DE1798285C3 - Neues Mittel und Verfahren zur Lipasebesti m mu ng - Google Patents
Neues Mittel und Verfahren zur Lipasebesti m mu ngInfo
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Description
Lipasen sind Enzyme, die Fette und Öle in Glyceride und Fettsäuren spalten. Sie sind im tierischen Organismus
weit verbreitet. Besonders hohe Konzentrationen findet man in der Leber und im Pankreassekret. das im
Dünndarm die Nahrungsfette verdaut. Bei Erkrankungen des Pankreas tritt Lipase in die Blutbahn über.
Deshalb ist die Bestimmung der Lipase im Serum ein wichtiges diagnostisches Hilfsmittel zur Erkennung von
Pankreaserkrankungen.
Nach den bekannten Verfahren wird die Lipase dadurch bestimmt, daß ein Überschuß eines Lipasesubstrats
vorgelegt und die hieraus durch die Lipase freigesetzte Menge Fettsäure durch Titration mit Alkali
unter Verwendung eines Indikators oder durch Extraktion der Kupfersalze gemessen wird. Als Indikatoren
werden für die Titrationsbestimmungen nach den bekannten Verfahren Thymolphthalein bzw. Phenolphthalein
verwendet (Deutsche Medizinische Wochenschrift, Bd. 90, S 1170 [1%5], und Analytical Biochemistry.
Bd. 6, S. 451 [1963]. Als Substrat wird im
allgemeinen eine Öl-in-Wasser-Emulsion eingesetzt. Die genaue Bestimmung der Lipase nach diesen
Verfahren ist jedoch mit erheblichen Schwierigkeiten verbunden, die einer breiten Anwendung im Kliniklaboratorium
entgegenstehen Das Substrat läßt sich nicht leicht handhaben und macht eine photometrische
Messung im Durchlicht wegen der Trübung unmöglich. Ferner ist sehr nachteilig, daß die zu bestimmende
Sam cniLMigc äußerst gering ist. Zum Beispiel erhält man
selbst beim Einsat/ von 1 ml Serum bei 10 Minuten Inkubation im Normalfall größennrdnungsmäßig nur
0.000") mMol Säure entsprechend einem Verbrauch von 0.00") ml 0,1 N-Niitronlauge bei der Titration. Deshalb ist
man auf sehr kostspielige Mikrotitricrauiomaten angewiesen,
mit denen Sencnuntersuehungen nicht durchführbar
sind. Solern keine Mikrotitrierautomaten zur Verfügung sieben. muH man bei Verwendung von
Knrhiiulikatorcn zur Titration, sehr laiige Inkubationszeiten
relativ große Senmimengen und ungenaue !■'!■"chnisse in Kau) nehmen.
Aus der britischen Patentschrift 1116 540 ist ein Test
zur Bestimmung der Cholinesteraseaktivität bekannt, bei dem ebenfalls eine Esterase mit einem Substrat
behandelt wird, wobei eine Fettsäure freigesetzt wird, die mit Hilfe von pH-Indikatoren bestimmt wird. Im
Vergleich zur Lipasebestimmung wird im Falle eines nichtpathologischen Serums hier etwa die feOfache
Säuremenge freigesetzt. Diese Methode kann jedoch nicht auf die Lipasebestimmung übertragen werden, da
ίο die dort angegebenen Indikatoren Brointhymolblau.
Phenolrot oder m-Nitrophenol für eine Lipasebestimmung ungeeignet sind.
Aus der Literatur, z. B. Index Merck, 9. Aufl.. 1961, ist
eine Vielzahl von pH-Indikatoren bekannt. Alle diese Indikatoren erfüllen jedoch nicht die speziellen
Anforderungen, die für eine direkte Messung der Geschwindigkeit des Farbumschlags in einer Emulsion
notwendig sind. So muß z. B. der Umschlagspunkt in der Emulsion im pH-Bereich der Messung liegen, die
Indikatorfarbe darf nicht durch die Serumeigenfarbe gestört werden, die Farbdifferenzierung muß trotz des
hohen Eiweißanteils der Probe für das Auge gut wahrnehmbar sein, der Farbumschlagsbereich in der
Emulsion muß eng sein und der Proteinfehler des Indikators, der eine Verschiebung und Erweiterung des
pH-Umschlagbereichs zur Felge hat. darf die Ablesung nicht stören.
Wegen dieser Schwierigkeiten begnügt man sich in der Praxis häufig mit einer Esterase-Bestimmung. d.h..
man verwendet einen löslichen Ester niederer Kettenlänge als Substrat, der gut definiert ist. jedoch
andererseits nicht nur von der Lipase, sondern auch von anderen im Serum enthaltenen Esterasen hydrolysiert
wird (vgl. Ärztliches Labor. Bd. 13. 157 [1967]. Die
Verwendung eines solchen löslichen Esters ist bei der Lipase-Bestimmung in angereicherten Enzym-Präparaten
zulässig, nicht aber im Serum, da im Serum die Lipase-Konzentration nur sehr gering ist (Normalbereich
bis 0,1 U/ml) und daneben viele andere Esterasen in z.T. hohen Konzentrationen vorliegen. Deshalb
mußten bisher für die Bestimmung der sogenannten »echten Lipase« die oben aufgeführten mit großen
Nachteilen behafteten Verfahren angewandt werden.
Es wurde nun gefunden, daß bei Verwendung bestimmter pH-Indikatoren die genannten Schwierigkeiten
bei der Lipasebestimmung mit Hilfe einer Öl/Wasser-Emulsion weitgehend vermieden werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Mittel zur Bestimmung von Lipase in Körperflüssig
keiten mit wäßrigen Fett- bzw. ölemulsionen unc pH-Farbindikatoren, das dadurch charakterisiert ist, dal:
als Farbindikator m-Kresolpurpur und/oder p-Xylenol
sulphophthalein enthalten ist.
Außerdem umfaßt der Gegenstand der vorliegendet Erfindung ein Verfahren zur Lipasebestimmung 11
Korperflüssigkeiten mit wäßrigen Fett- bzw. ötemulsio
nen und pH-Farbindikatoren, das dann besteht, daß mai
der zu untersuchenden Probe das vorstehend definiert und im folgenden an Hand von Ausführungsbeispiele
näher erläuterte Mittel zusetzt und die während de Inkubationszeit eingetretene Farbänderung bestimmt.
Vorteilhafte Weiterbildungen des Mittels nach de Erfindung sind in den Patentansprüchen 2 bis
besehrieben.
besehrieben.
fts Besonders vorteilhaft ist, daß in dem neuen Verfahre nur »'ine sehr geringe Menge der zu bestimmend.:
Probe (etwa 0,2 ml bei einer Normalbestimnv.iii)' b/\
0,02ml für eine Mikrobestimmung) benötigt wir
Ferner bietet das neue Mittel bzw. Verfahren den Vorteil, daß — im Gegensatz zu den mit bekannten
Mitteln und dem Titrator arbeitenden Verfahren — keine aufwendigen Apparaturen und kein hierfür
geschultes Personal erforderlich sind und daß das neue Verfahren — im Vergleich zu den bekannten Verfahren,
bei denen unter Verwendung von Indikatoren die durch die Lipase freigesetzte Säuremenge durch Titration
bestimmt werden muß — erheblich rascher durchgeführt werden kann. Außerdem wird eine mehrfache
Pipettierung. wie sie für die bekannten Verfahren erforderlich ist, durch Anwendung des neuen Mittels
vermieden. Ein weiterer Vorteil ist die hohe Spezifität und Genauigkeit der Lipasebestimmung mit dem Mittel
nach der Erfindung. ,5
Die sehr guten Ergebnisse bei einfacher Handhabung des neuen Mittels waren auf Grund des Standes der
Technik nicht vorauszusehen. Da Substrat und Indikator der Einwirkung der Lipase in einer eiweißhaltigen
Lösung ausgesetzt sind, war mit einer Verschiebung des Umschiagbereiches für die nach der Erfindung einzusetzenden
Farbindikaloren zu rechnen. Ferner ist bekannt, daß der Umschlagbereich des Indikators sich im
allgemeinen in einer eiweißhaltigen Lösung nicht nur verschiebt, sondern meist auch verbreitert, so daß
genaue pH-Ablesungen erschwert sind. Außerdem wird eine solche Verbreiterung des Umschlagbereiches auch
durch Zusatz vom emulsionsstabilisierenden Stoffen, uic z. B. Gummi arabicum, hervorgerufen. Sofern ein
Zusatz nicht völlig farblos ist, wie es z. B. bei Gummi arabicum der Fall ist, wird außerdem die Farbablesung
erschwert. Auf Grund dieser Unsicherheitsfaktoren sind die guten Meßergebnisse, die mit dem neuen Mittel zu
erzielen sind, als überraschend anzusehen.
Im folgenden werden das Mittel und das Verfahren
nach der Erfindung an Hand vcn Beispielen näher erläutert:
Die erfindungsgemäß verwendeten Indikatoren zeigen einen scharfen Farbumschlag, beispielsweise
m-Kresolpurpur von Violett nach Gelb und p-Xylenolsulphophthalein
von Blau nach Gelb. Bei der Herstellung des Mittels nach der Erfindung wird der pH-Wert
der Lösung zweckmäßigerweise so eingestellt, daß der Farbumschlag schon durch Zugabe einer minimalen
Menge Säure auftritt. Beispielsweise stellt man bei 4S
Verwendung von m-Kresolpurpur auf einen braunstichigen Violett-Ton. bei Verwendung von p-Xylenolsulphophthalein
auf einen braunstichigen blauen Farbton ein. Die Einstellung des gewünschten pH-Wertes führt
man vorteilhaft durch, indem man eine alkalische Lösung des Indikators, z. B. eine Lösung des m-Kresolpurpur
oder p-Xylenolsulphophthalein. in verdünnter,
beispielsweise 0.1 N-Natronlauge der Emulsion zufügt
und anschließend eine Säure, z. B. verdünnte Salzsäure oder eine andere verdünnte Mineralsäure, zusetzt, bis S5
der gewünschte Farbton erreicht ist. Grundsätzlich kann man den Indikator auch in wäßriger Säure, z. B. als
Suspension oder als Lösung, zusetzen und anschließend durch Zusatz von Alkali. ?.. B. von verdünnter Natronlauge,
den gewünschten Farbton einstellen. Im allgemei- ^0
non ist jedoch wegen der besseren Löslichkeit der Zusatz des Indikators in alkalischer Lösung vorzuziehen.
Sofern das Mittel über längere Zeit vor der '.ipasebcstimmung aufbewahrt wird, empfiehlt es sich,
ur Erhöhung der Haltbarkeit den Indikator erst kurz <,<,
■or Gebrauch der Emulsion zuzusetzen In diesem Fall
•.eilt man die Emulsion mit einem vorzugsweise
!trnirn h/v. nur schwach alkalischen b/w. sehwach
sauren pH-Wert zunächst ohne Indikator und getrennt hiervon eine alkalische Indikatorlösung her. Beide
Lösungen sind sehr gut auch über längere Zeit haltbar. Der Indikator ist in der gebrauchsfertigen Emulsion in
einer Konzentration von etwa 0,001 bis 1%, vorzugsweise 0,05 bis 0,2%, bezogen auf das Gewicht der
gesamten Emulsion, enthalten.
Gegebenenfalls kann der Indikator auch aus einem Gemisch von m-Kresolpurpur und p-Xylenolsulphophthalein
bestehen. Insbesondere kann es in manchen Fällen zweckmäßig sein, neben einem dieser Indikatoren
einen weiteren Indikator wie z. B. Dibromthymolsulphophthalein, Thymolsuphophthalein oder ,-*-Naph
tholphthalein in geringer Konzentration zur genauen Einstellung der für den Umschlagsbereich gewünschten
Farbnuance des Mittels nach der Erfindung anzuwenden. Eine solche Einstellung kann z. B. erforderlich sein,
wenn zur besseren Vergleichsmöglichkeit mit einer vorgedruckten Farbskala der Farbton des Hauptindikators
verschoben werden soll. Beispielsweise kann durch Zusatz einer geringen Menge des im alkalischen Bereich
blauen &-Naphtholphthalein zu einer als Hauptbestandteil
des Farbindikators verwendeten Verbindung, wie m-Kresolpurpur oder p-Xylenolsulphophthalcin, der
Farbton des Mittels im alkalischen Bereich insgesamt nach Blau verschoben werden.
Gegebenenfalls können auch derartige Farbverschiebungen
in dem Mittel nach der Erfindung durch Zusatz von geringen Mengen anderer als der oben aufgeführten
Farbindikatoren, z. B. durch Zusatz von Diphenolpurpur
(Rotverschiebung besonders im neutralen Bereich bei Verwendung von m-Kresolpurpur als
Hauptbestandteil des Farbindikators) oder in manchen Fällen auch durch Zusatz geringer Mengen einer
anderen farbigen Verbindung, wie Carotin, mit dem ein gelber Farbton erhalten wird, erzielt werden. Diese
Verbindungen werden z. B. in einer Konzentralion bis zu 0,05°/Ό (bezogen auf die Emulsion) zugesetzt.
Als Lipasesubstrat enthält das Mittel nach der Erfindung natürliche oder synthetische Ester von
Fettsäuren, insbesondere Fettsäuregiycerinester Allgemein sind Triglyceride oder gegebenenfalls auch
Diglyceride von Fettsäuren, wie Palmii Stearin-. Öl-,
Linol- oder Laurylsäure, zu verwenden. So sind natürliche öle und Fette, z. B. a'ich Cocosfett. als
Lipasesubstrat für das Mittel nach der Erfindung geeignet. Besonders bevorzugt ist Olivenöl. Es empfiehlt
sich, aus den ölen und Feiten vor der Verwendung als Lipasesubstrat die freien Fettsäuren, beispielsweise
durch chromatographische Reinigung des Öles oder Fetts über einem basischen Adsorptionsmittel wie
Aluminiumoxid, zu entfernen. Gegebenenfalls können die öle und Fette auch anderweitig gereinigt oder auch
hydriert werden. Beispielsweise ist hydriertes Rapsöl als Lipasesubstrat ebenfalls geeignet.
Zur Erhöhung der Haltbarkeit der Emulsion enthält das Mittel der Erfindung zweckmäßig einen emulsionsstabilisierenden
Zusatz. Dieser Zusatz kann aus einer oder mehreren Verbindungen der im folgenden
beschriebenen Stoffgruppen bestehen.
Als emulsionsstabilisierender Zusatz haben sich vor allem Verbindungen mit Schutzkolloidwirkung insbesondere
Gummi arabicum, bewahrt. Gegebenenfalls kann auch Polyvinylpyrrolidon als Schutzkolloid eingesetzt
werden. Die Emulsionsstabilisatoren mit Schutzkolloidwirkung, insbesondere das Gummi arabicum,
sind in der Emulsion in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 30%, vorzugsweise 10 bis 25%. enthalten. Neben
der Schutzkolloidwirkung übt das Gummi arabicum einen aktivierenden Einfluß auf die Lipase aus.
Ferner können im Mittel nach der Erfindung auch die üblichen Emulgatoren für Öl- bzw. Fett/Wasser-Emulsionen,
wie z. B. Polyäthylenglykol-Fettalkoholäther. Polyäthylenglykolaikylphenoli.iher, Sulfonsäuresalze
oder Schwefelsäureester, z. B. Isopropylnaphthalinsulfonsäuresalze,
oder Cetyl-stearylschwefelsäureester, zur
Stabilisierung der Emulsion enthalten sein. Oie Konzentration
dieser Emulgatoren liegt beispielsweise bei bis zu 20%, vorzugsweise bis zu 1 %.
Als weiterer Zusatz, der die Emulsion stabilisiert und gleichzeitig aktivierend aul die zu messende Lipase im
Fall einer Pankreaslipasebestimmung wirkt, können Salze von Gallensäuren, z. B. Alkalicholate, -desoxycho
late, -taurocholate, -glykocholaie u. a. Gallensäuresalze. im Mittel der Erfindung enthalten sein. Diese Salze
werden in einer Konzentration bis zu etwa 2%. insbesondere bis zu 0.5%, angewandt.
Als weiterer geeigneter Zusatz kann die Emulsion zur
Stabilisierung Stoffe enthalten, die das Absetzen verhindern, beispielsweise die Geliermittel auf Montmonllonit-Basis,
insbesondere Erdalkali- oder quartäre Ammoniumsalze von Montmorillonit-Fettsäuren. Zum
Beispiel können insbesondere die üblicherweise als EmuKionsstabilisatoren für Öl-in-Wasser-Systeme angewandten
feinstverteilten Magnesium-montmorillonite von einer Dichte von 2,4 g/cm3 und einem
Feuchtigkeitsgehalt von etwa b°/o oder e;n Dimethyldioctadecyl-animonium-Montmonllonit
von einer Dichte von 1,80 g/cm3 und einem Feuchtigkeitsgehalt von
weniger als 3% als Zusatz für die Emulsion nach der Erfindung verwendet werden. Diese Antiabsetzmittel
werden in einer Konzentration bis zu etwa 3%. insbesondere bis zu 1 °/o, angewandt.
Ferner kann das Mittel der Erfindung emulsionsstabilisierende
Stoffe enthalten, die die Viskosität von Emulsionen bei niedrigen Temperaturen erhöhen.
Hierfür kommen z. B. gelbildende, höhermolekulare Verbindungen, die von Esterasen nicht gespalten
werden, in Frage. Insbesondere Agar hat sich als Zusatz
zur Erhöhung der Viskosität und damit zur Stabilisierung der Emulsion bewährt.
Außerdem kann das Mittel der vorliegenden Erfindung zur Verhinderung einer Autoxydation und der
hierdurch bedingten Entmischung der Emulsion reduzierende Verbindungen, insbesondere Mercaptoäthanol
bzw. Cystein, in Konzentrationen bis zu etwa 1%, vorzugsweise bis zu 0,05%, enthalten.
Das Mittel nach der Erfindung kann zur Stabilisierung
der Emulsion auch biostatische Stoffe enthalten, die die Einwirkung von Mikroorganismen auf das verwendete
Substrat verhindern. Hierfür kommen beispielsweise quecksilberorganische Verbindungen, wie p-Chlormer
curibenzoat. Phenylquecksilberacetat, Äthylmercurithiobenz-3.4-oxazoll-carbonsäure
bzw. deren Natriumsalz, Äthylqueeksilberthiosalicylate, Äthylquecksilberthiophenölsulfonsäuren.
jodacetate und/oder Azide in Frage. Bevorzugt werden hierfür Natrium-jodacetat
und Natriumäthylmereurithiosalicylat eingesetzt. Die biostatischen Stoffe sind vorzugsweise in einer Konzentration
bis zu etwa 1%, insbesondere in einer Konzentration bis zu etwa 0.1 %. enthalten.
Biostatische Stoffe können gegebenenfalls zusammen mit Gummi arabicum als emulsionsstabilisierende
Zusät/e enthalten sein. Allgemein sind Emulsionsstabilisatoren besonders geeignet, die durch Esterasen,
insbesondere durch andere Esterasen als Lipase, im schwach alkalischen Bereich nicht verändert werden.
Bei der Zubereitung des Mittels nach der Erfindung wird im allgemeinen eine Lösung mindestens einer
emulsionsstabilisierenden Verbindung, z. B. von Gummi arabicum, in Wasser vorgelegt. In manchen Fällen ist es
zweckmäßig, diese Lösung vor der Zubereitung der Emulsion zu filtrieren oder zu zentrifugieren, um
Rückstände aus den Zusätzen, z. B. aus dem Gummi arabicum, zu entfernen. Anschließend wird durch
ίο Zugabe des Substrats, z. B. des Olivenöls, unter
Turbinieren die Emulsion gebildet. Die weiteren für das Mittel verwendeten Zusätze, z. B. weitere emulsionsstabilisierende,
insbesondere biostatische Stoffe, können der Mischung vor oder nach Zugabe des Substrats
beigemengt werden.
Der Indikator kann zweckmäßigerweise in Form einer Lösung der Emulsion zugefügt werden. Man erhält
so die gebrauchsfertige Emulsion. Man kann auch den Indikator getrennt von der Emulsion in Form einer
Lösung aufbewahren und erst vor der jeweiligen Lipasebestimmung der Emulsion zufügen. Diese Ausführungsform
des Mittels nach der Erfindung ist bevorzugt, wenn eine lange Haltbarkeit erforderlich ist.
Insbesondere günstig ist es. die Öl/Wasser-Emulsion
in der jeweils für eine Lipasebestimmung erforderlichen Menge in einem geeigneten Behälter, vorzugsweise in
einer Kunststoffküvette mit insbesondere rechteckiger Grundfläche, abzufüllen. Gegebenenfalls kann auch
hierbei der erforderliche Indikator getrennt von der Emulsion in einer gesonderten Lösung bereitgestellt
werden. Die abgefüllte Menge der Emulsion wird hierbei so bemessen, daß sie für eine Lipasebestimmung
ausreicht. Zum Beispiel werden in dieser Ausführungsform jeweils 1 oder 2 ml Emulsion in die Küvette
abgefüllt. In der gegebenenfalls von der Emulsion getrennten Indikatorlösung wird die Konzentration des
Indikators zweckmäßigerweise so eingestellt, daß ein einfach abzumessender aliquoter Teil, beispielsweise ein
Tropfen, der Indikatorlösung der vorab bereitgestellten
Öl/Wasser-Emulsion, z. B. in der Kunststoffküvette, für eine Bestimmung zugefügt wird. Eine Öl/Wasser-Emulsion,
die den Indikator enthält, ist etwa 4 Wochen haltbar, wobei sich ein Umschütteln der Emulsion vor
dem Gebrauch empfiehlt.
Das Verfahren zur Lipasebestimmung mit dem Mittel nach der Erfindung wird durchgeführt, indem das
vorstehend beschriebene Mittel mit der zu untersuchenden lipasehaltigen Probe vereinigt wird und die
während der Inkubationszeit eingetretene Farbänderung des Indikators bestimmt wird. Man gibt hierzu ein
kleines abgemessenes Volumen, vorzugsweise 0.1 ml, der zu untersuchenden Körperflüssigkeit, z, B. des
Serums bzw. Plasmas, in ein abgemessenes Volumen, z. B. 1 ml, der gebrauchsfertigen Emulsion. Hierauf wird
wie üblich durchgemischt und die Farbänderung gemessen. Die Farbänderung kann durch Vergleich des
jeweiligen Farbtons der Mischung mit dem entsprechenden Farbton auf einer geeichten Farbskala oder
einem geeichten Farbband gemessen werden. Hierzu wird z. B. die auf der Farbskala bzw. dem Farbband
abgelesene Eichzahl für den Farbton, der unmittelbar nach Zugabe der Probe zu der Emulsion vorliegt.
aufgezeichnet. Anschließend läßt man den Ansatz für eine bestimmte Inkubationszeit, z. B. 1 Stunde lang,
ds vorzugsweise bei einer Standardtemperatur, z. B.
Zimmertemperatur oder 37CC, stehen und liest erneut die dem jetzt entstandenden Farbton zugeordnete Zahl
auf der geeichten Farbskala bzw. dem geeichten
Farbband ab. Die Differenz ergibt den Lipasegehalt in den der Farbskala- bzw. Farbbandeichung zugrunde
liegenden Einheiten.
Eine bei der Messung verwendete geeichte Farbskala bzw. ein geeichtes Farbband kann, wie im französischen
Patent 15 16 492 beschrieben, hergestellt werden. Für die Eichung der Skala bzw. des Bandes wird der
Zeitabschnitt zugrunde gelegt, der bei der nachfolgenden Lipasebestimmung für die Inkubation angewandt
wird, z. B. 1 Stunde.
Das Verfahren nach der Erfindung kann auch so ausgeführt werden, daß die Farbänderung durch
Vergleich der untersuchten Proben untereinander nach der Inkubationszeit von z. B. einer Stunde bestimmt
wird. Bei dieser Methode wird der — nach der Inkubationszeit nahezu unveränderte — Farbton von
Proben mit normalem Lipasegehalt als Standard benutzt. Diese Durchführung der Lipasebestimmung
nach der Erfindung ist insbesondere für Serienanalysen geeignet, da meist über 90% der in den Kliniken
untersuchten Blutseren normalen Lipasegehalt aufweisen und damit als Standard dienen können. Die wenigen
Proben mit pathologisch erhöhtem Lipasegehalt erkennt man dann an einem nach der Inkubationszeit von
der nahezu unveränderten Farbe der Mehrzahl der untersuchten Proben abweichenden Farbton. Bei
Verwendung der Indikatoren m-Kresolpurpur oder p-Xylenolsulphophthalein zeigen die pathologischen
Proben eine hellbraune bis hellgelbe Farbe. Sofern eine genauere Bestimmung erforderlich ist, können die als
pathologisch erkannten Proben nochmals durch Vergleich mit dem geeichten Farbband bzw. der geeichten
Farbskala genauer gemessen werden.
Im folgenden werden weitere Beispiele für das Mittel
nach der vorliegenden Erfindung gegeben.
Zu 480 ml Wasser werden im Mischgerät bei hoher Drehzahl 30 mg Äthylquecksilberthiosalicylat und
90 mg Gummi arabicum zugefügt.
Anschließend wird die Mischung durch Zusatz von 2 N-wäßriger Natronlauge auf pH 10 eingestellt. Hierauf
wird zentrifugiert und der Überstand zur Entfernung von Verunreinigungen durch einen Wattebausch filtriert.
Das Filtrat wird danach im Mischgerät bei hoher Drehzahl mit 120 ml Olivenöl (gereinigt über basischem
Aluminiumoxid) versetzt.
Anschließend wird erneut 5 Minuten gemischt und mit 600 mg m-Kresolpurpur, gelöst in 60 ml 0,1 N-Natronlauge, versetzt
Durch Zusatz verdünnter Säure, z.B. verdünnter Salzsäure, wird das pH der Mischung auf 8.8 (Farbe:
braunstichiges Violett) eingestellt
Die so hergestellte Emulsion wird entweder direkt zur Lipasebestimmung eingesetzt oder vorteilhafterweise maschinell zu je 1 ml in verschließbare Kunststoffküvetten abgefüllt. Der Inhalt einer Kunststoffküvette wird dann jeweils für eine Lipasebestimmung
verwendet.
60 Beispiel 2
Eine Emulsion wird analog der Vorschrift im Beispiel 1 hergestellt jedoch wird kein Indikator zugesetzt und
das pH auf 7,0 eingestellt Getrennt von der in Küvetten
zu je 2 ml abgefüllten Emulsion werden eine 1%ige Lösung von m-Kresolpurpur in 0,055 N-Natronlauge.
eine 0.02 N-Natronlauge und eine 0,02 N-Salzsäurelösung bereitgestellt. Die 0.02 N-Natronlauge bzw. Salz
säure kann zur Regulierung eines nach längerer Lagerzeit veränderten pH der Emulsion verwendet
werden.
In Analogie zu Beispiel 1 wird aus folgenden Komponenten eine gebrauchsfertige Emulsion hergestellt:
80 ml Wasser
20 mg Natriumjodacetat
10g Gummi arabicum
0.2 g Agar
15 ml Olivenöl
20 mg Natriumjodacetat
10g Gummi arabicum
0.2 g Agar
15 ml Olivenöl
80 mg p-Xylenolsulphophthalein
Die Farbe der Emulsion wird auf ein braunstichiges Blau durch Zugabe von verdünnter Natronlauge bzw. Salzsäure eingestellt.
Die Farbe der Emulsion wird auf ein braunstichiges Blau durch Zugabe von verdünnter Natronlauge bzw. Salzsäure eingestellt.
Das so hergestellte Mittel kann, wie in Beispiel A beschrieben, zur Lipasebestimmung eingesetzt werden.
Analog Beispiel 3 wird eine Emulsion, jedoch ohne Indikator, hergestellt, deren pH auf 7,0 eingestellt wird.
Getrennt von der Emulsion stellt man eine 1%ige Lösung von p-Xylenolsulphophthalein in 0.055 N-Natronlauge
bereit sowie eine 0,02 N-Lösung von Natronlauge und eine 0,02 N-Salzsäurelösung.
Die folgenden Beispiele beschreiben die nähere Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung.
Man gibt 0,1 ml Serum in die mit 1 ml der nach Beispiel 1 hergestellten Emulsion gefüllte Küvette. Die
Mischung wird geschüttelt. Anschließend wird der entstandene Farbton mit einer geeichten Farbskala
verglichen. Die auf der Skala dem Farbton zugeordnete Zahl, z.B. 150, wird abgelesen. Anschließend läßt man
die Probe 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen und erhält durch Vergleich des entstandenen Farbtons mit
demselben Farbton auf der geeichten Farbskala die Zahl 350. Der Lipasegehalt der gemessenen Probe ist dann
200 mU/ml.
Dasselbe Ergebnis erhält man, wenn die gebrauchsfertige Emulsion nach dem Beispiel 3 eingesetzt wird.
In einer Wiederholung der vorstehend beschriebenen Messungen werden die Proben nach Bestimmung des
Ausgangsfarbtons 20 Minuten bei 37°C stehengelassen. Der hierbei bestimmte Lipasegehalt ist derselbe wie der
oben erhaltene.
In einer Serienuntersuchung werden jeweils 0,1 ml
Serum mit 1 ml der nach den Beispielen 1 und 3 hergestellten Emulsionen gemischt und anschließend 1
Stunde stehengelassen. In der Mehrzahl der Proben ist
der bräunlich-violette bzw. bräunlich-blaue Farbton gegenüber dem Ausgangsfarbton kaum verändert. Die
Seren mit pathologisch erhöhtem Lipasegehalt zeigen eine braune bis gelbe bzw. eine schmutzig-grüne bis
gelbe Farbe. Der genaue Lipasegehalt kann in diesen pathologischen Seren entsprechend Beispiel A exakt
bestimmt werden.
0,2 ml der nach Beispiel 2 vorbereiteten Indikatorlösung werden zu 2 ml der Emulsion von Beispiel 2
gegeben. Anschließend wird gemischt wobei normalerweise der pH-Indikator die gewünschte Farbe (braunsti-
609639/73
chiges Violen) zeigt. Wenn das pH der Emulsion, z. B.
infolge langer Lagerzeiten, nicht mehr den gewünschten Wert hat, gibt man einige Tropfen 0,02 N-Natronlauge
bzw. Salzsäure hinzu, bis der gewünschte braunstichige violette Farbton erreicht ist.
Analog bereitet man eine gebrauchsfertige Emulsion mit dem Indikator von Beispiel 4. Die gegebenenfalls
erforderliche Korrektor des pH einer langer gelagertei
Emulsion erfolgt durch Zugabe der 0,02 N-Natronlaugi
bzw. Salzsäure, bis ein blauer Farbton erreicht ist.
Zu den gebrauchsfertigen Emulsionen gibt mai jeweils 0,2 ml Serum hinzu, schüttelt um und mißt dei
Lipasegehalt, wie in den Beispielen A und B bcschriebei ist.
Claims (5)
1. Mittel zur Lipasebestimmung in Körperflüssigkeiten mit wäßrigen Fett- bzw. ölemulsionen und
pH-Farbindikatoren, dadurch gekennzeichnet, daß als Farbindikator m-Kresolpurpur
und/oder p-Xylenolsulphophthalein enthalten ist.
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß neben einem der genannten Indikatoren ein
weiterer Indikator enthalten ist.
3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein emulsionssiabilisierender
Zusatz, insbesondere Gummi arabicum, enthalten ist.
4. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als emulsionsstabilisierender
Zusatz quecksilberorganische Verbindungen enthalten sind.
5. Verfahren zur Lipasebestimmung mit wäßrigen Fett- bzw. ölemulsionen und pH-Farbindikatoren,
dadurch gekennzeichnet, daß man der zu untersuchenden Probe das Mittel nach den Ansprüchen 1 bis
3 zusetzt Ui-J die während der Inkubationszeit
eingetretene Farbänderung bestimmt.
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