quantitativen Analysenverfahrens eignen würden, denn die festgestellten Spaltraten waren nicht quantitativ, sondern erreichten nur maximal 80 % (J. of Biol.
• Chem., 244, 1937-1945 (1969)). Ferner liegt gebundenes Cholesterin in biologischem Material in Form von Estern sehr unterschiedlicher Säuren vor. Für eine Brauchbarkeit im Rahmen eines Analysenverfahrens ist es Voraussetzung, daß alle vorkommenden Ester in etwa gleicher Geschwindigkeit und mit gleicher Zuverlässigkeit quantitativ gespalten werden. Aufgrund der bekannten Eigenschaften dieser Enzyme ist es überraschend, daß die Cholesterinesterasen in der Lage sind, sämtliche vorkommenden Cholesterinester innerhalb sehr kurzer Zeit quantitativ zu spalten. Dies ist besonders deshalb auch überraschend, weil bekannt war, daß bei den bekannten Cholesterinesterasen erhebliche Unterschiede hinsichtlich der Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Cholesterinestern bestehen.
• Als besonders geeignet für das Verfahren der Erfindung erwiesen sich Cholesterinesterasen aus Mikroorganismen. Sie erwiesen sich hinsichtlich Spaltungsgeschwindigkeit und Wirksamkeit gegenüber unterschiedlichen Cholesterinestern den Cholesterinesterasen anderen Ursprungs als überlegen und werden daher im Rahmen der Erfindung bevorzugt.
• Weiter wurde gefunden, daß verschiedene Mikroorganismen besonders aktive Cholesterinesterasen enthalten und daher im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens ohne Abtrennung und Reinigung der Cholesterinesterasen direkt eingesetzt werden können. Dies hat neben der besonders einfachen Zugänglichkeit auch den Vorteil, daß bei Unterlassung jeder Trennung und Anreicherung der Cholesterinesterase die Gefahr vermieden wird, daß aus der in der Praxis meist vorliegenden Mischung mehrerer, für verschiedene Cholesterinester spezifischer Cholesterinesterasen eine Trennung derselben, die eine quantitative Erfassung alles gebundenen Cholesterins sehr erschweren würde, vermieden wird.
• Hinzu kommt noch, daß die Reinigung der meist in Lipoidmembranen gebundenen Cholesterinesterasen umständlich ist und daher zu einem Präparat führt, das aufgrund seines Preises für eine Routinediagnostik weniger gut geeignet ist als ein ohne Jegliche Enzymreinigung brauchbares Mikroorganismenpräparat.
• Besonders vorteilhafte Ergebnisse wurden beim erfindungsgemäßen Verfahren erhalten unter Verwendung einer Cholesterinesterase aus Candida rugosa (auch als Cylindracea bezeichnet) ATCC 14830 bzw. WS 90031 und von Aspergillus spec. WS 90030. Diese beiden Mikroorganismen können direkt als solche oder in aufgeschlossener Form, beispielsweise als Acetontrockenpulver im Rahmen der Erfindung eingesetzt werden. Ebenso ist aber natürlich auch die Verwendung eines angereicherten Cholesterinesterasepräparates aus diesen Mikroorganismen möglich, wobei ein besonderer Vorteil darin besteht, daß eine gewisse Anreicherung hier sehr einfach erzielt werden kann. Der erwähnte Candida rugosa stellt einen großtechnisch produzierten Mikroorganismus dar, der im Handel erhältlich ist. Die gebräuchliche Handelsform ist ein mit Lactose stabilisiertes Acetontrockenpulver, welches sich als für die Erfindung vorzüglich geeignet erwies. Ähnlich günstige Eigenschaften wurden gefunden bei Actinomyces aureoverticillium WS 90002 Actinomyces cyaneofuscatus WS 90003 Actinomyces griseomycini WS 90004 Actinomyces longisporus-fl. WS 90005 Actinomyces malachiticus WS 90006 Actinomyces roseolus WS 90007 Actinomyces toxytricini WS 90008 Actinomyces variabilis WS 90009 Streptomyces spec. WS 90010 Streptomyces autotrophicus WS 90011 Streptomyces canescens WS 90012 Streptomyces chartreusis WS 90013 Streptomyces michiganensis WS 90014 Streptomyces murinus WS 90015 Streptomyces hachijoensis WS 90016 Streptomyces caelestes WS 90017 Streptomyces tendae WS 90018 Nocardia rubra WS 90019 Candida mycoderma WS 90020 Candida albicans WS 90021 Candida albicans WS 90022 Candida albicans WS 90023 Candida spec. WS 90024 Cunninghamela elegans WS 90025 Mucor mucedo WS 90026 Rhizopus spec. WS 90027 Penicillium spec. WS 90028 Aspergillus spec. WS 90029 Neben den bevorzugten Cholesterinesterasen mikrobiologischen Ursprungs können aber auch Cholesterinesterasen anderer Herkunft in vielen Fällen verwendet werden.
• Wie bereits erwähnt, besteht ein besonders wichtiger Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens darin, daß eine vollenzymatische Gesamt-Cholesterinbestimmung möglich wird. Hierbei ist es vcn Bedeutung, daß mit den bevorzugten Cholesterinesterasepräparaten aus Mikroorganismen eine rasche und quantitative Freisetzung des Cholesterins aus seinen Estern möglich ist. Insbesondere mit den oben erwähnten bevorzugten Mikroorganismen ist es möglich, durch direkten Zusatz derselben in einer sehr geringen Menge und unter Beibehaltung der pH-Wert- und Temperaturbedingungen, wie sie bei der nachfolgenden enzymatischen Cholesterinbestimmung erwünscht sind, innerhalb weniger Minuten eine quantitative Freisetzung des Cholesterins zu erzielen. Dabei wurde gefunden, daß die üblichen Stabilisierungsmittel auf Kohlehydratbasis, welche für solche Mikroorganismen verwendet werden, im Rahmen des vollenzymatischen Verfahrens der Cholesterinbestimmung nicht stören.
• Wie erwähnt, kann für das erfindungsgemäße Verfahren auch eine abgetrennte und angereicherte Cholesterinesterase, vorzugsweise aus Mikroorganismen, verwendet werden. Eine geeignete Anreicherung läßt sich erzielen, indem von einem Acetontrockenpulver des Mikroorganismus oder sonstigen biologischen Materials ausgegangen wird und dieses einer Dialyse, einer Behandlung mit schwach-basischem Anionenaustauscher und einer Ammonsulfatfraktionierung unterzogen wird. Auf diese Weise gelingt leicht eine 20- bis 30-fache Anreicherung der Cholesterinesterase. Als schwach-basischer Anionenaustauscher erwies sich ein mit Diäthylaminoäthanolgruppen modifiziertes Präparat auf Kohlehydratbasis als besonders geeignet. BeiderAmmonsulfatfraktionierung wird vorzugsweise die Fraktion zwischen 1,8 und 2,4 Mol Ammonsulfat gewonnen. Die so erhaltene Enzymfraktion wird anschließend vorzugsweise auf dem genannten Austauschermaterial chromatographiert.
• Besonders günstige Ergebnisse wurden im Rahmen der Erfindung mit Mikroorganismen erhalten, welche auf einem Cholesterinesterhaltigen Nährmedium gezüchtet wurden. Hierbei kann der Cholesterinester oder eine Cholesterinestermischung als einzige Kohlenstoffquelle während der Züchtung zugesetzt werden oder zusammen mit einer anderen Kohlenstoffquelle verwendet werden.
• Besonders bevorzugt wird die Verwendung von Mikroorganismen, die in einem mehrstufigen Züchtungsverfahren erhalten wurden, wobei sie in der ersten Stufe auf einem geeigneten Kohlenstofflieferanten, wie Glycerin, und in der zweiten Stufe auf einem Cholesterinester gezüchtet werden. Ein geeignetes Züchtungsverfahren ist beispielsweise in den deutschen Offenlegungsschriften 2 224 133 und 23 07 518 beschrieben.
• Die erfindungsgemäß bevorzugt verwendete Cholesterinesterase aus Candida rugosa ATCC 14830 weist im schwach-sauren Bereich zwischen pH 5 und 6,5 sehr gute Stabilität auf. Das pH-Optimum des Enzyms liegt bei 7,5. Eine Eigenart des Enzyms liegt darin, daß ein besonders guter Ablauf der katalytischen Reaktion bei relativ hohem Salzgehalt des Reaktionsmediums erfolgt. Vorzugsweise wird daher in einer 0,2 bis 0,8 M, insbesondere 0,4 bis 0,6 M, Pufferlösung gearbeitet. Der pH-Wert kann im Bereich zwischen 4,5 und 7,5 liegen, vorzugsweise im oben erwähnten Bereich pH 5 bis 6,5. Die Wirksamkeit der Cholesterinesterase wird vorzugsweise durch Zusatz oberflächenaktiver Substanzen gesteigert. Besonders bevorzugt wird ein Zusatz von Hydroxypolyäthoxydodecan.
• Wie bereits erwähnt, wird besonders bevorzugt das Verfahren der Erfindung vollenzymatisch durchgeführt, d.h. die anschliesende Cholesterinbestimmung erfolgt ebenfalls enzymatisch, vorzugsweise unter Verwendung von Cholesterinoxydase. Es kann jedoch auch Cholesterindehydrase oder Cholesterindehydrogenase verwendet werden.
• Die Bestimmung mit Cholesterinoxydase ist beispielsweise beschrieben in der deutschen Offenlegungsschrift 2 224 132. Das dort beschriebene Verfahren kann vorteilhaft mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kombiniert werden. Prinzipiell kann hierbei der Sauerstoffverbrauch, die H202-Bildung oder die Cholestenonbildung gemessen werden.
• Die Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs kann beispielsweise gaschromatographisch, polarometrisch oder nach dem Polarisationsverfahren erfolgen. Diese Bestimmungsmethoden sind an sich bekannt. Gebildetes Wasserstoffperoxyd kann titrimetrisch, potentiometrisch, polarographisch und colorimetrisch sowie enzymatisch bestimmt werden. Bevorzugt ist die enzymatische Bestimmung unter Verwendung von Katalase oder Peroxydase, insbesondere die Bestimmung mittels Katalase in Gegenwart von B-Diketonen wie Acetylaceton, niedrigen Alkoholen und Ammoniumionen-haltigem Puffer oder die Bestimmung mittels Peroxydase in Gegenwart eines Chromogens wie 2,2' -Aminobenzthiazolinsulfonsäure. Cholestenon wird mit Hilfe von Ketoreagentien, z.B.
• 2,4-Dinitrophenylhydrazin oder photometrisch bei 240 nm bestimmt.
• Falls die vollenzymatische Bestimmung des gesamten oder gebundenen Cholesterins mit Cholesterinoxydase erfolgt, wird vorzugsweise eine solche aus Nocardia erythropolis ATCC 17895, Nocardia erythropolis ATCC 4277, Nocardia formica ATCC 14811 oder Proactinomyces erythropolis NCIB 9158 verwendet.
• Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagens zur Bestimmung von Cholesterin, bestehend aus Cholesterinesterase und einem Reagens zur Bestimmung von freiem Cholesterin. Vorzugsweise besteht ein Reagens dieser Art aus einer Cholesterinesterase mikrobiologischen Ursprungs, Cholesterinoxydase, einem System zur Bestimmung von H202 oder einem System zur Bestimmung von Cholestenon. Ganz besonders bevorzugt wird hierbei ein Reagens, bei welchem als Cholesterinesterase einer der weiter oben erwähnten Mikroorganismen, insbesondere in Form eines Acetontrockenpulvers, oder eine daraus erhaltene Proteinfraktion mit Cholesterinesteraseaktivität verwendet wird.
• In einer speziellen und bevorzugten Ausführungsform besteht ein solches Reagens aus Cholesterinoxydase, einem Cholesterinesterasepräparat aus einem der oben erwähnten Mikroorganismen, Katalase, Acetylaceton, Methanol und Ammoniumionen-haltigen Puffer, einzeln oder gemischt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das Reagens aus Cholesterinoxydase, einem Präparat aus einem der erwähnten Mikroorganismen mit Cholesterinesteraseaktivität, Peroxydase, Chromogen und Puffer, einzeln oder gemischt. Als Chromogen wird 2,2'-Aminobenzthiazolinsulfonsäure bevorzugt.
• In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das erfindungsgemäße Reagens aus Cholesterinoxydase, einem Cholesterinesterasepräparat aus einem der genannten Mikroorganismen und einem mit Ketogruppen unter Hydrazonbildung reagierenden Hydrazinderivat sowie gegebenenfalls einem Puffer. Als Hydrazinderivat wird 2,4-Dinitrophenylhydrazin bevorzugt Die oben erwähnten bevorzugten Reagenskombinationen können außer den angeführten obligaten Bestandteilen zusätzlich übliche Lösungsmittel, Stabilisatoren oder/und oberflächenaktive Substanzen enthalten. Alle diese Zusatzstoffe sind dem Fachmann bekannt und in Nachweissystemen für Wasserstoffperoxyd bzw.
• Cholestenon üblich.
• Vorzugsweise enthalten die oben erwähnten Reagenskombinationen die essentiellen Bestandteile in folgenden Mengenverhältnissen: 1. 13 bis 150 U Cholesterinoxydase, 0,05 bis 0,5 mg Mikroorganismen-Cholesterinesterase, 2 x 104 bis 5 x 105 U Katalase, 0,05 bis 0,2 ml Acetylaceton und 2 bis 10 ml Methanol in 100 ml Ammoniumionen-haltigem Puffer pH 5 bis 7 sowie gegebenenfalls 0,02 bis 0,3 ml eines oberflächenaktiven Mittels, vorzugsweise Hydroxypolyäthoxydodecan.
• 2. 3 bis 40 U Cholesterinoxydase, 0,05 bis 0,5 mg Mikroorganismen-Cholesterinesterase sowie 2 x 102 bis 1 x 104 U Peroxydase, 50 bis 200 mg 2,2'-Aminobenzthiazolinsulfonsäure sowie gegebenenfalls 0,05 bis 0,5 ml oberflächenaktives Mittel, vorzugsweise Hydroxypolyäthoxydodecan, in 100 ml Puffer pH 6 bis 8.
• 3. 0,1 bis 1 U Cholesterinoxydase, 0,05 bis 0,5 mg Mikroorganismen-Cholesterinesterase, 1 bis 5 ml einer 1 mM Lösung von 2,4-Dinitrophenylhydrazin sowie gegebenenfalls 0,005 bis 0,1 ml oberflächenaktives Mittel in 10 ml Puffer pH 6 bis 8.
• 4. 2 bis 100 U Cholesterinoxydase, 0,05 bis 0,5 mg Mikroorganismen-Cholesterinesterase sowie gegebenenfalls 0,1 bis 2,0 ml oberflächenaktives Mittel (vorzugsweise Hydroxypolyäthoxydodecan), in 50 ml Puffer pH 5 bis 9, vorzugsweise in 0,5 m Natriumphosphatpuffer pH 7,5.
• Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und Reagens läßt sich eine außerordentlich rasche und vollständige Verseifung von gebundenem Cholesterin durchführen. Beispielsweise wird unter den Bedingungen der Cholesterinbestimmung mit Cholesterinoxydase erfindungsgemäß eine quantitative Spaltung von gebundenem Cholesterin innerhalb von 1 bis 3 Minuten bei einem Zusatz von Candida rugosa ATCC 14830 oder Aspeigillus sp. WS 90030 Acetontrockenpulver in einer Menge zwischen 0,1 und 0,3 mg erzielt.
• Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
• Beispiel 1 In Serum wurde unter Anwendung des in Beispiel 1 der deutschen Offenlegungsschrift 2 224 132 beschriebenen Verfahrens der Gehalt an freiem Cholesterin zu 63 m (63 mg in 100 ml) bestimmt. Zur Bestimmung von gebundenem Cholesterin wurde eine Vergleichsprobe des Serums 30 Minuten mit alkoholischer Kalilauge bei 700C behandelt. Nach Neutralisation und erneuter Messung des vorhandenen Cholsterins ergab sich ein Gesamtgehalt von 181 mg% Cholesterin. Hieraus ergibt sich, daß 118 mg Cholesterin/100 ml in gebundener Form vorlagen.
• Das Verfahren wurde mit unbehandeltem Serum wiederholt, jedoch wurden zu Beginn der Bestimmung 0,3 mg (bezogen auf das Protein) Candida rugosa ATCC 14830-Acetontrockenpulver in handelsüblicher Porm zugesetzt. Nach 3 Minuten ergab die polarographische Bestimmung einen Gehalt von 183 mio Gesamtcholesterin.
• Beispiel 2 Zur Anreicherung der Cholesterinesteraseaktivität wurde handelsübliches Acetontrockenpulver von Candida rugosa ATCC 14830 in Kaliumphosphatpuffer pH 6,0 gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Nach Entfernung der als Stabilisierungsmittel enthaltenen Lactose ergab sich eine spezifische Cholesterinesteraseaktivität von 0,3 U/mg Protein in der dialysierten Lösung.
• Die so erhaltene Lösung wurde mit einem mit Diäthylaminoäthanolgruppen modifizierten Ionenaustauscher auf Dextranbasis verrührt, der Austauscher abgetrennt und mit 0,2 M Phosphatpuffer pH 6,0 eluiert. Im Eluat ergab sich eine spezifische Cholesterinesteraseaktivität von 1,2 U/mg.
• Die so erhaltene Lösung wurde einer Ammoniumsulfatfraktionierung unterworfen. Die zwischen 1,8 und 2,4 M Ammoniumsulfat asfallende Proteinfraktion wurde abgetrennt. Sie wies eine spezifische Cholesterinesteraseaktivität von 2,5 U/mg auf.
• Das erhaltene Produkt wurde erneut in Phosphatpuffer pH 6,0 aufgelöst, gegen den gleichen Puffer bis zur Salzfreiheit dialysiert und dann über eine Säule, die mit dem gleichen Anionenaustauscher wie oben angegeben gefüllt war, chromatographiert.
• Die Elution erfolgte wiederum mit 0,2 M Phosphatpuffer pH 6,0.
• In der Fraktion mit Cholesterinesteraseaktivität ergab sich eine spezifische Aktivität von 7 U/mg Protein.
• Das so erhaltene angereicherte Cholesterinesterasepräparat wurde wie in Beispiel 1 beschrieben in der Cholesterinbestimmung eingesetzt. Die eingesetzte Menge betrug jedoch lediglich 0,001 mg, bezogen auf Protein. Das Ergebnis entsprach dem von Beispiel 1.
• Die Cholesterinesterase aus Candida rugosa kann nach den üblichen Methoden der Enzymfeinreinigung weiter gereinigt werden.
• Anstelle der oben genannten Anreicherungsschritte können auch andere übliche biochemische Reinigungsschritte wie z.B. Fällung bzw. Fraktionierung mit Polyäthylenimin, organischen Lösungsmitteln oder Salzen, Chromatographie über Molekularsiebmaterialien oder schwache Anionenaustauscher mit anderen funktionellen Gruppen als Diäthylaminoäthanolgruppen, Protaminsulfatfällung und dgl. angewandt werden.
• Beispiel 3 Zu 0,5 ml Serum bzw. Cholesterin-Standard werden 1,0 ml 0,5 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,5, der 0,4 % Hydroxypolyäthoxydodecan enthält, und 2,5 U Cholesterinesterase nach Beispiel 2 gegeben.
• Dieses Reaktionsgemisch wird 40 Minuten bei 370C inkubiert.
• Danach werden 0,25 ml dieser Lösung zu 3 ml Cholesterinreagens, das zwei Teile Essigsäure, drei Teile Essigsäureanhydrid und ein Teil Schwefelsäure enthält, gegeben (Liebermann-Burchardt-Reagens).
• Unter Benutzung eines Standards als Bezugsgröße wurden für eine typische Probe 170 mg% Gesamtcholesterin gefunden. Die Vergleichsbestimmung bei Verseifung der Cholesterinester mit alkoholischer Kalilauge ergab 165 mg%o.
• Beispiel 4 0,02 ml Serum werden mit 10 ml 0,5 M Kaliumphosphatpuffer, der 0,4 % Hydroxypolyäthoxydodecan enthält, und 0,2 U Cholesterinesterase nach Beispiei 2 versetzt Die Reakionslösung wird 60 nun bei 370C inkubiert. Danach wird die Extinktion (E1) bei 240 nm in einem geeigneten Spektralphotometer abgelesen und die Reaktion mit 0,1 U Sterindehydrase aus Brevibacterium sterolicum gestartet.
• Nach 15 Minuten wird erneut die Extinktion (E2) abgelesen. Die Konzentration des gebildeten A4-Cholestenons und damit des Cholesterins ergibt sich aus der Differenz zwischen der ersten und zweiten Ablesung unter Berücksichtigung des molaren Extinktionskoeffizienten für A4-Cholestenon bei 240 nm. Die Messung einer typischen Probe ergab 183 mio Gesamtcholesterin.
• Die Vergleichsbestimmung mit einer Cholesterinoxydase (aus Nocardia erythropolis) anstelle der Sterindehydrase ergab 181 mgs Gesamtcholesterin.
• Beispiel 5 10 g Diammoniumhydrogenphosphat werden in 100 ml Wasser gelöst und mit 85-proz. Phosphorsäure auf pH 7,0 eingestellt. Dann werden 1Q5 U Katalase zugesetzt. Mit der so erhaltenen Lösung wird eine Mischung von 0,2 ml Acetylaceton, 10 ml Methanol und 0,1 g Hydroxypolyäthoxydodecan auf 100 ml aufgefüllt. Zu dieser Lösung werden 2,5 U Cholesterinesterase aus Rhizopus spec. (WS 90027) gegeben.
• 5,0 ml der so erhaltenen Lösung werden mit 0,02 ml Serum bzw.
• 0,02 ml einer Cholesterin-Standard-Lösung mit einem Gehalt von 200 mg% Cholesterin gemischt. Aliquotes der serumhaltigen sowie der cholesterinstandardhaltigen Probe werden mit je 0,1 U Cholesterinoxydase versetzt und 60 Minuten bei 370C inkubiert. Dann wird der gebildete Farbstoff bei 405 nm photometrisch gemessen unter Berücksichtigung des Proben-Leerwertes.
• Der Cholesteringehalt der serumhaltigen Probe betrug - unter Benutzung eines Standards als Bezugsgröße - 154 mg% Gesamtcholesterin. Die Kontrollbestimmung mit Cholesterinesterase aus Candida rugosa ATCC 14830 anstelle von Cholesterinesterase aus Rhizopus spec. (WS 90027) ergab den gleichen Wert.

Claims (15)

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Bestimmung von Gesamtcholesterin oder gebunenem Cholesterin durch Freisetzung des gebundenen Cholesterins und anschließende Bestimmung des freigesetzten Cholesterins nach bekannten Methoden, dadurch gekennzeichnet, daß gebundenes Cholesterin mit Cholesterinesterase aus Mikroorganismen freigesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Cholesterinesterase aus Candida rugosa ATCC 14830, Rhizopus spec. WS 90027 oder Aspergillus spec. WS 90030 verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Cholesterinesterase aus Actinomyces aureoverticillium WS 90002 Actinomyces cyaneofuscatus WS 90003 Actinomyces griseomycini WS 90004 Actinomyces longisporus-fl. WS 90005 Actinomyces malachiticus WS 90006 Actinomyces roseolus WS 90007 Actinomyces toxytricini WS 90008 Actinomyces variabilis WS 90009 Streptomyces spec. WS 90010 Streptomyces autotrophicus WS 90011 Streptomyces canescens WS 9001 2 Streptomyces chartreusis WS 9001 3 Streptomyces michiganensis WS 9001 4 Streptomyces murinus WS 90015 Streptomyces hachijoensis WS 9001 6 Streptomyces caelestes WS 90017 Streptomyces tendae WS 9001 8 Nocardia rubra WS 90019 Candida mycoderma WS 90020 Candida albicans WS 90021 Candida albicans WS 90022 Candida albicans WS 90023 Candida spec. WS 90024 Cunninghamella elegans WS 90025 Mucor mucedo WS 90026 Penicillium spec. WS 90028 Aspergillus spec. WS 90029 verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung vollenzymatisch durch Kombination mit einer enzymatischen Bestimmung für freies Cholesterin durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Cholesterinesterase und ein Enzym zur Bestimmung von freiem Cholesterin gleichzeitig zugesetzt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß freigesetztes Cholesterin mit Cholesterinoxydase bestimmt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Cholesterinoxydase aus Nocardia erythropolis ATCC 17895, Nocardia erythropolis ATCC 4277, Nocardia formica ATCC 14811 oder Proactinomyces erythropolis NCIB 9158 verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine Cholesterinesterase aus einem Mikroorganismus verwendet wird, der auf einem Cholesterinesterhaltigen Nährmedium gezüchtet wurde.

9. Reagens zur Bestimmung von Cholesterin, bestehend aus Cholesterinesterase aus Mikroorganismen und einem System zur Bestimmung von freiem Cholesterin.

10. Reagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer Cholesterinesterase mikrobiologischen Ursprungs, Cholesterinoxydase, einem System zur Bestimmung von H202 oder einem System zur Bestimmung von Cholestenon besteht.

11. Reagens nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Cholesterinesterase aus einem Mikroorganismus gemäß Anspruch 2 oder 3 enthält.

12. Reagens zur Bestimmung von Cholesterin, bestehend aus Cholesterinoxydase, einer Cholesterinesterase aus einem Mikroorganismus gemäß Anspruch 2 oder 3, Katalase, Acetylaceton, Methanol und Ammoniumionen-haltigen Puffer.

13. Reagens nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es Peroxydase, Chromogen und Puffer als System zur Bestimmung von H202 enthält.

14. Reagens nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es als System zur Bestimmung von Cholestenon ein mit Ketogruppen unter Hydrazonbildung reagierendes Hydrazinderivat enthält.

15. Reagens nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es ein oberflächenaktives Mittel enthält.