CH500487A

CH500487A - Proteintestmischung

Info

Publication number: CH500487A
Application number: CH1416266A
Authority: CH
Inventors: Lee Atkinson Roger; Lloyd Fader Marshall
Original assignee: Miles Lab
Priority date: 1965-10-01
Filing date: 1966-09-30
Publication date: 1970-12-15
Also published as: SE334758B; BE696319A; US3438737A; DE1598818A1; GB1150296A; FR1515793A

Description

Proteintestmischung
Vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine verbesserte Testmischung zum qualitativen Nachweis und zur quantitativen Bestimmung proteinhaltiger Stoffe in Flüssigkeiten, insbesondere auf Verfahren zum qualitativen Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Albuminen in biologischen Flüssigkeiten sowie auf der Verwendung der erfindungsgemässen Testmischung auf einem Träger zum Nachweis von Protein in Flüssigkeiten.

Die Bezeichnung Nachweis soll im folgenden sowohl die qualitative als auch quantitative Bestimmung eines besonderen Stoffes bedeuten.

Der Nachweis von wasserlöslichen proteinhaltigen Stoffen in verschiedenen Flüssigkeiten ist in vielen Fällen wichtig. Es ist z. B. bekannt, dass die Anwesenheit von Albumin im menschlichen Urin ein Anzeichen für Krankheit oder Trauma ist. Aus diesem Grunde gibt es zahlreiche Prüfmethoden auf solche Stoffe. Diese Prüfmethoden sind jedoch zumeist sehr langwierig und erfordern eine sehr beachtliche Laboratoriumsausrüstung sowie Instrumentation und Fachpersonal. Wenn dar über hinaus eine grosse Zahl solcher Prüfungen ausgeführt wird, ist zur Ermittlung der Ergebnisse in einer angemessenen Zeit bei den bisherigen Verfahren zur Durchführung der zahlreich zu handhabenden Schritte ein entsprechend grosser Stab von Laboranten erforderlich.

Um diesen Schwierigkeiten zu entgehen, wurden vor kurzem Prüfungsverfahren und Mischungen entwickelt, für die keine Fachkräfte und ein Minimum an Geräten benötigt werden. Die Prüfungsverfahren basieren üblicherweise auf dem Phänomen des sogenannten Proteinfehlereffekts , den gewisse chromogene Indikatoren aufweisen, wobei solche Indikatoren in Gegenwart von Proteinen einer Farbänderung bei einem pH-Wert unterliegen, der von dem pH-Wert verschieden ist, bei dem die Indikatoren bei Abwesenheit von Proteinen umschlagen. Das heisst ein Indikator, der den Proteinfehlereffekt aufweist, zeigt in einer Protein enthaltenden Lösung einen höheren oder niedrigeren pH-Wert an, als-es tatsächlich der Fall ist, wobei das Ausmass, in dem der Umschlagspunkt des Indikators verschoben wird, dem Proteingehalt der Lösung entspricht.

Auf der Grundlage des Proteinfehlereffekts wurden Testmischungen und Testmittel hergestellt, die im wesentlichen einen den Proteinfehlereffekt aufweisenden chromogenen Indikator enthielten und darüber hinaus einen Puffer, der in der Lage ist, die unmittelbare Umgebung des Indikators bei einem spezifischen pH-Wert zu halten. Dieser pH-Wert muss bei einem Wert in der Nähe aber ausserhalb dem Bereich, in dem der Farbumschlag bei einer pH-Änderung normalerweise erfolgt, gehalten werden. Tritt z. B. der Umschlag des Indikators normalerweise in einen pH-Bereich von 3,0 bis 4,5 auf, so wird bei Einbringen der Proteintestmischung der Indikator nach der bisherigen Verfahrensweise gewöhnlich auf einen pH-Wert von 3,0 oder niedriger gepuffert.

Um ein leicht zu handhabendes Testmittel herzustellen, das bei Lagerung stabil bleibt und wirtschaftlich in der Herstellung und Verwendung ist, werden solche Testmischungen vorzugsweise in und/oder auf einen Trägerkörper einverleibt. Dieser Träger ist gewöhnlich ein absorbierender oder Flüssigkeit aufsaugender Stoff, wie Filterpapier, Holz, faseriges synthetisches Material oder dergleichen. Der Träger kann mit der Testmischung imprägniert oder beschichtet werden, und die Kombination aus Testmischung und Träger kann allein oder auf einem zusätzlichen Träger angewendet werden.

Bei Anwendung der bekannten Testmischungen und Verfahren zur Bestimmung von Protein in Flüssigkeiten ist die Genauigkeit der Proteinbestimmung ziemlich begrenzt, weil maximale Empfindlichkeit für den einzelnen Indikator nicht erreicht wird, die Faben blass sind und die vorhandene Proteinmenge visuell schwer zu beurteilen ist. Dieses ist besonders dann der Fall, wenn ein Flüssigkeit aufsaugender Träger verwendet wird und wenn der Träger aus wirtschaftlichen Gründen und wegen der leichten Herstellung sehr dünn gehalten wird und die darin enthaltene Menge an Testmischung begrenzt ist. Darüber hinaus tritt hierbei mehr ein Wechsel der Farbsättigung als des Farbtons auf, wodurch die Bestimmung schwierig wird.

Die in der vorliegenden Beschreibung verwendete Terminologie der Farbe sei wie folgt definiert: Als Grundfarbton wird diejenige Eigenschaft einer bestimmten Farbe bezeichnet, die zur Benennung wie rot oder blau führt. Wechselt z. B. eine Farbe von Gelb nach Grün, so sagt man, sie wechselt im Grundfarbton. Die Sättigung wird in Prozenten eines bestimmten Grundfarbtons in einer Farbe ausgedrückt. Ein Wechsel von z. B. Blassblau nach Tiefbau ist ein Wechsel in der Farbsättigung.

Ziel vorliegender Erfindung ist eine höchstempfindliche Testmischung zur Bestimmung von proteinhaltigen Stoffen in Flüssigkeiten, die einen schnellen Farbumschlag bei Anwesenheit von proteinhaltigen Stoffen zeigt und einen ausgeprägten Farbtonwechsel aufweist, der die in der Flüssigkeit vorliegende Menge an Protein wiedergibt. Ein weiteres Ziel war darüber hinaus eine Ausführungsform, bei der die Testmischung einem Flüssigkeit aufsaugenden Träger einverleibt ist.

Es wurde gefunden, dass die oben erwähnten Ziele erreicht werden können, indem man den pH-Wert der Testmischung innerhalb des Umschlagsbereichs und vorzugsweise bei einem Wert in der Nähe des Umschlagspunktes, bei dem der chromogene Indikator normalerweise einen Wechsel bzw. Farbumschlag auf eine pH Änderung zeigt, einstellt und nicht auf einen Wert ausserhalb dieses Bereiches. Dieses ist überraschend und neu, da in der bisherigen Praxis eine völlig andere Auffassung über die pH-Einstellung vorliegt. So heisst es z. B., dass bei einem wirksamen Proteintest der chromogene Indikator, der den Proteinfehlereffekt aufweist, auf einen pH-Wert eingestellt bzw. gepuffert werden muss, der ausserhalb des pH-Bereiches seines normalen Farbumschlags liegt.

Durch Puffern des pH-Wertes der Testmischung auf einen Wert innerhalb, vorzugsweise in der Nähe des Mittelwertes des normalen Farbumschlagbereichs des mit dem Proteinfehlereffekt behafteten chromogenen Indikators wird eine höchstempfindliche, schnell farbumschlagende Proteintestmischung erhalten. Schlägt z. B.

der chromogene Indikator normalerweise bei einer pH linderung im Bereich von 3,0 bis 4,5 um, so wird der pH-Wert der Testmischung vorzugsweise auf einen Wert von etwa 3,5 bis 4,0 gepuffert.

Es sei an dieser Stelle erwähnt, dass tatsächliche chromogene pH-Umschlagsbereiche gewisser Indikatoren in Abhängigkeit von verwendeten Lösungsmittelsystemen, Beleuchtungsbedingungen, Indikatoreinheit, subjektive Wahrnehmung der Farbumschläge, Konzentrationen, Salzeffekt des Puffers, Zusätzen wie oberflächenaktiven Mitteln usw. erheblich variieren können.

Der hier für einen Indikator verwendete und genannte normale pH-Umschlagsbereich kann daher wesentlich von denjenigen anderer Bearbeiter abweichen. Dieses bedeutet nicht, dass ein Indikatorsystem bei Abweichung von den vorliegend angegebenen Bereichen aus dem Bereich vorliegender Erfindung herausfällt. Es ist lediglich massgebend, dass die festgelegten Bereiche durch Einhalten der genannten besonderen Testbedingungen und Indikatoreigenschaften erhalten werden. Der für einen Indikator normale pH-Umschlagsbereich kann somit als derjenige pH-Bereich definiert werden, in dem die Indikatorsubstanz unter Berücksichtigung der angegebenen Testparameter von einem Grundfarbton im sauren Bereich zu einem anderen Grundfarbton im basischen Bereich umschlägt.

Die Bezeichnung Grundfarbton bedeutet, dass bei Zusetzen von mehr Säure oder Base zu einer spezifischen Lösung des Indikators der Farbton sich nicht ändert. Die Bezeichnung Farbton im sauren Bereich bedeutet denjenigen durch den Indikator erzeugten Farbton, wenn der pH-Wert einer Lösung des Indikators bei einem pH gehalten wird, dessen Wert niedriger ist als der Umschlagsbereich des Indikators.

Die Bezeichnung Farbton im basischen Bereich bedeutet denjenigen durch den Indikator erzeugten Farbton, wenn der pH-Wert einer Lösung des Indikators bei einem pH gehalten wird, dessen Wert höher ist als der Umschlagsbereich des Indikators. Diese Definitionen sind anwendbar ohne Rücksicht darauf, ob der besagte pH-Wert über oder unter pH=7 liegt. Ist z. B. die Indikatorlösung auf einen pH-Wert, der im basischen Bereich des Indikators liegt, eingestellt, so tritt ein basischer Farbton auch im pH-Bereich von weniger als 7 auf.

Weiterhin wurde gefunden, dass es vorteilhaft ist, der erfindungsgemässen Testmischung eine einen Grundfarbton erzeugende Substanz zuzusetzen. Wie noch ausgeführt wird, besitzt diese Substanz zwei Aufgaben, d. h. sie bewirkt ein Überdecken irgend welcher leichter Farbänderungseffekte, die wegen der erneuten Pufferung des Indikators auf einen innerhalb seines Umschlagsbereiches liegenden pH-Wert auftreten können, und sie ermöglicht eine genauere Bestimmung der in der zu prüfenden Lösung vorhandenen Proteinmenge.

Zusatzfarbstoffe sind in den bisherigen Verfahren verwendet worden, ihre Anwendung und Aufgabe diente jedoch anderen Zielen. Gewisse Testmischungen weisen z. B. ein vor der Umsetzung unansehnliches Aussehen auf und/oder neigen bei Alterung zur Zersetzung und Entfärbung. In diesen Fällen erhält man bei Anwendung eines Zusatzfarbstoffs ein besseres Ausgangsprodukt und/oder das anfängliche Aussehen des Produktes wird über lange Zeit hinaus beibehalten. Es sollte jedoch beachtet werden, dass diese Verwendung eines zusätzlichen Farbstoffs völlig verschieden ist von derjenigen in den gemäss vorliegender Erfindung verwendeten Mischungen.

Die erfindungsgemässe Testmischung ist nun dadurch gekennzeichnet, dass sie einen auf pH-ilnderun- gen ansprechenden chromogenen Indikator enthält, der in Gegenwart von Protein eine Farbveränderung erleidet und einen konstanten Grundfarbton im sauren und einen davon verschiedenen konstanten Grundfarbton im basischen Bereich hat, weiterhin einen Puffer, der den pH-Wert der Mischung in einem Bereich abpuffert, in dem der chromogene Indikator bei einer pH-Änderung anspricht und das Vorliegen von Protein durch einen Farbumschlag oder -übergang nach einem der jeweiligen Farbtöne anzeigt, und darüber hinaus eine einen Grundfarbton gebende Substanz, die denselben Farbton wie der chromogene Indikator hat, bevor er auf Protein anspricht.

Wie bereits erwähnt, ist der chromogene Indikator, der auf Vorliegen von Protein empfindlich ist, d. h. der Proteinfehlereffekte aufweisende chromogene Indikator, im wesentlichen ein pH-Indikator. Dieser chromogene Indikator kann demnach irgendeine pH-empfindliche Substanz sein, die das sogenannte Proteinfehlereffektphänomen besitzt. Es sei bemerkt, dass in der erfindungsgemässen Testmischung alkalische sowie saure pH Indikatoren verwendet werden können. Das heisst der individuelle pH-Bereich, in dem der chromogene Indi kator normalerweise anspricht, kann unter oder über einem pH-Wert von 7 liegen. Darüber hinaus kann entsprechend vorhandenem Protein in der zu testenden Lösung die jeweilige Richtung der pH-Verschiebung von der Säure zur Base oder in Richtung von der Base zur Säure sein.

Zu den das Proteinfehlereffektphänomen aufweisenden chromogenen Substanzen zählen zum Beispiel Tetrabromphenolblau, Bromkresolgrün, Methylgelb, Kongorot, Bromthymolblau, Thymolblau, Bromphenolblau, Tetrabromphenolphthaleinäthyl- und -butylester, Methylviolett 5 B, Natriumalizarinsulfonat, Alizarin, Bromkresolpurpur, o-Kresolsulfonphthalein oder dergleichen.

Da gute, feste sowie saure Puffersubstanzen erhältlich sind, werden diejenigen chromogenen Indikatoren bevorzugt, die im sauren pH-Bereich ansprechen. Für die erfindungsgemässe Testmischung eignen sich wegen ihrer Empfindlichkeit auf Protein hierfür vorzugsweise Indikatoren, wie Tetrabromphenolblau und Tetrabromphenolphthaleinäthylester.

In der Praxis kann der Indikator entweder als freie Base oder in Form seines Salzes angewendet werden und gemäss vorliegender Erfindung schliesst die basische Form des Indikators irgendeine Form ihres Salzes mit ein. Ist es wünschenswert, die Testmischung in einem wässerigen System zu benutzen, so kann wegen ihrer erhöhten Wasserlöslichkeit die Salzform des Indikators benutzt werden. Werden jedoch Teststreifen mit einer Lösung der Testmischung angefertigt, dann kann es auf Grund der Flüchtigkeit des Lösungsmittels nützlich sein, in der Lösung Alkohol oder andere mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel und den Indikator in Form seiner freien Base zu verwenden. Die Wahl ist jedoch nicht kritisch und hängt von der gewählten Indikatorsubstanz sowie den Bedingungen des Testsystems ab.

Bei der Wahl eines Puffersystems für die vorliegende Mischung ist die Auswahl an chromogener Substanz ausschlaggebend für die Wahl des Puffers. Soll ein auf Säure ansprechender chromogener Stoff verwendet werden, so kann irgendeine geeignete, sauer reagierende Substanz als Puffer benutzt werden, sofern sie dazu befähigt ist, den pH-Wert auf den gewünschten Bereich innerhalb des normalen pH-Farbumschlagsbereichs des chromogenen Indikators einzustellen. Wo beispielsweise der verwendete Indikator Tetrabromphenolblau ist, der für gewöhnlich in einem pH-Bereich von 3,0 bis 4,6 chromogen anspricht, muss die Säure den pH-Wert der Mischung innerhalb dieses Bereichs puffern können.

Es wurde gefunden, dass der bevorzugte pH-Bereich für diesen Indikator bei etwa 3,4 bis 4,0 liegt und somit der benutzte Puffer den pH-Wert der Testmischung unter Verwendung von Tetrabromphenolblau in diesem bevorzugten Bereich einstellen können muss. Bei Verwendung des anderen bevorzugten Indikators Tetrabromphenolphthaleinäthylester, der einen normalen pH-Umschlagsbereich von etwa 3,7 bis 5,2 hat, muss das Puffersystem den pH-Wert der Testmischung innerhalb des für diesen Indikator bevorzugten pH-Bereichs, d. h. auf etwa 4,0 bis 4,8, einstellen können.

Es wurde gefunden, dass die folgenden Säuren zusammen mit ihren Salzen sowohl einzeln als auch in verschiedenen Kombinationen verwendet werden können: Zitronensäure, Weinsäure, Maleinsäure, Ascorbinsäure, Salicylsäure, Sulfosalicylsäure, Oxalsäure, Itakonsäure, Glukonsäure, Sulfaminsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure, Mandelsäure, Glutarsäure, Äpfelsäure, Phthalsäure, Borsäure, Phosphorsäure oder dergleichen. Es sei darauf hingewiesen, dass die Auswahl eines solchen Puffersystems vollkommen nach Belieben und entsprechend dem Bereich des Verfahrens vorgenommen wird und die verwendete Menge von der Säurestärke und dem chromogenen Indikator abhängt.

Bevorzugt verwendet wird ein Zitrat-Zitronensäure Puffer.

Wie erwähnt, enthält die Mischung gemäss vorliegender Erfindung ausserdem eine einen Grundfarbton gebende Substanz. Die Anwendung dieser Substanz hat zwei Aufgaben: (1) sie führt zur Unterdrückung oder Maskierung irgendwelcher schwacher Farbtonänderungen, die die Mischung, bevor sie mit einer Protein enthaltenden Lösung zusammenkommt, auf Grund dessen, dass der Indikator in dem Umschlagsbereich gepuffert wird, aufweist, und (2) ermöglicht sie einen Umschlag zu erhalten, der viel deutlicher in der Änderung des Farbtons als in der Änderung der Farbsättigung ist. Die Wahl für diese den Grundfarbton gebende Substanz hängt von dem einzelnen sauren und basischen Farbton des den Proteinfehlereffekt aufweisenden chromogenen Indikators ab.

Hiervon ausgehend, wurde gefunden, dass die den Grundfarbton liefernde Substanz vorzugsweise denselben Farbton haben sollte, wie ihn der Indikator vor dem Ansprechen auf Protein besitzt, und zusammen mit dem Farbton des Indikators bei Anzeige von Protein einen dritten von dem Farbton des Indikators abweichenden Farbton liefert. Wenn zum Beispiel die bevorzugten chromogenen Indikatoren Tetrabromphenolblau oder Tetrabromphenolphthaleinester verwendet werden, die auf der sauren Seite gelb und auf der basischen Seite oder wenn sie auf Vorhandensein von Protein ansprechen, blau sind, dann muss die bevorzugte, den Grundfarbton gebende Substanz, gelb sein. Der gelbe Farbton führt zum Überdecken bzw.

Maskieren von irgendeinem Auftreten von Schwachblau oder Grün, das unter den vorliegenden pH-Bedingungen auftreten kann, oder sogar gefunden wird, obwohl kein Protein in der zu prüfenden Lösung vorliegt. Eine solche positive Fehlanzeige kann beispielsweise bei Prüfung von Urin oder anderen zu testenden Flüssigkeiten mit hoher Alkalität auftreten.

Wenn ein etwas intensiverer Farbton durch den chromogenen Indikator erzeugt wird, als er mittleren Proteingehalten entspricht, so ergibt die gelbe, den Grundfarbton liefernde Substanz zusammen mit dem blauen Farbton einen grünen Zwischenfarbton, wodurch eine genauere quantitative Angabe erfolgt als ohne Grundfarbton.

Als Beispiele für die zahlreichen Grundfarbton gebenden Substanzen, die in der erfindungsgemässen Mischung eingesetzt werden können, seien die folgenden aufgeführt: FD & Gelb Nr. 1 Dinatriumsalz der 2,4-Dinitro-l-naphthol-7-sulfonsäure (Naphtolgelb) FD & Gelb Nr. 2 Dikaliumsalz der 2,4-Dinitro-l-naphthol-7-sulfonsäure (Dinatriumsalz des Naphtolgelb) FD & Gelb Nr. 5 Trinatriumsalz des 3 -Carboxy-5-hydroxy- 1 -p-sulfophenyl-4-psullophenylazopyrazols (Tartrazin) D & Gelb Nr. 1 Naphthol-Gelb-Pigment; Pigment des FD & Gelb Nr. 1 Ext.

D & Gelb Nr. 1 Mononatriumsalz des 4-m-Sulfophenylazo-diphenylamins (Methylenblau) FD & Blau Nr. 1 Dinatriumsalz des 4-([4-N-Äthyl-p-sulfobenzylamin)-phenyU-(2-sulfoniumphenyD- methylen)-[t -(N-äthyl-N-p-sulfobenzyl)-A25 -cyclohexadienimin] (Brillantblau FCF) FD & Rot Nr. 3 Dinatriumsalz von 9-o-Carboxyphenyl-6-hydroxy-2,4,5 ,7-tetraiod-3 -isoxanthon (Erythrosin) FD & Grün Nr. 2 Dinatriumsalz des 4-([4-N-Äthyi-sulfobenzylamin)-phenyU-(4-sulfoniumphenyD- methylen)-[l-(N-äthyl-N-p-sulfobenzyl)-A2s5-cyclohexadienimin] (Lichtgrün SF gelblich) FD & Orange Nr.

1 Mononatriumsaiz des 4-p-Sulfophenylazo-l-naphthol (Orange J) FD & a Farbstoffe für Nahrungsmittel, Arzneimittel und Kosmetika D & Farbstoffe für Arzneimittel und Kosmetika jedoch nicht für Nahrungsmittel Ext. D & Farbstoffe für äusserlich anzuwendende Arzneimittel und Kosmetika FCFa Der Barrett Division, Allied Chemical & Dye Corp., New York, USA SF > Saurer grüner Teerfarbstoff
Es sei erwähnt, dass neben gewöhniicherweise benutzten nicht pH-empfindlichen Grundfarbton gebenden Substanzen auch solche wie o-Cresolsulfonphthalein, das den Proteinfehler aufweist, oder 1 ,2-Dihydroxyanthra- chinon, das pH-empfindlich ist,

als Grundfarbton liefernde Substanzen in der erfindungsgemässen Mischung verwendet werden dürfen, wenn diese Substanzen bei dem bestimmten im System angewandten pH-Bereich nicht umschlagen. In den bevorzugten Mischungen wird FD & Gelb Nr. 5 (Tartrazin) als die Grundfarbton liefernde Substanz für die chromogenen Indikatoren Tetrabromphenolblau oder Tetrabromphenolphthalein äthylester verwendet.

Es sei darauf hingewiesen, dass wegen der grossen Zahl anwendbaren Substanzen für die erfindungsgemässe Mischung die verschiedenen Bestandteile davon in der Testmischung im Mengenverhältnis stark variieren können.

Wie eingangs der Beschreibung erwähnt, ist es gemäss vorliegender Erfindung wünschenswert, die Testmischung auf oder in einen Träger einzuverleiben und diese Kombination als eine Tauch- und Ablesetestvorrichtung zu benutzen. Diese soll jedoch keine Begrenzung der physikalischen Anwendbarkeit der erfindungsgemässen neuen Testmischung bedeuten. Es sei darauf hingewiesen, dass diese Mischungen in Form von Tabletten, Pulver oder Lösungen, um nur einige zu nennen, angewendet werden können. In der bevorzugten Anwendungsform befindet sich die Testmischung jedoch in und/oder auf einem Träger.

Dieses kann durch verschiedene Methoden erzielt werden, beispielsweise durch Imprägnieren eines Flüssigkeit aufsaugendes Materials mit einer Lösung der Testmischung und anschliessender Trocknung des imprägnierten Testmittels, durch adhäsive Haftung an der Oberfläche des Trägers, durch feinteilige trockene innige Mischung der Bestandteile usw.

Die bevorzugte Herstellungsart ist das Imprägnieren eines Flüssigkeit aufsaugenden Trägers mit einer Lösung oder Lösungen der Testmischung und anschliessende Trocknung.

Wenn ein Flüssigkeit aufsaugender Träger zur Anwendung kommt, so kann der Träger aus verschiedenen Substanzen bestehen. So können z. B. Filtrierpapier, Holzstreifen, synthetische Kunstfasererzeugnisse, nichtgewebte oder gewebte Erzeugnisse usw. in dieser Form angewendet werden. Das bevorzugte Flüssigkeit aufsaugende Material ist Filtrierpapier mit einer Dicke von etwa 0,25 bis 0,5 mm.

Die Anwendung des imprägnierten Trägers wird nachfolgend beschrieben. Zur Durchführung der Prüfung auf Protein wird das Testmittel in die zu prüfende Flüssigkeit getaucht und sofort wieder herausgezogen.

Dieses erfolgt deshalb, weil der pH-Wert des feuchten Testmittels durch den Puffer in der Testmischung eingestellt werden muss. Wird das Testmittel längere Zeit in der Flüssigkeit belassen, so besteht die Gefahr, dass die Testmischungsbestandteile vom Träger in die Flüssigkeit übergehen. Die sich entsprechend dem vorhandenen Protein entwickelnde Farbe wird dann visuell oder durch Vergleich mit einer Farbskala abgelesen. Zur Bestimmung der entstandenen Farbqualität können auch verschiedene instrumentelle Methoden angewendet werden, wobei infolge Beseitigung der subjektiven Farbbestimmung durch das menschliche Auge die Genauigkeit der Prüfung erhöht wird.

Geeignete Zusammensetzungen der erfindungsgemässen Testmischung werden in den anschliessenden Beispielen gezeigt.

Beispiele 1-6
Die in Tabelle I aufgeführten Mischungen wurden wie folgt hergestellt: Durch Mischen von Natriumzitrat, Zitronensäure und Wasser wurde zuerst eine Pufferlösung hergestellt. Diese Lösung wurde dann mit der angegebenen Menge einer 0,10/obigen wässerigen Lösung von Tartrazin vereinigt und die Mischung mit einer Lösung, die die angegebenen Mengen Äthanol und Tetrabromphenolblau enthielt, gemischt. Tabelle I gibt den pH-Wert der Pufferlösung an. Streifen aus Eatman und Dikeman Nr. 641 Filtrierpapier wurden in die verschiedenen Mischungen getaucht und sodann nach Abtropfen 11 Minuten lang bei 100 0C getrocknet. Wenn 258 cm2 des imprägnierten Streifens mit 15 ml Wasser extrahiert wurden, so wiesen die Streifen im wesentlichen denselben pH-Wert auf wie die Pufferlösung.

Bei Benetzung mit verschiedenen von 0 bis 1000 mg O/o Protein enthaltenden Lösungen konnte durch die aus den Testmischungen der Beispiele 1 bis 6 hergestellten Teststreifen die Proteinmenge bis zu einer unteren Konzentration von etwa 5 bis 10 mg < )/o genau nachgewiesen werden. Die Farbtonänderung erstreckte sich von Gelb oder einem Schwachgelb bis zu Blau, wobei verschiedene Zwischenfarbtöne, die von dem vorliegenden Proteingehalt der Lösung abhängen, auftraten.

Tabelle II zeigt die einzelne Farbreaktion der Testmischung für Beispiel 2. Bei den in Tabelle I gezeigten Testmischungen ergaben die Beispiele 2-5 ausgezeichnete Reaktion in bezug auf Helligkeit und Farbintensität. Die Testmischungen der Beispiele 1 und 6 waren gegenüber der bisherigen Praxis sowohl in Empfindlichkeit als auch Genauigkeit überlegen.

Tabelle l
Probe
1 2 3 4 5 6 NatriumzitratO' (g) 10,06 10,06 10,06 10,06 10,06 10,06 ZitronensäureO (g) 17,50 15,00 12,50 10,00 7,50 5,00 Wasser (ml) 145,4 142,4 139,4 139,4 131,4 121,4 TetrabromphenolblauO (mg) 48,6 48,6 48,6 48,6 48,6 48,6 Athanol (95 O/o) (ml) 48,6 48,6 48,6 48,6 48,6 48,6 Tartrazin-Lösung (ml) 6,0 9,0 12,0 12,0 20,0 30,0 pH-Wert der Puffer-Lösung 3,2 3,4 3,5 3,7 4,0 4,4 0 CBH5Na907'2Hs0 O NormalerpH-Umschlagsbereich 3,0 zu 4,6 G) wasserfrÅa
Tabelle II
Menge Protein in Lösung O Farbton des Streifens nach Ein (mg O/o) bringung in die proteinhaltige Lösung 0 Pyrethrum-Gelb (51) 5-200 Apfelgrün

(57)
30 Variscat-Grün (66)
100 Türkisgrün (72)
300 Türkisblau (75)
1000+ Blautürkis (78) OFarbdefinition und -Zahl nach Websters New International
Dictionary of the English Language (Unabridged), 2nd
Edition (1941), G. und C. Merriam Company, Springfield,
Massachusetts.

O Unterschiede zwischen 5 bis 20 mg o/o Protein, gekennzeichnet durch leichte Schattierung durch Apfelgrün-(57)-Farbton.

Beispiele 7-11
Zur Herstellung der in Tabelle III angegebenen Lösungen wurden zuerst 3,5 g Zitronensäure (wasserfrei) und die angegebenen Mengen Natriumzitrat (Dihydrat) in 100 ml des destillierten Wassers aufgelöst und danach diese Lösung mit 1000 ml einer 0,040/oigen Lösung von Tetrabromphenolphthaleinäthylester in Athylalkohol (normaler pH-Reaktionsbereich 3,7 bis 5,2) gemischt.

Die anfallende Lösung besass den in Tabelle III angegebenen pH-Wert. Unter Anwendung des in den Beispielen 1 bis 6 angegebenen Verfahrens wurden aus diesen Lösungen Teststreifen hergestellt.

Tabelle III
Probe
7 8 9 10 11 Natriumzitrat (g) 1,0 1,6 2,3 3,7 4,2 Zitronensäure 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 Wasser (ml) 100 100 100 100 100 Tetrabromphenol phthalein-äthyl ester (g) 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 Äthanol (95 O/o) (ml) 100 100 100 100 100 pH-Wert der ent standenen Lösung 3,75 4,0 4,4 4,8 5,2 Die getrockneten Teststreifen hatten die folgende Farbe:

:
Probe Farbe (Farbton)
7 Gelb
8 Gelb
9 schwach Grüngelb
10 Grüngelb
11 Grünblau
Wenn mit einer Urinprobe versetzt wird, die in Proben aufgeteilt worden war, die mit variierten Proteingehalten versetzt wurden, konnte mit den nach Beispiel 7 und 11 hergestellten Streifen ein Zusatz von 0,004 O/o (4 mg O/o) Protein (sehr schwache Farbänderung) nachgewiesen werden, während die entsprechend den Beispielen 8-10 hergestellten Streifen eine ausgezeichnete Farbänderung bei Nachweis von 0,004 O/o Protein zeigten. In allen Testen wurde zum Farbvergleich ein Streifen mit dem ursprünglichen Urin versetzt, der geeicht war und unbedeutende Mengen Protein enthielt.

In den folgenden Beispielen (1218) wurden entsprechend dem in den Beispielen 1-6 angegebenen Verfahren Mischungen und Teststreifen hergestellt. Diese Mischungen und Streifen besassen die angegebenen Mengen an Bestandteilen und Eigenschaften. Der aufgeführte pH-Wert ist derjenige der Imprägnierungslösung. Diese zur Imprägnierung dienenden Alkohol enthaltenden Lösungen zeigten einen um etwa 0,2 pH-Einheiten höher liegenden pH als der der verwendeten Pufferlösung. Die erhaltenen Streifen besassen somit einen um etwa 0,2 pH-Einheiten niedriger liegenden pH als die Imprägnierungslösungen.

Beispiel 12 Testmischung: Natriumzitrat (Dihydrat) 3,2 g
Zitronensäure (wasserfrei) 2,0 g Bromkresolgrün 0,1 g Äthanol (95 o/o) 30,0 ml
Destill. Wasser 120,0 ml pH der Imprägnierlösung 4,5 Eigenschaften des Indikators-Bromkresolgrün:
Saurer Farbton Gelb
Basischer Farbton Blau
Normaler Bereich der pH-Änderung 3,8-5,4 Eigenschaften der Teststreifen:
Farbton des trockenen Streifens Gelb
Farbton des Streifens nach Kontakt mit proteinhaltiger Lösung Blau
Beispiel 13 Testmischung:

:
Natriumzitrat (Dihydrat) 27,0 g
Zitronensäure (wasserfrei) 2,0 g Bronikresolpurpur 0,1 g Äthanol (95 /o) 30,0 ml
Wasser 120,0 ml pH der erhaltenen Lösung 5,8 Eigenschaften des Indikators-Bromkresolpurpur:
Saurer Farbton Gelb
Basischer Farbton Purpur
Normaler Bereich der pH-Änderung 5,2-6,8 Eigenschaften der Teststreifen:
Farbton des trockenen Streifens Gelb
Farbton des Streifens nach Kontakt mit proteinhaltiger Lösung Purpur
Beispiel 14 Testmischung:
Natriumzitrat (Dihydrat) 11,1 g o-Kresolsulfonphthalein (Kresol-Rot) 0,05 g Äthanol (95 0/o) 30,0 mi
Destill.

Wasser 120,0 ml pH der erhaltenen Lösung 7,9 Eigenschaften des Indikators-o-Kresolsulfonphthalein (Kresol-Rot):
Saurer Farbton Gelb
Basischer Farbton Rot
Normaler Bereich der pH-Anderung 7,e8,8 Eigenschaften der Teststreifen:
Farbton des trockenen Streifens Rot-Orange
Farbton des Streifens nach Kontakt mit proteinhaltiger Lösung Gelb
Beispiel 15 Testmischung:
Phosphatpuffer - pH 6,61 (0,2 m) 120,0 ml
Bromthymol-Blau W.S. 0,05 g Äthanol (95 O/o) 30,0 ml pH der erhaltenen Lösung 7,0 Eigenschaften des Indikators-Bromthymol-Blau W.S.:

:
Saurer Farbton Gelb
Basischer Farbton Blau
Normaler Bereich der pH-Anderung 6,0-7,6 Eigenschaften der Teststreifen:
Farbton des trockenen Streifens Grün
Farbton des Streifens nach Kontakt mit proteinhaltiger Lösung Gelb
Beispiel 16 Testmischung:
Natriumzitrat (Dihydrat) 9,6 g
Zitronensäure (wasserfrei) 9,0 g
Bromphenol-Blau-Natriumsalz 0,04 g
Destill. Wasser 100,0 ml pH der erhaltenen Lösung 3,4 Eigenschaften des Indikators-Bromphenol-Blau- Natriumsalz:
Saurer Farbton Gelb
Basischer Farbton Blau
Normaler Bereich der pH-Änderung 3,0-4,6 Eigenschaften der Teststreifen:
Farbton des trockenen Streifens Gelb
Farbton des Streifens nach Kontakt mit proteinhaltiger Lösung Blau
Beispiel 17 Testmischung:
Borax 3,0 g
Borsäure 0,65 g
Thymol-Blau 0,016 g
Destill.

Wasser 100,0 ml pH der erhaltenen Lösung 8,8 Eigenschaften des Indikators-Thymol-Blau:
Saurer Farbton Gelb
Basischer Farbton Blau
Normaler Bereich der pH-Anderung 8,0-9,6 Eigenschaften der Teststreifen:
Farbton des trockenen Streifens Blau
Farbton des Streifens nach Kontakt mit proteinhaltiger Lösung Grau
Beispiel 18
Es wurde eine trockene Mischung der Zusammensetzung nach Beispiel 5 ohne Wasser hergestellt. Zum Anfeuchten wurde der Alkohol zugesetzt und kleine Tabletten mit einem Gewicht von 0,14 g daraus hergestellt. Jeweils eine dieser Tabletten wurden zu je 0,5 ml Urinproben mit einem Gehalt von 0 /o, 0,01 0/0, 0,03 O/o, 0,10 O/o, 0,30 O/o und 1,0 O/o Protein gegeben.

Die 0 O/o-Urinprobe wechselte zu einem gelblich-oliven Farbton, während die 1 o/o Protein enthaltende Urinprobe nach blau-türkis umschlug. Die verschiedenen Proben mit den dazwischen liegenden Proteingehalten schlugen gemäss der vorliegenden Proteinmenge nach schwach blau-grün um. Eine quantitative Bestimmung der Probe erfolgte visuell oder elektronisch.

PATENTANSPRUCH 1
Testmischung zum Nachweis von Protein in Flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen auf pH änderungen ansprechenden chromogenen Indikator enthält, der in Gegenwart von Protein eine Farbveränderung erleidet und einen konstanten Grundfarbton im sauren und einen davon verschiedenen konstanten Grundfarbton im basischen Bereich hat, weiterhin einen Puffer, der den pH-Wert der Mischung in einem Bereich abpuffert, in dem der chromogene Indikator bei einer pH-Anderung anspricht und das Vorliegen von Protein durch einen Farbumschlag oder -übergang nach einem der jeweiligen Farbtöne anzeigt, und darüber hinaus eine einen Grundfarbton gebende Substanz, die denselben Farbton wie der chromogene Indikator hat, bevor er auf Protein anspricht.

UNTERANSPRÜCHE
1. Testmischung nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass der Indikator bei Vorliegen von Protein nach dem dem basischen Bereich entsprechenden Farbton umschlägt oder übergeht, und die den Grundfarbton gebende Substanz den dem sauren Bereich entsprechenden Farbton des Indikators hat.

2. Testmischung nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer den pH-Wert der Testmischung bei einem dem Mittelpunkt des pH-Bereichs, in dem der chromogene Indikator urnschlägt, benachbarten Wert hält.

3. Testmischung nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass der Indikator von gelb nach blau umschlägt und die den Grundfarbton gebende Substanz gelb ist.

PATENTANSPRUCH II
Verwendung der Testmischung gemäss Patentanspruch I auf einem Träger zum Nachweis von Protein in Flüssigkeiten.

**WARNUNG** Ende DESC Feld konnte Anfang CLMS uberlappen**.

Claims

**WARNUNG** Anfang CLMS Feld konnte Ende DESC uberlappen **. Eigenschaften der Teststreifen: Farbton des trockenen Streifens Gelb Farbton des Streifens nach Kontakt mit proteinhaltiger Lösung Blau Beispiel 17 Testmischung: Borax 3,0 g Borsäure 0,65 g Thymol-Blau 0,016 g Destill. Wasser 100,0 ml pH der erhaltenen Lösung 8,8 Eigenschaften des Indikators-Thymol-Blau: Saurer Farbton Gelb Basischer Farbton Blau Normaler Bereich der pH-Anderung 8,0-9,6 Eigenschaften der Teststreifen: Farbton des trockenen Streifens Blau Farbton des Streifens nach Kontakt mit proteinhaltiger Lösung Grau Beispiel 18 Es wurde eine trockene Mischung der Zusammensetzung nach Beispiel 5 ohne Wasser hergestellt. Zum Anfeuchten wurde der Alkohol zugesetzt und kleine Tabletten mit einem Gewicht von 0,14 g daraus hergestellt.

Jeweils eine dieser Tabletten wurden zu je 0,5 ml Urinproben mit einem Gehalt von 0 /o, 0,01 0/0, 0,03 O/o, 0,10 O/o, 0,30 O/o und 1,0 O/o Protein gegeben.

Die 0 O/o-Urinprobe wechselte zu einem gelblich-oliven Farbton, während die 1 o/o Protein enthaltende Urinprobe nach blau-türkis umschlug. Die verschiedenen Proben mit den dazwischen liegenden Proteingehalten schlugen gemäss der vorliegenden Proteinmenge nach schwach blau-grün um. Eine quantitative Bestimmung der Probe erfolgte visuell oder elektronisch.

PATENTANSPRUCH 1 Testmischung zum Nachweis von Protein in Flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen auf pH änderungen ansprechenden chromogenen Indikator enthält, der in Gegenwart von Protein eine Farbveränderung erleidet und einen konstanten Grundfarbton im sauren und einen davon verschiedenen konstanten Grundfarbton im basischen Bereich hat, weiterhin einen Puffer, der den pH-Wert der Mischung in einem Bereich abpuffert, in dem der chromogene Indikator bei einer pH-Anderung anspricht und das Vorliegen von Protein durch einen Farbumschlag oder -übergang nach einem der jeweiligen Farbtöne anzeigt, und darüber hinaus eine einen Grundfarbton gebende Substanz, die denselben Farbton wie der chromogene Indikator hat, bevor er auf Protein anspricht.

UNTERANSPRÜCHE 1. Testmischung nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass der Indikator bei Vorliegen von Protein nach dem dem basischen Bereich entsprechenden Farbton umschlägt oder übergeht, und die den Grundfarbton gebende Substanz den dem sauren Bereich entsprechenden Farbton des Indikators hat.

2. Testmischung nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer den pH-Wert der Testmischung bei einem dem Mittelpunkt des pH-Bereichs, in dem der chromogene Indikator urnschlägt, benachbarten Wert hält.

3. Testmischung nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass der Indikator von gelb nach blau umschlägt und die den Grundfarbton gebende Substanz gelb ist.

PATENTANSPRUCH II Verwendung der Testmischung gemäss Patentanspruch I auf einem Träger zum Nachweis von Protein in Flüssigkeiten.