JPS61242599A - 胃液からの腫瘍グロブリンの定量スクリ−ニング検定方法 - Google Patents
胃液からの腫瘍グロブリンの定量スクリ−ニング検定方法Info
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- JPS61242599A JPS61242599A JP60130959A JP13095985A JPS61242599A JP S61242599 A JPS61242599 A JP S61242599A JP 60130959 A JP60130959 A JP 60130959A JP 13095985 A JP13095985 A JP 13095985A JP S61242599 A JPS61242599 A JP S61242599A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
１粟」！ｌ！［：卸」
本発明は一般に胃ガンの定量検定の分野にあつて、胃粘
膜の悪性腫瘍と良性腫瘍とを鑑別する際に、早期診断を
提供するためのものである。
膜の悪性腫瘍と良性腫瘍とを鑑別する際に、早期診断を
提供するためのものである。
ｗ米へ皮術−
胃ガンの診断において複合体を形成する抗原と抗体とは
、本発明者の米国特、許第４，２１９，５３９号に記載
されている。この抗原は、前記の特許明細書に記載しで
あるように、［ガンサー・リサーチ」（Ｃａｎｃｅｒ
Ｒ，ｅｓｅａｒｃｌ＋）第３３巻１９７３年１月号に報
告されており、またこの抗原は免疫化学的に反応して、
寒天ゲル中の二重拡散で１本の沈降素線を与える。前記
特許に記載されている定性検査は、ヒトの患者の胃液か
ら採取した検体１１□１当り２５０マイクログラム（μ
ｍ？）の程度の濃度の腫瘍グロブリンについて有効であ
るが、３つの追加拡散基準を満足する危険度で定量する
。
、本発明者の米国特、許第４，２１９，５３９号に記載
されている。この抗原は、前記の特許明細書に記載しで
あるように、［ガンサー・リサーチ」（Ｃａｎｃｅｒ
Ｒ，ｅｓｅａｒｃｌ＋）第３３巻１９７３年１月号に報
告されており、またこの抗原は免疫化学的に反応して、
寒天ゲル中の二重拡散で１本の沈降素線を与える。前記
特許に記載されている定性検査は、ヒトの患者の胃液か
ら採取した検体１１□１当り２５０マイクログラム（μ
ｍ？）の程度の濃度の腫瘍グロブリンについて有効であ
るが、３つの追加拡散基準を満足する危険度で定量する
。
先行技術において、クロマトグラフを使用する分離操作
を使ってタンパク質抗原を濃縮し、それによって以下に
ＥＬＩＳＡと呼称する酵素結合免疫吸収体検定を使用す
る定量検、定に対す４る感度を大きくすることは公知で
ある。
を使ってタンパク質抗原を濃縮し、それによって以下に
ＥＬＩＳＡと呼称する酵素結合免疫吸収体検定を使用す
る定量検、定に対す４る感度を大きくすることは公知で
ある。
マツダ（Ｍａｔｓｕｄａ）に許与された米国特許第４．
２６９，７６５号には、ガン患者の体液からガンの診断
に有用な免疫血清を製造する方法が記載され、その方法
では、胃ガン患者からの腹膜液をｐＨ５，５に調整し、
０．２Ｍ酢酸塩緩衝液によってｐＨ５，５で平衡してい
るジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロースのカラ
ムで精製する。この酸性１）Ｈ（ｂ）Ｈ５，５＞の操作
とは異って、またマツダらが使用した電解濃縮とは異っ
て、本発明はリン酸水素二カリウム緩衝液によってｐＨ
８に緩衝したアガロース上で濃縮する。本発明で使用す
るイオン交換樹脂はアガロース、の陰イオン交換樹脂で
あって、第１画分を捨て、食塩を次第に増量したく０．
１モルから０，２ モルまで）ｐＨ８の緩衝したリン酸
塩を少量使用して吸収されたタンパク質を溶離する分別
によって、少なくとも１０ないし２０倍の、そして８０
倍までの精製が行われる。
２６９，７６５号には、ガン患者の体液からガンの診断
に有用な免疫血清を製造する方法が記載され、その方法
では、胃ガン患者からの腹膜液をｐＨ５，５に調整し、
０．２Ｍ酢酸塩緩衝液によってｐＨ５，５で平衡してい
るジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロースのカラ
ムで精製する。この酸性１）Ｈ（ｂ）Ｈ５，５＞の操作
とは異って、またマツダらが使用した電解濃縮とは異っ
て、本発明はリン酸水素二カリウム緩衝液によってｐＨ
８に緩衝したアガロース上で濃縮する。本発明で使用す
るイオン交換樹脂はアガロース、の陰イオン交換樹脂で
あって、第１画分を捨て、食塩を次第に増量したく０．
１モルから０，２ モルまで）ｐＨ８の緩衝したリン酸
塩を少量使用して吸収されたタンパク質を溶離する分別
によって、少なくとも１０ないし２０倍の、そして８０
倍までの精製が行われる。
ビョクランド（Ｂ ｊｏｒｋｌａｎｄ）に許与された米
国特許第３，９６０，８２７号明細書は、ガンに随伴す
るポリペプチド抗原を精製する操作を示し、この明細書
は、ポリアクリルアミドゲル、デキストランゲルおよび
アガロースゲルのような、様々なモレキュラーシーブ型
のゲルをビート状にし、適当なｔＩＩ液て７．０ 以上
のｐ Ｈで平衡させて使用している。
国特許第３，９６０，８２７号明細書は、ガンに随伴す
るポリペプチド抗原を精製する操作を示し、この明細書
は、ポリアクリルアミドゲル、デキストランゲルおよび
アガロースゲルのような、様々なモレキュラーシーブ型
のゲルをビート状にし、適当なｔＩＩ液て７．０ 以上
のｐ Ｈで平衡させて使用している。
この特許明細書に示されているゲルの例では、それらゲ
ルはいずれも共有結合をしたジエチルアミノエチル基を
有するゲルてはない。さらにビョクランドの技法は、タ
ンパク質を沈澱さぜるためにｎｉｌ の等零調整を選択
するにある。この沈澱を行うために、ｐａｌ 勾配を造
りそれを試験する。本発明では精製のためのこの複雑な
操作を避けているがジエチルアミノエチル基を結合させ
た共有結合したアガロースピードそして最良の実施様態
では結合されたチバクロン ブルー（Ｃｉｂａｃｒｏｎ
Ｂ １ｕｅ）Ｆ３ＧＡ色素結合させた共有結合したア
ガロースピードを使用して行なわれる。
ルはいずれも共有結合をしたジエチルアミノエチル基を
有するゲルてはない。さらにビョクランドの技法は、タ
ンパク質を沈澱さぜるためにｎｉｌ の等零調整を選択
するにある。この沈澱を行うために、ｐａｌ 勾配を造
りそれを試験する。本発明では精製のためのこの複雑な
操作を避けているがジエチルアミノエチル基を結合させ
た共有結合したアガロースピードそして最良の実施様態
では結合されたチバクロン ブルー（Ｃｉｂａｃｒｏｎ
Ｂ １ｕｅ）Ｆ３ＧＡ色素結合させた共有結合したア
ガロースピードを使用して行なわれる。
ＥＬＩＳＡで使用する標識としてペルオキシダーゼを使
用することは公知であり、またデ・ファジイ（Ｄ ｅ
Ｆ ａｚｉｏ）らの米国特許第４，４４７，５４５号明
細書には膀胱ガンの検出のためにタンパク質を精製して
からＥ Ｌ Ｔ Ｓ Ａ検定を行う例が記載されている
。
用することは公知であり、またデ・ファジイ（Ｄ ｅ
Ｆ ａｚｉｏ）らの米国特許第４，４４７，５４５号明
細書には膀胱ガンの検出のためにタンパク質を精製して
からＥ Ｌ Ｔ Ｓ Ａ検定を行う例が記載されている
。
デ・ファジイらは炎症性疾患および転移ガン羅病中に発
見されるＣＲＰタンパク質と呼ばれる特別なタンパク質
を膀胱ガン患者から回収することからなる危険状態にあ
る集団のスクリーニングと検出方法を記載している。第
１段階は、尿を集め、吸収剤がヒドロキシアパタイトで
あるクロマトグラフカラムて膀胱ガンタンパク質を分離
することである。２つの別々の画分を、異なるリン酸塩
レベルで溶離する第２の画分を、抗ＣＲＰ、即ちマイル
ス・ラボラトリイ（Ｍ ｉ Ｉｅｓ Ｌ ａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ）から市販されている抗血清に対して、アガロー
スゲルてのｐＨ８における免疫電気泳動で検査する。こ
れとは異って、本発明は共有結合的にＤＥＡＦ、に、そ
して好適にはチバクロン・ブルー（ＣｉｂａｃｒｏｎＢ
ｌｕｅ）Ｆ３ＧＡにも結合した、ビードにしたアガロー
スの陰イオン交換クロマトグラフカラムを使用する。
見されるＣＲＰタンパク質と呼ばれる特別なタンパク質
を膀胱ガン患者から回収することからなる危険状態にあ
る集団のスクリーニングと検出方法を記載している。第
１段階は、尿を集め、吸収剤がヒドロキシアパタイトで
あるクロマトグラフカラムて膀胱ガンタンパク質を分離
することである。２つの別々の画分を、異なるリン酸塩
レベルで溶離する第２の画分を、抗ＣＲＰ、即ちマイル
ス・ラボラトリイ（Ｍ ｉ Ｉｅｓ Ｌ ａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ）から市販されている抗血清に対して、アガロー
スゲルてのｐＨ８における免疫電気泳動で検査する。こ
れとは異って、本発明は共有結合的にＤＥＡＦ、に、そ
して好適にはチバクロン・ブルー（ＣｉｂａｃｒｏｎＢ
ｌｕｅ）Ｆ３ＧＡにも結合した、ビードにしたアガロー
スの陰イオン交換クロマトグラフカラムを使用する。
デ・ファジイによる第２段階はＥＬＩＳＡ定量検定であ
る。
る。
ムロイ（Ｍｕｒｏｉ）らの米国特許第３，７２５，０７
５号により種々のタンパク質の溶離に、次第に濃度を高
めた塩化ナトリウノ＼を使用することは既知である。
５号により種々のタンパク質の溶離に、次第に濃度を高
めた塩化ナトリウノ＼を使用することは既知である。
この特許は最適１）Ｉ］でのタンパク質を分離する原理
についての一般的な教示を示している点で興味あるもの
である。
についての一般的な教示を示している点で興味あるもの
である。
デ・ファジイの米国特許第４，４４７，５４５号が教示
しているタンパク質の精製は、胃液の中に存在するタン
パク質の量よりも遥にに大量な、ヒトの膀胱ガンに特徴
的なタンパク質を回収することに基づいていることに注
目されたい。
しているタンパク質の精製は、胃液の中に存在するタン
パク質の量よりも遥にに大量な、ヒトの膀胱ガンに特徴
的なタンパク質を回収することに基づいていることに注
目されたい。
見枡だ荒海しようと −るロ 一
本発明の目的は、胃ガンに随伴していて、本発明者の先
行米国特許第４，２１９，５３９号で説明した操作によ
って、患者から採取した吸引ガン液から回収した腫瘍グ
ロブリンを精製する新規な濃縮操作を提供して、胃ガン
腫瘍グロブリンである濃縮されたタンパク質に対する定
量検定が実施できるようにし、その後にＥＬｉＳＡ検査
を行って患者の胃液３−ｘ１当り約１ナノ・グラム（ｎ
ｇ）までもの少量の腫瘍グロブリンを検出する感度を与
えることである。
行米国特許第４，２１９，５３９号で説明した操作によ
って、患者から採取した吸引ガン液から回収した腫瘍グ
ロブリンを精製する新規な濃縮操作を提供して、胃ガン
腫瘍グロブリンである濃縮されたタンパク質に対する定
量検定が実施できるようにし、その後にＥＬｉＳＡ検査
を行って患者の胃液３−ｘ１当り約１ナノ・グラム（ｎ
ｇ）までもの少量の腫瘍グロブリンを検出する感度を与
えることである。
本発明のさらに別の目的は、濃縮したタンパク質をベー
スにした範囲で非常に小さい濃度を検出する標準法を提
供することであって、この標準法は酵素結合免疫吸収体
検定を使用して、特別なビートにしたアガロースおよび
、結合されたジエチルアミノエチル基および好適には共
有結合によって結合されたチバクロン・ブルーＦ３ＧＡ
をも有する陰イオン交換樹脂の上で、タンパク質の拡張
されたクロマトグラフ精製から回収された腫瘍Ｉ９Ｇ
の量を関連させるにある。胃液からクロマトグラフによ
り回収された精製品中に存在するタンパク質１マイクロ
・グラム（μｍ？）当りのＴｙＧのｎｇで表わした値は
、ガンの診断がなかった患者からの正常な胃液を、同じ
操作で検査して得た値の、少なくとも３〜４倍の大きさ
である。事実、正常な患者を検査すると、ＥＬＩＳＡ検
査で記録できないゼロ値を示すＩｇＧ 検査値を示す極
めて多数の検体があり、またすべての場合に回収された
タンパク質１屑ｇ当って表わした正常なＩ）ｇＧ レ
ベルは、タンパク質１肩り当り２．Ｏｒ＋ｙ以下のＩｇ
Ｇであり、如何なる場きにもタンパク質のｌｌ１ｇ当り
］、ＴｇＧ 以下のことはない。この検査は、０ 、０
５ ｎｇ／ｗｌ−０、１０ｎｇ／ｍｌを検出する感度が
ある。
スにした範囲で非常に小さい濃度を検出する標準法を提
供することであって、この標準法は酵素結合免疫吸収体
検定を使用して、特別なビートにしたアガロースおよび
、結合されたジエチルアミノエチル基および好適には共
有結合によって結合されたチバクロン・ブルーＦ３ＧＡ
をも有する陰イオン交換樹脂の上で、タンパク質の拡張
されたクロマトグラフ精製から回収された腫瘍Ｉ９Ｇ
の量を関連させるにある。胃液からクロマトグラフによ
り回収された精製品中に存在するタンパク質１マイクロ
・グラム（μｍ？）当りのＴｙＧのｎｇで表わした値は
、ガンの診断がなかった患者からの正常な胃液を、同じ
操作で検査して得た値の、少なくとも３〜４倍の大きさ
である。事実、正常な患者を検査すると、ＥＬＩＳＡ検
査で記録できないゼロ値を示すＩｇＧ 検査値を示す極
めて多数の検体があり、またすべての場合に回収された
タンパク質１屑ｇ当って表わした正常なＩ）ｇＧ レ
ベルは、タンパク質１肩り当り２．Ｏｒ＋ｙ以下のＩｇ
Ｇであり、如何なる場きにもタンパク質のｌｌ１ｇ当り
］、ＴｇＧ 以下のことはない。この検査は、０ 、０
５ ｎｇ／ｗｌ−０、１０ｎｇ／ｍｌを検出する感度が
ある。
さらに他の目的は、以下の詳細な記載およ全好適な操作
を提供する実施例から明瞭になる筈である。
を提供する実施例から明瞭になる筈である。
圃ＩロＩ解−状４Ｕζ件の、ｌＪＬ
本発明者の米国特許第４，２１９，５３９号には、採取
した胃液検体を抗１ｇＧ および抗Ｆｅに対して使用し
て、第１の免疫拡散て二重沈澱剤線を見出だすことから
なるＤ ｕｃｂｔｅｒｌｏｎｙ板上での簡単な検査法が
記載されている。この沈澱割線は複合体の生成を指示す
る複雑な特徴を有するものである。ガンが疑われる患者
について二重沈澱剤線が観察されない場合が起こること
があるので、胃液中のガンまたは腫瘍のグロブリンの精
製または濃縮が必要な一層感度のよい検査が望まれる。
した胃液検体を抗１ｇＧ および抗Ｆｅに対して使用し
て、第１の免疫拡散て二重沈澱剤線を見出だすことから
なるＤ ｕｃｂｔｅｒｌｏｎｙ板上での簡単な検査法が
記載されている。この沈澱割線は複合体の生成を指示す
る複雑な特徴を有するものである。ガンが疑われる患者
について二重沈澱剤線が観察されない場合が起こること
があるので、胃液中のガンまたは腫瘍のグロブリンの精
製または濃縮が必要な一層感度のよい検査が望まれる。
このことは本発明において、ビート状の、ジエチルアミ
ノエチル基が共有結合的に結合されているアガロースを
使用する特別なカラムクロマトグラフ段階を組合わせそ
れによって少なくとも１０倍〜２０倍のタンパク質の精
製が達成され、カラムに結合したタンパク質は０．１モ
ルから０．２モルへと次第に増加する食塩濃度によって
希釈される。次に精製されたタンパク質は非常に高感度
な酵素結合免疫吸収体検定（ＥＬＩＳＡ）によって検査
される。この検査はタンパク質ｌｉ＋ｇ当たり０ 、１
ｎｇもの微量のＩｌ？Ｇ を検出することができる。
ノエチル基が共有結合的に結合されているアガロースを
使用する特別なカラムクロマトグラフ段階を組合わせそ
れによって少なくとも１０倍〜２０倍のタンパク質の精
製が達成され、カラムに結合したタンパク質は０．１モ
ルから０．２モルへと次第に増加する食塩濃度によって
希釈される。次に精製されたタンパク質は非常に高感度
な酵素結合免疫吸収体検定（ＥＬＩＳＡ）によって検査
される。この検査はタンパク質ｌｉ＋ｇ当たり０ 、１
ｎｇもの微量のＩｌ？Ｇ を検出することができる。
胃ガンの陽性の診断をされた患者は、タンパク質１′１
２当たり４．４〜３３ｎｇに亘るＴｇＧ値を有し、一方
ガンの診断されない患者は、タンパク質１■当たり２．
０１ｇ以下の検定値を有する。
２当たり４．４〜３３ｎｇに亘るＴｇＧ値を有し、一方
ガンの診断されない患者は、タンパク質１■当たり２．
０１ｇ以下の検定値を有する。
青吸収物をｐＨ８の０．０２ＭＫ２１１Ｐ０４によって
透析する。透析された液は共有結合的に結合したチバク
ロン・ブルー（Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂ Ｉｕｅ）Ｆ ３
Ｇ Ａとジエチルアミノエチル基とを有するビ一ド状
アガロースから構成されている。イオン交換樹脂のクロ
マトグラフにかけられる。漏出画分を集めた後に、開始
緩衝液をＮａＣｌ濃度０、ＩＭ〜０．２Ｍに作り、胃ガ
ン腫瘍グロブリンを含む第２画分を集める。この画分を
リン酸塩で緩衝した食塩水（ＰＢＳ）によって透析し、
凍結乾燥する。
透析する。透析された液は共有結合的に結合したチバク
ロン・ブルー（Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂ Ｉｕｅ）Ｆ ３
Ｇ Ａとジエチルアミノエチル基とを有するビ一ド状
アガロースから構成されている。イオン交換樹脂のクロ
マトグラフにかけられる。漏出画分を集めた後に、開始
緩衝液をＮａＣｌ濃度０、ＩＭ〜０．２Ｍに作り、胃ガ
ン腫瘍グロブリンを含む第２画分を集める。この画分を
リン酸塩で緩衝した食塩水（ＰＢＳ）によって透析し、
凍結乾燥する。
分析の前に、凍結乾燥物を０．０５Ｍナトリウムバルビ
タール緩衝液で再溶解して１０ Ｈ７ｍｌのタンパク質
濃度にする。再溶解凍結乾燥物について、免疫電気泳動
を胃腫瘍グロブリンの抗血清に対して行う。領域α１−
β１の陽極弧は、陽性の検査と考えられる。
タール緩衝液で再溶解して１０ Ｈ７ｍｌのタンパク質
濃度にする。再溶解凍結乾燥物について、免疫電気泳動
を胃腫瘍グロブリンの抗血清に対して行う。領域α１−
β１の陽極弧は、陽性の検査と考えられる。
増強された胃腫瘍グロブリンに対して開発されたＥＬＩ
ＳＡ検査は、アビジン−ビオチン、ワサビダイコンペル
オキシダーゼを使用してタンパク質１ｍｇ当り０．１〜
０．２ｎｇのような低レベルまでの胃腫瘍グロブリンを
測定する。
ＳＡ検査は、アビジン−ビオチン、ワサビダイコンペル
オキシダーゼを使用してタンパク質１ｍｇ当り０．１〜
０．２ｎｇのような低レベルまでの胃腫瘍グロブリンを
測定する。
アビジンのビオチンに対する高い親和性をもつことと、
ビオチンが腫瘍グロブリンと結合し易いことと組合わさ
って、非常に感度のよい検定がで一１２＝ きる。
ビオチンが腫瘍グロブリンと結合し易いことと組合わさ
って、非常に感度のよい検定がで一１２＝ きる。
アビジンは、６８，０００の分子量を有する塩基性糖タ
ンパク質である。その名前は、ビオチンに対する親和性
が高くて、大抵の抗体−抗原結合よりも約１００万倍も
大きく、さらにアビジン−ビオチン結合は本質的に不可
逆である事実から由来している。
ンパク質である。その名前は、ビオチンに対する親和性
が高くて、大抵の抗体−抗原結合よりも約１００万倍も
大きく、さらにアビジン−ビオチン結合は本質的に不可
逆である事実から由来している。
約２７４の分子量を有するビオチンは、容易にタンパク
質と結合し、しかもタンパク質の生物学的活性を変える
ととがない。
質と結合し、しかもタンパク質の生物学的活性を変える
ととがない。
アビジン−ビオチン結合を使用する本発明検査では、ワ
サビダイコンのペルオキシダーゼが、ビオチニル化され
る。アビジンはビオチン−ペルオキシダーゼと正確な割
合で培養されるので、３次元的な複合体が生成する。９
個のワサビダイコンペルオキシダーゼ分子が、３個のア
ビジン分子と結合されて、１個のビオチン結合部位が残
り、それが色原体基質の存在で腫瘍タンパク質を検出す
る。
サビダイコンのペルオキシダーゼが、ビオチニル化され
る。アビジンはビオチン−ペルオキシダーゼと正確な割
合で培養されるので、３次元的な複合体が生成する。９
個のワサビダイコンペルオキシダーゼ分子が、３個のア
ビジン分子と結合されて、１個のビオチン結合部位が残
り、それが色原体基質の存在で腫瘍タンパク質を検出す
る。
好１１失ｌ」１０糞刊〜
胃液からの腫瘍グロブリンの定量スクリーニング検定は
、一般には米国特許第４，２１９，５３９号（ｂ９８４
年８月２６日付与）の検体採取操作に従って行うが、次
の追加的な定量段階が含まれる。
、一般には米国特許第４，２１９，５３９号（ｂ９８４
年８月２６日付与）の検体採取操作に従って行うが、次
の追加的な定量段階が含まれる。
１、 胃管（ｎａｓａｇａｓｔｒｉｃ ｔｕｂｅ）を通
しての、また胃鏡検査中に内視鏡を通しての胃ガン液の
採取。
しての、また胃鏡検査中に内視鏡を通しての胃ガン液の
採取。
２、不純物を除くために、０．００５ＭＴＲ，ＩＳ緩衝
液による透析。
液による透析。
３、胃液に随伴するタンパク質を、共有結合的に結合し
たジエチルアミノエチル基を有する、または同様に共有
結合的に結合したＣ １ｂａｃｒｏｎ Ｂ １ｕｅＦ３
ＧＡ を追加して有するビート状アガロースカラムで
の分別［４・：共に（米国カリフォルニア州、リッチモ
ンドのビオラド（ＢｉｏＲａｄ） ）社によって供給さ
れる。］。クロマトグラフにかけるグロブリン１１ｇ当
り、ＩＩ？のアガロースを使用する。
たジエチルアミノエチル基を有する、または同様に共有
結合的に結合したＣ １ｂａｃｒｏｎ Ｂ １ｕｅＦ３
ＧＡ を追加して有するビート状アガロースカラムで
の分別［４・：共に（米国カリフォルニア州、リッチモ
ンドのビオラド（ＢｉｏＲａｄ） ）社によって供給さ
れる。］。クロマトグラフにかけるグロブリン１１ｇ当
り、ＩＩ？のアガロースを使用する。
１時間当り約５〜１０１１１の流速を使用する。
４、第１画分を取出して捨てる。第２画分を構成する約
６ ｙ、１の容積のガン腫瘍グロブリンを採取する。
６ ｙ、１の容積のガン腫瘍グロブリンを採取する。
５、段階４からの第２画分をリン酸塩緩衝食塩水を用い
て透析しまた、ＥＬＩＳＡ検査を行なうための腫瘍グロ
ブリン約２００μｌが回収されている凍結乾燥物につい
て品質管理検査を実施する。
て透析しまた、ＥＬＩＳＡ検査を行なうための腫瘍グロ
ブリン約２００μｌが回収されている凍結乾燥物につい
て品質管理検査を実施する。
６、色原体基質として５−アミノサリチル酸の存在下で
、アビジン−ビオチンとワサビダイコンペルオキシダー
ゼとを使用して低腫瘍グロブリン値に対するＥＬＩＳＡ
検査。
、アビジン−ビオチンとワサビダイコンペルオキシダー
ゼとを使用して低腫瘍グロブリン値に対するＥＬＩＳＡ
検査。
胃ガン液を胃管（ｎａｓａｇａｓｔｒｉｃｔｕｂｅ）を
通して、また同じく胃鏡検査中に内視鏡を通してガン胃
液の採取 米国特許第４，２１９，５３９号に従って、ファイバオ
プティック胃鏡を複合生体組織検査用に使用し、また胃
液検体を胃管（・“°・ｇ・・ｔｒｉｃｔ・ｌ・・）を
３臀して・また同しく胃鏡検査中に内視鏡を通して断食
患者から採取する。断食患者からの採取検体の第１画分
を捨て、充分量の胃液を集める。これは５％炭酸水素ナ
トリウムを胃内的に加えてアルカリ性ｐ Ｉ−１として
ペプシンを不活性化しである。採取した検体（約２５〜
’３０ｗ（ｂ＞を０．００５Ｍ トリス（ＴＲＪＳ）
緩衝液を用いて３〜５日透析する。透析は冷蔵庫の中で
透析用緩衝液を２回変えて行う。
通して、また同じく胃鏡検査中に内視鏡を通してガン胃
液の採取 米国特許第４，２１９，５３９号に従って、ファイバオ
プティック胃鏡を複合生体組織検査用に使用し、また胃
液検体を胃管（・“°・ｇ・・ｔｒｉｃｔ・ｌ・・）を
３臀して・また同しく胃鏡検査中に内視鏡を通して断食
患者から採取する。断食患者からの採取検体の第１画分
を捨て、充分量の胃液を集める。これは５％炭酸水素ナ
トリウムを胃内的に加えてアルカリ性ｐ Ｉ−１として
ペプシンを不活性化しである。採取した検体（約２５〜
’３０ｗ（ｂ＞を０．００５Ｍ トリス（ＴＲＪＳ）
緩衝液を用いて３〜５日透析する。透析は冷蔵庫の中で
透析用緩衝液を２回変えて行う。
次に検体を凍結乾燥し、所望により使用するまで冷凍状
態て貯蔵する。凍結乾燥物１０ｖｇを０．５旬のＢ ＋
２バルビタール緩衝液に溶解する（Ｗｉｌｌｉａｍｓ
及びＣ，Ｉ＋ａｓｅｌｉの教本［メソッズ・イン・イミ
ュノロジイ・エンド・イミュノケミストリイ（Ｍ−ｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｔ＋ｎｏｌｏ ｇｙ ａ
ｎｄ Ｉ＋ｏｍｕｎｏ Ｃｂｅｍｉｓｔｒｙ） ア
カデミツク・プレス（Ａ ｃａｄｅ＋ｏｉｃ Ｐ ｒｅ
ｓｓ）刊、１９６８年、第２巻、付録■、３７２頁参照
」。
態て貯蔵する。凍結乾燥物１０ｖｇを０．５旬のＢ ＋
２バルビタール緩衝液に溶解する（Ｗｉｌｌｉａｍｓ
及びＣ，Ｉ＋ａｓｅｌｉの教本［メソッズ・イン・イミ
ュノロジイ・エンド・イミュノケミストリイ（Ｍ−ｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｔ＋ｎｏｌｏ ｇｙ ａ
ｎｄ Ｉ＋ｏｍｕｎｏ Ｃｂｅｍｉｓｔｒｙ） ア
カデミツク・プレス（Ａ ｃａｄｅ＋ｏｉｃ Ｐ ｒｅ
ｓｓ）刊、１９６８年、第２巻、付録■、３７２頁参照
」。
トリス緩衝液はトリス〈ヒドロキシメチル）アミノメタ
ンから造った緩衝液で、教本［メソッズ・イン・イミュ
ノロジイ・エンド・イミュノケミストリイ」第２巻、付
録■、第６３８頁に記載されている。
ンから造った緩衝液で、教本［メソッズ・イン・イミュ
ノロジイ・エンド・イミュノケミストリイ」第２巻、付
録■、第６３８頁に記載されている。
上記の段階２でｐＨ８の０ 、２ Ｍ Ｋ、 ２ ＨＰ
Ｏ４によって透析した製品を、アガロースピードより
成る陰イオン交換樹脂（ジエチルアミノエチル基とチバ
クロン・ブルー（Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂ Ｉｕｅ ）
Ｆ ３ Ｇ Ａ色素とがアガロースに共有結合的に結合
されるように処理しである）に通す。透析した青板出物
の水溶液を、上記のクロマトグラフカラムに通し、画分
Ａとして知られる第１画分を集めて捨てる。
Ｏ４によって透析した製品を、アガロースピードより
成る陰イオン交換樹脂（ジエチルアミノエチル基とチバ
クロン・ブルー（Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂ Ｉｕｅ ）
Ｆ ３ Ｇ Ａ色素とがアガロースに共有結合的に結合
されるように処理しである）に通す。透析した青板出物
の水溶液を、上記のクロマトグラフカラムに通し、画分
Ａとして知られる第１画分を集めて捨てる。
腫瘍グ、ロブリンより成るのは、カラムから取り出され
る画分Ｂである。
る画分Ｂである。
０．０２ＭＫ２ＨＰ０４Ｍ街溶液中の開始時の塩化ナト
リウム濃度は、０．１Ｍから０．２Ｍまで変えてカラム
に通して第２画分を溶離する。この第２画分は青板出物
から回収されたより濃厚な腫瘍グロブリン画分より成る
。次にこの画分Ｂを、ＥＬＩＳＡ検査用の検体材料とし
て使用する。
リウム濃度は、０．１Ｍから０．２Ｍまで変えてカラム
に通して第２画分を溶離する。この第２画分は青板出物
から回収されたより濃厚な腫瘍グロブリン画分より成る
。次にこの画分Ｂを、ＥＬＩＳＡ検査用の検体材料とし
て使用する。
低［ブリ４１ｇＡ４］ｄｕ□Ｉ ＳへＪｊＬＥ、Ｌ Ｉ
Ｓ Ａ検査は、好適にはミクロＥ Ｌ Ｉ Ｓ、Ａ検
査であるが、これは回収された非常に低レベルの腫瘍タ
ンパク質について、精密な再現性と正確さとが得られる
ように特に造られたものである。
Ｓ Ａ検査は、好適にはミクロＥ Ｌ Ｉ Ｓ、Ａ検
査であるが、これは回収された非常に低レベルの腫瘍タ
ンパク質について、精密な再現性と正確さとが得られる
ように特に造られたものである。
この種のミクロＥＬＩＳＡ検査装置は多数のメーカーか
ら入手でき、これらの検査装置はこの検査装置で使用さ
れる試薬に不活性であるかまたは反応しないプラスチッ
ク材料から造られ且−）少量の検体を受入れるように適
合させたミクロ力価検定枚を使用している。さらに使用
する装置は、紫外領域の吸光度測定に適応した走査装置
の使用により光学的走査にも適する。ＥＬＩＳＡ材料の
供給業者の１つは米国カリフォルニア州すッチモンドの
ビオラード・ラボラトリイズ（Ｂ １ｏ−Ｒ，ａｄ Ｌ
ａｂ−ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）である。他の供給業者は米
国ペンシルベニア州つエストチェスタのクーパー・ダイ
アノスチツクス（Ｃｏｏｐｅｒ Ｄ ｉａｇｎｏｓｔｉ
ｃｓ）社の事業部カッペル・ラボラトリイズ（Ｃａｐｐ
ｅｌ Ｌ ａｌ＋ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）である。第３の
供給業者は米国イリノイ州ネーパービル郵便番号６０５
６６、ノースオーロラ通４７５、西３０マイルズ・ラボ
ラトリイズ（Ｍ ｉ １ｅＳＬ ａｂｏ−ｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）社の事業部、マイルズ・サイエンティフィック（
Ｍｉｌｅｓ ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。
ら入手でき、これらの検査装置はこの検査装置で使用さ
れる試薬に不活性であるかまたは反応しないプラスチッ
ク材料から造られ且−）少量の検体を受入れるように適
合させたミクロ力価検定枚を使用している。さらに使用
する装置は、紫外領域の吸光度測定に適応した走査装置
の使用により光学的走査にも適する。ＥＬＩＳＡ材料の
供給業者の１つは米国カリフォルニア州すッチモンドの
ビオラード・ラボラトリイズ（Ｂ １ｏ−Ｒ，ａｄ Ｌ
ａｂ−ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）である。他の供給業者は米
国ペンシルベニア州つエストチェスタのクーパー・ダイ
アノスチツクス（Ｃｏｏｐｅｒ Ｄ ｉａｇｎｏｓｔｉ
ｃｓ）社の事業部カッペル・ラボラトリイズ（Ｃａｐｐ
ｅｌ Ｌ ａｌ＋ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）である。第３の
供給業者は米国イリノイ州ネーパービル郵便番号６０５
６６、ノースオーロラ通４７５、西３０マイルズ・ラボ
ラトリイズ（Ｍ ｉ １ｅＳＬ ａｂｏ−ｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）社の事業部、マイルズ・サイエンティフィック（
Ｍｉｌｅｓ ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。
ヨーロッパには多数の供給業者があって、それらの製品
も米国て販売されている。結果を読み取る装置、例えば
光学装置は米国バージニア州、アレグサンドリア郵便番
号２２３１４、ステーツレーン９００のダイナチック・
ラボラトリイズＤ ｙｎａｔｅ−ｃｈ Ｌ ａｂａｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）が製造している。こうしてミクロＥＬＴ
Ｓ’Ａ法に対する試薬、装置及び検査用器はすべて、種
々様々な色原体に対するペルオキシダーゼ基質用に製造
されていて、ミクロＥＬＩＳＡを使って非常に少量のタ
ンパク質を検出できることが認められている。
も米国て販売されている。結果を読み取る装置、例えば
光学装置は米国バージニア州、アレグサンドリア郵便番
号２２３１４、ステーツレーン９００のダイナチック・
ラボラトリイズＤ ｙｎａｔｅ−ｃｈ Ｌ ａｂａｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）が製造している。こうしてミクロＥＬＴ
Ｓ’Ａ法に対する試薬、装置及び検査用器はすべて、種
々様々な色原体に対するペルオキシダーゼ基質用に製造
されていて、ミクロＥＬＩＳＡを使って非常に少量のタ
ンパク質を検出できることが認められている。
ダイナチック・ラボラトリイズは、再現性を達成するの
に忠実でなければならない対照試薬を使用して、最適条
件を提供することの必要性を指摘した。第１に重要な考
慮事項は緩衝液である。第２に重要な考慮事項は共役し
た酵素の安全性である。さらに別の重要な考慮事項は培
養時間、温度、反応剤の濃度および再現性を確保する条
件の維持である。最後に、ウェル中の首尾一貫した目視
による結果が、測光の読みと相関がなければならない。
に忠実でなければならない対照試薬を使用して、最適条
件を提供することの必要性を指摘した。第１に重要な考
慮事項は緩衝液である。第２に重要な考慮事項は共役し
た酵素の安全性である。さらに別の重要な考慮事項は培
養時間、温度、反応剤の濃度および再現性を確保する条
件の維持である。最後に、ウェル中の首尾一貫した目視
による結果が、測光の読みと相関がなければならない。
これに関連して色原体の選択が重要である。
本発明による場合、選定した色原体は５−アミノサリチ
ル醇である。他の色原体はジアミノベンジ＝１９− ジンである。更に他の色原体は、２，２′−アミノ−ジ
ー（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン−６）（ジア
ンモニウム塩）であり、なお別の色原体は０−フェニレ
ンジアミン（ＯＰ Ｄ ）である。
ル醇である。他の色原体はジアミノベンジ＝１９− ジンである。更に他の色原体は、２，２′−アミノ−ジ
ー（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン−６）（ジア
ンモニウム塩）であり、なお別の色原体は０−フェニレ
ンジアミン（ＯＰ Ｄ ）である。
本発明ではこれらの色原体はどれも使用でき、それらの
最高の性能を得るのに適応した条件も既知である。本明
細書で実施する検査では、色原体として５−アミノサリ
チル酸を使用したが、初期の検査は３．３’、５．５’
−テトラメチルベンジジンを色原体として使用したもの
である。
最高の性能を得るのに適応した条件も既知である。本明
細書で実施する検査では、色原体として５−アミノサリ
チル酸を使用したが、初期の検査は３．３’、５．５’
−テトラメチルベンジジンを色原体として使用したもの
である。
胃ガン患者から得た胃液の凍結乾燥物は、千葉ガンセン
ター（千葉系）所長Ｔ 、 Ｎ ｏｒｏｂｕ医学博士か
ら提供された。凍結乾燥物５〜７１１？を０．０１．Ｍ
リン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化すし、リウム、ｐＨ
７，２の溶液に溶解した。溶解した凍結乾燥物（全容積
１＋ｙｇ）のタンパク質含有量をＣｏｏｍａｓｓｉｅ色
素結合法（ｂ） ［ｒＢ １ｏ−Ｒａｄタンパク質検定
の使用説明書」（米国カリフォルニア州すッチモンドビ
オーラド・ラボラトリイズ（Ｂ １ｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ
ｏｒ−ａｔｏｒｉｅｓ） １．９８１年）］によって検
定した。タンパク質は０．５〜５ 、８ ｚｇｈｌの範
囲であった。免疫グロブリンＧの検定は、マイルズ・サ
イエンティフィック（Ｍ １ｌｅｓ Ｓ ｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ） ［米国イリノイ州ネーパービル（２）の［プ
ロダクト・プロフィル −１９８４コンシユ
ゲーテツド、アンチセラ（Ｐ ｒｏｄ−ｕｃｔ Ｐｒｏ
ｆｉｌｅ １９８４ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊ
ｕｇａｔｅｄａｎｔｉｓｅｒａ） Ｊによって提供され
たＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫学検定法）に従って行っ
た。この操作はワサビダイコンのペルオキシダーゼに結
合した抗■１？Ｇを使用する直接検定法である。基質（
色原体）は５−アミノサリチル酸である。反応はミクロ
力価検定枚中で行い、個々のウェル（発色後）をダイナ
チック（Ｄ ｙｎａｔｅｃｂ）光学走査装置［米国バー
ジニア州、アレグザンドリア、ダイナチック・ラボラト
リイズ（Ｄｙｎａｔｅｃｂ Ｌａｂｏｒａ’ｔｏｒｉｅ
ｓ）］を使用して光学的に読み取った。胃液検体中のヒ
トＩｇＧ の範囲は、第１図に示した検量線から定量し
た。この検量線のレベルは、２ａｇ〜３８ｎｇであった
。
ター（千葉系）所長Ｔ 、 Ｎ ｏｒｏｂｕ医学博士か
ら提供された。凍結乾燥物５〜７１１？を０．０１．Ｍ
リン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化すし、リウム、ｐＨ
７，２の溶液に溶解した。溶解した凍結乾燥物（全容積
１＋ｙｇ）のタンパク質含有量をＣｏｏｍａｓｓｉｅ色
素結合法（ｂ） ［ｒＢ １ｏ−Ｒａｄタンパク質検定
の使用説明書」（米国カリフォルニア州すッチモンドビ
オーラド・ラボラトリイズ（Ｂ １ｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ
ｏｒ−ａｔｏｒｉｅｓ） １．９８１年）］によって検
定した。タンパク質は０．５〜５ 、８ ｚｇｈｌの範
囲であった。免疫グロブリンＧの検定は、マイルズ・サ
イエンティフィック（Ｍ １ｌｅｓ Ｓ ｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ） ［米国イリノイ州ネーパービル（２）の［プ
ロダクト・プロフィル −１９８４コンシユ
ゲーテツド、アンチセラ（Ｐ ｒｏｄ−ｕｃｔ Ｐｒｏ
ｆｉｌｅ １９８４ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊ
ｕｇａｔｅｄａｎｔｉｓｅｒａ） Ｊによって提供され
たＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫学検定法）に従って行っ
た。この操作はワサビダイコンのペルオキシダーゼに結
合した抗■１？Ｇを使用する直接検定法である。基質（
色原体）は５−アミノサリチル酸である。反応はミクロ
力価検定枚中で行い、個々のウェル（発色後）をダイナ
チック（Ｄ ｙｎａｔｅｃｂ）光学走査装置［米国バー
ジニア州、アレグザンドリア、ダイナチック・ラボラト
リイズ（Ｄｙｎａｔｅｃｂ Ｌａｂｏｒａ’ｔｏｒｉｅ
ｓ）］を使用して光学的に読み取った。胃液検体中のヒ
トＩｇＧ の範囲は、第１図に示した検量線から定量し
た。この検量線のレベルは、２ａｇ〜３８ｎｇであった
。
泉取上プラｙ、−□久月３ニトグラニｌ不二一１、胃ガ
ン液は胃管（ｎａｓａｇａｓｔｒｉｃ ｔｕｂｅ）を通
して、また胃鏡検査中に内視鏡を通して採取。
ン液は胃管（ｎａｓａｇａｓｔｒｉｃ ｔｕｂｅ）を通
して、また胃鏡検査中に内視鏡を通して採取。
２、 ０．００５Ｍ（トリス）緩衝液による透析。
３、チバクロン（Ｃ１ｌ）ａｃｒｏｎ Ｂ １ｕｅ）
Ｆ ３ Ｇ Ａ が共有結合により結合し、またジエチ
ルアミノエチル基を共有結合で結合したビート状アガロ
ースを使用して、胃液に随伴するタンパク質を分別。
Ｆ ３ Ｇ Ａ が共有結合により結合し、またジエチ
ルアミノエチル基を共有結合で結合したビート状アガロ
ースを使用して、胃液に随伴するタンパク質を分別。
４、第１画分を取り出して棄却し、ガン種瘍グロブリン
（第２画分）を採取。
（第２画分）を採取。
５、 リン酸塩で緩衝した食塩水による第２画分の透析
と、凍結乾燥物についての品質管理検査。
と、凍結乾燥物についての品質管理検査。
６、色原体基質として５−アミノサリチル酸の存在下で
、アビジン−ビオチンとワサビダイコンペルオキシダー
ゼとを使用する低種瘍グロブリン値に対するＥＬＩＳＡ
検査。
、アビジン−ビオチンとワサビダイコンペルオキシダー
ゼとを使用する低種瘍グロブリン値に対するＥＬＩＳＡ
検査。
上記の手順は、マイルズ・サイエンティフィック社のミ
クロＥＬＴＳＡ法に適したように変更した。
クロＥＬＴＳＡ法に適したように変更した。
Ｉ９Ａ検出用にマイルズ・サイエンティフィックから入
手したＩｇＧ試薬は、コード番号６１−１３０、ヒトＩ
Ｉ？Ｇ、力値１： １，５０Ｑまたはコード番号６１−
２３０、ヒトＩ！？Ｇ、力値１：２．５００であった。
手したＩｇＧ試薬は、コード番号６１−１３０、ヒトＩ
Ｉ？Ｇ、力値１： １，５０Ｑまたはコード番号６１−
２３０、ヒトＩ！？Ｇ、力値１：２．５００であった。
チバクロン（Ｃｉｂａｃｒｏｎ ） Ｆ ３ Ｇ Ａの
化学式は次の通りである。
化学式は次の通りである。
この色素は１９５７年に紹介されたプロジノン−（Ｐ
ｒｏｃｉｏｎ−、） Ｉ ＣＩ 、チバクロンーチバ（
Ｃｉｂ−ａｃｒｏｎ Ｃ１１）ａ）としても公知である
。Ｐｒｏｃｉｏｎ−■ＣＩは、イギリスのインペリアル
・ケミカル・インダストリイズ（Ｉ ｍｐｅｒｉａｌ
Ｃ１＋ｅｍｉｃａｌ Ｉ ｎｄｕｓ−ｔｒｉｅｓ）の
商品名である。チバクロン（Ｃｉｂａｃｒｏｎ ）はス
イスのチバ（（ｂ：：１ｂａ）社の商品名である。３Ｇ
シリーズのチバクロン−ブルー（Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂ
Ｉｕｅ）色素は１９５７年に紹介されて、セルロース
用の反応色素として広く使用された。
ｒｏｃｉｏｎ−、） Ｉ ＣＩ 、チバクロンーチバ（
Ｃｉｂ−ａｃｒｏｎ Ｃ１１）ａ）としても公知である
。Ｐｒｏｃｉｏｎ−■ＣＩは、イギリスのインペリアル
・ケミカル・インダストリイズ（Ｉ ｍｐｅｒｉａｌ
Ｃ１＋ｅｍｉｃａｌ Ｉ ｎｄｕｓ−ｔｒｉｅｓ）の
商品名である。チバクロン（Ｃｉｂａｃｒｏｎ ）はス
イスのチバ（（ｂ：：１ｂａ）社の商品名である。３Ｇ
シリーズのチバクロン−ブルー（Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂ
Ｉｕｅ）色素は１９５７年に紹介されて、セルロース
用の反応色素として広く使用された。
次の方法を、ミクロＥＬ Ｉ ＳＡ法に対するＭｉｌｅ
ｓの手順に従って使用した。
ｓの手順に従って使用した。
ミクロＥＬＩＳＡ’−
試薬：
１、被覆用緩衝液
１０ＭＭ リン酸塩緩衝液ｐＨ７，４
１５０ｗＭ ＮａＣｌ
１，１％ アジ化ナトリウム
２、洗浄用Ｍ衝液
１０ｍＭ リン酸塩Ｍ衝液ｐＨ７，４１５０ｎ＋Ｍ塩
化ナトリウム ０．０５容量％トウイン２０ ３、反応緩衝液 ０．０２Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ６，８４、停止
緩衝液 ３ Ｍ Ｎ ａｏ Ｈ ５，５−アミノサリチル酸 ６、過酸化水素 手順： １、抗原を被覆用緩衝液に溶解、２０μｇ／ｍ１２、被
覆用緩衝液０．２ｚ１をポリスチレン製ミクロカ価検定
枚の各ウェルの中にピペットで入れ、４℃で一夜培養（
カバーして）。
化ナトリウム ０．０５容量％トウイン２０ ３、反応緩衝液 ０．０２Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ６，８４、停止
緩衝液 ３ Ｍ Ｎ ａｏ Ｈ ５，５−アミノサリチル酸 ６、過酸化水素 手順： １、抗原を被覆用緩衝液に溶解、２０μｇ／ｍ１２、被
覆用緩衝液０．２ｚ１をポリスチレン製ミクロカ価検定
枚の各ウェルの中にピペットで入れ、４℃で一夜培養（
カバーして）。
３、被覆用緩衝液を除いて洗浄用緩衝液で３回洗浄。
４、ペルオキシダーゼ共役体を洗浄用緩衝液中に希釈。
個々に希釈してもよいし、また系列的な希釈を行っても
よいが、期待される力価、例えば１：５０または１：’
１００よりも十分低い希釈から開始するのが最もよい。
よいが、期待される力価、例えば１：５０または１：’
１００よりも十分低い希釈から開始するのが最もよい。
各ウェルに０．１５ｚ１の希釈した共役体を加える。
５、室温で２時間培養。
６ａ、養生中に反応溶液を用意する。５６℃に予熱した
反応緩衝液に５−アミノサリチル酸を’１．Ｈ／ｗ１の
濃度に溶解。
反応緩衝液に５−アミノサリチル酸を’１．Ｈ／ｗ１の
濃度に溶解。
６ｂ 各１００Ｒ１の基質に活性炭約１〜５ｚｇを添
加。混合してワットマンＮｏ１３紙でろ過。この段階は
基質溶液から過剰な色を除去する。
加。混合してワットマンＮｏ１３紙でろ過。この段階は
基質溶液から過剰な色を除去する。
６ｃ 新鮮な１％過酸化水素水溶液を用意して０．１
ｍｎを各１０’ｗｌの反応緩衝液に加える。
ｍｎを各１０’ｗｌの反応緩衝液に加える。
７、培養（段階５）に続いて、洗浄用緩衝液て３回、各
洗洋毎に少なくとも５分洗浄する。次に蒸留水で３回水
洗。
洗洋毎に少なくとも５分洗浄する。次に蒸留水で３回水
洗。
８、新しく用意したＨ２ｏ２／基質溶液０．２ｍｌを各
ウェルに加える９ ９、３０分後に０ 、１ ｗｌの停止緩衝液て呈色反応
を停止。
ウェルに加える９ ９、３０分後に０ 、１ ｗｌの停止緩衝液て呈色反応
を停止。
１０、４５ Ｏｎｅｏの吸光度を読み取る。
胃ガン検体の結果は第１表に示しである。正常な胃分泌
液は、マサチューセッツ州ドルチェスタＣａｒｎｅｙ病
院外来診療部から得た。検体をリン酸塩緩衝食塩水によ
って透析した。検体は凍結乾燥しないで、タンパク質含
有量を上述したようにＣｏｏ＋ｎ’ａｓｓ ｉ ｅ色素
で定量した。タンパク質含有量は０．１２〜１ 、２
ｗｒｇ／ ｉｒｌの範囲であった。正常検体のＩｌ？Ｇ
レベルは、上記したようにして定量した。
液は、マサチューセッツ州ドルチェスタＣａｒｎｅｙ病
院外来診療部から得た。検体をリン酸塩緩衝食塩水によ
って透析した。検体は凍結乾燥しないで、タンパク質含
有量を上述したようにＣｏｏ＋ｎ’ａｓｓ ｉ ｅ色素
で定量した。タンパク質含有量は０．１２〜１ 、２
ｗｒｇ／ ｉｒｌの範囲であった。正常検体のＩｌ？Ｇ
レベルは、上記したようにして定量した。
結果は第２表に示しである。
第 １ 表
１５−２ １０．５２．４ ４．４
＊検体の第１番目の数字は患者の識別てあり、また次の
数字は材料を示す。例えば９−１．９−２．９−３は患
者９がらの３つの材料を示す。
数字は材料を示す。例えば９−１．９−２．９−３は患
者９がらの３つの材料を示す。
＊＊０−２で得られた低い値は技術的なエラーを示して
いて、検査を繰り返して９−１と９−３との間の結果が
得られた。
いて、検査を繰り返して９−１と９−３との間の結果が
得られた。
第 ２ 表
ＮＧＪ（ケリ） ０．４５ ０．２５
１．８ＮＧＪ（スイー）） ０．４０ ０．２
５ １．６ＮＧＪ（ガＩＣｙ） ＯＯ，４０
０ＮＧＪ（７７７’！Ｊ） ＯＯ，３７、０ＮＧＪ（
マ−：ンク） ０ ０．１２ ０ＮＧＪ
（リザール） ０．３５ ０．６． ０．６
ＮＧＪ（スミス） 、 ０．４０． ０．２３
１．７ＮＧＪ（タンガン＞ ０．２４ ０．６
１ ０．４ＮＧＪ （ボイル）ｏｌ、１゜ ＮＧＪ（ウィルをウスキー）ｏ、 、 、、
、 、ｏｌ、７ＯＮ（Ｊ（マｏイ） ０．４５
、 １．２ ０．４
１．８ＮＧＪ（スイー）） ０．４０ ０．２
５ １．６ＮＧＪ（ガＩＣｙ） ＯＯ，４０
０ＮＧＪ（７７７’！Ｊ） ＯＯ，３７、０ＮＧＪ（
マ−：ンク） ０ ０．１２ ０ＮＧＪ
（リザール） ０．３５ ０．６． ０．６
ＮＧＪ（スミス） 、 ０．４０． ０．２３
１．７ＮＧＪ（タンガン＞ ０．２４ ０．６
１ ０．４ＮＧＪ （ボイル）ｏｌ、１゜ ＮＧＪ（ウィルをウスキー）ｏ、 、 、、
、 、ｏｌ、７ＯＮ（Ｊ（マｏイ） ０．４５
、 １．２ ０．４
図は本発明のために行ったＥＬＩＳＡ検査の検査線を示
す。
す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ヒト患者のガン性胃液に対する検定方法であって、 （ａ）管を通して患者から断食胃液を採取して断食検体
の第１部分を捨て、さらに胃液検体を採取してそれにア
ルカリを加え、ｐＨを７以上にしてペプシンを不活性化
し、 （ｂ）胃液を０．００５Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液に
よって透析して干渉物質を除去し、 （ｃ）透析された物質を、ビード状の共有結合で結合し
たジエチルアミノエチル基を有するアガロースのクロマ
トグラフカラムで分別し、それによって胃液に随伴する
ガンタンパク質をカラムに吸収し、不純物を第１画分の
中に取出してそれを捨て、 （ｄ）濃縮された胃液に随伴するタンパク質を、ＮａＣ
ｌを加えてＮａＣｌ溶液を０．１Ｍから０．２Ｍまで次
第に高めた０．０２Ｍ Ｋ＿２ＨＰＯ＿４緩衝溶液を添
加して取出し、それによって濃縮された画分を取出し、 （ｅ）濃縮された画分を０．０２Ｍ Ｋ＿２ＨＰＯ＿４
と０．１ＭＮａＣｌとを用いて透析し、さらに（ｆ）色
原体基質として５−アミノサリチル酸の存在下で、アビ
ジン−ビオチンとワサビダイコンペルオキシダーゼとを
使用してＥＬＩＳＡ検査を行って、検体中に存在するタ
ンパク質の量に基づくＩｇＧ値を得、そのＩｇＧ値はタ
ンパク質１ｍｇ当り２．５ｍｇからグロブリンタンパク
質１ｍｇ当り３３ｎｇに亘るものであって、胃ガン診断
の根拠であるアミノグロブリンＧの量を示すものである
、ことを包含する方法。 ２、アガロースクロマトグラフカラムが、共有結合によ
ってチバクロン・ブルー（Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ
）Ｆ３ＧＡに橋かけ結合されてなる、特許請求の範囲第
１項記載の方法。 ３、グロブリンタンパク質１ｍｇ当り０．１ｎｇのＥＬ
ＩＳＡ検査の検体を造ってＩｇＧの２．５ｎｇを越える
値をもって胃ガンと診断する根拠とするために、胃液中
の腫瘍またはガンの疑いのあるグロブリンを濃縮するこ
とによってヒトの患者から精製胃液の検体を製造する方
法であって、 （ａ）管を通して患者から断食胃液を採取して断食検体
の第１部分を捨て、さらに胃液検体を採取してそれにア
ルカリを加えてｐＨを７以上にしてペプシンを不活性化
し、 （ｂ）胃液を０．００５Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液に
よって透析して干渉物質を除去し、 （ｃ）透析された物質を、ビード状の共有結合で結合し
たジエチルアミノエチル基を有するアガロースのクロマ
トグラフカラムで分別し、それによって胃液に随伴する
ガンタンパク質をカラムに吸収し、さらに不純物を第１
画分中に取出してそれを捨て、 （ｄ）濃縮された胃液に随伴するタンパク質を、ＮａＣ
ｌを添加してＮａＣｌ溶液を０．１Ｍから０．２Ｍまで
次第に高めた０．０２Ｍ Ｋ＿２ＨＰＯ＿４緩衝溶液を
添加して移動させ、それによって濃縮された画分を取り
出し、 （ｅ）濃縮された画分を０．０２Ｍ Ｋ＿２ＨＰＯ＿４
と０．１ＭＮａＣｌとを用いて透析し、さらに（ｆ）色
原体基質としての５−アミノサリチル酸の存在下で、ア
ビジン−ビオチンとワサビダイコンペルオキシダーゼと
を使用してＥＬＩＳＡ検査を行って検体中に存在するタ
ンパク質の量に基づくＩｇＧ値を得、タンパク質１ｍｇ
当り２．０ｎｇからグロブリンタンパク質１ｍｇ当り３
３ｎｇに亘るＩｇＧ値が、胃ガン診断の根拠であるアミ
ノグロブリンＧの量を示すものであるとする ことを包含する方法。 ４、該アガロースクロマトグラフカラムが、共有結合に
よってシバクロン（Ｃｉｂａｃｒｏｎ）Ｆ３ＧＡに橋か
け結合されてなる、特許請求の範囲第３項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US725246 | 1985-04-19 | ||
| US06/725,246 US4656025A (en) | 1985-04-19 | 1985-04-19 | Quantitative screening assay of tumor globulin from gastric juice |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61242599A true JPS61242599A (ja) | 1986-10-28 |
Family
ID=24913751
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60130959A Pending JPS61242599A (ja) | 1985-04-19 | 1985-06-18 | 胃液からの腫瘍グロブリンの定量スクリ−ニング検定方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4656025A (ja) |
| JP (1) | JPS61242599A (ja) |
| DE (1) | DE3522531A1 (ja) |
| GB (1) | GB2174807A (ja) |
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-
1985
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- 1985-06-24 DE DE19853522531 patent/DE3522531A1/de not_active Ceased
Also Published As
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|---|---|
| US4656025A (en) | 1987-04-07 |
| GB8513494D0 (en) | 1985-07-03 |
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