DE2559875C3 - - Google Patents
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Description
zur Bestimmung von Cholesterin, und zwar von Ge
samtcholesterin oder von gebundenem Cholesterin.
Serum u. dgl., teils in freier Form, teils in gebundener Form als Ester vor. Zur Bestimmung von gebundenem
Cholesterin oder des gesamten Cholesterins ist es erforderlich, das in gebundener Form vorliegende Cholesterin zuerst freizusetzen. Dies erfolgte bisher durch
Verseifung unter alkalischen Bedingungen, beispielsweise mit alkoholischer Kalilauge. Nach der Verseifung wird das freigeseSzte Cholesterin dann nach einer
der bekannten Methoden bestimmt.
sterins ist ein störender und zettraubender Verfahrensschritt. Hinzu kommt, daß die verwendeten relativ
aggressiven Reagentien zu einem Abbau des Cholesterins führen können. Um einen solchen Abbau und
damit eine Verfälschung der Analysenergebnisse zu
verhindern, muß unter relativ milden Bedindungen
hydrolysiert werden, welche wiederum die erforderliche Zeitdauer für die Bestimmung unerwünscht vergrößern.
SS des Cholesterins dann, wenn anschließend die Bestimmung des Cholesterins nach der bevorzugten enzymatischen Methode mittels Cholesterinoxidase erfolgen soll. Da im stark alkalischen Medium
bekanntlich die Enzyme inaktiviert werden, muß das
Hydrolysat durch Zusatz von Säure auf pH 5 bis 8 gebracht werden, ehe mit der enzymatischen Bestimmung begonnen werden kann. All dies führt dazu, daß
die Bestimmung des gesamten Cholesterins oder des gebundenen Cholesterins immer noch unerwünscht
lange dauert und zu arbeitsaufwendig ist.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Bestimmung von Gesamtcholesterin oder gebundenem Cholesterin zu schaffen, welches die obener-
wähnten Nachteile beseitigt,
erfindungsgemäß gelingt dies durch das im Patentanspruch
1 definierte Verfahren,
Die gemäß Anspruch 1 ausgenommene Verwendung von Cholesterinesterase aus Candida rugosa
(bzw, cylindracea) ist bereits Gegenstand der älteren
Anmeldung DE-AS 2315501,
Es wurde gefunden, daß mit Cholesterinesterase aus Mikroorganismen eine rasche und quantitative
Verseifung von gebundenem Cholesterin durchgeführt werden kann. Da die anschließende Bestimmung
des freigesetzten Cholesterins mit Cholesterinoxidase erfolgt, ermöglicht das Verfahren der Erfindung die
vollenzyniatische Bestimmung des Cholesterins und damit eine entscheidende Verbesserung der medizinisehen
Routinediagnostik sowie eine leichte Adaption des Verfahrens auf die Durchführung in Analysenautomaten.
Es war zwar bereits bekannt, daß in Pankreas und Leber Cholesterinesterasewirksamkeit Vorhände» ist ao
und für die Vescifung von Cholesterinestern in Kombination
mit einem Cholesterin oxidierenden System auf Basis von Cholesterinoxidase verwendet werden
kann (DE-AS 2224132). Jedoch liegt gebundes Cholesterin
in biologischem Material in Form von Estern sehr unterschiedlicher Säuren vor. Im Rahmen eines
Analysenverfahrens ist es erwünscht, wenn alle vorkommenden Ester in etwa gleicher Geschwindigkeit
und mit gleicher Zuverlässigkeit quantitativ gespalten werden. Bei den bekannten Cholesterinesterasen bestehen
jedoch erhebliche Unterschiede hinsichtlich der Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Cholesterinestern.
Aufgrund der bekannten Eigenschaften dieser Enzyme ist es überraschen:/, daß die Cholesterinesterasen
aus Mikroorganismen iti der Lage sind, sämtliche vorkommenden Cholesu dnester innerhalb
sehr kurzer Zeit quantitativ zu spalten.
Cholesterinesterasen aus Mikroorganismen erwiesen sich hinsichtlich Spaltungsgeschwindigkeit und
Wirksamkeit gegenüber unterschiedlichen Choleste- 4»
rinestern und Cholesterinesterasen anderen Ursprungs
als überlegen.
Weiter wurden gefunden, daß verschiedene Mikroorganismen besonders aktive Cholesterinesterasen
enthalten und daher im Rahmen des erfindungsgemäßen
Verfahrens ohne Abtrennung und Reinigung der Cholesterinesterasen direkt eingesetzt werden können.
Dies hat neben der besonders einfachen Zugänglichkeit auch den Vorteil, daß bei Unterlassung jeder
Trennung und Anreicherung der Cholesterinesterase die Gefahr vermieden wird, daß aus der in der Praxis
meist vorliegenden Mischung mehrerer, für verschiedene Cholesterinester spezifischer Cholesterinesterasen
eine Trennung derselben, die eine quantitative Erfassung alles gebundenen Cholesterins sehr erschweren
würde, vermieden wird.
Hinzu kommt noch, daß die Reinigung der meist in Lipoidmembranen gebundenen Cholesterinesterasen
umständlich ist und daher zu einem Präparat führt, das aufgrund seines Preises für eine Routinediagnostik
weniger gut geeignet ist als ein ohne jegliche Enzymreinigung brauchbares Mikroorganismenpräparat.
Besonders vorteilhafte Ergebnisse wurden beim erfindungsgemäßen Verfahren erhalten unter Verwendung
einer Cholesterinesterase aus Aspergillus spec. WS 90030. Dieser Mikroorganismus kann direkt als
solcher oder in aufgeschlossener Form, beispielsweise als Acetontrockenpulver, im Rahmen der Erfindung
eingesetzt werden, Ebenso ist aber natürlich auch die Verwendung eines angereicherten Cholesterinesterasepräparates
aus diesem Mikroorganismus möglich, wobei ein besonderer Vorteil darin besteht, daß eine
gewisse Anreicherung hier sehr einfach erzielt werden
kann. Ähnlich günstige Eigenschaften wurden gefunden bei
Actinomyces aureoverticjUium WS 90002
Actinomyces cyaneofuscatus WS 90003
Actinomyces griseomycini Wk 90004
Actinomyces longisporus-fl, WS 90005
Actinorayces malachiticus WS 90006
Actinomyces roseolus WS 90007
Actinomyces toxytricini WS 90008
Actinomyces variabilis WS 90009
Streptomyces spec. WS 90010
Streptomyces autotrophicus WS 90011
Streptomyces canescens WS 90012
Streptomyces chartreusis WS 90013
Streptomyces michiganensis . WS 90014
Streptomyces murinus WS 90015
Streptomyces hachijoensis WS 90016
Streptomyces caelestes WS 90017
Streptomyces tendae WS 90018
Nocardia rubra WS 90019
Candida mycoderma WS 90020
Candida albicans WS 90021
Candida albicans WS 90022
Candida albicans WS 90023
Candida spec. WS 90024
Cunninghamella elegans WS 90025
Mucor mucedo WS 90026
Rhizopus spec. WS 90027
Penicillium spec. WS 90028
Aspergillus spec. WS 90029
Mit den oben erwähnten bevorzugten Mikroorganismen ist es möglich, durch direkten Zusatzderselben
in einer sehr geringen Menge und unter Beibehaltung der pH-Wert- und Temperaturbedingungen, wie sie
bei der nachfolgenden enzymatisch Cholesterinbestimmung
erwünscht sind, innerhalb weniger Minuten eine quantitative Freisetzung des Cholesterins zu erzielen.
Dabei wurde gefunden, daß die üblichen Stabilisierungsmittel auf Kohlehydratbasis, welche für solche
Mikroorganismen verwendet werden, im Rahmen des vollenzymatischen Verfahrens der Cholesterinbestimmung
nicht stören.
Wie erwähnt, kann für das erfindungsgemäße Verfahren auch eine abgetrennte und angereicherte Cholesterinesterase
aud Mikroorganismen, verwendet werden. Eine geeignete Anreicherung läßt sich erzielen,
indem von einem Acetontrockenpulver des Mikroorganismus oder sonstigen biologischen Materials
ausgegangen wird und dieses einer Dialyse, einer Behandlung mit schwach-basischem Anionenaustauscher
und einer Ammonsulfatfraktionierung unterzogen wird. Auf diese Weise gelingt leicht eine 20- bis
30fache Anreicherung der Cholesterinesterase. Als schwach-basischer Anionenaustauscher erwies sich
ein mit Diäthylaminoäthanolgruppen modifiziertes Präparat auf Kohlenhydratbasis als besonders geeignet.
Bei der Ammonsulfatfraktionierung wird vorzugsweise die Fraktion zwischen 1,8 und 2,4 Mol Ammonsulfat
gewonnen. Die so erhaltene Enzymfraktion wird anschließend vorzugsweise auf dem genannten
Austauschermaterial Chromatographien.
Besonders günstige Ergebnisse wurden im Rahmen der Erfindung mit Mikroorganismen erhalten, welche
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auf einem ChalesterinesterhaJtigen Nälirmedium gezüchtet
wurden. Hierbei kann tier Cholesterinestei
oder eine Cholesterinestermischung als einzige Kohlenstoffquelle
während der Züchtung zugesetzt werden oder zusammen mit einer anderen Kohtenstoffquelle
verwendet werden. Besonders bevorzugt wird die Verwendung von Mikroorganismen, dia in einem
mehrstufigen Züchtungsverfahren erhalten wurden, wobei sie in der ersten Stufe auf einem geeigneten
Kohlenstcfrlieferanten, wie Glycerin, und in der Twei-lo
ten Stufe auf einem Cholesterinester gezüchtet werden. Ein geeignetes Züchtungsverfahren ist beispielsweise
in den deutschen Offenlegungsschriften 2224133 und 2307518 beschrieben.
Die Wirksamkeit der Cholesterinesterase wird vorzugsweise
durch Zusatz oberflächenaktiver Substanzen gesteigert. Besonders bevorzugt wird ein Zusatz
von Hydroxypolyäthoxydodekan.
Die Bestimmung mit Cholesterinoxydase ist beispielsweise beschrieben in der deutschen Offenle- ao
gungsschrift 2224132. Das dort beschriebene Verfahren kann vorteilhaft mit dem erfindungsgemäßen
Verfahren kombiniert werden. Prinzipiell kann hierbei der Sauerstoffverbrauch, die H2O2-8iIdung oder
die Cholestenonbildung gemessen werden. as
Die Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs kann beispielsweise gaschromatographisch, polarometrisch
oder nach dem Polarisationsverfahren erfolgen. Diese Bestimmungsmethoden sind an sich bekannt. Ge-.
bildetes Wasserstoffperoxyd kann titrimetrisch, potentiometrisch, polarographisch und kolorimetrisch
sowie enzymatisch bestimmt werden. Bevorzugt ist die enzymatische Bestimmung unter Verwendung von
Katalase oder Peroxydase, insbesondere die Bestimmung mittels Katalase in Gegenwart von /J-Diketonen
wie Acetylaceton, niedrigen Alkoholen und Ammoniumionen-haltigem Puffer oder die Bestimmung mittels
Peroxydase in Gegenwart eines Chromogens wie 2,2'-Aminobenzthiazolinsulfonsäure. Cholestenon
wird mit Hilfe von Ketoreagentien, z. B. 2,4-Dinitrophenylnydrazin oder photometrisch bei 240 nm bestimmt.
Für die vollenzymatische Bestimmung des gesamten oder gebundenen Cholesterins mit Cholesterinoxidase
wird vorzugsweise eine solche aus Nocardia erythropolis ATCC 17895, Nocardia erythropolis
ATCC 4277, Nocardia formica ATCC 14811 oder Proactinomyces erythropolis NCIB 9158 verwendet.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagens
zur Bestimmung von Cholesterin, bestehend aus Cholesterinesterase aus Mikroorganismen, ausgenommen
Candida rugosa (bzw. cylindracea) und einem System zur Bestimmung von freiem Cholesterin
mittels Cholesterinoxidase. Vorzugsweise besteht das Reagens aus Cholesterinesterase mikrobiologischen
Ursprungs, Cholesterinoxidase, einem System zur Bestimmung von H2O2 oder einem System zur Bestimmung
von Cholestenon. Ganz besonders bevorzugt wird hierbei ein Reagens, bei welchem als Cholesterinesterase
einer der weiter oben erwähnten Mikro-Organismen, insbesondere in Form eines Acetontrokkenpulvers,
oder eine daraus erhaltene Proteinfraktion mit Cholesterinesteraseaktivität verwendet
wird.
In einer speziellen und bevorzugten Ausführungsform besteht ein solches Reagens aus Cholesterinoxidase,
einem Cholesterinesterasepräparat aus einem der oben erwüiinten Mikroorganismen, Katalase,
Acetylaceton, Methanol und Ammoniumionen-naUi
gen Fuffer, einzeln oder gemischt. In einer weiteren
bevorzugten Ausfiibrungsform besteht das Reagens
aus Cholesterinoxidase, einem Präparat aus einem der
erwähnten Mikroorganismen mit Choiesterinesteraseaktivität,
Peroxydase, Chromogen und Puffer, einzeln oder gemischt. Als Chromogen wird 2,2'-Aminobenzthiazolinsulfonsäure
bevorzugt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das erfindungsgemäße Reagens aus Cholesterinoxidase,
einem Cholesterinesterasepräparat aus einem der genannten Mikroorganismen und einem mit
Ketogruppen unter Hydrazonbildung reagierenden Tlydrazinderivat sowie gegebenenfalls einem Puffer.
Als Hydrazinderivat wird 2,4-Dinitrophenylhydrazin bevorzugt.
Die oben erwähnten bevorzugten Reagenskombinationen
können außer den angti^-Tten obligaten
Bestandteilen zusätzlich übliche Lösungsmittel, Stabilisatoren oder/und oberflächenaktive Substanzen
enthalten. Alle diese Zusatzstr/ie sind dem Fachmann
bekannt und in Nachweisäystemen für Wasserstoffperoxyd
bzw. Cholesteron üblich.
Vorzugsweise enthalten die oben erwähnten Reagenskombinationen die essentiellen Bestandteile in
folgenden Mengenverhältnissen: l". 13 bis 150 U Cholesterinoxidase, 0,05 bis 0,5 mg
Mikroorganismen-Cholesterinesterase, 2 X 104 bis 5 X 105 U Katalase, 0,05 bis 0,2 ml Acetylaceton
und 2 bis 10 ml Methanol in 100 ml Ammoniumionen-haltigem Puffer pH 5 bis 7 sowie
gegebenenfalls 0,02 bis 0,3 ml eines oberflächenaktiven Mittels, vorzugsweise Hydroxypolyäthoxydodecan.
2. 3 bis 40 U Cholesterinoxidase, 0,05 bis 0,5 mg Mikroorganismen-Cholesterinesterase sowie
2 X 102 bis 1 X 104 U Peroxydase, 50 bis 200 mg 2,2'-Aminobenzthiazolinsulfonsäure sowie gegebenenfalls
0,05 bis 0,5 ml oberflächenaktives Mittel, vorzugsweise Hydroxypolyäthoxydodecan
in 100 ml Puffer pH 6 bis 8.
3. 0,1 bis 1 U Cholesterinoxidase, 0,05 bis 0,5 mg Mikroorganismen-Cholesterinesterase, 1 bis
5 ml einer 1 mM Lösung von 2,4-Dinitrophenylhydrazin
sowie gegebenenfalls 0,005 bis 0,1 ml oberflächenaktives Mittel in 10 ml Puffer in pH
6 bis 8.
4. 2 bis 100 U Cholesterinoxidase, 0,05 bis 0,5 mg Mikroorganismen-Cholesterinesterase sowie
gegebenenfalls 0,1 bis 2,0 ml oberflächenaktives Mittel (vorzugsweise Hydroxypolyäthoxydodecan),
in 30 ml Puffer pH 5 bis 9, vorzugsweise in 0,5 ml Natriumphosphatpuffer pH 7,5.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und Reagens läßt sich eine außerordentlich rasche und vollständige
Verseifung von gebundenem Cholesterin durchführen. Beispielsweise wird unter den Bedingungen
der Cholesterinbestimmung mit Cholesterinoxidase erfindungsgemäß eine quantitative Spaltung
von gebundenem Cholesterin innerhalb von 1 bis 3 Minuten bei einem Zusatz von Aspergillus sp.
WS 90030 Acetontrockenpulver in einer Menge zwischen 0,1 bis 0,3 mg erzielt.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung weiter.
Beispiel
10 g Diammoniumhydrogenphosphat werden in
10 g Diammoniumhydrogenphosphat werden in
100 ml Wasser gelöst und mit 85-proz. Phosphorsäure auf pH 7,0 eingestellt. Dann werden HO5 U Katalase
zugesetzt. Mit der so erhaltenen Lösung wird eine Mischung von 0,2 ml Acetylaceton, 10 ml Methanol
und 0,1 g Hydroxypolyäthoxydodecain auf 100 ml 5
aufgefüllt. Zu dieser Lösung werden 2,5 U Cholesterinesterase
aus Rhizopus spec. (WS 90027) gegeben.
5,0 ml der so erhaltenen Lösung werden mit 0,02 ml Serum bzw. 0,02 ml einer Cholesterin-Slandard-Lösung
mit einem Gehalt von 200 mg^ Chnlcsteiin
gemischt. Aliquotes der serumhaltigcn sowie
der cholesterinstandardhaltigen Probe werden mit je
0,1 U Cholesterinoxidase versetzt und 60 Minuten bei 37° C inkubiert. Dann wird der gebildete Farbstoff
bei 405 nm photometrisch gemessen unter Berücksichtigung des Proben-Leerwertes.
DerCholesteringehaltderserumhaltigen Probe betrug
- unter Benutzung eines Standards als Bezugsgröße - 154 mg% Gesamtcholesterin. Die Kontrollbestimmung
mit Cholesterinesterase aus Candida rugosa ATCC 14830 anstelle von Cholesterinesterase
aus Rhizopus spec. (WS 90027) ergab den gleichen Wert.
Claims (13)
1. Verfahren zur Bestimmung von Gesamtcholesterin oder gebundenem Cholesterin durch Freisetzung des gebundenen Cholesterins mit Cbolesterinesterase und anschließende enzymatische
Bestimmung des freigesetzten Cholesterins mittels Cholesterinoxidase, dadurch gekennzeichnet, daß gebundenes Cholesterin mit Cholesterinesterase aus Mikroorganismen, ausgenommen
Candida rugosa (bzw. cylindracea) freigesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Cholesterinesterase aus
Rhizopus spec. WS 90027 oder Aspergfllus spec.
WS 90030 verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Cholesterinesterase aus
Actinomyces aureoverticillium WS 90002 Actinomyces cyaneofuscatus WS 90003
Actinomyces griseomycini WS 90004 Actinomyces longisporus-fl. WS 90005
Actinomyces malachiticus WS 90006 Actinomyces roseolus WS 90007 Actinomyces toxytricini WS 90008
Actinomyces variabilis WS 90009 Streptomyces spec. WS 90010 Streptomyces autotrophicus WS 90011
Streptocymes canescens WS 90012 Streptomyces chartreusis WS 90013
Streptomyces michiganensis WS 90014 Streptomyces murinus WS 90015 Streptomyces hachijoensis WS 90016
Streptomyces caelestes WS 90017 Streptomyces tendae WS 90018 Nocardia rubra WS 90019
Candida mycoderma WS 90020 Candida albicans WS 90021 Candida albicans WS 90022 Candida albicans WS 90023
Candida spec. WS 90024 Cunninghamella elegans WS 90025 Mucor mucedo WS 90026
Penicillium spec. WS 90028 Aspergillus spec. WS 90029
verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase gleichzeitig zugesetzt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Cholesterinoxidase aus
Nocardia erythropolis ATCC 17895, Nocardia erythropolis ATCC 4277, Nocardia formica
ATCC 14811 oder Proactinomyces erythropolis NCIB 9158 verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Cholesterinesterase aus einem Mikroorganismus verwendet wird, der auf einem Cholesterinesterhaltigen
Nährmedium gezüchtet wurde.
7. Reagens zur Bestimmung von Cholesterin, bestehend aus Cholesterinesterase aus Mikroorganismen, ausgenommen Candida rugosa (bzw.
cylindracea) und einem System zur Bestimmung von freiem Cholesterin mittels Cholesterinoxidase.
8. Reagens nach Anspruch 7, dadurch gekenn*
zeichnet, daß das System zur Bestimmung von freiem Cholesterin aus Cholesterinoxidase, einem
System zur Bestimmung von H2O2 oder einem System
zur Bestimmung von Cholestenon besteht,
9. Reagens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Cholesterinesterase aus einem Mikroorganismus gemäß Anspruch 2 oder 3
enthält,
10. Reagens nach Anspruch 9, bestehend aus Cholesterinoxidase, einer Cholesterinesterase aus
einem Mikroorganismus gemäß Anspruch 2 oder 3, Katalase, Acetylaceton, Methanol und Amrooniumionen-haltigem Puffer.
11. Reagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es Peroxidase, Chromogen und
Puffer als System zur Bestimmung von H2O2 enthält.
12. Reagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es als System zur Bestimmung
von Cholestenon ein mit Ketogruppen unter Hydrazonbildung reagierendes Hydrazinderivat enthält.
13. Reagens nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es ein oberflächenaktives Mittel enthält.
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