DE1197250B - Diagnostische Tablette zur Bestimmung von Albumin - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. (X:

GOIn

Deutsche Kl.: 421-3/54

Nummer: 1197 250

Aktenzeichen: M 33875IX b/421

Anmeldetag: 11. April 1957

Auslegetag: 22. Juli 1965

Die Erfindung bezieht sich auf eine diagnostische Tablette zur Bestimmung von Albumin in wäßrigen Körperflüssigkeiten, z. B. in Urin.

Die Gegenwart von Albumin in Urin kann ein Anzeichen für einen kranken oder traumatischen Zustand darstellen, so daß ein einfacher und schneller Nachweis von Albumin sehr wichtig ist.

Zur Bestimmung von Eiweißsubstanzen sind bereits zahlreiche analytische Methoden bekannt, die auf kolorimetrischen und elektrophoretischen Verfahren sowie auf Trübungs- bzw. Ausfalkeaktionen beruhen. In diese Gruppe gehören auch verschiedenartige Tüpfelreaktionen, lichtelektrisch ausgewertete Xanthoproteinreaktionen sowie die Anfärbung mikroskopischer Schnitte fester Eiweißkörper. Zu erwähnen sind auch die bekannten Biuret-Reaktionen und ihre Modifikationen nach K. Hindsberg und J. G1 e i s s. Ferner die Xanthoproteinreaktion und ihre Modifikation nach F. Duensing sowie die Nachweisreaktion mit Tetrabromphenolphthaleinäthy- !ester.

Auch Trockenreagentien von Eiweiß bzw. Albumin sind bekannt, doch wurde hierfür im allgemeinen ein so stark alkalisches Medium verwendet, daß es für die Zwecke der vorliegenden Erfindung nicht geeignet wäre. Auch ein Nachweisverfahren auf der Basis von Peroxyd eignet sich nicht für eine diagnostische Tablette zur Bestimmung von Albumin in wäßrigen Flüssigkeiten. Die Verwendung von Sulfosalicylsäure beim Eiweißnachweis ist bekannt, ebenso die Tatsache, daß bestimmte »Säurebasen-Indikatoren« sich an einer Grenzschicht von Luft — Wasser in verschiedener Weise verhalten, wobei diese Erscheinungen jedoch wegen einer unterschiedlichen Färbung des Indikators als Schwierigkeiten angesehen wurden. Die Schaumbildung bzw. Zusammenballung von Albumin durch CO₂ ist in diesem Zusammenhang mit basischen Lösungen beschrieben worden, die mit Luft oder anderen Gasen geschüttelt werden mußten oder bei denen diese Gase durch die Lösung hindurchgeschickt wurden.

Am häufigsten wurden bis jetzt zur Bestimmung von Albumin in Urin in der klinischen Praxis folgende qualitative Untersuchungsmethoden angewendet:

45 Erhitzen einer abgemessenen Menge Urin, worauf eine äquivalente Menge Essigsäure zugegeben wird; eine Trübung zeigt einen positiven Ausfall des Tests an.

Hellers-Test, wobei konzentrierte Salpetersäure in ein Reagenzglas gegeben und mit einer kleinen Menge Urin überschichtet wird. Ein trüber Ring Diagnostische Tablette zur Bestimmung
von Albumin

Anmelder:

Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind. (V. St. A.) Vertreter:

Dr.-Ing. F. Wuesthoff, Dipl.-Ing. G. Puls und
Dipl.-Chem. Dr. rer. nat. E. Frhr. v. Pechmann,
Patentanwälte, München 9, Schweigerstr. 2

Als Erfinder benannt:

Richard Spencer Nicholls,

Dale Edwin Fonner, Elkhart, Ind.;

Paul William Gerding, Fort Wayne, Ind.

(V. St. A.)

Beanspruchte Priorität:

V. St. v. Amerika vom 12. April 1956

an der Verbindungsstelle der zwei Flüssigkeiten zeigt eine positive Probe an.

SuIfosalicylsäuretest, bei dem 4 bis 5 ml Urin in ein Reagenzglas und dann zwei bis drei Tropfen einer wäßrigen Lösung von Sulfosalicylsäure zugegeben werden. Eine Trübung zeigt einen positiven Ausfall der Probe an.

Pikrinsäuretest, wobei eine abgemessene Menge Urin in einem Reagenzglas mit einer äquivalenten Menge einer gesättigten Pikrinsäurelösung versetzt wird. Trübung der Lösung ergibt einen positiven Ausfall der Probe.

Demgegenüber besteht die diagnostische Tablette zur Bestimmung von Albumin in wäßriger Flüssigkeit unter Verwendung einer für trockendiagnostische Massen üblichen mechanischen Wirkstoff komponente erfindungsgemäß darin, daß sie ein an sich bekanntes Protein ausfällendes Metallsalz, einen Farbstoff, der eine Bindungsfähigkeit zu dem ausgefällten Protein aufweist und einen Farbwechsel innerhalb des pH-Bereichs ergibt, in dem das Protein ausgefällt wurde, sowie eine stark organische wasserlösliche Säure und ein Alkalicarbonat oder -bicarbonat zur Erzeugung eines Schaums in Gegenwart der Flüssigkeit zur Zusammenballung des an der Tablettenoberfläche ausgeschiedenen Proteins enthält.

509 627/249

Der Albuminnachweis kann mit Hilfe der erfindungsgemäßen Tablette auch von ungeübten Leuten vorgenommen werden, so daß man leicht Reihenuntersuchungen zur Bestimmung des Urins in großem Umfang durchführen kann.

Die Tablette zeigt die Konzentration des Albumins im Urin bereits an, wenn nur ein oder zwei Tropfen auf die Tablette gegeben werden.

Als proteinausfällendes Mittel eignen sich Metallsalze, wie Bleinitrat, Zinksulfat, Bariumchlorid, Aluminiumsulfat und Aluminiumchlorid.

Als Schaum entwickelnde Komponente dient eine starke, feste, wasserlösliche organische Säure wie die Sulfosalicyl- oder Pikrinsäure, ferner z. B. die Malein-, Wein-, Zitronen-, Itacon- und eine Sulfonamidsäure zusammen mit einem Alkalicarbonat oder -bicarbonat. Diese Komponente bewirkt in wäßrigem Medium die Entwicklung von Kohlendioxyd.

Der dritte Bestandteil ist ein Farbstoff, der aus einem oder mehreren Farbstoffen bestehen kann, von denen wenigstens einer zu dem Protein, das aus der Lösung ausgefällt wurde, eine solche Bindungsfähigkeit hat, daß er von dem ausgefällten Protein adsorbiert wird. Neben der Bindungsfähigkeit zu dem ausgefällten Protein müssen ein oder mehrere der Farbstoffe einen Farbwechsel innerhalb des pH-Bereichs ergeben, in dem das Albumin ausfällt.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Die Mengen sind in Gewichtsteilen angegeben.

Beispiel

IV

Sulfonamidsäure

SuIf osalicylsäure

Natriumtetrametaphosphat

Natriumbicarbonat

Calciumsulfat

External D & C Gelb Nr. 1

Kristallviolett

Basisches Fuchsin

Brilliantgrün

15
7
6

0,8
3

0,020

Beispiel

VI

VII

VIII

Zitronensäure, wasserfrei

Sulfosalicylsäure, wasserfrei

Calciumsulfat

Borsäure

Natriumbicarbonat

Natriumtetrametaphosphat

Sulfonamidsäure

Brilliantgrün

FDC Violett Nr. 1

p-(p-Anilinphenylazo)

Benzolsulfonsäure Na-SaIz

Kristallviolett 1

Ein vorzugsweise zu verwendendes Gemisch und dessen Variationen sind im folgenden beschrieben, wobei das Ausmaß der erlaubten Abänderungen bei verschiedenen Bestandteilen bis zu dem Punkt angegeben ist, bei dem sogar das Weglassen gewisser Bestandteile möglich ist.

Beispiel IX

Abänderung

Zitronensäure 17 0 bis 20

Sulfosalicylsäure 6,8 5 bis 40

Calciumsulfat 3 0 bis 8

Tartrazin 0,005 0 bis 0,010

Brilliantgrün 0,015 0,010 bis 0,030

Natriumbicarbonat 0,8 0,6 bis 1,0

Borsäure 2,4 0 bis 8

Natriumhexametaphosphat 6 2 bis 10

Bei allen vorhergehenden Beispielen wurde die Ausfällung des Proteins unterhalb des isoelektrischen

65 15
7
3

2,4
0,8

0,03

15
7
3

2,4
0,8

0,03
0,03

15
7
3

2,4
0,8
6

0,025

7
3

2,4
0,8
6
15

0,015

Punktes vorgenommen. Insbesondere sind Sulfosalicylsäure, Pikrinsäure, Natriumtetrametaphosphat und Natriumhexametaphosphat Beispiele für Substanzen, die Protein unterhalb des isoelektrischen Punktes ausfällen. Das Natriumtetrametaphosphat und -hexametaphosphat erfordert zusätzlich eine Säure, wie Zitronensäure oder Sulfonamidsäure. Wenn man das Albumin unterhalb seines isoelektrischen Punktes ausfällt, sollte die Reaktionsmischung einen pH-Wert von nicht höher als 3 aufweisen, und infolgedessen muß die Farbstoffkomponente einen Farbwechsel von der basischen zur sauren Farbverbindung bei oder unterhalb eines pH-Werts 3 aufweisen. In der Praxis scheint der optimale pH-Wert zur Ausfällung im Bereich von 2,0 bis 2,5 zu liegen.

Wie bei der vorhergehenden allgemeinen Erörterung gezeigt wurde, können nicht alle Farbstoffe, die unterhalb des pH-Werts 3 ihre Farbe wechseln, in der Farbstoffkomponente verwendet werden. Wenn man mehr als einen Farbstoff verwendet, muß wenigstens einer eine Bindungsfähigkeit für Proteine und eine

genügende Färbekraft aufweisen, um den Farbwechsel genau genug zum leichten und bestimmten Ablesen zu gestalten. Farbstoffe, die diese erwünschten Eigenschaften besitzen, sind Brilliantgrün (Sulfat von Tetraäthyldiaminotriphenylmethan), Kristallviolett (Hexamethyl-p-rosanilinchlorid), Kresolrot (o-Kresolsulfonphthalein), p-(p-anilinphenylazo)-benzolsulfonsaures Natriumsalz, Malachitgrün (Zinkdoppeloxalat von Tetramethyl-p-aminotriphenylcarbinol), m-(p-anilinphenylazo)-benzolsulfonsaures Natriumsalz, Brilliant- ίο blau (Dinatriumsalz von 4-([4-N-Äthyl-p-sulf o-benzylamino)-phenyl] - (2 - sulfoniumphenyl) - methylen) - [1 (N-äthyl-N-p-sulfobenzyl-zl ^2>5-cyclohexadienimin], FD & C Violett Nr. 1, (Mononatriumsalz von 4-[C4-CN-Äthyl-p-sulfonbenzylamino)]-phenyl)-(4-N-äthyl- p-s ulfonium- benzylamino) -phenyl)] - methylen (N₅N-dimethyl-Delta²'⁵-cyclohexadienimin) Tartrazin (Trinatriumsalz von S-Carboxy-S-hydroxy-l-p-sulfophenyl-4-p-sulfophenylazopyrazol). Metanilgelb (Mononatriumsalz von 4-m-Sulfonphenylazodiphenylamin) und basisches Fuchsin (eine Mischung von Rosanilin- und p-Rosanilin-Hydrochloriden) sind Beispiele für Farbstoffe, die von dem ausgefällten Protein adsorbiert werden, die aber wegen ihrer schwachen Färbekraft zu einem schwerer erkennbaren Ergebnis führen.

Im Beispiel IX fällen Sulfonsalicylsäure und Natriumhexametaphosphat sowohl getrennt als auch zusammen das Protein aus, wobei beim Hexametaphosphat die Säure eine genügende Azidität ergibt. Aus wirtschaftlichen Gründen wird auch die billigere Zitronensäure verwendet, um eine zusätzliche Azidität zu erzeugen, die sowohl für die Regulierung des pH-Werts beim Ausfällen des Proteins durch das Hexametaphosphat als auch für die Reaktion mit dem Natriumcarbonat zur Erzeugung des Schäumens notwendig ist. In diesem besonderen Ansatz ist Tartrazin nur enthalten, um den Farbuntergrund, d. h. die Farbtiefe, der Zubereitung zu modifizieren, wohingegen Brilliantgrün den Farbwechsel zum Ablesen des Ergebnisses der Probe ergibt. Calciumsulfat wird als Füllmittel und Borsäure als Gleitmittel verwendet, um das Tablettieren zu erleichtern.

Es hat sich gezeigt, daß zur Ausfällung eines Proteins oberhalb des isoelektrischen Punktes von Albumin, z. B. die wasserlöslichen Metallsalze, Bleinitrat, Zinksulfat, Bariumchlorid, Aluminiumsulfat und Aluminiumchlorid dienen. Charakteristische Ansätze, die andere verwendbare Zubereitungen wiedergeben, sind in den folgenden Beispielen in Gewichtsteilen angegeben.

	X	3 16	Be XI	ispiel XII	XIII
Zitronensäure	0,015 0,8 3	3	3 16	5 14
Natriumacetat	6	0,8 3	0,015 0,8 3
Methylrot (p-Dimethylamino-azobenzol-o-carboxyl- säure)				0,8 3
Natriumbicarbonat		0,015 6	6
Borsäure	16		0,015
Bleinitrat
Bromkresolgrün	6
Zinksulfat
Bariumchlorid
Aluminiumsulfat
Natriumeitrat

Beispiel

XV

XVI

XVII

Zitronensäure

Natriumbicarbonat

Natriumeitrat

Aluminiumsulfat

Borsäure

Natriumborat

4- (4 - Dimethylamine -1 -naphthazo - 3 - methoxybenzol-

sulf onsäure)

Resazurin-Diazoresorcinol

Lacmoid

C₆H₂(OH)₃-N= [C₆H₃(OH)₂I₂

Propylrot (Anthranilsäure-di-n-propylanilin) ....

0,8
14
6
3

0,02

0,8
10
6
3
6

0,015

0,8
10
6
3
7

0,015

0,8
9
6
3
11

0,015

Die aufgeführten Ansäzte sind Beispiele, bei denen Bromkresolgrün (Tetrabrom-m-kresol-sulfophthalein), Resazurin (»Diazoresorcinol«), Lacmoid (Heptahydroxytriphenylamin) und Propylrot (Anthranilsäuredi-n-propylanilin) getrennt als Indikatorfarbstoff verwendet werden, obgleich sich auch hier die erwähnte Möglichkeit ergibt, daß jeder dieser Farbstoffe in Verbindung mit anderen Farbstoffen benutzt werden kann, um eine Farbstoffkomponente zu ergeben. Im allgemeinen ergibt ein Farbstoff, der seine Farbe oberhalb von pH 6 ändert, insofern keinen Farbunterschied, als der pH-Wert 6 der höchste zu sein scheint, bei dem das

Verfahren und die Zubereitung brauchbare Ergebnisse liefern, wenn das Protein oberhalb seines isoelektrischen Punktes ausgefällt wird.

Auch bei diesen Zubereitungen, bei denen eine Ausfällung des Proteins oberhalb des isoelektrischen Punktes stattfindet, sind Variationen möglich. Im folgenden ist eine Zubereitung mit ihren möglichen Abänderungen jedes Bestandteils in Gewichtsteilen angegeben.

Beispiel XVIII

Zitronensäure 5

Bromkresolgrün 0,02

Aluminiumsulfat 6

Natriumbicarbonat 3

Natriumeitrat 14

IO

Abänderung

3 bis 7 0,01 bis 0,05

4 bis 10 2 bis 5

11 bis 18

Es ist also ersichtlich, daß die Ausfällung von Albumin sowohl unterhalb als auch oberhalb des *° isoelektrischen Punktes durchgeführt werden kann, ohne daß sich ein Unterschied in den Eigenschaften des Proteins beim Erhöhen des pH-Werts zu einem Punkt ergibt, der höher ist, als der der Flüssigkeit und der Tablette. In jedem Fall ist der Nachweis von Albumin mit der erfindungsgemäßen Zubereitung der gleiche: Ein oder zwei Tropfen der Urinprobe werden auf die Tablette gegeben. Das Natriumbicarbonat, mit dem die vorhandene Säure einen Schaum bildet, sieht Mittel vor für die Freisetzung der aktiven Bestandteile der Tablette und auch gesteuerte mechanische Mittel zur Isolierung des ausgefällten Proteins, das eine bestimmte Farbe im Falle des positiven Ausfalls der Probe besitzt. Durch das Schäumen an der Oberfläche der Tablette wird das ausgefällte Protein konzentriert und an der Oberfläche der Flüssigkeit isoliert. Offensichtlich fängt das Albumin im Augenblick seiner Ausfällung genügend Kohlendioxyd ein, so daß es an die Oberfläche steigt und dort bleibt. Andererseits geht im Falle eines negativen Ausfalls der Probe das Schäumen schneller vor sich, so daß innerhalb weniger Sekunden die an der Tablette verbleibende Flüssigkeit frei von Bläschen ist und natürlich dieselbe Farbe wie die ursprüngliche Lösung aufweist. Der letztere Effekt ist, auf die Flüssigkeit selbst angewandt, im Falle einer negativen und positiven Probe stets vorhanden. Im Falle des Ansatzes, der Brilliantgrün als Farbstoffkomponente enthält, ist der von der Tablette nach oben steigende Schaum blau, wobei die Menge und Intensität von der vorhandenen Albuminmenge abhängt. Die Tablette und die Flüssigkeit unterhalb des Schaums bleiben orangegelb, während der Schaum, falls vorhanden, im Falle eines negativen Ausfalls orangegelb ist. Mit Kristallviolett geht der Farbwechsel vom ursprünglichen Purpur zum Grün bei einem positiven Test, beim basischen Fuchsin ist der Farbwechsel Hellgelb zu einem leichten Rot, beim External D & C Gelb Nr. 1 von Violett zu Gelb. Bei jedem Farbstoff, der ausgewählt wurde, geht, wie es vorher beschrieben wurde, der Farbwechsel beim positiven Ausfall der Probe vom sauren Bereich zum basischen innerhalb des Intervalls der Zunahme des pH-Werts, der durch das ausgeschiedene Protein entsteht.

Obgleich die Erfindung in bezug auf die Urinanalyse beschrieben wurde, ist es ersichtlich, daß man den Anwendungsbereich des Verfahrens und der Zubereitung auf andere Körperflüssigkeiten ausdehnen kann.

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Diagnostische Tablette zur Bestimmung von Albumin in wäßrigen Körperflüssigkeiten unter Verwendung einer für trockene diagnostische Massen üblichen mechanischen Wirkstoffskomponente, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein an sich bekanntes proteinausfällendes Metallsalz, einen Farbstoff, der eine Bindungsfähigkeit zu dem ausgefällten Protein aufweist, und einen Farbwechsel innerhalb des pH-Bereichs ergibt, in dem das Protein ausgefällt wurde, sowie eine starke organische wasserlösliche Säure und ein Alkalicarbonat oder -bicarbonat zur Erzeugung eines Schaums in Gegenwart der Flüssigkeit zur Zusammenballung des an der Tablettenoberfläche ausgeschiedenen Proteins enthält.

2. Tablette nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie als proteinausfällendes Metallsalz Alkalimetaphosphat, Bleinitrat, Zinksulfat, Bariumchlorid, Aluminiumsulfat oder Aluminiumchlorid enthält.

3. Tablette nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie als starke, organische, wasserlösliche Säure Sulfosalicylsäure, Pikrinsäure, Maleinsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Itaconsäure oder Sulfonamidsäuren enthält.

In Betracht gezogene Druckschriften:

österreichische Patentschrift Nr. 68 346;

britische Patentschriften Nr. 575 612, 708 996;

USA-Patentschrift Nr. 2 314 336;

»Chimia«, Bd. 2, 1948, S. 25 bis 40;

Klinische Wochenschrift, Bd. 31, 1953, S. 153 bis 155;
Die Naturwissenschaften, Bd. 39, 1952 S. 451;

Zeitschrift für physikalische Chemie, Bd. 51,
S. 245; Bd. 52, 1905, S. 2, S. 26;

Medizinische Klinik, Bd. 44, 1949, S. 740 und 741; Mikrochimika Acta, Bd. 2, 1937, S. 107 bis 110; Medizinische Wochenschrift, Bd. 95, 1953, S. 102;

Kolthoff, »Säure-Basen-Indikatoren«,

4. Auflage, 132, S. 358 bis 360.

1905,

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