DE2134928B2

DE2134928B2 - Immunologisches Reagens und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE2134928B2
Application number: DE2134928A
Authority: DE
Inventors: Ian Westerham Kent Cayzer; Pamela Mary Addington Surrey Pitcher
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1970-07-17
Filing date: 1971-07-13
Publication date: 1981-01-22
Also published as: US3912805A; GB1362776A; DE2134928A1

Description

Polystyrolteiex besonders aus dem Gesichtspunkt der allgemeinen präparativen Geeignetheit und Qualität des Reagens bevorzugt werden. Die Partikel haben am zweckmäßigsten im Durchmesser eine Größe von 0,01 bis 1 u, obgleich Partikel mit einem größeren Durchmesser als 1 μ verwendbar sind, wobei jedoch ihre Reaktion, wenn sie mit dem Antiserum beschichtet sind, mit FAP ziemlich unbefriedigend ist und dazu neigt, zu gering zu sein. Die Konzentration der Partikel in wäßriger Suspension liegt zweckmäßigerweise im Bereich zwischen 0,2 und 5% (Gewicht/Voiumen), obgleich vorzugsweise eine Konzentration von 0,4 bis 1 % (Gewicht/Volumen) verwendet wird.

Die Antikörper, mit denen die inerten Partikel beschichtet werden, können gegen ein Gemisch von Human-FAP gezüchtet werden, und demzufolge ist die Suspension, die solche Partikel enthält, polyvalent, d h, sie kann mit irgendeinem der verschiedenen Human-FAP reagieren. Man kann auch die Antikörper gegen ein individuelles, gereinigtes FAP züchten, wodurch man eine Suspension bildet, die spezifisch mit dem individuellen FAP reagiert

Die optimale Konzentration des Antikörpers in dem Reagens kann leicht empirisch, wie nachfolgend angegeben, bestimmt werden. Eine Anzahl von Proben einer Suspension der inerten Teilchen wird mit unterschiedlichen Mengen an Antikörper in der nachfolgend beschriebenen Weise sensibilisiert, so daß man eine Anzahl von Reagensproben erhält, bei denen die Konzentration der inerten Teilchen konstant und die jo der Antikörper variabel ist Bei zu niedriger Antikörper-Konzentration wird festgestellt, daß das Reagens unempfindlich ist. Bei zu hoher Antikörper-Konzentration wird gefunden, daß das Reagens einer spontanen, nichtspezifischen Agglutination zugänglich ist Die optimale Konzentration an Antikörper liegt zwischen diesen beiden Extremen, und ist diejenige Konzentration an Antikörper, welche in einei" Reagensprobe vorhanden ist, die genau beim Vorliegen eines gewünschten FAP-Spiegels agglutiniert

Der gewünschte FAP-Spiegel kann im Bereich zwischen 1 und 50 μg/ml liegen, obgleich ein Reagens, das so hergestellt wird, daß es genau in Gegenwart von etwa 3 μg/ml FAP agglutiniert, besonders wertvoll ist, da dies der FAP-Spiegel in Normalblut ist; liegen daher abnormale FAP-Spiegel vor, so können diese mit einem solchen Reagens besonders zweckmäßig bestimmt werden. Die Antikörper werden durch Injizieren von Human-FAP in einen Säuger, außer Menschen, gezüchtet Der Säuger kann irgendeine, herkömmlicherweise so für Antikörperbildung verwendete Spezies sein, beispielsweise Pferde, Schafe, Kaninchen, Ziegen, Meerschweinchen oder Ratten. Die Injektion kann nach irgendeinem Immunisationsschema, das zur Züchtung von Antikörpern geeignet ist durchgeführt werden.

Das dem Säuger injizierte FAP kann geeigneterweise durch Spaltung von Fibrinogen oder Fibrin mit einem proteolytischen Enzym erhalten werden. Das Enzym Plasmin wird wegen seiner begrenzten spezifischen Aktivität, mit Fibrinogen oder Fibrin FAP-Fragmente D und E zu bilden, bevorzugt Die Spaltung wird zur Sicherstellung eines ausreichenden Abbaus vorzugsweise durch Inkubation des Fibrinogens oder Fibrins mit dem Enzym bei Raumtemperatur während eines Zeitraums von 12 bis 36 Stunden bewirkt. Das aus der proteolytischen Spaltung erhaltene Gemisch enthält fibrinolytische Produkte, Enzyme und Enzymaktivatoren, und kann als solches zur Züchtune eines Antiserums verwendet werden, jedoch wird es vorzugsweise zur Entfernung des nicht von Fibrinogen oder Fibrin stammenden Materials gereinigt Die Reinigung kann nach irgendeinem dem Fachmann bekannten Verfahren durchgeführt werden, beispielsweise durch Gelfiltration oder Elektrophorese. Falls es gewünscht wird, kann das gereinigte FAP dann fraktioniert werden, so daß mehr spezifisches Antiserum gezüchtet werden kann. Die Fraktionierung kann nach irgendeiner dem Fachmann bekannten Weise, beispielsweise durch Agargelelektrophorese oder durch Gelfiltrieren, geeigneterweise unter Verwendung von Sephadex, bewirkt werden.

Die ungereinigte FAP-, gereinigte FAP- oder individuelle FAP-Fraktion wird dann auf die gewünschte Konzentration gebracht und mit dem Blut des Säugers, dem sie injiziert werden soll, gegebenenfalls mit einem Adjuvans, isotonisch gemacht Irgendeines der üblichen Adjuvantien kann verwendet werden, obgleich Freunds Gesaimtadjuvans besonders geeignet ist Dieses besondere Adjuvans besteht aus einer wäßrigen Emulsion von heiß abgetöteten Bakterien in einem Paraffinöl.

Wenn ein Antiserumi auf einen ausreichend hohen Antikörpertiter gezüchtet ist wird das Blut von dem Säuger entfernt, wobei man das Blut gerinnen läßt und das Antiserum sammelt Vorteilhafterweise wird dann das Antise-um nach herkömmlichen Verfahren fraktioniert wozu beispielsweise das Serum dekomplementiert werden kann, um eine Interferenz mit dem Komplement auszuschließen, wenn man das Reagens für Untersuchungen bei Human-FAP verwendet Weiterhin kann die Immunoglobulin-G-Fraktion, die in erster Linie die Antikörper enthält isoliert werden. Man kann aber noch weiter die Immunoglobulin-G-Fraktion durch Immuno-Absorptionsverfahren fraktionieren, so daß man eine Fraktion, die Antikörper der gesamten FAP-Art, die dem Säuger injiziert wurden, aufweist oder eine Fraktion, die Antikörper von einer dieser FAP-Arten aufweist erhält

Das Reagens kann in der Weise hergestellt werden, daß man eine Lösung, die Antiserum oder eine Antikörper-Fraktion derselben enthält, mit einer Suspension von inerten Partikeln, gegebenenfalls mit einem Puffer herstellt vermischt

Optimale Bedingungen für das Mischen können leicht empirisch bestimmt werden. Im allgemeinen wurde festgestellt daß es wünschenswert jedoch nicht wesentlich ist, das Reagens zu erhitzen, und daß, um optimale Verhältnisse zu erreichen, der pH-Wert des Puffers im Bereich von 6 bis 9 liegt Liegt ein Reagens vor, bei dem die inerten Teilchen ein Polystyrol-Latex sind, so wurde festgestellt, daß man vorteilhafterweise während eines von der Temperatur im Bereich von 20 bis 8O⁰C abhängigen Zeitraums, beispielsweise 15 bis 30 Minuten lang bei 50 bis 7O⁰C, erhitzt

Der Zusatz von Serumalbumin vom Blut irgendeines geeigneten Säugers ist zur Erhöhung der Stabilität des Reagens vorteilhaft obgleich die Stabilität des Reagens und dessen Sensibilität in den nachfolgenden Untersuchungsverfahren in erster Linie von der Verwendung der optimalen sensibilisicrenden Menge an Antikörpern in dem Reagens abhängig ist. Auch Natriumazid kann dem Reagens zur Erhöhung seiner Stabilität zugesetzt und das Reagens kann bei etwa 4° C gelagert werden.

Das Reagens der vorliegenden Erfindung ist hoch empfindlich gegenüber dem Vorhandensein von FAP und agglutiniert bei deren Vorhandensein schnell infolge der Antikörpeirbindungsstellen. die an den

Partikeloberflächen vorhanden sind. Es kann daher das Reagens bei einem einfachen Versuchssystem verwendet werden, wobei die Spezifizität der Untersuchung abhängig ist von der Spezifizität des .zur Sensibilisierung der Partikel verwendeten Antikörpers. Die Spezifizität der Antikörper hängt ihrerseits von den Verfahren ab, durch welche sie isoliert werden und von dem Antigen, gegenüber dem sie gezüchtet werden.

Ein Versuch hinsichtlich dem Vorhandensein von FAP unter Verwendung des Reagens kann zweckmäßigerweise in der Weise durchgeführt werden, daß man wenige Tropfen des Reagens mit einem geringen Volumen einer Serumprobe auf einer impermeablen Oberfläche mischt So, wie sie hier verwendet wird, ist als impermeable Oberfläche ein Glasschieber, eine Keramikplatte, die Innenseite eines Reagenzglases, eine Mulde und eine geeignet behandelte Karte bzw. Kartonage zu verstehen. Die impermeable Oberfläche muß aus irgendeinem nicht durchd-ingbaren Material bestehen, obgleich Glas und keramische Materialien besonders geeignet sind. Vorzugsweise weist die impermeable Oberfläche eine Farbe auf oder wird im Falle einer klaren Glasoberfläche gegenüber einem Farbhintergrund verwendet, wobei die Farbe mit der Farbe der im Reagens verwendeten, inerten Partikel kontrastiert; dadurch ist es möglich, das Verhalten des zur Beobachtung verwendeten Reagens leichter zu verfolgen.

Wenn FAP in einer ausreichenden Konzentration vorhanden sind, d. h. in einer Konzentration, die höher als der vorstehend definierte, gewünschte Spiegel ist, liegt diese Konzentration am zweckmäßigsten über 3 μg/ml; die sensibilisierten Teilchen werden innerhalb von wenigen Minuten agglutiniert, und das flüssige Gemisch ändert sein gleichmäßiges, opaleszierendes Aussehen unter Bildung von Klumpen aus agglutinierten Teilchen, die für das unbewaffnete Auge sichtbar sind. Ein solcher Test ist zur Auffindung von FAP in den normalerweise im Humanserum festzustellenden Konzentrationen ausreichend empfindlich, und die mit den abnormalen Verklumpungsbedingungen in Verbindung stehenden hohen Konzentrationen werden in der Weise gemessen, daß man sie mit geeignet verdünnten Proben des Serums untersucht. Serumproben können innerhalb von etwa 30 Minuten nach einer Venenpunktion erhalten und positive Reaktionen können innerhalb einer so geringen Zeit, wie 2 Minuten nach dem Mischen der Reaktionspartner, festgestellt werden.

Zusätzlich kann das Reagens der vorliegenden Erfindung in einer Agglutinationsuntersuchung für Fibrinogen in gleicher Weise wie herkömmliche Reagentien verwendet werden, die mit Antikörpern gegenüber Fibrinogen oder Fibrin sensibilisierte, inerte Teilchen enthalten.

Das Reagens der vorliegenden Erfindung kann als Versuchsausrüstung dargeboten werden, wobei diese einen Behälter für das Reagens und Anweisungen zur Verwendung der Versuchsausrüstung in einer Agglutinationsuntersuchung für FAP enthält Wünschenswerterweise enthält die Versuchsausrüstung weiterhin einen Behälter für einen Puffer, eine Kontrollprobe und Sammelröhrchen für Blutproben, wobei die Röhrchen Thrombin und gegebenenfalls einen Proteaseinhibitor enthalten. Zweckmäßigerweise kann die Versuchsausrüstung ebenso einen Mischstab, Tropfer und eine nicht permeable Mischplatte enthalten.

Der Puffer wird als Verdünnungsmittel für das Serum verwendet dem er vor dem Mischen mit dem Reagens zugegeben wird. Der Puffer hiift ebenso, einen optimalen pH-Wert, im allgemeinen von 6 bis 9, aufrechtzuerhalten, wobei bei diesem pH-Wert die Agglutination am leichtesten abläuft Zweckmäßiger weise wird ein Glycin-Kochsalzpuffer verwendet obgleich ebenso irgendein anderer, pharmakologisch geeigneter Puffer eingesetzt werden kann. Vorteilhafterweise kann die Versuchsausrüstung ebenso einen Behälter mit einer Kontroll-Losung enthalten, die eine

ίο FAP-Menge enthält, die einem in abnormalem Blut vorhandenen Spiegel entspricht Die Sammelröhrchen zum Sammeln von Blutproben enthalten Thrombin zum Gerinnen von Fibrinogen und einen Proteaseinhibitor. Das Gerinnen des Fibrinogen* macht es unlöslich, und

is so kann das Serum leicht von diesem abgetrennt werden, wodurch man die mögliche Reaktion des Reagens mit Fibrinogen eliminiert Die Verwendung eines Proteaseinhibitors vermeidet einen enzymatischen Abbau des Fibrinogens oder Fibrins durch Plasmin, wodurch zusätzliche FAP geschaffen werden, die einen falschen hohen Spiegel ergeben würden.

Die Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Beispiele erläutert

B e i s ρ i e 1 1

Herstellung einer

Antikörper-sensibil isierten Suspension von inerten Partikeln

25 CU Humanplasminogen wurden in wäßriger Lösung mit 1250 Einheiten Streptokinaselösung gemischt und eine Stunde bei Raumwärme zur Bewirkung der Umwandlung des Plasminogens in Plasmin bebrütet. Die Piasminaufbereitung wurde zu einer Lösung von 50 mg Humanfibrinogen in 20 ml Zitratpuffer, pH 6,4, zugegeben und das erhaltene Gemisch bei Raumwärme 24 Std. bebrütet. Die enzymatische Wirksamkeit wurde durch Zugabe von 100 Einheiten Trasylol (eingetragenes Warenzeichen) pro ml Lösung inhibiert und das rückständige Fibrinogen mit Thrombin (10 Einheiten/ml Lösung) zum Gerinnen gebracht und dann durch Zentrifugieren entfernt.

Die klare, überstehende Schicht wurde mittels Immunoelektrophorese in l°/oigem Agarosegel auf das Vorhandensein von Abbauprodukten und die Abwesenheit des gesamten Fibrinogens untersucht bevor sie durch Druckdialyse eingeengt wurde. Dann wurden die beiden Hauptfragmente von FAP, D und E, mittels Elektrophorese in Agarosegel bei einem pH-Wert von

so 8,5 abgetrennt; die Antigenlösung wurde auf 52° C erwärmt bevor sie auf das Gel aufgebracht wurde, und die Elektrophorese wurde etwa 20 Stunden lang bei 150 Volt durchgeführt Die Fragmente wurden durch Entfernung von Gelpfropfen lokalisiert und auf das Vorhandensein von Antigen in einem Immunoelektrophoresesystem unter Verwendung von Kaninchen-Antifibrinogenserum geprüft. Die ein Abbaufragment E enthaltende Gelfäche wurde in einem kleinen Kochsalzlösungsvolumen homogenisiert und das Homogenat war zur nachfolgenden Verwendung zur Züchtung eines Antiserums geeignet

1 ml des so hergestellten Homogenats von Antigen enthaltender Agarose wurde in 3 ml Freund-Vollständigadjuvans emulgiert und intramuskulär in alle vier Gliedmaßen eines Kaninchens injiziert. Die Injektion wurde in monatlichen Zeitabständen drei Monate lang wiederholt, wonach das Antiseram einen geeigneten Agglutinationstiter aufwies, wenn es gegen mit Fibrino-

gen sensibilisierle, rote Blutkörperchen getestet wurde; dem Kaninchen wurde dann das Blut entnommen und das Serum gesammelt.

Antikörper für andere Proteine als FAP wurden aus dem Kaninchenserum entfernt, wozu man das rohe Antiserum mit einem unlöslichen Polymerisat von Normalhumanserum mit nichtentdeckbaren FAP-Spiegeln mischte und die Absorption ungefähr 1 Stunde bei 37⁰C ablaufen ließ. Das Polymerisat wurde in der Weise hergestellt, daß man 20 ml Humanserum, das 2 ml 1,0 M Acetatpuffer, pH-Wert 4,4, enthielt, mit 6 ml 2,5% (Gewicht/Volumen) Glutaraldehyd umsetzt und die Gelbildung bei Zimmertemperatur eintreten läßt. Nach 3 Stunden wurde das Polymerisat gründlich in Puffer gewaschen und vor Verwendung trockengesaugt. Nach r> Absorption wurde das Antiserum, das gegenüber einem Fragment der FAP monospezifisch gemacht worden war, von dem Polymerisat abdekantiert.

10 ml des in dieser Weise hergestellten Antiserums wurden auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt, und es wurden 30 ml 0,4%iges (Gewicht/Volumen) 2-Äthoxy-6,9-diaminoacridinlactat in destilliertem Wasser unter langsamem Rühren zugegeben. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren entfernt, und es wurden der überstehenden Schicht 50 mg Tierkohle zugegeben. Das :s Gemisch wurde dann geschüttelt, 1 Stunde lang stehengelassen und dann filtriert. Das Filtrat wurde langsam unter Zugabe eines gleichen Volumens gesättigter Ammoniumsulfatlösung gerührt und das Gemisch mehrere Stunden bei 4° C stehengelassen. Der Niederschlag wurde erneut in 4 ml isotonischer Kochsalzlösung gelöst und gegen verschiedene Kochsalzkonzentrationen zur Entfernung der gesamten Ammoniumsulfatspuren dialysiert. Dann wurde das Gemisch einige Stunden gegen 0,1 M Glycin-Kochsalzpuffer, pH-Wert 8,2, dialysiert.

Die Proteinkonzentration der erhaltenen Globulinlösung wurde nach ihrer optischen Dichte bei 280 mu, die in einem Spektrophotometer gemessen wurde, bestimmt.

Eine wässerige, 40%ige (Gewicht/Volumen) Suspension von Polystyrol-Latex-Teilchen wurde mit 0,1 M Glycinkochsalzlösungspuffer, pH-Wert 8,2, auf 1% (Gewicht/Volumen) verdünnt. Die wie oben beschrieben hergestellte Globulinlösung wurde auf eine Konzentration von 2 mg/ml Protein verdünnt, und 0,4 ml der verdünnten Proteinlösung mit 0,4 ml der 1 % (Gewicht/Volumen) Latexsuspension und 0,2 ml Puffer gemischt.

Die Suspension wurde 20 Minuten lang in einem Wasserbad bei 60° C zur Koagulation der Teilchen erhitzt. Zu der Suspension wurden 0,05 ml einer Lösung von l%igem (Gewicht/Volumen) Rinderserumalbumin zugegeben, die dann kräftig geschüttelt und erneut 10 Minuten zur Stabilisierung des Reagens erhitzt wurde.

Die sensibilisierte Latexsuspension wurde gegenüber einer Lösung des reinen Fragments E, die in der oben beschriebenen Weise hergestellt wurde, geprüft; das Latexpräparat agglutinierte genau in Gegenwart von 3 μg Fragment/mL

In einem 0,1 M Glycinkochsalzlösungspuffer, pH-Wert 8,2, wurden zwei Standardverdünnungen (1:5 und 1 :50) der unbekannten Serumprobe hergestellt und ein Tropfen von jeder Lösung und ein Tropfen des Puffers auf einen Objektträger aufgebracht Zu jedem der zwei Tropfen wurde ein Tropfen der wie oben beschrieben hergestellten sensibilisierten Latexsuspension zugegeben. Nach Mischen und Ausbreiten der Flüssigkeit unter Bildung kleiner Lachen wurde der Objektträger 2 Minuten lang leicht geschaukelt und die Proben dann auf Anzeichen von Agglutination geprüft.

Agglutination trat nicht auf bei einer Serumverdünnung von 1 :50, trat jedoch bei der Serumverdünnung

1 :5 auf. Daraus ist erkennbar, daß die Konzentration von FAP in dem nicht verdünnten Serum zwischen 15 und 150 ng/ml beträgt und daß daher der FAP-Spiegel in dem unbekannten Serum über den normalen Wert angestiegen war.

Beispiel 2

Herstellung einer

Antikörper-sensibilisierten Suspension
von roten Blutkörperchen

Eine wässerige Suspension mit einem Gehalt an 4% (Gewicht/Volumen) von roten, behandelten Blutkörperchen vom Schaf in Phosphat-Citratpuffer (0,15 M Phosphat, 0,1 M Citrat, pH-Wert 6,4) wurde nach dem Verfahren von Merskey et al. hergestellt (Proc. Soc. Exp.Biol.& Med„ 131,871 [1969]).

Gleiche Volumina der wässerigen Suspension und das gesamte, wie in Beispiel 1 hergestellte und auf eine Konzentration von 80 mg/ml Protein verdünnte Antiserum wurden gemischt und bei 37°C 60 Minuten inkubiert. Die erhaltene Suspension von sensibilisierten Zellen wurde 4mal in Phosphat-Citratpuffer (0,15 M Phosphat, 0,1 M Citrat, pH-Wert 6,4) gewaschen und erneut bis zu einer Konzentration der Zellen in dem Phosphat-Citratpuffer von 4% (Gewicht/Volumen) suspendiert.

Die Suspension der sensibilisierten Zellen wurde erneut gegen eine Lösung von nicht fraktioniertem Human-FAP, hergestellt wie in Beispiel I₁ geprüft; die Suspension agglutinierte genau in Gegenwart von

2 mg/ml Human-FAP. Die Suspension der sensibilisierten Zellen wurde auch gegenüber Fibrinogen geprüft; die Suspension agglutinierte genau in Gegenwart von 1 mg/ml Fibrinogen.

Beispiel 3
Herstellung eines Testsatzes

Eine wässerige Suspension von Antikörper-sensibilisierten Teilchen aus wie in Beispiel 1 beschrieben hergestelltem Polystyrol-Latex wurde in einen Behälter überführt. Der Behälter, der die Suspension enthielt, wurde dann mit drei weiteren Behältern zu einem Testsatz vereinigt: Dabei enthielt ein Gefäß ein Glycin-Salz-Puffer (0,1 M₁ pH-Wert 8,2), das zweite Gefäß eine wässerige Suspension von Humanfibrinogen-Abbauprodukten (10 μg/πll), das als Kontrollprobe Verwendung finden soll, und ein drittes Gefäß (das als Sammlungsröhrchen verwendet werden soll) enthielt Thrombin und einen Proteaseinhibitor. Der Testsatz enthielt weiterhin einen mit Meßvorrichtung versehenen Tropfer mit Gummisauger, ein Glasplättchen, zum Gebrauch verfügbare Mischstäbe, Tropf er mit Gummisaugern und Anweisungen, die u.a. die folgenden Richtlinien enthalten:

»Anweisungen zur Verwendung des Testsatzes«

1. Entnimm Blut in eine trockene Spritze durch saubere Venenpunktur ohne venöse Stauung. Obertrage 2 ml des Blutes in das vorgesehene Sammelröhrchen und mische sofort und gründlich durch wiederholte Umkehrung; das Samme'röhr-

25

chen enthält Thrombin und einen Enzyminhibitor, um den Abbau von Fibrin in FAP zu verhindern; das Blut wird innerhalb weniger Sekunden nach seinem Einbringen in das Röhrchen gerinnen.

2. Bilde aus dem Blutgerinsel einen »Ring«, um die Retraktion zu ermöglichen und lasse das Röhrchen (bei 37° C, wenn möglich) stehen, bis oben auf der Probe ein klares Serum zu erkennen ist.

3. Stelle Verdünnungen von Serumproben her. Nimm zwei kleine Glas- oder Kunststoffröhrchen und ^lü bezeichne sie mit 1 und 2. Bringe 0,5 ml Glycin-Puffer in jedes Röhrchen; verwende den mit Meßeinteilung versehenen Tropfer, der am Boden des Puffers angebracht ist.

4. Verwende einen verfügbaren Tropfer, sauge klares Serum aus den Probenröhrchen auf und gib 3 Tropfen zu Röhrchen 1. Gib den Rest des Serums in das Probenröhrchen zurück. Mische Puffer und Serum (nunmehr mit einer ungefähren Verdünnung von 1 :5) durch wiederholtes Ansaugen in der gleichen verfügbaren Pipette, wobei zu beachten ist, daß die Flüssigkeit nicht in den Sauger steigt. Nach dem Mischen bringe einen einzigen Tropfen des verdünnten Serums an die Stelle 1 des Glasplättchens und übertrage dann weitere drei Tropfen zu dem Puffer in Röhrchen 2. Gib den Rest der 1 :5-Verdünnung in das Röhrchen 1.

5. Mische die neue Verdünnung (ungefähr 1 :50) in dem Röhrchen 2 durch wiederholtes Ansaugen in dem gleichen Tropfer und bringe dann einen einzigen Tropfen auf die Stelle 2 des Glasplättchens.

6. Mische die Latexsuspension durch kurzes, kräftiges Schütteln des Röhrchens und gibt dann 1 Tropfen der Suspension zu jeder der Serumverdünnungen auf dem Glasplättchen.

7. Rühre jedes der Serumlatexgemische mit einem der zur Verfügung stehenden Mischstäbe. Beginne mit dem Gemisch an der Stelle 2, breite es so aus, daß es die Fläche innerhalb des Kreises auf der Glasplatte bedeckt und wiederhole das Gleiche mit dem Gemisch an der Stelle 1.

8. Bewege das Glasplättchen mäßig und maximal 2 Minuten unter Beachtung der makroskopischen Agglutination hin und her. Diese kann am besten erkannt werden, wenn die Glasplatte gegen einen entfernten, dunklen Hintergrund betrachtet wird (wenn der Versuch an einem Arbeitstisch in der Nähe eines Fensters durchgeführt wird, kann der Fußboden neben dem Arbeitsplatz als Kontrast zur Beobachtung des Latexmusters auf der Glasplatte dienen).

Wie bei allen auf Glasplatten durchgeführten Agglutinationsreaktionen sind die Ergebnisse am besten bei Beobachtung in hellem, diffusem Tageslicht, wobei jedoch die erhaltenen Muster mit dem Testsatz extrem klar ausgeprägt sind und leicht unter allen normalen Lichtbedingungen beobachtet werden können.

Kontrollen

Das Reagens hat ausgezeichnete Stabilität und macht es normalerweise nicht erforderlich, die bekannten positiven oder negativen Kontrollseren bei jedem Versuchsablauf durchzuführen. Wenn jedoch ein Zwischenraum von mehreren Tagen oder Wochen seit dem letzten Test vorliegt, kann es zweckmäßig sein, das geeignete Funktionieren des Systems sicherzustellen, wozu man die Latexsuspension mit dem positiven, in dem Versuchssatz enthaltenen Kontrollserum prüft. Dieses ist als 1 :5-Verdünnung eines ungefähr 50 μg/ml FAP enthaltenden Serums hergestellt. Für die geeignete Versuchskontrolle sollte daher das Kontrollserum, wie es ist und bei einer weiteren Verdünnung von 1:10 (entsprechend den 1 :5- und 1 :50-Verdünnungen der normalerweise untersuchten Seren) verwendet werden. Zur Herstellung einer 1 :10-Verdünnung sind 0,25 ml Glycinpuffer in ein kleines Röhrchen zu geben und 1 Tropfen positives Kontrollserum hinzuzufügen. Die Verdünnung ist dann zu mischen und 1 Tropfen an der Stelle 2 des Objektträgers zu placieren; an der Stelle 1 des Objektträgers ist 1 Tropfen des Kontrollserums, wie es vorliegt, zu placieren. Das Verfahren ist dann entsprechend der oben angegebenen Stufe 6 fortzuführen. Unter diesen Umständen sollte der Versuch an der Stelle 1 Agglutination, der an der Stelle 2 keine Agglutination zeigen.

Bewertung der Ergebnisse

Ein agglutiniertes Muster an einer Stelle auf dem Objektträger zeigt das Vorhandensein von FAP in einer größeren Konzentration als 3 μg/ml in der Serumverdünnung an dieser Stelle. Weil die Verdünnungen an der Stelle 1 und an der Stelle 2 1:5 bzw. 1 :50 sind, zeigt ein positives Ergebnis an der Stelle 1, daß FAP in dem Ausgangsserum in einer Konzentration über 15 μg/ml vorhanden war, während die Agglutination an der Stelle 2 anzeigt, daß die Ausgangskonzentration größer als 150 μg/mί betrug.

Beachte

Wenn die Agglutination an der Stelle 2 auftritt, muß sie ebenso an der Stelle 1 vorhanden sein. Wenn dies nicht der Fall ist, ist der Versuch nicht einwandfrei durchgeführt worden.

Claims

Patentansprache:

1. Immunologisches Reagens für die Verwendung bei der Bestimmung eines Humanfibrinogen-Abbauproduktes, welches mit Antikörpern sensibilisierte, adsorbierende, inerte Teilchen aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper in einem Säuger, außer Menschen, gegen das Humanfibrinogen- Abbauprodukt gezüchtet wurden.

2. Immunologisches Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine wässerige Suspension der sensibilisierten, inerten Teilchen enthält

3. Immunologisches Reagens nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die adsorbierenden, inerten Teilchen Siliciumdioxid, Bentonit Kohle, Aluminiumoxid, Kaolin oder Polyacrylsäure-Polymerisate, oder geeignet behandelte rote Blutkörperchen oder Bakterien sind.

4. Immunologisches Reagens nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die inerten Teilchen solche aus einem Polystyrol-Latex sind.

5. Immunologisches Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die inerten Teilchen einen Durchmesser von 0,01 bis 1 Mikron aufweisen.

6. Immunologisches Reagens nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der inerten Teilchen in wässeriger Suspension 0,2 bis 5% Gewicht/Volumen beträgt

7. Immunologisches Reagens nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der inerten Teilchen in wässeriger Suspension 0,4 bis 1 % Gewicht/Volumen beträgt

8. Immunologisches Reagens nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet daß das Humanfibrinogen-Abbauprodukt Fragment D und/oder E ist

9. Verfahren zur Herstellung eines immunologischen Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) zur Bildung eines Antiserums gegen das Humanfibrinogen-Abbauprodukt im Blut eines Säugers, außer Menschen, einem Säuger, außer Menschen, das Humanfibrinogen-Abbauprodukt injiziert

(b) das Blut des Säugers sammelt,

(c) das Antiserum aus dem Blut des Säugers isoliert, gegebenenfalls

(d) das Antiserum unter Bildung einer Antikörper-Fraktion fraktioniert und

(e) adsorbierende, inerte Teilchen mit dem Antiserum oder der Antikörper-Fraktion desselben sensibilisiert

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß dem Reagens zur Stabilisierung Serumalbumin zugegeben wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß man das Fibrinogen-Abbauprodukt durch Spaltung von Humanfibrinogen oder -fibrin mit einem proteolytischen Enzym erhält

12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Humanfibrinogen-Abbauprodukt die Fragmente D und/oder E enthält.

Die Erfindung bezieht sich auf ein immunologisches Reagens gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Reagens.

Fibrinogen-Abbauprodukte (FAP) sind normalerweise im Blut als Folge der enzymatischen Wirkung vorhanden, die für die Spaltung von unerwünschtem Fibrin nach Blutkoagulation verantwortlich ist Die zwei Hauptfragmente von FAP sind die Fragmente D und E, vgL Marder, V. J, »Immunologie structure of fibrinogen

ίο and its plasmin degradation products. Theoretical and clinical considerations« in »Fibrinogen«, Herausgeber K. Laki, 1968, Marcel Dekker Ina, New York und Edward Arnold (Publishers) Ltd, London, Seiten 339 bis 358. Der FAP-Spiegel im Blut gewinnt in Verbindung mit den mit der Blutkoagulation und Fibrinolyse verbundenen Problemen ein steigendes Interesse. Eine abnormale Blutkoagulation ist durch einen hohen FAP-Spiegel in dem zirkulierenden Piasma gekennzeichnet und daher dient dieses einer Frühindikation von thrombotischen Zuständen, wie sie als Folge von chirurgischen Eingriffen eintreten, oder in Verbindung mit Myokardinfarkt auftreten können.

Die zur Bewertung der FAP zur Zeit zur Verfügung stehenden Verfahren beruhen auf einem Hämagglutina tions-Hemmtest.

Dieser verwendet gegerbte bzw. tanninbehandelte rote Blutkörperchen, die mit Fibrinogen sensibilisiert und mit einem Antiserum gegenüber dem Fibrinogen agglutiniert sind. Diese Art von Untersuchung erfordert weil sie sehr genau ist eine SpezialVorrichtung und einen hohen Stand an technischem Können, ist jedoch zeitraubend, da sie einen Zeitbedarf von ungefähr 3 Stunden zu ihrer Durchführung erfordert Außerdem ist es ein indirekter oder Agglutinations-Hemmtest, der auf

» der Inhibierurg der Agglutination durch Kombination zwischen dein Antiserum und den FAP beruht Der Hämagglutinations-Hemmtest ist daher für Forschungszwecke geeignet jedoch für* Routineuntersuchungen klinischer Probleme nur begrenzt verwendbar. Auf dem klinischen Gebiet kann auf extreme Genauigkeit zugunsten der Schnelligkeit und leichteren Durchführung einer FAP-Untersuchung verzichtet werden.

Es wurden bereits Versuche unternommen, eine schnellere Untersuchung für FAP auf dem Prinzip eines direkten Agglutinationstests unter Verwendung eines Latexreagens, das mit Antikörpern gegenüber Fibrinogen sensibilisiert ist zu entwickeln, wobei jedoch festgestellt wurde, daß dieses Reagens zwar sehr empfindlich gegenüber Fibrinogen ist jedoch zur Messung der Abbauprodukte unbefriedigend arbeitet, vgl. Blood, I. of Hematology, Vol. 28, Nr. 1, 1966, S. 1 — 18. Die Aufgabe der Erfindung war daher, ein Untersuchungsverfahren zu schaffen, das schnell und leicht durchzuführen ist jedoch noch empfindlich und daher für klinische Routinezwecke zur Messung von FAP geeignet ist.

Diese Aufgabe wird bei einem Reagenz der eingangs beschriebenen Art dadurch gelöst, daß die Antikörper in einem Säuger, außer Menschen, gegen das Humanfibri nogen-Abbauprodukt gezüchtet wurden.

Irgendwelche herkömmliche, adsorbierende, inerte Partikel, wie sie zur Verwendung bei einem Agglutinierungsversuch bekannt sind, können in dem Reagens der vorliegenden Erfindung verwendet werden. So können die inerten Partikel Bakterien oder geeignet behandelte rote Blutkörperchen oder Partikel von Siliciumdioxid, Bentonit Kohle, Aluminiumoxid, Kaolin oder Polyacrylsäurepolymerisaten sein, obgleich die Partikel von