DE3522531A1 - Verfahren zum quantitativen analysieren von tumorglobulin in magensaft - Google Patents

Description

Die Erfindung liegt allgemein auf dem Gebiet der quantitativen Analyse bei Magenkrebs, um eine Frühdiagnose durch Unterscheiden zwischen bösartigen und nicht bösartigen Tumoren der Magenschleimhaut möglich zu machen.

Das Antigen und der Antikörper, die bei der Diagnose von Magenkrebs einen Komplex bilden, ist in der US-PS 4 219 des Erfinders der vorliegenden Anmeldung beschrieben. Über dieses in der PS beschriebene Antigen ist in Cancer Research, Vol. 33, Januar 1973 berichtet worden. Das Antigen reagiert immunochemisch und gibt eine Präcipithin-Linie nach doppelter Diffusion in Agargel. Der in der oben genannten PS beschriebene qualitative Test ist bei Konzentrationen von Tumor-Globulin aus gastrischem Aspirat in der Größenordnung von 250 ug/ml von Proben, genommen von dem Magensaft des gefährdeten Patienten, wirksam und erfüllt drei zusätzliche Diffusionskriterien.

Es ist bekannt, Abtrennmethoden, die Chromatographie benutzen, anzuwenden, um das Protein-Antigen zu konzentrieren und dadurch größere Empfindlichkeit einer quantitativen Analyse unter Verwendung des Enzym linked Immunosorbent Assay, nachstehend mit ELISA bezeichnet, zu erhalten.

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In der US-PS 4 269 765 (Matsuka) ist ein Verfahren zur Herstellung eines spezifischen Immunserums aus den Flüssigkeiten von krebskranken Patienten beschrieben, das zur Diagnose von Krebs geeignet ist. Dabei wird Peritonealflüssigkeit von Magenkrebspatienten auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt und an einer Säule von DiethylaminoethyI-(DEAE)-Cellulose, die mit 0,2 M Acetatpuffer auf _ph 5,5 eingestellt ist, gereinigt. Im Gegensatz zu diesem sauren Verfahren und im Gegensatz zum Elektro-Fokussieren, das bei dem Verfahren nach der ÜS-PS 4 269 765 angewendet wird, wird erfindungsgemäß die Konzentrierung an einem Agarose-Puffer bei einem pH-Wert von 8 mit sauren Dikalium-Phosphatpuffern vorgenommen. Das Austauscherharz ist bei der vorliegenden Erfindung ein Anionenaustauscherharz von Agarose, und die Fraktionierung, ausgeführt nach Verwerfen der ersten Fraktion, und Eluieren des absorbierten Proteins mit einer kleinen Menge gepufferten Phosphats eines pH-Wertes von 8 in Gegenwart steigender Mengen von Salz (0,1 M bis 0,2 M) resultiert in einer Reinigung von mindestens dem Zehn- bis Zwanzigfachen und bis zu dem Achtzigfachen.

Die US-PS 3 960 827 (Björklund) zeigt ein Verfahren zum Reinigen eines krebsassoziierten Polypeptid-Antigens, bei welchem verschiedene Typen von Molekularsieb-Gelen in Perlform verwendet werden, wie Polyacrylamidgele,

Dextrangele und Agarosegele, die mit einem geeigneten Puffer bei pH-Werten über 7,0 im Gleichgewicht gehalten werden. Unter den in der PS gebrachten Beispielen für Gele ist keines, das kovalent gebundene Diethylaminoethyl-Gruppen hat. Die Technik besteht darin, eine isoelektrische Einstellung des pH-Wertes auszuwählen, um das Protein zu fällen. Um diese Fällung auszuführen, wird ein pH-Gradient erzeugt, der getestet wird.Dieses komplexe Reinigungsverfahren wird erfindungsgemäß durch die Verwendung von kovalent gebundenen Agaroseperlen, die Diethylaminoethylgruppen, und bei der besten Ausführungsform auch den Farbstoff Cibacron Blue F3GA angefügt haben, vermieden.

Es ist bekannt, Peroxidase als eine Markierung in einem ELISA zu verwenden und Beispiele für die Reinigung von Protein, gefolgt von dem ELISA Assay sind in der US-PS 4 447 545 von DeFazio et al. zum Nachweis von Blasenkrebs beschrieben.

DeFazio boschreibt ein Screening der Risiko-Population (the at risk population) und eine Nachweismethode, bei der ein besonderes Protein, bezeichnet mit CRP-Protein, das bei Entzündungen und in Krebsmetastasen gefunden wurde, von Blasenkrebskranken gewonnen werden kann. Eine erste Stufe ist das Sammeln von Urin und Abtrennen des Blasenkrebsproteins an der Chromatographiersaule, in

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welcher Hydroxyapatit das Absorbens ist. Es werden zwei getrennte Fraktionen bei verschiedenen Phosphatkonzentrationen eluiert. Die zweite Fraktion wurde gegen Anti-CRP, ein Antiserum, das im Handel (von Miles Laboratory) erhältlich ist, in Immunelektrophorese bei pH 8,2 in einem Agarosegel getestet. Im Gegensatz dazu wird bei der vorliegenden Erfindung eine Chromatographiersaule verwendet, die ein Anionenaustauscherharz in Perlenform, nämlich Agarose, kovalent gebunden an DEAE und vorzugsweise auch an den Farbstoff Cibacron Blue F3GA, enthält.

Die zweite Stufe bei dem DeFazio-Verfahren ist eine quantitative ELISA-Analyse.

Aus der US-PS 3 725 075 (Muroi et al.) ist auch bekannt, zunehmende Natriumchloridkonzentrationen zum Eluieren der abgetrennten Proteine zu verwenden. Diese PS ist im Hinblick auf die Prinzipien der Proteintrennung bei optimalem pH von allgemeinem Interesse.

Es ist darauf hinzuweisen, daß die in der schon genannten US-PS 4 447 545 (DeFazio) offenbarte Lehre zur Reinigung von Protein auf der Gewinnung einer sehr viel größeren Menge Protein, welches für Blasenkrebs bei Menschen charakteristisch ist, beruht, als der Menge Protein, die im Magensaft vorliegt.

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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Anreicherungsverfahren von gereinigtem Tumor-Globulin, das mit Magenkrebs verbunden ist, und ein Verfahren zum Nachweis sehr kleiner Mengen von Immunglobulin G (IgG) in diesem gereinigten Protein anzugeben.

Ein Merkmal der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur Anreicherung gereinigten Tumorglobulins, das mit Magenkrebs verbunden ist, und aus abgesaugtem Magensaft gewonnen wird, der von Krebspatienten gesammelt wurde, nach dem in der eingangs genannten US-PS 4 219 539 des Anmelders der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren, um eine quantitative Analyse des angereicherten Proteins, das ein Magenkrebs-Tumorglobulin ist, anzugeben, wobei ein ELISA-Test ausgeführt wird, um eine Empfindlichkeit des Nachweises des Tumorglobulins bis hinunter auf etwa 1 Nanogramm pro Milliliter (ng/ml) Magensaft des Patienten zu ermöglichen.

Ein weiteres Merkmal der Erfindung ist die Bereitstellung eines Standards zum Nachweis sehr kleiner Konzentrationen in Bereichen, basierend auf den angereicherten Proteinen, wobei ein Enzym linked Immunosorbent Assay verwendet wird, um die Menge Tumor-IgG anzugeben, die gewonnen wird von der ausgedehnten öhromatographischen Proteinreinigung an dem speziellen geperlten Agarose-Anionen-Austauscherharz,

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dem Diethylaminoethylgruppen und vorzugsweise auch Cibacron Blue F3GA durch kovalente Bindung angefügt ist. Der Wert, ausgedrückt in Nanogramm IgG/Mikrogramm Protein in dem chromatographisch gereinigten, aus dem Magensaft gewonnenen Produkt, ist mindestens drei bis viermal so groß wie der Wert, der beim Testen von normalem Magensaft von Patienten, bei denen kein Krebs festgestellt worden ist, nach der gleichen Methode erhalten wird. Tatsächlich zeigt das Testen von normalen Patienten eine große Anzahl von Proben, bei denen kein IgG-Nachweis erhalten wird, einen Null-Wert, der beim ELISA-Test nicht registrierbar ist; in allen Fällen ist der normale IgG-Wert, ausgedrückt pro mg gewonnenen Proteins, kleiner als 2,0 ng IgG/mg Protein und in keinem Fall kleiner als 1 IgG/mg Protein. Der Test ist so empfindlich, daß zwischen 0,05 ng/ml und 0,10 ng/ml nachgewiesen werden.

Weitere Merkmale der Erfindung werden aus der nun folgenden ins einzelne gehenden Beschreibung hervorgehen.

In der US-PS 4 219 539 hat der Erfinder der vorliegenden Anmeldung einen einfachen Test an einer Ouchterlony-Platte beschrieben, bei welchem die gesammelten Magensaftproben gegenüber einem Anti-IgG und einem Anti-Fc verwendet wird, um die doppelte Präzipitantlinie bei der ersten Immundiffusion zu finden. Diese Präzipitantlinie hat Sinusverlauf,

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was Komplexbildung anzeigt. Es treten einige Fälle auf, wo die doppelte Präcipitantlinie bei einem krebsverdächtigon Patienten nicht festgestellt wird. Deshalb ist ein empfindlicherer Test erwünscht, der die Reinigung oder Konzentrierung des Krebs- oder Tumor-Globulins in dem Magensaft erfordert. Dies wird erfindungsgemäß erreicht durch Vereinigen der Stufen der speziellen Säulenchromatographie unter Verwendung perlförmiger Agarose, an welche Diethylaminoethylgruppen kovalent gebunden sind, wodurch eine Reinigung des Proteins um mindestens das Zehn- bis Zwanzigfache erreicht wird; das gebundene Protein wird mit zunehmenden Salzkonzentrationen von 0,1 M bis 0,2 M verdünnt. Das gereinigte Protein wird dann mittels eines sehr empfindlichen Enzym linked Immunosorbent Assay (ELISA) getestet. Der Assay oder die Analyse ist in der Lage so kleine Mengen wie 0,1 ng IgG/mg Protein nachzuweisen. Patienten, bei denen die Magenkrebsdiagnose positiv ist, haben Werte von IgG/mg Protein, die zwischen 4,4 und 33 liegen, während Patienten mit negativer Magenkrebsdiagnose Analysenwerte unter 0,2 ng/mg Protein haben.

Das gastrische Aspirat wird gegen 0,02 M K₃HPO₄, pH 8, dialysiert. Der dialysierte Magensaft wird an einem Ionenaustauscherharz chromatographiert, der aus perlenförmiger Agarose, die sowohl Cibacron Blue F3GA als auch Diethylaminoethylgruppen kovalent gebunden enthält, auf-

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gebaut ist. Nachdem die durchbrechende Fraktion gesammelt worden ist, wird der Ausgangspuffer, 0,1 M bis 0,2 M K₂HPO₄ in NaCl, hergestellt und eine zweite Fraktion, die das Magenkrebs-Tumorglobulin enthält, wird gesammelt. Diese Fraktion wird gegen phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) dialysiert und lyophilisiert. Vor dem Analysieren wird das Lyophilat mit 0,05 M Natriumbarbital-Puffer wieder auf eine Proteinkonzentration von 10 mg/ml gebracht. Mit dem wieder hergestellten Lyophilat wird Immunelektrophorese gegen Magentumor-Globulin-Antisera durchgeführt. Ein Anodenbogen im Bereich Oi₁ -ß^ wird als ein positiver Test angesehen.

Bei einem ELISA-Test, der zur Verstärkung von gastrischem Tumorglobulin entwickelt worden ist, wird Avidin-Biotin und Meerrettich-Peroxidase verwendet, um so geringe Mengen an gastrischem Tumorglobulin wie 0,1 bis 02 ng/mg Protein bestimmen zu können.

Die hohe Affinität von Avidin zu Biotin, verbunden mit der Leichtigkeit,mit welcher Biotin an Tumorglobulin konjugiert, resultiert in extrem empfindlichen Analysen.

Avidin ist ein basisches Glykoprotein eines Molekulargewichts von 68.000. Sein Name ist auf die Tatsache zurückzuführen, daß seine Affinität zu Biotin so hoch ist - etwa

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eine Million mal größer als die der meisten Antikörper-Antigen-Bindungen, und die Avidin-Biotin-Bindung ist praktisch irreversibel.

Biotin hat ein Molekulargewicht von etwa 274 und konjugiert leicht mit Proteinen,ohne die biologische Aktivität der Proteine zu ändern.

Bei dem erfindungsgemäßen Test, bei dem die Avidin-Biotin-Bindung verwendet wird, ist Meerrettich-Peroxidase biotinyliert Das Avidin wird mit der Biotin-Peroxidase in einem bestimmten Verhältnis bebrütet, so daß ein dreidimensionaler Komplex gebildet wird. Neun Moleküle Meerrettich-Peroxidase werden durch drei Avidinmoleküle zusammengehalten, wobei eine Biotinbindungsstelle offen bleibt, welche das Tumorprotein in Gegenwart eines chromogenen Substrats anzeigt.

Die beigefügte Figur zeigt die Eichkurve für den ELISA-Test, ausgeführt nach der Erfindung. Auf der X-Achse ist die IgG-Konzentration in Nanogrammen und auf der Y-Achse die Absorbanse bei 450 Nanometer aufgetragen.

Die quantitative Screening-Analyse von Tumorglobulin aus Magensaft folgt im allgemeinen der Probenahmemethode, wie sie in der US-PS 4 219 539 beschrieben ist, schließt aber die nachstehenden zusätzlichen quantitativen Stufen ein:

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1. Sammeln von krebshaltigem Magensaft durch einen Nasen-Magen-Schlauch und auch durch ein Endoskop während der Gastroskopie.

2. Dialysieren gegen 0,005 molaren Tris-Puffer, um Verunreinigungen zu eliminieren.

3. Fraktionieren von mit Magensaft assoziierten oder verbundenen Proteinen an einer Säule von Agaroseperlen, die Dimethylaminoethylgruppen kovalent gebunden haben oder die zusätzlich Cibacron Blue F3GA kovalent gebunden haben (Beide Materialien werden von der Firma BioRad Company, Richmond, California in den Handel gebracht). Pro Milligramm chromatographiertes Globulin wird 1 Gramm Agarose verwendet. Es wird eine Fließrate von etwa 5 bis 10 ml pro Stunde angewendet.

4. Entfernen der ersten Fraktion, Verwerfen und Sammeln von Krebstumorglobulin in einer Menge von etwa 6 ml, von welchen die zweite Fraktion gebildet wird.

5. Dialysieren der zweiten Fraktion der Stufe 4 gegen mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung und Durchführen eines Qualitätskontrolltests am Lyophilat, bei welchem etwa 200 μΐ Tumorglobulin zur Durchführung des ELISA-Tests gewonnen werden.

6. Durchführen des ELISA-Tests für niedrige Tumorglobulinwerte unter Verwendung von Avidin-Biotin und Meerrettich-Peroxidase in Gegenwart von 5-Aminosalicylsäure als das chromogene Substrat.

Sammeln von krebshaltigem Magensaft durch einen Nasen-Magen-Schlauch und auch durch ein Endoskop während der Gastroskopie:

Dem in der US-PS 4 219 539 angegebenen Verfahren folgend wird ein faseroptisches Gastroskop für multiple Biopsie verwendet und Magensaftproben werden durch einen Nasen-Magen-Schlauch und auch durch das Endoskop während der Gastroskopie eines nüchternen Patienten gesammelt. Die erste Portion der Nüchtern-Probe wird verworfen und eine adequate Portion Magensaft wird gesammelt, die intragastrikal durch Zufügen von 5%igem Natriumbicarbonat auf einen alkalischen pH-Wert gebracht worden ist, was Pepsin inaktiviert. Die gesammelte Probe (etwa 25 bis 50 ml) wird 3 bis 5 Tage gegen 0,005 M Tris dialysiert und die Dialyse wird in einem Kühlschrank mit zweimaligem Austauschen des dialysierenden Puffers ausgeführt. Die Probe wird dann lyophilisiert und wenn gewünscht, kann sie in gefrorenem Zustand bis zu ihrem Gebrauch gelagert werden. 10 mg des Lyophilats werden in 0,5 mg B-2 Barbitalpuffer gelöst (siehe das Buch "Methods in Immunology and Immonochemistry" herausgegeben von Williams und Chase, Academic Press, 1968, Vol. II, Appendix II, Seite 372). Tris ist ein Puffer, der aus Tris-(Hydroximethyl)-aminomethan hergestellt wird und in dem eben zitierten Buch auf Seite beschrieben ist.

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Fraktionieren von mit Magensaft verbundenen Proteinen durch Anionenaustausch-Säulenchromatographie: Das dialysierte Produkt aus der vorstehend beschriebenen Stufe 2, das gegen 0,02 M K₂HPO. bei pH 8 dialysiert worden ist, wird durch ein Anionenaustauscherharz geschickt; das Austauscherharz besteht aus Agaroseperlen, die behandelt worden sind, so daß sie Diethylaminoethylgruppen und den Farbstoff Cibacron Blue F3GA gebunden enthalten. Die so dialysierte wäßrige Lösung des gastrischen Aspirats läuft dann durch die vorstehend beschriebene Chromatographiersäule und eine erste Fraktion, als Fraktion A bekannt, wird gesammelt und verworfen. Es ist die zweite Fraktion B, die von der Säule abgenommen wird, welche das Tumorglobulin enthält.

Die Natriumchloridkonzentration der Ausgangspufferlösung von 0,02 M K₂HPO. wird geändert von einer NaCl-Konzentration von 0,1 M auf 0,2 M und der Puffer wird durch die Säule geschickt, um die zweite Fraktion zu eluieren, welche die höher konzentrierte Tumorglobulinfraktion aus dem gastrischen Aspirat ausmacht. Diese Fraktion B wird dann als das Probematerial für den ELISA-Test verwendet.

ELISA-Test für niedrige Tumorglobulinwerte: Der ELISA-Test ist bevorzugt ein Mikro-ELISA-Test, der besonders auf Präzisions-Reproduzierbarkeit und Genauigkeit

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bei sehr kleinen Mengen gewonnenen Tumorproteins ausgelegt ist. Solche Mikro-ELISA-Testsysteme des Standes der Technik sind von vielen Herstellern erhältlich und diese Testsysteme verwenden speziell hergestellte Mikrotiterplatten, die der Aufnahme kleiner Probemengen angepaßt sind. Die Platten sind aus Kunststoff hergestellt, der inert oder nicht reaktiv gegenüber den in dem Testsystem verwendeten Reagenzien ist. Die benutzten Systeme eignen sich außerdem selbst zum optischen Abtasten bei Verwendung von Spezial-Abtastvorrichtungen, die dem Messen der Absorptionsfähigkeit (absorbency) im Ultraviolettbereich angepaßt sind. Ein Lieferant für ELISA-Material ist Bio-Rad Laboratories in Richmond, California. Ein anderer Lieferant ist Cappel Laboratories, a Division of Cooper Diagnostics Inc. in West Chester, Pennsylvania. Ein dritter Lieferant ist Miles Scientific, a Division of Miles Laboratories, Inc. in 30 West 375 North Aurora Road, Naperville, 111. 60566.

Es gibt viele Lieferanten in Europa, deren Produkte auch in den Vereinigten Staaten auf den Markt gebracht werden. Die Vorrichtung, die zum Ablesen der Ergebnisse verwendet wird, zum Beispiel der optische Apparat, wird hergestellt von Dynatech Laboratories, 900 States Lane, Alexandria, Virginia 22314. Die Reagenzien, die Vorrichtung und die Laborplatten für die Mikro-ELISA-Methode sind alle für die Peroxidase-Substrate für eine große Vielzahl von

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Chromogenen ausgearbeitet worden und es ist anerkannt, daß die Mikro-ELISA-Methode benutzt werden kann, um sehr kleine Mengen Protein nachzuweisen.

Dynatech Laboratories stellt die Notwendigkeit heraus, optimale Bedingungen bei Verwendung der Bezugsreagenzien zu schaffen, die genau eingehalten werden müssen, um Reproduzierbarkeit zu erhalten. Eine erste entscheidende Bedeutung hat der Puffer. Eine zweite entscheidende Bedeutung hat die Stabilität des konjugierten Enzyms. Eine weitere entscheidende Bedeutung haben die Inkubationszeit, die Temperatur, die Konzentration der Reaktanten und das Nachdrucklegen auf die Beibehaltung der Bedingungen, um Reproduzierbarkeit zu sichern. Schließlich müssen übereinstimmende visuelle Ergebnisse in den Vertiefungen mit fotometrischen Ablesungen in Wechselbeziehung gebracht werden. In dieser Beziehung ist die Auswahl des Chromogens wichtig. Das im vorliegenden Fall ausgewählte Chromogen war 5-Aminosalicylsäure. Andere Chromogene sind Diaminobenzidin; das Diammoniumsalz des 2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzothiazolin-sulfon-6); o-Phenylendiamin (OPD).

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann irgendeines dieser Chromogene verwendet werden, da jedes unter bestimmten bekannten Bedingungen an die beste Wirkungsweise angepaßt werden kann. Die hier beschriebenen Tests wurden mit

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5-Aminosalicylsäure als Chromogen durchgeführt, aber bei früheren Tests wurde 3,3",5,5'-Tetramethylbenzidin als Chromogen verwendet.

Testen bei Humanpatienten:

Bericht über Immunglobulin-G-Werte in Krebsproben aus Japan: Magensaft-Lyophilate, die von Patienten mit Magenkrebs erhalten worden waren, wurden von T. Norobu, MD & DDS, Director, Chiba Cancer Center, Chiba, Japan bereitgestellt. 5 bis 7 mg der Lyophilate wurden in 0,01 M Natriumphosphat, 0,15 M Natriumchlorid, pH 7,2, gelöst. Der Proteingehalt der gelösten Lyophilate (die in einem Gesamtvolumen von 1 ml waren) wurden nach der Coomassie-Farbstoff-Bindungsmethode ((1) "Instruction Manual for Bio-Rad Protein Assay, Bio-Rad Laboratories, Richmond, Californie 1981") getestet. Das Protein lag im Bereich von 0,5 bis 5,8 mg/ml. Die Immunglobulin G-Analyse wurde nach der ELISA (Enzym linked Immunoassay)-Methode ausgeführt (siehe Miles Scientific, Naperville, Illinois (2) "Product Profile 1984 Peroxidase conjugated antisera, Miles Scientific, Naperville, Illinois"). Das Verfahren war die direkte Analyse, bei der Anti-IgG, gekoppelt an Meerrettich-Peroxidase, verwendet wurde. Das Substrat (Chromogen) was 5-Aminosalicylsäure. Die Reaktion wurde in Mikrotiterplatten ausgeführt und die einzelnen Vertiefungen (nach der Farbentwicklung) wurden optisch unter Verwendung des Dynatech

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Optical Scanner (Dynatech Laboratories, Alexandria, Virginia) abgelesen. Der Bereich des Human-IgG in den Magensaftproben wurde aus der Eichkurve der Fig. 1 bestimmt. Die Konzentrationen in der Kurve reichten von 2 ng bis 38 ng.

Sammeln und Säulenchromatographie:

1. Sammeln von Magensaft von Krebspatienten durch einen Nasen-Magen-Schlauch und auch durch ein Endoskop während der Gastroskopie.

2. Dialysieren gegen 0,005 M Tris-Puffer.

3. Fraktionieren der mit Magensaft verbundenen Proteine unter Verwendung von Agarose in Perlform, die den Farbstoff Cibacron Blue F3GA* und Diethylaminoethylgruppen kovalent gebunden hat.

4. Entfernen der ersten Fraktion, Verwerfen und Sammeln des Krebstumorglobulins.

5. Dialysieren der zweiten Fraktion gegen mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung und qualitativer Kontrolltest am Lyophilat.

6. ELISA-Test für niedrige Tumorglobulinwerte unter Verwendung von Avidin-Biotin und Meerrettich-Peroxidase in Gegenwart von 5-Aminosalicylsäure als das Chromogensubstrat.

Das vorstehend beschriebene Verfahren wurde abgewandelt, um die Miles Scientific Mikro-ELISA-Methode wiederzugeben.

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Die IgG-Reagenzien, erhältlich von Miles für den Nachweis von IgA, waren Code Nr. 61-130, Human-IgG, Titer 1:1500; oder Code Nr. 61-230, Human-IgG, Titer 1:2500.

*Cibacron F3GA hat die nachstehende Formel:

Cl

Dieser Farbstoff ist auch bekannt als Procion-ICI, Cibacron Clba, 1957 eingeführt. Procion ICI ist der Warenzeichenname der Imperial Chemical Industries in England. Cibacron ist der Warenzeichenname der Ciba Company in der Schweiz. Die Cibacron Blue Farbstoffe der 3G-Serie wurden 1957 eingeführt und werden weit verbreitet als Reaktionsfarbstoffe für Cellulose verwendet.

Es wurde das nachstehend beschriebene Verfahren angewendet, das dem Verfahren von Miles für die Mikro-ELISA-Methode entspricht:

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Mikro-ELISA-Methode

Reagenzien:

1. Beschichtungspuffer

1OmM Phosphatpuffer, pH 7,4 150 mM NaCl
1,1% Natriumazid

2. Waschpuffer

1OmM Phosphatpuffer, pH 7,4 15OmM Natriumchlorid 0,05% (V/V Tween 20)

3. Reaktionspuffer

0,02 M Natriumphosphat, pH 6,8

4. Stoppuffer
3M NaOH

5. 5-Aminosalicylsäure

6. Wasserstoffperoxid

Verfahren:

1. Löse Antigen in Beschichtungspuffer, 20 ug/inl

2. Pipettiere 0,2 ml der Überzugslösung auf jede Vertiefung der Polystyrol-Mikrotiterplatte und bebrüte (bedeckt) über Nacht bei 4⁰C.

3. Entferne die Überzugslösung und wasche dreimal mit dem Waschpuffer.

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4. Verdünne das Peroxidasekonjugat mit Waschpuffer. Man kann einzelne oder laufende. Verdünnungen vornehmen, aber es ist am besten mit einer Verdünnung zu beginnen, die gut unterhalb des erwarteten Titers liegt, zum Beispiel 1:50 oder 1:100, Füge 0,15 ml verdünntes Konjugat zu jeder Vertiefung zu.

5. Bebrüte bei Raumtemperatur 2 Stunden.

6a. Bereite die Reaktionslösung während des Bebrütens vor. Löse 1 mg 5-Aminosalicylsäure pro ml auf 56°C vorgewärmten Reaktionspuffer.

6b. Füge etwa 1 bis 5 mg Aktivkohle zu je 100 ml Substrat zu. Mische durch und Filtriere durch ein Filterpapier Whatman No. 1. In dieser Stufe wird überschüssige Farbe aus der Substratlösung entfernt.

6c. Bereite eine frische l%ige Lösung von Peroxid in Waser und füge 0,1 ml davon zu je 10 ml des Reaktionssubstrats .

7. Wasche im Anschluß an das Bebrüten (Stufe 5) dreimal mit Waschpuffer, mindestens 5 Minuten pro Wäsche. Dann spüle dreimal mit destilliertem Wasser.

8. Gebe 0,2 ml der frisch bereiteten HpOp/Substratlösung in jede Vertiefung.

9. Stoppe die Farbreaktion nach 30 Minuten mit 0,1 ml Stopp-Puffer.

10. Lese die Absorbanz bei 450 nm ab.

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Die Ergebnisse der Magenkrebsproben sind in Tabelle 1 zusanunengestellt. Normale Magensekretionen wurden von dem Out Patient Department des Carney Hospitals, Dorchester, Massachusetts erhalten. Die Proben wurden gegen mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung dialysiert. Dann wurden die Proben lyophilisiert und der Proteingehalt mit Coomassie-Farbstoff bestimmt, wie oben angegeben. Die Proteingehalte lagen im Bereich von 0,12 bis 1,2 mg/ml Die IgG-Konzentrationen in den normalen Proben wurden wie vorstehend beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt.

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TABELLE 1

Immunoglobulin G-Konzentrationen in Proben von magenkrebskranken Patienten

Probe	IgG (ng/ml)	Protein (mg/ml)	IgG (ng/mg Protein)
2-1	15	2	7,5
2-2	6	1,8	3,3
3-1	6,5	1,0	6,5
3-2	5,5		5,0
4-1	10	2,3	4,3
4-2	9	2,1	4,3
5	10	3,1	3,2
6-1	14,6	5,8	2,5
6-2	20	0,74	27
7-1	10,5	0,42	25
7-2	11,5	0,54	21,3
8-1	9,0	0,54	16,7
8-2	8,5	0,93	9,1
9-1	15	0,76	19,7
9-2	0,35	0,74	0,5**
9-3	11,0	1,3	8,5
10-1	11,5	0,8	14,3
10-2	11,5	1	11,5
10-3	16,5	0,5	33
11-1	6,5	1,1	6
11-2	5	1	5
12-1	15	2	7,5
12-2	13,5	2,1	6,4
13-1	11,5	2,1	5,5
14-1	13,0	1,1	11,8
14-2	6,5	2	3,2
14-3	21	2	10,5
15-1	11,5	2,1	5,5
15-2	10,5	2,4	4,4

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* Die erste Zahl der Probe ist die Patienten-Kennzeichnung, die zweite Zahl gibt die Probe wieder; zum Beispiel 9-1, 9-2, 9-3 besagt drei Proben von Patient 9.

** Der bei 9-2 erhaltene untere Wert zeigt einen technischen Fehler an; der Test wurde wiederholt und gab ein Ergebnis zwischen 9-1 und 9-3.

TABELLE 2

Probe

IgG(mg/ml) Protein (mg/ml)

NGJ	(Kelly)	0,45	0,25
NGJ	(Sweet)	0,40	0,25
NGJ	(Guerro)	0	0,40
NGJ	(Fufari)	0	0,37
NGJ	(Manning)	0	0,12
NGJ	(Rizal)	0,35	0,6
NGJ	(Smith)	0,40	0,23
NGJ	(Duncan)	0,24	0,61
NGJ	(Boyle)	0	1,1
NGJ	Wilcewski)	0	0,7
NGJ	(Malloy)	0,45	1,2

IgG (ng/mg Protein)

1,8

1,6

0,6

1,7

0,4

0,4

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Claims (6)

910-21 PATENTANWÄLTE^ DR.-ING. H. NBGBNDANK* HAUCK, SCHMITZ, GRAALFS, WiSHltfERT*-DÖ-RIN. HAMBURG MÜNCHEN DÜSSELDORF PATENTANWÄLTE ■ NEUBH WAl,t, 41 ■ 20OO HAMHUHC JM Dlpl.-PhjS. W. SCHMITZ - Dipl.-Ing. B. GRAALFS Neuer WnIl 41 · 20OO Hamburg Telefon + Telecopier (040) 3Θ 67 BB Telex 02 U 769 Input d Emmanue 1 Deutsch DlpL.i„B. H. hauck - DiPL-inff. w. wbhnbrt BeaCOn Street MozoruiraSe 23 · SOW) München Telefon + Telecopier (O89) B3 92 36 BOStOn, MaSS. 02115 Telex 05216 563 pamu d Dr.-Inf». W. DÖRING K.-WUhelm-mnß 41 · 4OOO Düsseldorf Telefon (02 11) 57 BO 27 ZUSTELLUNGSANSCHHIFT / PLEASE REPLY TO: HAMBURG, 20. JUni 1985 Verfahren zum quantitativen Analysieren von Tumorqlobulin in Magensaft A_n_s_£_r_ü_c_h_e_£

1. Verfahren zum Analysieren von Magensaft eines krebskranken Human-Patienten, gekennzeichnet durch 1) Sammeln einer Magensaftprobe eines nüchternen Patienten mittels eines Schlauches, wobei die erste Nüchternprobe verworfen und eine weitere Probe gesammelt und ihr Alkali zugesetzt wird, um den pH-Wert auf über 7 zu bringen und das Pepsin zu inaktivieren;

2) Dialysieren des Magensaftes gegen 0,005 molaren Tris-Puffer, um störende Substanzen zu entfernen;

...12

European Patent Attorneya Zugelassene Vertreter beim Europäischen Patentamt

Deutsche Bank AO Hamburg, Nr. OS/28 497 (BLZ 2OO7OO0O) · Postscheck Hamburg 2842-206

Dresdner Bank AO Hamburg, Nr. 833 60 35 (BLZ 2OO 8OO 00)

3) Fraktionieren des dialysierten Materials in einer Chromatographiersaule, die mit perlförmiger Agarose, welche Diethylaminoethylgruppen kovalent gebunden hat, gefüllt ist, wodurch die mit dem Magensaft verbundenen Krebsproteine an der Säule absorbiert und Verunreinigungen in einer ersten Fraktion, die verworfen wird, entfernt werden;

4) Entfernen des konzentrierten mit Magensaft verbundenen Proteins durch Zufügen einer 0,02 molaren K₂HPO₄-PUfferlösung, zu welcher Natriumchlorid in steigender Konzentration von 0,1 bis 0,2 M zugefügt wird, um eine konzentrierte Fraktion zu entfernen;

5) Dialysieren der konzentrierten Fraktion mit 0,02 M K₃HPO₄ und 0,1 M NaCl; und

6) Durchführen eines ELISA-Tests unter Verwendung von Avidin-Biotin und Meerrettich-Peroxidase in Gegenwart von 5-Aminosalicylsäure als das chromogene Substrat, um einen IgG-Wert basierend auf der in der Probe vorhandenen Menge Protein zu erhalten, wobei ein IgG-Wert im Bereich von 2,5 ng/mg Protein bis 33 ng/mg Globulinprotein eine Aminoglobulin G-Konzentration anzeigt, die präsumptiv diagnostisch für Magenkrebs ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die in der Chromatographiersäule verwendete Agarose mit dem Farbstoff Cibacron F3GA durch eine kovalente Bindung vernetzt ist.

3. Verfahren zur Herstellung einer Probe von gereinigtem Magensaft eines Human-Patienten um jegliches verdächtiges Tumor- oder Krebs-Globulin in dem Magensaft zu konzentrieren und eine Probe für einen ELISA-Test zum Nachweisen von 0,1 ng pro mg Globulinprotein bereitzustellen, wobei ein Wert von über 2,5 ng IgG präsumptiv diagnostisch für Magenkrebs ist, gekennzeichnet durch

1) Sammeln einer Magensaftprobe eines nüchternen Patienten mittels eines Schlauches, wobei die erste Nüchternprobe verworfen und eine weitere Probe gesammelt und ihr Alkali zugesetzt wird, um den pH-Wert auf über 7 zu bringen und das Pepsin zu inaktivieren;

2) Dialysieren des Magensaftes gegen 0,005 molaren Tris-Puffer, um störende Substanzen zu entfernen;

3) Fraktionieren des dialysierten Materials in einer Chromatographiersaule, die mit perlförmiger Agarose, welche Diethylaminotheylgruppen kovalent gebunden hat, gefüllt ist, wodurch die mit dem Magensaft verbundenen Krebsproteine an der Säule absorbiert und Verunreinigungen in einer ersten Fraktion, die verworfen wird, entfernt werden;

4) Enfernen des konzentrierten mit Magensaft verbundenen Proteins durch Zufügen einer 0,02 molaren K₃HPO₄-PUfferlösung, zu welcher Natriumchlorid in steigender Konzentration von 0,1 bis 0,2 M zugefügt wird, um eine konzentrierte Fraktion zu entfernen;

5) Dialysieren der konzentrierten Fraktion mit 0,02 M K₂HPO₄ und 0,1 M NaCl; und

6) Durchführen eines ELISA-Tests unter Verwendung von Avidin-Biotin und Meerrettich-Peroxidase in Gegenwart von 5-Aminosalicylsäure als das chromogene Substrat, um einen IgG-Wert basierend auf der in der Probe vorhandenen Menge Protein zu erhalten, wobei ein IgG-Wert im Bereich von 2,5 ng/mg Protein bis 33 ng/mg Globulinprotein eine Aminoglobulin G-Konzentration anzeigt, die präsumptiv diagnostisch für Magenkrebs ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die in der Chromatographiersaule verwendete Agarose mit dem Farbstoff Cibacron F3GA durch eine kovalente Bindung vernetzt ist.