DE2523697C2

DE2523697C2 - S-Acylverbindungen und deren Verwendung zur Lipasen-Aktivitätsbestimmung

Info

Publication number: DE2523697C2
Application number: DE2523697A
Authority: DE
Inventors: Masahisa Toyonaka Osaka Hashimoto; Shigeru Fujiidera Osaka Kurooka; Akio Kyoto Maki; Masatsugu Takatsuki Osaka Tomita
Original assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1974-05-28
Filing date: 1975-05-28
Publication date: 1986-09-18
Also published as: CA1041409A; AU8153775A; GB1486523A; FR2273283B1; DE2523697A1; US3986930A; CH616749A5; FR2273283A1

Description

S—CO —C H
/ "' "' CH₂-S-CO-C H, ,

₁₅ (CH₂^ σπ) I " ²" αν)

CO-O —C .H₇ .₊₁

m 2m -rl

CH₂-O-CO-C ,H,

λ 2/Ι+1

wobei

η eine ggnze Zahl von 2 bis 4,

λ' eine ganze Zahl von 2 bis 4 oder 9 bis 13,

/n die Zahl 3, 7 oder 11,

m' die Zahl 4 oder 12 und

25 j> den Wert 1 oder 2 bedeuten und

Y ein Schwefel- oder Sauerstoffatom oder eine Äthylengruppe darstellt,

mit der Maßgabe, daß m' die Zahl 4 bedeutet, wenn y den Wert 1 hat, und m' die Zahl 12 bedeutet, wenn y den Wert 2 hat.
30 2. Verwendung der Verbindungen der Formeln (II), (III) oder (IV) gemäß Anspruch 1 sowie der Formel (I)

CH₂-O-CO-C H, ,

CH-X —CO—C H, , (I)

35 I " ²^'

CH₂-O-CO- 0,,H₂^,

in der // und η' die Rir die Formel (IV) angegebene Bedeutung haben und X für ein Schwefel- oder Sauerstoff-40 atom steht, als Substrat in einem Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung der Lipasen-Aktivität.

3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel (I) einsetzt, in der X ein Schwefelatom bedeutet und η und «'jeweils den Wert 3 haben.

Lipasen spielen eine wichtige Rolle im menschlichen und tierischen Stoffwechsel. Zur Bestimmung der Lipasen-Aktivität sind bereits verschiedene Verfahren bekannt.

Ein Verfahren besteht darin, daß man die Lipase mit Olivenöl reagieren läßt und dann auf optischem Wege die 50 Abnahme der Trübung mißt (P. A. Verduin et al. in Clin Chim. Acta 46 (1973) 11-19).

Ein zweites bekanntes Verfahren besteht darin, daß man die Lipase mit Olivenöl reagieren läßt und die freigesetzte Fettsäure mit Alkali titriert (J. H. Roe et al. in Analytical Biochem. 6 (1963) 451-460).

Bei einem kolorimetrischen Verfahren geht man so vor, daß man nach der Reaktion der Lipase mit Olivenöl

die freigesetzte Fettsäure, oder das Glycerin, kolorimetrisch bestimmt, zum Beispiel durch Versetzen der freien

55 Fettsäure mit einem Kupfersalz und Extraktion mit η-Hexan, Versetzen des Extrakts mit Natriumdiäthylthiocarbamat und kolorimetrische Untersuchung der Probe (R. Fried et al. in Z. Klin. Chem. Biochem. 11 (1973) 189-192).

Ein weiteres kolorimetrisches Verfahren besteht darin, daß man die Lipase mit einem synthetischen Substrat umsetzt und das erhaltene Hydrolyseprodukt der Kolorimetrie unterwirft. Hierbei läßt man die Lipase zum Bei-60 spiel mit α-Naphthylpalmitat reagieren, kuppelt das freigesetzte a-Naphthol mit einem Diazoniumsaiz, worauf die kolorimetrische Messung erfolgt (J. F. Whitaker et al. in Clinica Chimica Acta 44 (1973) 133-138).

Bei den bekannten Verfahren läßt jedoch die Empfindlichkeit zu wünschen übrig, und man benötigt relativ große Mengen der zu untersuchenden Probe. Darüber hinaus sind die genannten Verfahren mit weiteren Mangeln behaftet, wie Schwierigkeiten bei der Durchführung der Analyse oder unzureichende Stabilität des Sub-' 65 strats.

Das Reaktionszentrum der Lipase stellt die Grenzfläche zwischen dem Ö! und den wäßrigen Phasen dar. Darüber hinaus ist es bei Verwendung von Olivenöl als Substrat erforderlich, die Reaktionsgeschwindigkeit der Lipase durch Erhöhung der Substratkonzentration an den Grenzflächen zwischen wäßriger und öliger Phase zu

steigern. Hierzu verwendet man das Olivenöl in Form einer Emulsion, die man unter Verwendung von Emulgatoren, wie Gummi arabicum oder Gallensäuresalze, oder durch heftiges Rühren erzielt. Die so hergestellten Olivenölemuisionen sind jedoch nicht stabil und können deshalb nur wenige Wochen, selbst bei Temperaturen nahe 0⁰C, aufbewahrt werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Verbindungen bereitzustellen, die sich als Substrat in einem Verfahren zurkolorimetrischen Bestimmung der Lipasen-Aktivität eignen. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Die Erfindung betrifft die in den Patentansprüchen angegebenen Gegenstände.

Die S-Ac> !verbindungen der Erfindung eignen sich zum Beispiel zur Bestimmung der Lipasen-Aktivität in menschlichen und tierischen Körperflüssigkeiten und Gewebeextrakten sowie Bakterienextrakten. Weiterhin können sie zur Überprüfung von Standard-Lipaseprodukten verwendet werden. Insbesondere sind sie zur Bestimmung der Lipasen-Aktiviiät in Humanserum geeigneL Erfindungsgemäß erfolgt die Farbbildung mit einer dem Serumlipasespiegel proportionalen Intensität vom Beginn der Reaktion an.

Spezielle Beispiele für S-Acylverbindungen der allgemeinen Formeln I, II, III und IV sind in Tabelle I angegeben.

Tabelle I

CH₂-S-CO-C H

■ π

2/Ι

CH-X—CO —C H, , CH₂-O-CO-C .H, ^

S
O
S

11

m y

Bezeichnung

BALB

MPB

(CHj)₂-S-CO-C H₁ ,

ι ^m 2/n+l

-(CHj)₂-

(CH₂)₂-S-CO-C_mH_2m+I

S — CO — C H, ^₁

y m 2m+1

(CH₂),

CO —O —C .H₁ , ,

m 2m+1

3 12 2

11 12 2

CH₂-S-CO-C H,

ι π 2/Ι+1

CH₂-O-CO-C ,H, . ,

¹ η In +1

3 11
3 3

2 11

BLME

Von den vorgenannten Verbindungen werden BALB und MPB besonders bevorzugt.

Die Bestimmung der Lipasenaktivität wird derart durchgeführt, daß man eine Lösung des Substrats in einem Alkohol zu der Reaktionspufferlösung hinzusetzt, die die Lipasenprobe und das chromogene Mercaptoreagens enthält. Dieses Mercaptoreagens reagiert mit einer Mercaptoverbindung, die duirchdie Lipase aus dem Substrat freigesetzt wird. Die Menge der freigesetzten Mercaptoverbindung bzw. die Intensität des gefärbten Reaklionsgemisches ist proportional der Lipasenaktivität in der Probe. Somit kann die Lipasenaktivität kolorimetrisch bestimmt werden.

Als Mercaptoreagens wird vorzugsweise 5,5'-Dithio-bis-(2-nätrobenzoesäure), nachfolgend als DTNB bezeichnet, verwendet. Im Fall der Verwendung der S-Acylverbindung der allgemeinen Formel I, in der X ein Sauerstoffatom ist, und von DTNB verläuft die Reaktion vermutlich nach folgendem Reaktionsschema:

CH₂-S-CO-C H

η 2/1 +

CH₂-O-CO-C H, ,

r η 2 η +1

CH₂-O-CO-C .H₇ . , fS-Acyl verbindung)

Lipase

CH₂-SH

-> CH- OH

CH₂-OH

(Mercaptoverbindung)

COOH NO₂

NO₂

COOH (DTNB)

(Mercaptoreagens)

CH₂-S

CH- OH

CH₂-OH

COOH

NO₂

(gelbes Anion)

Die Messung der Lipaseaktivität kann unter Verwendung sehr kleiner Probemengen, die nur 1/10 bis 1/100 der Probenmenge bei den bekannten Verfahren betragen, und in kürzerer Zeit durchgeführt werden. Darüber hinaus erreicht man bei dem Substrat eine micellare Verteilung durch einfaches Mischen und Schütteln mit einer Pufferlösung, ohne daß Emulgatoren oder heftiges Rühren erforderlich sind. Weiterhin ist diealkoholische Lösung des Substrats bei Raumtemperatur über 6 Monate stabil.

Es ist bekannt, bestimmte synthetische Clyceride, wie Glycerintributtersäureester, die eine ähnliche Struktur wie die erfindungsgemäß verwendeten S-Acylverbindungen besitzen, zur Bestimmung der Lipasenaktivität zu verwenden. Diesem Verfahren liegt jedoch ein anderes Prinzip zugrunde. Das verwendete Reagens besitzt nur eine geringe Empfindlichkeit und keine Substratspezifität; diese Methode hat deshalb in der Praxis keinen Eingang gefunden.

Erfindungsgemäß erfolgt die Bestimmung der Lipasenaktivität durch Hydrolyse des Substrats mit Lipasen und anschließende Messung der freigesetzten Mercaptoverbindung. Wenn die zu untersuchende, Lipasen enthaltende Probe andere Enzyme enthält, die eine Hydrolyse des Substrats bewirken, kann die Bestimmung der Lipasenaktivität nicht durchgeführt werden. Im allgemeinen teilt man die Enzyme, die Carbonsäureester zu spalten vermögen, in folgende Klassen ein:

(1) Carboxylesterasen (Enzymkommission Nr. [3.1.1.1]),

(2) Arylesterasen (Enzymkommission Nr. [3.1.1.2]) und

(3) Lipasen (Enzymkommission Nr. [3.1.1.1]).

Wenn somit die zu untersuchende Probe neben Lipasen die genannten Carboxylesterasen und/oder Aryiesterasen enthält, erfolgt die Substratspaltung auch durch diese anderen Enzyme unter Bildung einer Mercaploverbindung. Falls die Probe zusätzlich zu Lipasen Carboxylesterasen und/oder Arylesterasen enthält, muß man der Probe einen Enzyminhibitor zusetzen, der eine spezifische Desaktivierung der Carboxylesterasen und Arylesterasen zu bewirken vermag. Geeignete Beispiele für Enzyminhibitoren sind Phenylmethylsulfonylfiuorid der Formel C₅H₅CH₂SO₂F (nachfolgend als PMSF bezeichnet) und Diisopropylfluorphosphat der Formel

Il

(CHj)₂CHO-P—OCH(CH,), F

65 PMSF wird besonders bevorzugt

Der Zusatz solcher Enzyminhibitoren bringt selbstverständlich keinen Vorteil, wenn Carboxylesterasen und/ oder Arylesterasen abwesend sind.
Eine bevorzugte Ausführungsform zur Bestimmung der Lipasenaktivität ist nachfolgend angegeben.

Eine Pufferlösung wird mit einer Lösung eines chromogenen Mercaptoreagens (zum Beispiel DTNB) und einer lipas.cnhaltigen Lösung (Testprobe) sowiegegebenenfalls einer alkoholischen Lösung eines Enzyminhibitors (PMSF), der zur spezifischen Desaktivierung von Carboxylesterasen und/oder Arylesterasen geeignet ist, versetzt. Anschließend versetzt man mit einer Lösung eines S-Acylverbindung der allgemeinen Formel I, II, III oder IV. Nach einer gewissen Zeit im Inkubator unterbricht man die Reaktion durch Zugabe von Aceton, wobei 5 eine Klärung des trüben Substrats eintritt. Das erhaltene Gemisch, das das gebildete gelbe Anion enthält, wird der Kolorimetrie unterworfen, wobei die optische Dichte bei 400 bis 420 niu, vorzugsweise 412 m;;., gemessen Wifif.

Vorzugsweise wird das Verfahren unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

(1) Puffer: für übliche enzymatische Reaktionen geeigneter, herkömmlicher Puffer. Tris-HCl-Puffer wird bevorzugt. (»Tris« wird hier und im folgenden als Kurzbezeichnung lur2-Amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol verwendet.)

(2) ρH-Wert: 7,5 bis 10, vorzugsweise 8,5 bis 9,0.

(3) Inkubatortemperatur: 30 bis 40⁰C.

(4) Inkubationszeit: nicht über 120 Minuten.

(5) Substratkonzentration: 1,3 bis 2,6 mMol/Liter(die scheinbare Michaeliskonstante von BALB und MPB Tür Lipasen beträgt etwa 4 X 10"⁴ Mol/Liter).

(6) Konzentration des Enzyminhibitors (zum Beispiel PMSF): im allgemeinen 0,03 bis 3 iTimüi, vorzugsweise

0,1 bis 1,5 mMol, insbesondere 0,2 bis 0,8 mMol, jeweils pro Liter.

Die Aufbewahrung der erfindungsgemäß zur Bestimmung der Lipasenaktivität verwendeten Reagentien erfolgt in jeweils geeigneter Form. Die meisten der Substrate der allgemeinen Formeln 1,11, III und IV sind bei Raumtemperatur nüssig und können in Form alkoholischer, zum Beispiel äthanolischer, Lösungen aufbewahrt werden.

Bei längerer Lagerung wäßriger Lösungen des chromogenen Mercaptoreagens (zum Beispiel DTNB) tritt eine Gelbfärbung ein, und deshalb wird dieses Reagens vorzugsweise in Pulverform aufbewahrt, wobei die Herstellung der wäßi igen Lösung erst unmittelbar vor Gebrauch erfolgt. Das DTNB-Pulver kann zum Zwecke der leichteren Dosierung bzw. Wägung mit anderen, inerten Pulvern, zum Beispiel Mannitpulver, vermischt werden. Der Puffer kann zwar in Form von Lösungen aufbewahrt werden; angesichts bakterieller Verunreinigungen und der unpraktischen Handhabung wird der Puffer jedoch vorzugsweise in Pulverform aufbewahrt und erst unmittelbar vor Gebrauch in Wasser gelöst.

Die Aufbewahrung des Enzyminhibitors (zum Beispiel PMSF) erfolgt vorzugsweise in Form alkoholischer, zum Beispiel äthanolischer, Lösungen. Alkoholische PMSF-Lösungen sind selbst beim Erhitzen auf 120° C 30 Minuten stabil. Beim Vermischen von PMSF-Lösungen mit den Substraten der allgemeinen Formel 1, II, III oder IV in Alkoholen erfolgt jedoch eine chemische Reaktion des PMSF mit dem Substrat, wobei die Esteraseinhibitorwirkung vsrlorsngsht. Deshalb müssen bsidsri Lösun°sn °sirsnnt aufbewahrt werden.

Die vorgenannten Reagentien werden vorzugsweise als Packungen für die Lipasenbestimmung in entsprechenden Packungsgrößen für 50 bis 100 Bestimmungen aufbewahrt, die bei Raumtemperatur viele Monate stabil sind. ' Jf*

Die erfindungsgemäß verwendete S-Acylverbindung der allgemeinen Formel I, in der X ein Schwefelatom bedeutet, ist als Antituberkulosemittel bekannt (J. Chem. Soc, 2660,1960); der Fachmann konnte jedoch aus dieser Tatsache keinerlei Hinweis auf die Eignung für das Verfahren der Erfindung entnehmen. Bei denjenigen Verbindungen der allgemeinen Formel I, in der X ein Sauerstoffatom darstellt, und den Verbindungen der allgemeinen Formeln II, III und IV handelt es sich um neue Verbindungen. Ihre Herstellung kann durch Acylierung der entsprechenden Thioalkohole mit Säuren oder Säurederivaten, wie Säurehalogenide oder Säureanhydride, gemäß dem in J. Chem. Soc, 2660, 1960 beschriebenen Verfahren erfolgen.

Die Herstellung der Reagentien, das Verfahren zur Bestimmung der Lipasenaktivität und die Herstellung der S-Acylverbindungen sind nachfolgend anhand von Beispielen beschrieben.

Beispiel 1
Herstellung des Reagens zur Lipasenbestimmung

(a) 20miIIimolare BALB-Lösung in Äthanol:

669 mg BALB werden in Äthanol zu einem Gesamtvolumen von 100,0 ml gelöst.

(a') 20millimolare MPB-Lösung in Äthanol:

636 mg MPB werden in Äthanol zu einem Gesamtvolumen von 100,0 ml gelöst.

(a") 20millimolare BLME-Lösung in Äthanol:

660 mg BLME werden in etwa 50 ml Äthanol gelöst; diese Lösung wird mit Äthanol auf ein Gesamtvolumen von 100,0 ml aufgefüllt.

(b) 20millimolare PMSF-Lösung in Äthanol:

348 mg PMSF werden in Äthanol zu einem Gesamtvolumen von 100,0 ml gelöst.

(c) DTNB (0,3miIlimolare)/Tris-HCl (O,lmillimolar) vom pH 8,5: 12,0 mg DTNB werden vollständig in 10,0 ml einer lmolaren Tris-HCl-Pufferlösung gelöst; anschließend versetzt man mit Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ml.

(d) Aceton p. a.

Beispiel 2

Bestimmung der Lipasenaktivität (Substrat BALB)
Reagens

(a) 20millimolare BALB-Lösung in Äthanol

(b) 20millimjlare PMSF-Lösung in Äthanol

(c) DTNB (ü,3mil!imolar)/Tris-HCl (O.lmillimolar); pH 8,5

(d) Aceton

Bestimmungsmethode

In die Teströhrchen I und II gibt man 1 ml (c) und die Testprobe (10 bis 1500 BALB-Einheiten von Lipase oder etwa 10 al Humanserum). Nachem man das Röhrchen I mit 20 μΐ (b) (0,4millimolar an PMSF) versetzt hat, läßt man das Gemisch 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen, um im Serum vorhandene Carboxylesterase und/ oder Arylesterase zu desaktivieren.

Nachdem man das Teströhrchen I mit 0,1 ml Substrat (a) versetzt hat, hält man die Teströhrchen I und II 30 Minuter! bei 38°C.

Unmittelbar anschließend wird das Teströhrchen II mit 0,1 ml Substrat (a) versetzt, und dann fügt man zu den Teströhrchen I und II2 ml Aceton (d), um die Reaktion abzubrechen. Anschließend werden die Röhrchen I und II 10 Minuten zentrifugiert (700 g), um unlösliche Serumproteine und aufgrund von Serumlipiden und Substrat bestehende Trübung zu beseitigen. Die Messung der optischen Dichte der überstehenden Flüssigkeit des Röhrchens I erfolgt bei 412 ma in einer Küvette mit 1 cm Schichtdicke (ODj™) gegen das Röhrchen II. Der Wert OD]iS^m CI—H) · 1000 gibt die BALB-Einheiten der Lipase wieder.

Zu Vergleichszwecken wird ein Versuch mit einem Röhrchen III in gleicher Weise wie bei dem Röhrchen 1 durchgerührt, wobei jedoch der Enzyminhibitor (b) weggelassen wird. Der Wert ODJf₂ ¹" (1Π-Ι) · 1000 gibt die Gesamtaktivität an Arylesterase und Carboxylesterase an.

Beispiel 3

Bestimmung der Lipasenaktivität (Substrat MPB)
Reagens

(a') 20millimolare MPB-Lösung in Äthanol

(b) 20millimolare PMSF-Lösung in Äthanol

(c) DTNB (0,3millimolar)/Tris-HCI (0,lmillimolar); pH 8,5

(d) Aceton

Bestimmungsmethode

Die Bestimmung der Lipasenaktivität erfolgt gemäß Beispiel 2 unter Verwendung des Substrats (a') anstelle des Substrats (a).

Beispiel 4

Dieses Beispiel enthält die Meßergebnisse bei der Bestimmung der Lipasenaktivität und der Gesamtaktivität an Carboxylesterase und Arylesterase in Humanserum von gesunden Menschen und von an Pankreas- oder Leberleiden erkrankten Menschen. Die Messung erfolgte nach dem Verfahren des Beispiels 2, das heißt mit 10 al Serum und BALB als Substrat. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II

Serum Ursprung

Lipase

CI-II) - 10³

Carboxylesterase + Arylesterase

OD],^C2^m (III-l) - 10³

A	Normal
B	Normal
C	Normal
D	Normal
E	Normal
F	Normal
G	Normal

18 17 20 11 Ϊ9 18 20

68 61 60 60 18 62 50

	Ursprung	25 23 697	Carboxylesterase +
			Arylesterase
Fortsetzung		Lipase	ODlif (HI-I) · 10³
Serum	Akute Pankreatitis		120
	Pankreas-Ca	ODlif (I-ll) · 10³	45
	Pankreas-Ca	379	63
H	Pankreas-Ca	290	40
I	Akute Pankreatitis	186	87
J	^Akute Pankreatitis	125	61
K	Akute Pankreatitis	85	136
L	Akute Hepatitis	!•27	469
M	Hepatitis	187	198
N	Hepatitis	30	72
0	Hepatitis	17	106
P	0
Q	6
R

Die unter Anwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen ermittelten Lipasenwerte stimmen gut mit denjenigen Werten überein, die aufgrund der Verhältnisse zu erwarten waren.

Bei Verwendung von MPB oder BLME als Substrat erhält cnan ganz ähnliche Ergebnisse. 25

Beispiel 5

Gemäß Beispiel 2 wird die Bestimmung der Lipasenaktivität von Humanserum (10 al) mit 30 000BALB-Einheiien Lipase/ml (Substrat BALB) durchgeführt. Bei 20maliger Bestimmung erhält man als Ergebnis für Mittelwert ± Standardabweichung 298,4 ± 9,7.

Beispiel 6

Gemäß Beispiel 3 wird die Bestimmung der Lipasenaktivität in Humanserum (10 u.1) mit 20 000 MPB-Einheiten Lipase/ml (Substrat MPB) durchgeführt. Bei 20maliger Bestimmung erhält man als Ergebnis für Mittel-

srt ± Standardabweichup.g 200 ± IQ.

Beispiel 7

Unter Verwendung von BLME als Substrat erfolgt die Bestimmung der Lipasenaktivität in Humanserum
(20 [jl1> mit etwa 4000 BLME-Einheiten Lipase/ml. Die Ergebnisse, die bei 20maliger Bestimmung (10 Tage,
jeweils 2mal täglich) erhalten wurden, sind in Tabelle III zusammengestellt.

Tabelle III

Tag ELME-Einheiten/20 al Serum

1. 2. Mittelwert

	1	76,8	83	70	76,5
	2	4,0	77	76	76,5
	3	5,2%	77	80	78,5
	4	77	72	74,5
	5	80	68	74,0
	6	75	80	77,5
	7	78	85	81,5
	8	73	78	75,5
	9	77	78	77,5
	10	77	75	76,0
Mittelwert:
Standardabweichung:
Veränderungskoeffizient:

Beispiel 8

Gemäß Beispiel 2 wird die Bestimmung von 1100 BALB-Einheiten Lipase, 450 BALB-Einheiten Carboxylesterase oder 60 BALB-Einheiten Arylesterase (Substrat BALB) durchgeführt. Die Versuche erfolgen bei veränderlicher PMSF-Konzentration, wobei die BALB-Hydrolysegescbwindigkeit (relative Aktivität) gemessen wird. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 zusammengestellt.

Aus Fig. 1 ist'-rsichtlich, daß die 50%-Inhibierungskonzentration von PMSF für Lipase 4,2 x 10"³ Mol/Liter,

für Carboxylesterase 3,5 x 10"⁵ Mol/Liter und für Arylesterase 1,2 X 10"⁵ Mol/Liter beträgt Somit stellt die 50%-Inhibierungskonzentration für Carboxylesterase oder Arylesterase nur etwa 1/100 bzw. 1/300 des Wertes für Lipase dar. Selbst wenn man die Mengen an Lipase, Carboxylesterase und Arylesterase um das Mehrfache

erhöht oder erniedrigt, bleiben die Ergebnisse nahezu die gleichen.

Sofern man also die Bedingungen des Beispiels 2 nicht sehr stark verändert beträgt im Fall der Bestimmung der Lipasenaktivität unter Verwendung von BALB als Substrat die PMSF-Konzentration vorzugsweise 0,05 bis 2 mMol pro Liter, vorzugsweise 0,3 bis 1,5 mMol pro Liter und ganz besonders bevorzugt 0,4 bis 1,0 mMol pro Liter.

Beispiel 9

Gemäß Beispiel 3 erfolgt die Bestimmung von 1100 MPB-Einheiten Lipase, 140 MPB-Einheiten Carboxylesterase oder 68 MPB-Einheiten Arylesterase unter Verwendung von MPB als Substrat bei veränderlicher PMSF-Konzentration, wobei die Hydrolysegeschwindigkeit von MPB (relative Aktivität) gemessen wird. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 zusammengestellt

Aus F i g. 2 geht hervor, daß die 50% Inhibienmgskonzentration von PMSF etwa 4 X 10~^J Mol/Liter für Lipase, etwa 2 x 10"⁵ Mol/Liter für Carboxylesterase und etwa 1 X 10~⁵ Mol/Liter für Arylesterase beträgL Somit beträgt die 50%-Inhibierungskonzentration für Carboxylesterase oder Arylesterase nur etwa 1/200 bzw. 1/400 des Wertes für Lipase. Selbst wenn man die Mengen an Lipase, Carboxylesterase und Arylesterase um das Mehrfache erhöht oder erniedrigt, sind die Ergebnisse nahezu die gleichen.

Sofern man die in Beispiel 3 genannten Bedingungen nicht sehr stark verändert, beträgt somit im Fall der Bestimmung der Lipasenaktivität unter Verwendung von MPB als Substrat die PMSF-Konzentration vorzugs- -./eise 0,05 bis 1 mMol/Liter, insbesondere 0,1 bis 1,0 mMol/Liter und ganz besonders bevorzugt 0,2 bis 0.8 mMol/Liter.

Beispiel 10

Gemäß Beispiel 9 wird die Bestimmung der Lipasenaktivität unter Verwendung von BLME als Substrat durchgeführt. Die Inhibierung der Lipasenaktivität ist in Gegenwart von bis zu 2,0 mMol/Liter PMSF vernachlässigbar, während die Carboxylesteraseaktivität in 0.2millimolarer PMSF-Lösung zu etwa 90% inhibiert wird.

Beispiel 11

Gereinigt Pankreaslipase vom Schwein wird in einer lprozentigen Humanserumalbuminlösung zu einer Konzentration von 10 ;jtg/ml gelöst. Die Bestimmung der Lipasenaktivität in 10 μΐ dieser Lösung (entsprechend 0,1 ug Lipase) erfolgt gemäß Beispiel 2 unter Verwendung von BALB als Substrat in Anwesenheit von PMSF. Die gemessene Lipasenaktivität beträgt 800 BALB-Einheiten. 1 μΜοΙ der aus dem Substrat freigesetzten SH-Gruppen ergibt 4,75 OD]™ unter den hier beschriebenen Bedingungen. Hieraus errechnet sich, daß 1 mg der gereinigten Schweinepankreaslipase die Abspaltung bzw. Hydrolyse derS-Acylgruppe von BALB unter Bildung einer freien SH-Gruppe mit einer Geschwindigkeit von 1,670 μΜοΙ/30 min bewirkt.

Beispiel 12 50

Das Verfahren des Beispiels 2 wird unter Verwendung von 10 ul der Lipaselösung von Beispiel 11 unter Verwendung verschiedener S-Acylverbindungen als Substrat in Abwesenheit von PMSF wiederholt. Die bei der Messung der relativen Aktivität der S-Acylverbindungen erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt, wobei die relative Aktivität von BLME für Lipase mit 100 angesetzt ist. In Tabelle IV bedeutet die Angabe *), daß es sich um Verbindungen handelt, die nicht den allgemeinen Formeln I, II, III und IV angehören.

Tabelle IV

CH₂-S-CO-C H_, S 3 3

65 I " ²"^+I O 3 3

CH-X— CO — C H₁ , S 2 2

I " ²"⁺ⁱ S 4 4

C₁₁₁H₂₁₁₁₊₁ S 3 11

Relative	Bezeich
Aktivität	nung
500	BALB
250	MPB
305
135
420

Fortsetzung

CH₂-S—CO — C H,

η 2

CH-X—CO—C H, ₊

ι η 1π+

CH₂—O — CO—C

1 1

11 11

Relative	Bezeich
Aktivität	nung
10	*)
5	*)
1,5	*)

η in τ!

S—CO —C

(CH₂),,

CO-O —C ,H, , ,

CH₂-S-CO-C H

η 2η+\

CH₂-O-CO-C_n.H_2/i.₊

CH₂-S-CO-C₃H₇

i„_o-co-c* CH₂-S-CO-C₃H₇

-(CH₂J₂-

S O O

-(CH₂),-

	11	3	12	2	170	*)
	11	7	12	2	105	*)
	11	3	4	1	158
	3	3	4	1	110
	Il	5	12	1	5
	9	5	4	2	5
	3			163	*)
	11			160	*)
	3			125	Bl
	7			130
	3			15
	11			7,5
3			100,0	*)
2			95	*)
4			70
3			110
ClO			JD
9			22

35

20

25

30

40

45

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die S-Acylverbindungen der Formeln I, II, III und IV eine hohe Aktivität gegenüber Lipase besitzen, wobei BALB eine besonders hohe Aktivität zeigt. Im Gegensatz hierzu zeigen diejenigen Verbindungen, die nicht der allgemeinen Formel I, II, III oder IV angehören, wie 2-Bufc-i'oyloxy-l ,3- so bisbutyroylthiopropan, das ein Strukturisomeres von BALB darstellt, wenigerals 1 /10 der relativen B ALB-Aktivität.

Beispiel 13

Herstellung einer Reagenspackung für die Lipasenbestimmung
(50 Bestimmungen)

(I) Puffer:

967 Gewichtsteile Tris (das heißt 2-An^ino-2-hydroxym6thyl-l,3-propandiol) und 380 Gewichtsteile Tris-HCI werden gründlich miteinander verrieben; jeweils 1,6 g des Gemisches werden in weiiße Flaschen eiiv gewogen. Bei Gebrauch wird das Gemisch in Wasser zu einem Gesamtvolumen von 120 rhi (pH 8,4 bis 8,6) gelöst.

(II) DTNB:

54 Gewichtsteile DTNB und 486 Gewichtsteüe Mannit werden gründlich miteinander verrieben; jeweils 110 mg des Gemisches werden in 5 ml fassende braune Fläschchen eingewogen. Bei Gebrauch wird das Gemisch im Puffer I zu einem Gesamtvolumen von 11 ml gelöst.

55

60

65

fill; PMSF, 20millimoiar:

Nachdem man eine 0,348prozentige PMSF-Lösung in Äthanol hergestellt hat, werden jeweils 11 ml der

Lösung in 2,5 ml fassende braune Fläschchen abgefüllt. (IV) BALB, 20millimolar:

Nachdem man eine 0,669prozentige BALB-Lösung in Äthanol hergestellt hat, werden jeweils 11 ml der Lösung in 25 ml fassende braune Fläschchen abgefüllt

Die vorgenannten Reagentien werden in Form einer Reagenspackung aufbewahrt. Jede Packung kann für Lipasenaktivitätsbestimmungen gemäß Beispiel 2 verwendet werden.

Beispiel

Herstellung von MPB der Forme!

CH₂-S—CO-C₃H₇(n) I CH-O-CO-CjH₇W I CH₂-O-CO-C₃H₇(Z!)

Eine Lösucjgvon 3,8 g ar-Monothioglycerin in 50 ml Pyridin wird bei Raumtemperatur unter Rühren tropfenweise mit 17,4 g n-Buttersäureanhydrid versetzt. Nachdem man das Reaktionsgemisch 3 Stunden auf dem Wasserbad gerührt und dann unter vermindertem Druck eingeengt hat, wird der Rückstand in Benzol gelöst; die 25 erhaltene Lösung wird mit verdünnter Salzsäure, Wasser und verdünnter, wäßriger Kaliumcarbonatlösung der Reihe nach gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Entfernung des Benzols wird der Rückstand der Destillation unter vermindertem Druck unterworfen. Man erhält 9,4 g der gewünschten Verbindung als farblose Flüssigkeit vom Kp. 162 bis 167°C/133 Pa (1 Torr).

Beispiel

Beispiel 14 wird unter Verwendung entsprechender Ausgangsverbindungen wiederholt, wobei die in Tabelle V aufgeführten, Verbindungen erhalten werden.

Tabelle V

Verbindung

SCOC₃H₇(Z;) (CH₂),

SCOC₃H₇(Z!)

SCOC₇H₁₅(Zi)

(CH₂)₆

SCOC₇Hi₅(Z!)

Schmelzpunkt (F.) oder Siedepunkt (Kp.)

Kp. 185-186°C/400 Pa (3 Torr)

F. 40,5-41,0⁰C

(CHj)₂SCOC₃H₇(Z!)

(CH₂J₂SCOC₃H₇(H) S
(CHj)₂SCOC₃H₇(Zi)

Kp. 157-160°C/267 Pa (2 Torr)

Kp. 170-173° C/267 Pa (2 Torr)

Fortsetzung

Verbindung

CH₂SCOC₃H₇(Z!)

CHSCOC₃H₇(Zz)

TH₂SCOC₃H₇(Zi)

Schmelzpunkt (F.) oder Siedepunkt (Kp.)

Kp. 143-146°C/20 Pa (0,15 Torr)

CH₂SCOC₃H₇(Zi)

I Kp. 112-114°C/400 Pa (3 Torr)

CH₂OCOC₃H₇(Zz)

Beispiel 16
Herstellung der Verbindung

S-CO — C₃H₇(Zi)

CH₂

COO-C₄H₉(Zi)

Eine Lösung von 6 g a-n-Butyroylmercaptoessigsäure und 7 g p-ToluolsuJfonsäurechlorid in 50 ml Benzol wird bei Raumtemperatur unter Rühren mit 9,4 g Triäthylamin und 2,8 g n-Butanol versetzt. Nachdem man das Reaktionsgemisch 30 Minuten auf einem Wasserbad von 50° C erwärmt hat, läßt man abkühlen, wäscht das Reaklionsgemisch der Reihe nach mit kaltem Wasser und wäßrigem Natriumhydrogencarbonat, trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat und entfernt das Benzol. Der Rückstand wird der Destillation unter vermindertem Druck unterworfen. Hierbei erhält man 6,5 g der gewünschten Verbindung in Form einer farblosen Flüssigkeit vom Kp. 122 bis 124°C/533 Pa (4 Torr).

Beispiel 17

Gemäß Beispiel 16 werden die in Tabelle VI angegebenen Verbindungen hergestellt.
Tabelle VI

Verbindung	Kp.
S-CO-C₇H₁₅(Zi) CH₂ COO-C₄H₉(Zi)	Kp. 143-145°C/133 Pa (1 Torr)
S-CO-C₃H₇(Zi)
(CHj)₂ COO-C₁₂H₂₅(ZI)	Kp. 135-140°C/40 Pa (0,3 Torr)
Beispiel Herstellung der Verbindung S-CO-C₁₁H₂₃(Zi)	18

COO-C₁₂H₂₅(Zi)

Eine Lösung von 4,0 gjS-Lauroylmercaptopropionsäure und 2,64 g p-Toluolsulfonylchlorid in 50 ml Benzol wird mit 3,51 g Triäthylamin und dann mit 2,58 g n-DodecanoI versetzt. Anschließend verfährt man wie in Beispiel 16 beschrieben. Nach Umkristallisieren des erhaltenen Rückstands aus Äthanol erhält man 5 g der gewünschten Verbindung vom F. 36 bis 37°C.

Beispiel 19
Herstellung von

CH₂-S —CO —CjH₇(/7)

CH—S—CO — C₃H,(«)

CH₂-O-CO-C₁₁H₂J(Ii)

Eine Lösung von 12,0 g 2,3-Dimercaptopropanol in 75 ml Benzol wird unter Rühren tropfenweise mit 21,5 g Lauroylchlorid versetzt. Nachdem man etwa 3,5 Stunden unter Rückfluß, bis zum Aufhören der Chlorwasserstoffentwicklung, gerührt hat, destilliert man das Benzoyl ab. Bei der Destillation des erhaltenen Rückstands erhält man 11,5 g gelbes, öliges Dimercaptopropyllaurat vom Kp. 167 bis 175°C/133 Pa (1 Torr). Das ]R-Spcktrum (Film) zeigt Absorptionsbanden bei 2563 und 1738 cm"¹.

Eine Lösung von 10 g 2,3-Dimercaptopropyllaurat und 11,8 g Pyridin in 50 ml Benzol wird bei Raumtemperatur tropfenweise mit 10,3 g n-Buttersäureanhydrid versetzt. Nachdem man 4 Stunden unter Rückfluß gerührt hat, wird das Reaktionsgemisch mit einer wäßrigen Kaliumcarbonatlösung ausgeschüttelt, mit Wasser gewasehen und getrocknet. Nach Abdestiüieren des Benzols wird der Rückstand unier Verwendung einer Kieselsäuregelsäule chromatographisch gereinigt, wobei mit η-Hexan gewaschen und mit Benzol eiuiert wird. Man erhält 8,0 g der gewünschten Verbindung in Form eines gelben, öligen Stoffs. Das IR-Spektrum (Film) zeigt Absorptionsbanden bei 1742 und 1698 cm"¹.

Beispiel 20

Herstellung der Verbindung
CH₂-S —CO —

CH₂-O-CO-C_nH₂J(Zi)

Eine Lösung von 15 g Thiolaurinsäure in 50 ml wasserfreiem Äthanol wird mit einer Lösung von 15 ml Äthy-Ienoxid in 20 ml kaltem wasserfreiem Äthanol versetzt. Nachdem man das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur 15 Stunden stehengelassen hat, wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Beim Umkristallisieren des Rückstands aus Petroläther erhält man 8 g farblose Schüppchen S-Lauroylmercaptoäthanol vom F. 45 bis 46° C (der SH-Test mit DTNB verläuft negativ).

5 g S-Lauroylmercaptoäthanol werden 3 Stunden in einem Ölbad auf 190⁰C erhitzt. Hierbei erhält man das gewünschte O-Lauroylmercaptoäthanol vom Kp. 153 bis 155°C/400 Pa (3 Torr) (der SH-Test verläuft positiv). Ein Gemisch aus 1 g O-Lauroylmercaptoäthanol und 4,5 ml n-Buttersäureanhydrid wird 2 Stunden in einem Ölbad auf 190 bis 200°C erhitzt. Nachdem man das Reaktionsgemisch, zur Entfernung von n-Buttersäure und überschüssigem n-Buttersäureanhydrid, unter vermindertem Druck eingeengt hat, wird der erhaltene Rückstand abgekühlt Nach zweimaligem Umkristallisieren der abgeschiedenen Kristalle aus Äthanol erhält man I g S-Butyroyl-O-Iauroylmercaptoäthanol vom F. etwa 25⁰C; Kp. 190 bis 195°C/400 Pa (3 Torr).

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:
1. S-Acylverbindungen der allgemeinen Formeln (10, (Π), (ΠΓ) und (TV)

5 C t Jr C C C\ f~* PT //"¹T-T ^ C Γ* /Λ /^T-J

L-MT ο — K^KJ K^ χι. , (v^-ri^b ο — C^U O rl

CH — O — CO-C H₁ , Ο') Y (H)

C* TT Γ\ /"* Γ\ C TJ (f*i TT \ ο C* /™\ /~ι TJ

tr» O ~Λ + · /Π 2/71 + 1