DE2512605A1

DE2512605A1 - Verfahren zur bestimmung des gesamt-cholesteringehaltes waessriger fluessigkeiten

Info

Publication number: DE2512605A1
Application number: DE19752512605
Authority: DE
Inventors: Charles Thomas Goodhue; Hugh Arthur Risley
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Eastman Kodak Co
Priority date: 1974-03-25
Filing date: 1975-03-21
Publication date: 1975-10-02
Also published as: GB1498461A; JPS50131588A; JPS5615240B2; US3869349A; DE2512605B2; CA1046389A; FR2265759A1; FR2265759B1

Description

O CT 1 O C Π C Dipl.-Chem. Dr Brandes

25126 0b Dr.-lng.Held

Dipl.-Phys. Wolff

8 München 22, ThierschstraBe

r> »τ to λ cm Tel.(089)293297

Reg. NT. U4 ΟΙ!) Telex 0523325 (patwo d)

— — ■ Telegrammadresse:

wolffpatent, münchen

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außer samstags

14. März 1975 25/2

EASTMAN KODAK COMPANY, 343 State Street, Rochester, Staat New York, Vereinigte Staaten von Amerika

Verfahren zur Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes

wäßriger Flüssigkeiten

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Verfahren zur Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes wäßriger

Flüssigkeiten

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes wäßriger, Cholesterinester enthaltender Flüssigkeiten, insbesondere Blutserum, bei dem vor der quantitativen Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes der Flüssigkeiten die Cholesterinester unter Freisetzen des Cholesterins hydrolysiert werden.

Die meisten üblichen klinischen Bestimmungsmethoden zur Ermittlung des Cholesteringehaltes ( Cholesterol) im Blutserum laufen darauf hinaus, den "Gesamt-Cholesteringehalt" zu bestimmen. Der ermittelte Wert ist ein Maß für die Menge des im Serum vorhandenen Cholesterins, der vorhandenen Cholesterinester und anderer Cholesterin-Abkömmlinge, beispielsweise Cholesterin-Vorläuferverbindungen, die auf die üblichen Testmethoden ansprechen, welche auf Reaktionen des "freien" Cholesterins basieren und zunächst eine Oberführung der Cholesterinester in "freies" Cholesterin erfordern.

So ist es beispielsweise bekannt, das Serum zunächst mit einem organischen Lösungsmittel zu extrahieren, den Extrakt mit alkoholischer KOH zu verseifen und das freigesetzte Cholesterin zu isolieren und zu bestimmen. Nachteilig an diesem Bestimmungsverfahren ist, daß es die Handhabung korrosiv wirkender Chemikalien erfordert, daß es zeitraubend ist und sich nicht leicht automatisieren läßt.

In der DT-OS 2 246 695 wird eine enzymatische Bestimmung von freiem Cholesterin unter Verwendung einer Cholesterinoxidase vorgeschlagen. Dieses Verfahren erfordert jedoch die Hydrolyse der im Blutserum vorhandenen Cholesterinester in vergleichsweise umständlicher Weise, bevor die enzymatische Bestimmung erfolgen kann.

Von G. Bucolo und H. David wird des weiteren in der Zeitschrift 'Clin. Chem.", W_ (1973), Seite 476,ein Lipase-Protease-System für

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die Hydrolyse von Serum-Triglyzeriden vorgeschlagen. In der Arbeit wird jedoch ausdrücklich darauf hingewiesen, daß Cholesterinester in diesem System nicht hydrolysiert werden.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein gegenüber den bekannten Bestimmungsverfahren vereinfachtes, wirksames Verfahren zur Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes wäßriger, Cholesterinester enthaltender Flüssigkeiten, beispielsweise Blutserum, anzugeben.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes wäßriger, Cholesterinester enthaltender Flüssigkeiten, beispielsweise Blutserum, bei dem vor der quantitativen Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes der Flüssigkeiten die Cholesterinester unter Freisetzen des Cholesterins hydrolysiert werden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Hydrolyse der Cholesterinester mit einer Lipase mit Cholesterin-Esterase-Aktivität und einer Protease erfolgt.

Nach erfolgter Hydrolyse der Cholesterinester kann das freie Cholesterin der zu untersuchenden Flüssigkeiten in üblicher bekannter Weise quantitativ erfaßt werden. So jtaoxonxsn zur quantitativen Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes beispielsweise die Gasflüssigkeit-Chromatographie angewandt werden oder es kann eine Bestimmung mit Cholesterin-Oxidase erfolgen oder es kann irgendeine der anderen bekannten Methoden angewandt werden, die eine Bestimmung von "freiem"Cholesterin ermöglichen.

Durch die Erfindung wird somit ein einfaches, enzymatisches Verfahren für die Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes wäßriger, Cholesterinester enthaltender Flüssigkeiten geschaffen, bei dem eine quantitative Hydrolyse der Cholesterinester auf enzymatischem Wege erfolgt, wodurch eine einfache quantitative Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes von Flüssigkeiten, wie beispielsweise Blutserum ermöglicht wird.

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Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung erfolgt
die Hydrolyse der Cholesterinester komplexer wäßriger Lösungen, beispielsweise Blutserum, durch Behandlung der Flüssigkeiten mit einer Mischung, die pro Milliliter zu testende Flüssigkeit, z.B. Serum enthält:

etwa 20 bis etwa 50 mg einer Lipase mit Cholesterin-Esterase-Aktivitat und

etwa 5 bis etwa 50 mg einer Protease.

Vorzugsweise wird beim Verfahren der Erfindung bei einer Temperatur von etwa 25 bis etwa 55°C gearbeitet. Der pH-Wert liegt vorzugsweise bei etwa 6,5 bis etwa 9,5.

Die Hydrolysedauer liegt in der Regel bei etwa 5 bis etwa 15 Minuten. Vorzugsweise erfolgt die Hydrolyse unter Bewegung der zu hydrolysierenden Flüssigkeit sowie in einer inerten Atmosphäre.

Werden die angegebenen Lipase- und Proteasekonzentrationen angewandt, so enthält die verwendete Lipase vorzugsweise mindestens etwa 30 internationale Einheiten/mg und die Protease mindestens etwa 10 Einheiten/mg.

Eine Lipasen-Einheit ist dabei definiert als die Enzymmenge, welche in einer bestimmten Zeitspanne bei einem bestimmten pH-Wert und einer bestimmten Temperatur ein Mikromol Fettsäure ausgehend von einem Substrat mit veresteter Fettsäure freisetzt. Im Falle der
vorzugsweise verwendeten Lipasenliegen die bevorzugten Bedingungen bei einer Minute bei einem pH-Wert von 7 und einer Tempeistur von 37°C bei Verwendung von Olivenöl als Substrat.

Eine Proteasen-Einheit hydrolysiert Casein unter Erzeugung eines Farbäquivalentes zu einem Mikromol (181 yg) Tyrosin pro Minute
bei einem pH-Wert von 7,5 und einer Temperatur von 37°C (Farbe pro Folin-Ciocalteu Reagent).

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-Jt-

Zu beachten ist dabei, daß, wenn der Grad der Enzym-Aktivität pro Gew.-Einheit Präparat ansteigt oder abnimmt, sich auch die Menge an zugesetztem Enzym-Präparat ändert.

In besonders vorteilhafter Weise liegt das Verhältnis von Lipase zu Protease auf Aktivitätsbasis bei etwa 3 bis etwa 10, wobei mindestens etwa 1000 Einheiten Lipase pro Milliliter Flüssigkeit, beispielsweise Blutserum verwendet werden. Die relative Lipasen-Aktivität zur Ester-Aktivität liegt normalerweise bei etwa 10 bis etwa 50.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in vorteilhafter Weise derart durchgeführt, daß ein wäßriges Medium mit Cholesterinester, beispielsweise Blutserum, welches sowohl verestertes Cholesterin als auch freies Cholesterin enthält, mit einer Mischung einer Lipase mit Cholesterin-Esterase-Aktivität (vergl. Beispiel 3) und einer Protease in Kontakt gebracht wird.

Die zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendete Lipase kann pflanzlichen oder tierischen Ursprunges sein.

Besonders vorteilhafte Ergebnisse werden mit mikrobiologischen Lipasen (microbial Lipases) erhalten, z.B. der Lipase von Candida cylindracca.

Lipasen vom Chromobacterium viscosum, Variant paralipolyticum, roh oder gemnigt, die Lipase von Rhizopus delemar, gereinigt, beispielsweise wie von Fukumoto und Mitarbeitern in "J.Gen. Appli. Microbiol", 10 (1964), Seiten 257 bis 265, beschrieben und Lipasen mit ähnlicher Aktivität, die von G. Bucolo und H. Davis in "Clin. Chem.¹¹, λ9_ (1973), Seite 476 beschrieben werden, zeigen nicht die erforderliche Cholesterin-Esterase-Aktivität.

Lipasen, die in vorteilhafter Weise zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendet werden können, sind im Handel erhältlich. Beispiele für handelsübliche, zur Durchführung des Verfahrens der

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Erfindung geeignete Lipasen sind beispielsweise Weizenkeimlipasen (Hersteller Miles Laborataies of Elkhart, Indiana), ferner die Lipase 3000 (Hersteller Wilson Laboratories, Chicago, Illinois), Steapsin (Hersteller Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri (bei den beiden zuletzt genannten Enzymen handelt es sich um pancreatische Enzyme) sowie die Lipase M von Candida cylindracca (Hersteller Enzyme Development Corporation, New York, New York).

Die Auswahl einer für die Durchführung des Verfahrens geeigneten Lipase, d.h. die Bestimmung der Cholesterin-Esterase-Aktivität kann nach einer Methode erfolgen, die später noch genauer beschrieben werden wird. Erfindungsgemäß verwendbar sind alle Lipasen, die eine Cholesterin-Esterase-Aktivität aufweisen, entsprechend der Freisetzung von über etwa 25 mg/100 ml Cholesterin nach der später angegebenen Testmethode.

Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung können des weiteren übliche bekannte Proteasen verwendet werden, beispielsweise Chymotrypsin, Streptomyces grisens-Protease (im Handel erhältlich unter der Handelsbezeichnung "Pronase"), Aspergillus oryzae-Protease, Bacillus subtilis-Protease, Elastase, Papain und Bromelain. Auch können Mischungen derartiger Enzyme verwendet werden.

Die Verwendung einer Protease des beschriebenen Typs ist lediglich in den Fällen erforderlich, in denen der oder die Cholesterinester in einer Protein enthaltenden Lösung enthalten sind, wovon die bedeutenste das Blutserum ist. In dem Falle, in dem eine einfache, nicht proteinöse (non protenaceous) Lösung analysiert wird, ist es möglich, wie später noch gezeigt werden wird, eine Esterhydrolyse unter Verwendung von der Lipase allein zu erreichen. In einer Protein enthaltenden Lösung, wie beispielsweise Serum,ist das Vorhandensein einer Protease zur Erzielung guter Ergebnisse jedoch erforderlich.

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Wie bereits dargelegt, kann die Bestimmung des durch die Einwirkung der Enzyaaischung freigesetzten Cholesterins nach einer Vielzahl von Methoden erfolgen. Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung erfolgt die Bestimmung durch Gasfltissigkeits-Chromatographie.

Demzufolge werden in vorteilhafter Weise etwa 0,5 bis etwa 5 ml der hydrolysierten wäßrigen Flüssigkeit, insbesondere Blutserum, mit etwa 0,5 bis etwa 2 ml Heptan oder einem anderen geeigneten organischen Lösungsmittel, beispielsweise Isooctan mit einem Gehalt von etwa 25 mg bis etwa 50 mg Gew.-% Octacosan oder einem anderen organischen Lösungsmittel vermischt. Das Heptan kann beispielsweise durch irgendein anderes Lösungsmittel, das sich für die Gasflüssigkeits-Chromatographie eignet, beispielsweise Isooctan ersetzt werden. Die Lösungsmittelmischung wird dann mit Wasser in üblicher Weise extrahiert, vorzugsweise unter Verwendung von etwa 3 bis etwa 10 ml Wasser pro Ml Lösungsmittellösung. Die mit Wasser extrahierte Lösungsmittellösung wird dann mit einer silylierenden Verbindung (silylating agent) umgesetzt, beispielsweise mit (N,O-Bis-(trimethylsilyl)-trifluoracetamid mit 11 Trimethylchlorsilan oder einer Mischung von gleichen Volumina Trimethylchlorsilan und 1,1,1, 3,3,3-Hexamethyldisilazan, und zwar eine Zeitspanne von etwa 2 bis etwa 15 Minuten lang. Die silylierte Lösungsmittellösung wird dann durch einen üblichen Gasflussigkeits-Chromatographen gegeben, wodurch der Gesamt-Cholesteringehalt der Probe ermittelt wird. Dies Cholesterin-Bestimmungsverfahren ist dabei der Bestimaungsmethode angepaßt, die im Detail von J. L. Driscoil, D. Aubuchon, M. Descotea« und R. F. Martin in "Anal. Chem. ", 43_, (1970), Seite 1196 beschrieben wird.

Einer der bedeutensten Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens ist darin zu sehen, daß erfindungsgemäß beispielsweise unverdünntes Blutserum verwendet werden kann, da unverdünntes Serum genauso schnell hydrolysiert wird$necein verdünntes Berum. Diese Tatsache ist insbesondere deshalb überraschend, weil bei den bisher bekannten üblichen Verfahren zur Bestimmung des Cholesteringehaltes von

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Blutserum stets eine Verdünnung des Blutserums erforderlich war.

Bei den im folgenden beschriebenen Versuchen wurde ein handelsübliches Standardserum verwendet. Verwendet wurde das Standardserum der Firma Warner-Lambert Company "Validate". Der Gesamt-Cholesteringehalt des Standardserums (Validate, Präparat 2560121) wurde dadurch überprüft, daß ein Anteil des Serums nach dem in "Anal. Chem." _43 (1971), Seite 1196 beschriebenen Verfahren verseift wurde, worauf der Heptanextrakt durch Gasflüssigkeits-Chromatographie und nach der Liebermann-Burchard-Methode bestimmt wurde. Es wurden Werte von 160 bzw. 162 mg/100 ml erhalten. Diese Werte stimmten mit den vom Hersteller angegebenen Werten von 148 bis 19 2mg/ 100 ml überein.

Hydrolyse der Cholesterinester im Serum

Eine Mischung von 1 ml Cholesterin-Standardserum mit 148 bis 192 mg Cholesterin/100 ml, 40 mg Lipase M,40 mg Papain, 8 mg α-Chymotrypsin und soviel einer 0,1 molaren Tris(hydroxymethy1)aminomethan-Pufferlösung zur Erzielung eines Gesamtvolumens von 3 ml (mit einem pH-Wert von 7,2) wurde in einem 25 ml fassenden Kolben unter Stickstoff bei 50⁰C 10 Minuten lang unter Schütteln bei 250 Umdrehungen pro Minute inkubiert.

Die Hydrolyse erfolgte in einer Stickstoffatmosphäre, um die Gefahr der Einschleppung von Auto-Oxidationsprodukten des Cholesterins und seiner Ester auf ein Minimum herabzudrücken. Eine geeignete Korrektur derartiger Auto-Oxidationsfaktoren ermöglicht es jedoch auch, daß die Hydrolyse in normaler Atmosphäre durchgeführt wird.

Quantitative Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes durch Gasflussigkeits-Chromatographie

1 ml Proben handelsübliches Standardserum mit bis zu 150 mg Cholesterin/100 ml wurden mit 5 ml Äthanol vermascht und 3 Minuten lang mit 1 ml Heptan, enthaltend 50 mg Octacosan/100 ml geschüttelt.

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Daraufhin wurden 5 ml Wasser zugesetzt, worauf die Mischung von neuem 3 Minuten lang geschüttelt wurde. Nach Trennung der Schichten wurden gleiche Anteile der Heptanschicht und Ν,Ο-Bis(trimethylsilyl)trifluoracetatamid mit 11 Trimethylchlorsilan vermischt. Nach einer Reaktionsdauer von 5 Minuten wurden 1 yl Proben in einen Chromatographen (vom Typ Hewlett Packard F und M 810) mit einer einzigen Koljonne aus rostfreiem Stahl (0,3 cm χ 1,2 m) gefüllt mit 31 Methylsilicon-Polymer.adsorbiert auf einem porösen Kieselsäurematerial (Chromasorb W, Hersteller Johns Manville Company, USA) injiziert.

Im übrigen wurden folgende Bedingungen eingehalten:

Gas-Strömungsgeschwindigkeit: 20 ml/Minute Ofentemperatur: 250 ⁰C

Temperatur an der Einspritzöffnung: 260 C

Flammendetektor: 265 ⁰C

Bereich: 10²

Dämpfung χ 1

Kartengeschwindigkeit: 1,23 cm/Minute

Die Octacosan-Verweilzeit lag bei etwa 1 Minute. Die Cholesterin-Verweilzeit lag bei etwa 2 1/2 Minuten. Die Testdauer lag bei etwa 4 Minuten. Unter den angegebenen Bedingungen war die Cholesterinmenge in der Probe proportional dem Spitzengewichtsverhältnis von Cholesterin zu Octacosan. Die angewandte Methode entsprach der Methode gemäß "Anal. Chem." 4_3 (1971), Seite 1196.

Bestimmung der Cholesterin-Esterasen-Aktivität von Lipasen

Bei den durchgeführten Versuchen wurde Cholesteryllinoleat als Substrat verwendet, da das Cholesteryllinoleat die Hauptesterkomponente menschlichen Blutserums darstellt und weil bei Verwendung von Cholesteryllinoleat vergleichsweise stabile Emulsionen erhalten werden können, im Vergleich zu gesättigten Estern, wie beispielsweise Palmitat.

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ήο

Bine Lösung von 200 mg redestilliertem Cholesteryllinoleat in 5 ml Äthyläther wurde unter kräftigem Rühren in 100 ml siedendes Wasser mit 430 mg Natriumcholat eingemischt. 5 ml dieser Suspension wurden dann zu einer Lösung von 50 mg Lipasepräparat in 5 ml eines 0,1 molaren Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,0 zugegeben. Die Mischung wurde dann 2 Stunden lang bei 37⁰C unter Stickstoff und 400 Umdrehungen pro Minuten inkubiert. Die nach dieser Behandlung verbliebenen Cholesterinester wurden nach der Hydroxylaminmethode von J. Vonhoeffmayr und R. Fried, Z. Klin. Chem. u·. Klin., Biochem. ·, ^ (1970), Seite 134, bestimmt, die auf der quantitativen Oberführung von Estern in Hydroxaminsäuren beruht. Die erzielten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I Hydroxylaminmethode mit Cholesteryllinoleat-Suspension

Enzym freigesetztes Cholesterin in mg/

100 ml

Lipase (Miles) 30

Lipase 3000 (Wilson) 42

Weizenkeim-Lipase (Miles) 59

Steapsin (Sigma) 59

Lipase M (Enzyme Development Corp.) " 68

Sämtliche der getesteten Enzyme zeigen Esterase-Aktivität. Die bevorzugte Lipase ist jedoch die Lipase M aufgrund ihrer beträchtlich größeren Esterase-Aktivität, wobei hinzukommt, daß es sich bei diesem Enzym um ein vergleichsweise billiges handelsübliches Enzym handelt. Bei Erhalt enthielt das Präparat etwa 80% Lactose, so daß auf Proteinbasis die Aktivität des Präparates etwa 5 mal seiner Aktivität auf Gewichtsbasis entspricht.

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Aktivität von Lipasen mit Serum-Cholesterinestern

Mischungen mit 40 mg Lipase in 1ml Serum-Standardlösung wurden 10 Minuten lang bei 50⁰C unter Stickstoff in 25 ml fassenden Kolben bei 250 Umdrehungen pro Minute inkubiert. Die Mischungen wurden dann extrahiert, worauf der Cholesteringehalt in der beschriebenen Weise ermittelt wurde. Die getesteten Enzyme und die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II Esterase-Aktivität mit Serum als Substrat

Enzym Cholesterin (mg/100 ml)

OHNE 2 3

Lipase 3000 26

Lipase M 36

Aus den Ergebnissen ergibt sich, daß die Lipase M und die Lipase 3000, d.h. zwei handelsübliche Lipasen, zwar eine beträchtliche Esterase-Aktivität im Falle von Cholesteryllinoleat-Emulsionen zeigen, jedoch eine sehr geringe Aktivität im Falle von Serumestern.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen, Beispiel 1

Esterase-Aktivität von Lipasen-Protease-Kombinationen auf Serum-Cholesterines ter

In der beschriebenen Weise wurden Kombinationen von Lipase M und verschiedenen Proteasen getestet. Proteasen, mit Ausnahme von α-Chymotrypsin, wurden direkt dem zu testenden Serum zugesetzt, und zwar in Konzentrationen von 40 mg/ml. Das α-Chymotrypsin wurde in einer Konzentration von 8 mg/ml verwendet. Die Mengen von

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Cholesterin (mg/100 ml) die durch die verwendeten Kombinationen freigesetzt wurden, ergeben sich aus der folgenden Tabelle III.

Tabelle III

Enzyme Cholesterin (mg/100 ml)

ohne 23

Lip as e M 36

α-Chymotrypsin (Sigma, Type 11,

3 χ kristallisiert) 37

Lipase M + α-Chymotrypsin 129

Papain (Sigma, rohes Produkt, Type 11) 29

Lipase M + Papain 115

Lipase M + a-Chymotrypsin + Papain 114

Aus den erhaltenen Ergebnissen ergibt sich, daß in Gegenwart von Proteasen, wie beispielsweise a-Chymotrypsin oder Papain die Cholesterin-Esterasen-Aktivität der Lipase M um das praktisch 4-fache gesteigert wurde. Die Proteasen können selbst eine geringe Esterasen-Aktivität aufweisen, ihr hauptsächlicher Effekt ist jedoch zu sehen in dem Anstieg der Zugänglichkeit der Cholesterinester für die Lipase durch Aufbrechen der Ester-Lipoproteinkomplexe im Serum. Die meisten Cholesterinester des Serums sind bekanntlich an Lipoproteine gebunden. Damit somit beispielsweise die Lipase M bezüglich Serum-Cholesterinester optimal effektiv wird, muß eine Protease vorhanden sein.

Beispiel 2

Eine Reihe von handelsüblichen Proteasen wurde auf ihre Fähigkeit zur Steigerung der Esterasen-Aktivität von Lipase M im Serum getestet.

Die Proteasen wurden dem Serum direkt in den in der folgenden Tabelle IV angegebenen Mengen zugesetzt. Die Konzentration der Lipase M lag bei 40 mg/ml Serum. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt.

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	11 -IA-	Cholesterin (mg/100ml)
	Tabelle IV	118 123
Protease	zugesetzte Menge (mg/ml)	145
1. Aspergillus oryzae (Sigma Type II)	20 40	147 144
	80	140
2. Streptoniyces griseus (Sigma Type VI)	5 10	140 118
	20	135
3. Bacillus subtilis (Sigma TJpe VIII)	5 10	114 127
	20	132
4. Bromelain (Sigma Grade II)	5 10	80 127 161
	20	133
5. Protease 30 (Hersteller: Rohm and Haas, Co., USA)	20 40 80
6. Pronase (Calbiochem, Grade A)	5

7. Subtilisin BPN (Sigma Type VII)

8. Protease, Bakteriel (Calbiochem, Grade B)

142

9. Lipase M

36

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-VS-

Sämtliche der getesteten Proteasen steigern ganz offensichtlich die Aktivität der Lipase M etwas mehr als α-Chymotrypsin und Papain. Es ist jedoch schwierig, die Aktivitäten dieser Proteasen auf der Basis der von den Herstellern angegebenen Einheiten miteinander zu vergleichen, da verschiedene Bestimmungsmethoden angewandt wurden. Im allgemeinen wurden die als weniger rein beurteilten Enzyme in höheren Konzentrationen verwendet.

Der Effekt des pH-Wertes auf die Esterase-Aktivität wurde mit verschiedenen Puffern und Enzymen, wie in den folgenden Beispielen 3 und 4 beschrieben, getestet.

Beispiel 3

Es wurden vier verschiedene Puffer in einem System mit drei Enzymen getestet. Jede getestete Probe bestand aus 1 ml Standard-Serum ("Validate"), 40 mg Lipase M, 40 mg Papain, 8 mg α-Chymotrypsin und soviel einer 0,1 molaren Pufferlösung, daß das Gesamtvolumen der Probe 3 ml betrug.

Die Proben wurden in der beschriebenen Weise inkubiert und getestet. Die erhaltenen Ergebnisse ergeben sich aus der beigefügten Zeichnung.

Die Messung des pH-Optimums bei diesen Bestimmungen mit Serum als Substrat können etwa zweideutig san, da zwei verschiedene Enzyme (Lipase und Protease) erforderlich sind. Es ist möglich, daß die pH-Optima der Enzyme nicht zusammenfallen. Bei den durchgeführten Versuchen erwies sich Tris(hydroxymethyl)aminomethan) bei einem pH-Wert von 7,2 als besonders vorteilhaft.

Beispiel 4

Es wurden Versuche mit Tris(hydroxymethyl)aminomethan als Puffersubstanz mit Kombinationen von Lipase M mit einer Reihe von Proteasen, wie beschrieben, durchgeführt. Die Menge einer jeden Protease, die verwendet wurde, entsprach der Menge, die die besten

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Ergebnisse der \^ersuche ergab, die in Tabelle IV niedergelegt sind. Es wurden drei pH-Werte zwischen 7 und 9 getestet. Die Bestimmungsmethode entsprach der in Beispiel 2 beschriebenen Methode, mit der Ausnahme jedoch, daß die Zeit auf 5 Minuten vermindert wurde, so daß Cholesterinwerte erwartet werden konnten, die unter 160 mg/ 100 ml liegen, d.h. dem maximalen Wert, der im Falle des Standard-Serum-Substrates (Validate) erreichbar ist.

Jede Inkubationsmischung enthielt 0,5 ml Standard-Serum (Validate), 0,5 ml einer 0,2 molaren Pufferlösung von Tris(hydroxymethyI)aminomethan bei dem angegebenen pH-Wert, 40 mg Lipase M und der Protease in den angegebenen Mengen. Die Inkubationsdauer lag bei 5 Minuten bei 50⁰C, 250 Umdrehungen pro Minute sowie unter Stickstoff. Die Proben wurden durch Gasflüssigkeits-Chromatographie in der beschriebenen Weise analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle V zusammengestellt.

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Protease

Tabelle V

Menge Cholesterin (mg/100 ml)

pH=7,2

pH-8,1

pH»9,0

1. A.oryzae

66

72

509	2.	Thermolysin (Calbiochem,	Grade A	10
0/0V8	3. 4.	Bromelain B. subtilis		20 5
to »J	5.
a.	6.	S. griseus		5
	7.	Pronase		5
	8.	Subtilisin	in	5
a-Chymotryps	8

9. Protease, Bacteriel
(Calbiochem)

58	74	52
66	100	72
54	65	70
56	58	30
67	74	40
56	66	56
84	56	22

86

100

102

Die meisten dieser Proteasen zeigen ein Optimum innerhalb der drei getesteten Werte. Die besten Ergebnisse wurden mit Bromelain bei einem pH-Wert von 8,1, Calbiochem-Bacterial-Protease bei einem pH-Wert von 8 bis 9 und A. oryzae-Protease bei einem pH-Wert von 8,1 sowie α-Chymotrypsin bei einem pH-Wert von 7,2 erhalten.

Beispiel 5

1 ml unverdünntes Serum (1 ml "Validate") wurde mit 50 mg Lipase M, Protease in in der folgenden Tabelle VI angegebenen Mengen und 12,1 mg Puffersubstanz (vergl. die Angaben in der folgenden Tabelle VI) bei einem pH-Wert von 7,2 inkubiert. Inkubiert wurde 10 Minuten lang bei 50⁰C unter Stickstoff bei 250 Umdrehungen pro Minute. Der Cholesteringehalt der Proben wurde durch Gasflüssigkeits-Chromatographie analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VI zusammengestellt.

- 17 -

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Tabelle VI

Hydrolyse von Cholesterinestern in unverdünntem Serum mit Lipase M und verschiedenen Proteasen

	Portease	B.subtilis	Menge (mg)	5	keine	Zugaben	116	Puffer	Cholesterin (mg/100ml)	Puffer	Cholesterin )mg/100ml)
	1.	Protease (Calbiochem)	5	5	pH- Bereich	Cholesterin (mg/100ml)	90	pH- Be reich	84	pH- - Rereich	2O3⁺⁺⁺⁺
cn ο	2.	A.oryzae	ι 5	7,1O-6,89⁺⁺⁺ 104	119	8,61-7,85	100	6,98-6,64	205
CD OO -C- O	3.	Bromelain	80	7,03-6,52	91	8,52-7,71	103	7,01-6,82	174
•^ O	4.		20	6,90-6,27	134	7,60-7,25	52	6,72-6,70	165
to	5.	α-Chymotrypsin 8	6,78-6,56	96	8,25-7,93	51	6,82-6,45	162
	6.	Pronase	7,08-6,93	8,65-8,19	64	7,00-6,94	160
	7.	S.griseus	6,82-6,66	8,72-7,99	63	7,01-6,89	119
		6,88-6,48	8,60-7,94	6,89-6,68

Die verwendete Puffersubstanz bestand aus Tris (hydroxymethyl)aminomethan in Form von "Trizma Base", Handelsbezeichnung der Puffersubstanz der Firma Sigma Chemical Corp., USA. Die Puffersubstanz wurde in Form eines Pulfers dem Serum zugesetzt;

verwendet wurde das HCl-SaIz von Tris(hydroxymethyl)aminomethan, pH-Wert = 7,2 gefriergetrocknet, dem Serum in Form eines Pulfers direkt zugegeben;

pH-Wert zu Beginn der Inkubation und pH-Wert am Ende der Inkubation;

gelegentlich lagen einige Werte bei über 160 mg/100 ml bei Verwendung der gleichen Probe des Standard-Serums (Validate), geeicht bei 160 mg/100 ml.

Obgleich gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung die quantitative Ermittlung des Gesamt-Cholesteringehaltes durch Gasflüssigkeits-Chromatographie erfolgt, lassen sich doch auch alle anderen bekannten Verfahren zur Bestimmung des Gesamtgehaltes an freiem Cholesterin (nach der Cholesterinester-Fydrolyse) anwenden. Hierzu gehören beispielsweise die von Pearson, Stern und McGarack, Carr und Drecker sowie Zak in "Fundamentals of Clinical Chemistry", Tietz, N.W., W.B. Saunders Co. (1970), Seite 355 bis 361 beschriebenen Methoden, ferner die bekannte Lieberman-Burchard-Methode sowie schließlich die Cholesterin-Oxidase-Methode, die in der DT-OS 2 246 695 beschrieben wird. Im letzteren Falle erfolgt die quantitative Bestimmung des gesamten freien Cholesteringehaltes durch Behandlung einer Cholesterinlösung mit Cholesterin-Oxidase und Messung der Menge eines oder mehrerer der Produkte dieser Oxidation.

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Claims

PATE N TAN S P. ROCHE

wäßriger, Cholesterinester enthaltender Flüssigkeiten, bei dem vor der quantitativen Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes der Flüssigkeiten die Cholesterinester unter Freisetzen des Cholesterins hydrolysiert werden, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolyse der Cholesterinester mit einer Lipase mit Cholesterin-Esterase-Aktivität und einer Protease erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lipase mit Cholesterin-Esterase-Aktivität verwendet wird, die mindestens 25 mg Cholesterin/100 ml in 2 Stunden bei 37⁰C unter Stickstoff freisetzt, wenn 50 mg eines Präparates der Lipase in 5 ml einer 0,1 molaren Phosphat-Pufferlösung bei einem pH-Wert von 7,0 zur Behandlung einer Dispersion von Cholesteryllinoleat verwendet werden,,die hergestellt wurde durch Dispergieren von 200 mg Cholesteryllinoleat in 5 ml Äthyläther und 100 ml siedendem Wasser, enthaltend 430 mg Natriumcholat.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mischung von etwa 600 bis etwa 1500 Einheiten der Lipase und von etwa 50 bis etwa 500 Einheiten der Protease pro ml Flüssigkeit (Serum) verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren bei einer Temperatur von 25 bis Wert von etwa 6,5 bis etwa 9,5 durchführt.

Verfahren bei einer Temperatur von 25 bis 55⁰C und einem pH-
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lipase mit Esterase-Aktivität eine mikrobiologische Lipase (microbial Lipase) verwendet.

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6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als mikrobiologische Lipase die Lipase von Candida cylindracca verwendet.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lipase eine Weizenkeimlipase oder eine pancreatische Lipase verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Protease α-Chymotrypsin, Papain, Bromelain, Bacillus subtilis-Protease, Aspergillus oryzae-Protease, Streptomyces griseus-Protease oder eine Mischung derartiger Proteasen verwendet.

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Γηs fttycfroxymethyl) Aminomeffran

G/yzj'n

GOlN 33-16 AT:21.03.1975 OTi02.10.1975

Eastman Kodak Company

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