JPH05507095A - 子宮内膜抗原、組成物、試験キット及び子宮内膜抗体検出方法 - Google Patents
子宮内膜抗原、組成物、試験キット及び子宮内膜抗体検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
子宮内膜抗原、組成物、試験キット及び子宮内膜抗体検出方法発明の分野
本発明は、子宮内膜症の検出に関し、そしてタンパク質抗原性断片頚、試薬類、
診断試験キント類及びそれらに有用な組成物類に関する。
発明の背景
子宮内膜症は、子宮粘膜もしくは子宮内膜(子宮の表面に沿って存在する)に類
似する組織が体の別の部位、例えば腹腔内で増殖する疾病状態をいう。この疾病
は、婦人科学における重要な課題である。異常な組織の存在は、腹部出血、癒着
、月経困難症及び特に不妊症を発症させる。
現在、一般的には、子宮内膜症の予備診断は、不妊症、解明されていない骨盤痛
、もしくは別の既知症状の患者の病歴に基づいて実施される。確認は、生検用組
織試料を得るために腹腔鏡検査法と称される外科的方法を用いて実施される9こ
れは、不快であり、そして侵入方法に伴う通常の危険を有する方法である。
正常な子宮内膜組織に対する抗体が、子宮内膜症の豐者の血清中に見い出される
ことが報告されている(ヨーロッパ特許第八−0,387,027号明細書、1
990年9月12日発行に記載の刊行物参照)。
各種抗原が、血清被検体中に見い出される子宮内膜抗体に免疫学的に関連するも
のとして推測されている。
ヨーロッパ特許第A−0.387,027号明細書には、各種の分子量を有する
子宮内膜抗原が、数種の上皮性癌腫セルラインより得られる培養組織もしくは培
養培地から単離されることが記載されている。また、その抗原に向けられたモノ
クローナル抗体及び免疫学的試薬が記載されている0次いで抗体及び抗原は、各
種の免疫学的方法を用いて患者被検体中の子宮内膜抗体を検出するのに使用され
た。
子宮内膜抗体についての鋭敏で正確なアンセイに使用可能な更なる抗原を提供す
ることが望ましいであろう。
発明の要約
本発明は、上皮性腺癌細胞の細胞質より単離されたタンパク質抗原であって、
a、約63から約67キロダルトンの分子量を有する断片、b、約33から約3
7キロダルトンの分子量を有する断片、C0約40から約44キロダルトンの分
子量を有する断片、d、約31から約35キロダルトンの分子量を有する断片、
もしくはe、約57から約64キロダルトンの分子量を有する断片、から成る群
より選ばれる抗原を提供する。
これらの抗原は、個別に又は子宮内膜抗体の存在を検出するのに有用な緩衝化組
成物への混合物として提供できる。
また、本発明は、水不溶性支持体に付着された1つ以上の上記タンパク質子宮内
膜抗原を含んで成る子宮内膜抗体捕捉試薬を提供する。
更に、1つ以上の抗原が、水溶性子宮内膜抗体検出試薬を提供するために直接標
識できる。
抗原又はいずれかの上記試薬が、子宮内膜抗体と反応性である抗ヒト抗体と共に
診断試験キットとして提供できる。
子宮内膜抗体の検出方法は、
A、子宮内膜抗体を含有することが推測される被検体を、上記りンバク質抗原と
接触させる工程、及び
B。被検体中の子宮内膜抗体の指標として、いずれか得られた抗原と子宮内膜抗
体の複合体を検出する工程、を含んで成る。
本発明は、侵入的腹腔鏡検査法を必要としない、優れた子宮内膜症の検出手段を
提供する。この結果は、上皮性腺癌細胞の細胞質より単離される新規タンパク質
抗原断片を用いて12色者の被検体、例えば血清中の子宮内膜抗体の存在を検査
することによって達成される。抗体の鋭敏な検出は、下記各種のアッセイフォー
マットを用いて実施できる。
図面の簡単な説明
図面は、下記例5により詳細に記載されたイムノブロットアッセイで用いられた
数種のニトロセルロースストリップの写真画像である。
によって同定される0分子量測定用電気泳動方法では若干の固有の不正確性(約
10%)があることが当該技術分野では標準であるとはいえ、それらは、狭い範
囲の分子量で同定される。また、幾つかの抗原は、等電点(ρI)により特徴付
けられる。
一般的には、抗原は、ヒト上皮性腺癌細胞の細胞質中に見い出される大きなタン
パク質より単離されるタンパク質断片である。このような細胞に包含される細胞
は、子宮内膜、乳房及び卵巣の細胞である0本明細書で同定される抗原断片は、
各種のセルラインより単離可能であり、そして分子量が同一である限り、多種の
アミノ酸組放物を有してもよい。また、細胞より単離されるX熱度抗原の当量体
として予測されるものは、同一の分子量、等電点、及び目的の抗体との免疫学的
反応性を有するペプチドであり、「免疫学的当量体」と称されるものである。
本発明の代表的な単離断片を下記表Iに列挙する。それらは本発明の実施に際し
て単一で、又は混合物として使用されうる。
F、 59−64
上記33−37kD、40−44kD及び57−59kDの断片を、別個に又は
混合物として使用することが好ましく、2つ以上の断片の混合物が最も好ましい
。
子宮内膜抗原は、洗浄剤のような抽出試薬で処理した上皮性組織(例えば、子宮
内膜組織)の抽出物をアフィニティークロマトグラフィーにかりることにより単
離できる。それらの抗原に特異的な抗体(モノクローナルもしくはポリクローナ
ル)が、クロマトグラフィー処理で使用できる。カラム精製による組織抽出物の
処理は、標準的な方法、例えば、Davis他、CaneJes、 46.61
43〜6148ページ(1,986)に記載されるものを用いて実施できる。「
単離されたjとは、タンパク質抗原断片が、上皮性腺癌細胞の細胞質中、もしく
はいずれか別のヒトの流体又は組織被検体中のその天然状態と比較して、少なく
とも一部分は精製状態であることを意味する。本明細書に記載されるもののほか
にも各種方法が、個別の抗原断片を単離するのに使用でき、それらとしては、例
えば、Harrington、 Methods of旦鉦懸旦[182,48
8〜495ページ(1990)に記載されるようなゲルからの電気溶離が挙げら
れる。
好ましい方法では、抗原は、上皮性腺癌セルライン(例えばヨーロッパ特許第A
−0,387,027号明細書に記載されるもの)の培養組織のようなm織培養
細胞より得ることができる。代表的な有用なセルラインは、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション(Ai+erican Type Cu!ture
Co11ection) (ロックウィル(Rockville)、メリーラ
ンド(Maryland))、に寄託されている、ずなわち: IIECIA(
ATCCHTB−112)、 AN3CA(ATCC[1TB−111)、 R
L95−2(ATCCCRL−1671)。
KLE(ATCCCRL−1622)、 T47D(ATCCHTB−133)
及びCAOV3(ATCCHTB−75)のセルラインである。
セルラインより抗原を単離する一般的な方法は、以下のとおりである。細胞を推
薦される培地で集密度が90%を越えるまで培養し、続いて緩衝溶液、もしくは
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、シ4!及びプロテアーゼインヒビタ
ーの溶液でホモジナイゼーションにかけた。緩衝溶液中の抽出物として、粒状物
質が遠心分離され、上滑を濃縮した。好ましいM欅では、原液の抽出#!yJヨ
して、粒状物質が遠心分離され、上清を4工で1時間、100.000 x重力
で回転させ、次いで濃縮した。次いで抽出物(すなわち、細胞質画分)を、適す
る緩衝剤系にて適する時間及びボルト数で5O5−PAGE電気泳動を用いて解
析した9次いで得られたタンパク質を、例えば、5tOtt。
J、Is+mun、Meすods 119.153〜187ページ(1989)
に記載される標準イムノブロッティング方法を用いてニトロセルロースへ移した
。この方法についてのより詳細な説明は、下記例1に提供される。抽出方法で用
いられるすべての材料が、市販されている。
単離された抗原もしくはそれらの混合物は、各種の免疫学的方法で使用するため
に緩衝化組成物として供給されうる。一般的には、組成物は6.1つ以上の適す
る緩衝剤、例えば、リン酸緩衝溶液、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
、グリシン、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸、ホウ酸塩及び当該技
術分野で既知である別のもの〔例えば、Good他、Biochem 、5,4
67(1966)) (これらのほとんどが市販されている)を用いてpH約6
〜約8に緩衝化される。このような組成物中の抗原の量は、その予定された用途
に依存して広範に変更できる。単離された抗原断片は、粗状11(すなわち、無
関係な細胞性物質との混合物)もしくは各種の精製段階の状態で使用できる。
また、本明細書に記載された抗原は、その抗原に結合させた適当な標識部分を担
持する検出可能な標識水溶性(もしくは水懸濁性)試薬とL2て提供されうる。
有用な標識としては、直接検出可能なもの、例えば、放射性同位体類1.色原体
類、蛍光原体類、懸濁性磁気粒子類、懸濁性着色ポリマー粒子類、化学ルミネッ
センス部分1.生物ルミネッセンス部分、及びリン並びに当該技術分野で既知の
別のものが挙げられる。更なる試薬との反応を介して間接的に検出可能な標識と
しては、酵素類及び色素生成体類並びに当該技術分野で既知の別のもの(例えば
、ヨーロッパ特許第A−0,387,027号明細書中のもの)が挙げられる。
特に有用な標識としては、放射性同位元素類及び酵素類が挙げられる。有用な酵
素標識としては、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ウレアーゼ、
グルコースオキシダーゼ、及び−β−−ゴー−トシダーゼ並びに当業者に容易に
明らかである別のものが挙げられる。ペルオキシダーゼ及びアルカリ性ホスファ
ターゼが好ましい。
標識部分は、例えば、米国特許第4,302.438号明細書、Marchal
onis、拒μ±印工り、旦3.299〜305ページ(1969)、 Hna
towich他、J、fnunol、Methods 、 65.147〜15
7ページ(1983)及び5cience 。
220.613〜615ページ(1983)放射性標識について、並びにYos
h i take他、Eur、J、Biochem、、 101.395(19
79)、Pe5ce他、Cl1n、Chem、+ 20+353〜359ページ
(1974)、米国特許第4,302.438号、同第4,376.110号及
び同第31,006号明細書並びにそこに記載される文献、例えば、酵素での標
識について記載されるWtj11!技術を用いて抗原断片に結合できる。抗原は
、例えば米国特許第4,795,698号明細書の教示を用いて磁気粒子もしく
は磁化粒子に結合できる。化学ルミネッセンス部分は、例えば、米国特許第4,
380,580号明細書の教示に従って抗原と結合できる0着色もしくは蛍光性
粒子は標識として有用であり、そして米国特許第4,259,313号明細書、
ヨーロッパ特許第A−0,208,556号及び同第^−308,235号明細
書に従って抗原に付着できる。フルオレセインもしくは別の蛍光性部分が、既知
方法を用いて標識とし、て付着できる。
また、抗原は、子宮内膜抗体に特異的ではない特異的パインディング部分で標識
してもよい、このような部分としては、アビジ〉・、ビオチン、レクチン、糖及
び当業者に容易に明らかである別のものが挙げられる。上記部分は、酵素、放射
性同位体もしくは上記の別の部分で標識できるそれに対応するレセプターと反応
性であるだろう0例えば、抗原がビオチンで標識される場合には、対応するレセ
プター、アビジンが酵素に結合できる。このような標識方法は、例えば、米国特
許第4,496,654号明細書、ヨーロッパ特許第A−0,201,079号
及び同第A−0.370,694号明細書に記載される。
水懸濁性であるようなこの試薬に用いられる粒子については、通常それらは約1
ミリメートル未満のサイズであるため、わずかに又は全く撹拌することなく、少
なくとも3時間それらを水中で懸濁させた。
また、本発明の抗原は、水不溶性支持体に結合せしめて、子宮内膜抗体と複合体
化させるための子宮内膜抗体1捉試薬を提供することによって、抗体を「補捉」
できる、水に容易に懸濁されず(上記試薬と異なる)かつ抗体−抗原反応もしく
は免疫学的反応の検出に必要ないずれか別の反応を干渉しない限り、いずれかの
有用な支持体が使用できる。有用な支持体としては、存機及び無機ポリマー類、
ガラス、セラミック類、シリカゲル、金属類並びに金属酸化物類の粒子類−紙、
ガラス、マット繊維類及び特定の構造のフィルター類;微孔質ポリマーフィルタ
ー類、ゲル類、マイクロタイタープレート類、試験管類、試験カップ類、バイア
ル類並びに当業者に容易に明らかである別のものが挙げられる。一般的には、粒
子は約0.05ミリメートルを越える直径を有する。また、このような支持体に
有用な材料は、特にヨーロッパ特許第A−0,387,027号明細書中の教示
を考慮して当業者に明らかとなるであろう、抗原は、吸着もしくは別の非共有結
合手段(例えば、米国特許第4,528,267号明細書を参照されたい)又は
周知方法を用いる共有結合手段により、このような材料に付着でき、上記方法と
しては、粒状標識を抗原に結合せしめることについて先に記載されたもの、並び
にChibata、 T*5obNized −影v刃駄シーHalsted
Press:New York(1978)及びCautrecasas、J、
Rio。
Ωem、、245.1059(1970)に記載される別のものが挙げられる。
従って、結合は、反応性基もしくはイオン性結合を介して又は当該技術分野で既
知である結合部分もしくはタンパク質を介して支持体に直接的であることができ
る0例えば、抗原は非特異的吸着もしくはプレート上の反応性基に対する共有結
合によりマイクロタイタープレートに結合できる。
本発明の抗原に対する抗体は、標準的方法を用いて開発できる。
例えば、ポリクローナル抗体は、適当な哺乳動物、例えば、ヤギ、サル、ウサギ
、モルモット及びウマを用いて製造できる。得られた抗血清は、伝統的なアフィ
ニティークロマトグラフィー、例えば、Mishell他、 5elected
Methods in CeXユular Immunolo 、5anFr
ancisco、 Freeman(1980)に記載されるものを用いて精製
できる。
また、非ヒトモノクローナル抗体が、懸濁されたwlI細胞を生産させるための
免疫感作マウスもしくはラットより生産されるノhイブリドーマの使用を含むに
5hler他、Nature、 256.495〜497ページ(1975)の
標準方法を用いて製造されうる。適するノ\イプリドーマは、市販のもの又はA
TCCを包含する各種細胞培養コレクションのどちらかより入手可能である。
抗原及び抗イデイオタイプ抗体に特異的なヒトモノクローナル抗体を包含する別
のタイプの抗体が、ヨーロッパ特許第A−0,387,027号明細書により詳
細に記載される方法を用いて製造できる。
本発明の抗原は、ヒト体液、例えば、全血、血清、子宮内膜!Il織の懸濁液、
腹膜の流体及び子宮の流体もしくは分泌物に見い出される子宮内膜抗体の検出(
すなわち、存在、量もしくは両方)に有用である。好ましくは、抗体が血清中に
検出される。一般的には、これらの抗体はヒ) rgc型抗体として同定される
とはいえ、またIgA型抗体が存在するかもしれない。
子宮内膜抗体の検出は、各種の免疫学的方法を用いて実施でき、一般的にはそれ
らのすべてが、この発明の抗原と対応する子宮内膜抗体との優先的なパインディ
ングを含むことが当該技術分野で周知である。限定されるものではないが、この
ような方法としては、競合パインディングアッセイ類、エンザイムリンクトイム
ノソルベントイムノアッセイ11 (ELISA)、ラジオイムノアッセイtl
! (1?IA)、イムノメトリックアッセイI!(サンドウィッチ)、イムノ
プロット類、凝集アッセイ類、光散乱アッセイ類及び超音波ブローブアフセイ類
、が挙げられる。
イムノプロット類は、例えば、5tOtt(上記)により記載された標準方法を
用いて実施できる。一般的には、抗原をイムノプロット媒体、例えば、ニトロセ
ルロース(これが好ましい)、ナイロンもしくはポリビニリデンジフルオリド、
に転写せしめ、非特異的部位を適当な物質でブロックせしめ、そして愚者のサン
プル中の抗体が媒体中で抗原と複合体化するのに十分な時開及び温度でそのサン
プルを媒体と接触せしめる。洗浄後、媒体中の複合体は、抗体を「サンドウィッ
チ」できる検出可能に標識された抗原と、又は子宮内膜抗体と反応性である検出
可能に標識された抗ヒト抗体と接触せしめることができる0代表的なイムノプロ
ットは下記例5に記載され、そして結果が図面に示されている。
光散乱アッセイ類は、ヨーロッパ特許第A−0.387,027号明細書の教示
に従うこの発明の抗原を用いて子宮内膜抗体を検出するのに有用である。
一般的には、競合パインディングアッセイは、子宮内膜抗体を含有する懸濁され
九波検体を抗原及び既知量の標識子宮内腔抗体を接触ゼしめる工程を含む。標識
及び未標識抗体は抗原と複合体化する際に競合し、ぞt7て複合体由来の検出可
能なシグナルの量は被検体中の末櫟識抗体の量に反比例する。標識抗体は、先に
(膜抗原について広く記載された材料及び方法を用いて製造できる。このような
7、izイについηのより詳細な説明は、米国特許第3.654,090号明細
書を包含する当該技術分野の多数の文献を調べることにより入手できる。
別のタイプのイムノアッセイは、目的とする子宮内膜抗体が特異的パインディン
グ材料の間に「サントライ・ンチ」されるイムノメトリックもしくはサン1゛ウ
インナアツセイとして既知であるものである。成る態様では、特異的パインディ
ング材料が両方とも子宮内膜抗原を含んで成り、その一方が検出可能に標識され
ており(すなわち、検出試薬)、そしてもう一方が上記捕捉試薬である。別の態
様では、サンドウィッチ中の一方の特異的パインティング材料が本明細書に記載
されるような抗原を含んで成る捕捉もしくは検出試薬のどちらかであることがで
き、そしてもう一方が、子宮内膜抗体と反応性である標識抗ヒト抗体もしくは捕
捉体である。抗ヒト抗体は、蛍光原体、酵素もしくは放射性同位体で都合良く標
識される。抗ヒト抗体が酵素で標識される場合には、アッセイはELISAとし
て既知である。このようなアッセイについての更に詳細な説明は、米国特許第3
2.696号、同第4,376.110号及び同第4,486,530号明細書
を包含する従来技術文献で周知である。子宮内膜抗体と反応性である抗ヒト抗体
は、標準的な方法を用いて製造できる。多くのものが市販されている。
子宮内膜抗体は、この発明の抗原断片をニトロセルロースに転写し、固定された
抗原を患者の試料と接触せしめて子宮内膜抗体を複合体化り、、そし、て標準的
方法に従って高温もしくは低pH?8液を用いて抗体をニトロセルロースより溶
離せしめることにより、血清もしくは別の、患者由来の被検体より単離できる。
上記アッセイの多くでは、各種洗浄溶液、遮断性溶液及び色素提供性溶液([m
が酵素もしくは検出のために更なる反応をa・要とする別の化学物質である場合
)が、必要であるがもじれない、このような材料の詳細は、手近な関連刊行物を
もって当業者に容易に明らかとなるであろう、明らかに、用いられる特異的試薬
はアッセイの形式及びそこで用いられる標識に依存するであろう。
患者の試料、例えば、血清試料は、所望であれば、水、緩衝液、もしくはその用
途について市販されている適当な希釈剤で希釈してもよい、特に有用な希釈組成
物が、ヨーロッパ特許第A−0,337,785号明細書(1989年10月1
8日発行)に記載されている。
これらのアッセイは、適当な装置もしくは試験デバイスで実施できる0例えば、
イムノプロットは、適当な媒体、例えばニトロセルロースストリップを用いて実
施される。競合パインディング及びサンドウィッチアッセイは、複数の試験ウェ
ルを担持するマイクロタイタープレート、試験管、試験スライド及び米国特許第
3,825,410号、同第3.888,629号、同第3.970,429号
、同第4,446,232号、同第4,870.007号、同第4.921,6
77号及び同第4,948,561号明細書に記載のものを初めとする使い捨て
試験デバイス並びに当業者に容易に明らかである別の容器を用いて実施できる。
好ましい試験デバイスとしては、マイクロタイタープレート及び複合体化されて
いない材料から複合体化された材料を分離するために微孔質膜を備え付けられた
使い捨て試験デバイス(イースI−マン・コダック・カンパニーより市販されて
いるスレセル(SURECHLL・商標)試験キット)が挙げられる。
本発明の抗原、組成物もしくは試薬は、別個にもしくは診断試験キットの一部と
して提供できる。このようなキットは、特定のアッセイで用いられる組成物及び
試薬(上記)並びに必要な使用説明書、試験デバイス、1つ以上の被検体をアッ
セイするための被検体処理装置を含んでもよい。好ましくはキットが、抗原(も
しくはそれらの混合物)、子宮内膜抗体と反応性である標識抗ヒト抗体及び得ら
れる免疫学的反応を検出するための手段を包含する。検出手段は、試験デバイス
、マイクロタイタープレート、色素提供性組成物もしくは当該技術分野で既知で
ある別のもの又はそれらの組み合わせであることができる。
以下の例は、本発明の実施方法を具体的に説明するものである。
それらは、その範囲もしくは特定の1!様に瞑定されることを意味するものでは
ない、特に断らない限り、パーセンテージは、重量バー各種の上皮性腺癌セルラ
インを用いて数種の抗原断片を1tltするのに、以下の方法及び材料を用いた
。
6種のセルライン: HECIA(ATCCHTB412)、^N5CA(AT
CC1(TB−111)。
RL95−2(ATCCCRL−1671)、 XLE(ATCCCRL−16
22)、 T47D(ATCC1(TB−133)及びCAOV3(ATCCH
TB−75)を、Aserican Type Cu1ture Co11ec
tion(Rockvi lie、 Maryland)より入手した。
各セルラインを以下の方法で処理した。細胞を推薦される培地(例えば、市販の
IIEcIA用マッコーイ(McCoy)培地)で、集密度が90%を越えるま
で培養した(このレベルで、1つ以上の抗原が存在すると確信した)、得られた
細胞を、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液(50ミリモル、pH
7,4)、ショ糖(250ミリモル)及びプロテアーゼインヒビター(ベーリン
ガーマンハイムもしくはシグマ化学市販の、ロイペプチン0.5μg/a+L、
ペプスタチン0.7pg /mL、 EDTA Na、 372μg /IIL
、及びアプロチニン2μg/sLの混合物)の溶液中、機械的ホモジナイザーを
用いて4°Cで2分間ホモジナイズした。核、ミトコンドリア及び未溶解物を包
含する細胞破片を遠心分離し、続いて4℃で1時間、100.000 x重力で
超遠心して望ましくない細胞の破片をすべて取り除き、そして細胞質の内容物を
そのまま残した0次いで上清を、Cen tr rce I l fi @器(
30,000正常分子量限界、Po1yscjences、 Warringt
、on、 Pa、)を用いて、タンパク質約0.5〜ioI1g/mLまで濃縮
した。
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝剤(25ミリモル、pH8,5)
、グリシン緩衝剤(200ミリモル)、ドデシル硫酸ナトリウム(0,1%)及
び酢酸ナトリウム(100ミリモル)の緩衝液中、10%均質ポリアクリルアミ
ド還元性ゲルを用いて3〜4時間、ボルト数を400ボルトまで増加させて5D
S−PAGEt気泳動を用いて抽出物を解析した。
2次元電気泳動により等電点(pI)を測定した。上述のように製造した細胞溶
解タンパク質を、まず、1次元で等電点電気泳動を用いて等電点により分離し、
次いで等電点電気泳動したタンパク質を、2次元で5O3−PAGE電気泳動に
より分子量に従って分離した。 5toet。
J、1x@un、Methods 、09,153〜187ページ(1989)
に記載されるように、そのタンパク質をニトロセルロースにプロットした。プロ
ットしたタンパク質を患者の血清でプローブ1.た、子宮内膜抗体を含有すると
信しられる血清(間接的免疫蛍光顕微鏡検査により検出された)並びに子宮内膜
症であることが既知である患者由来のものである血清(腹腔検査により検出され
た)を試験した。また、同様の方法を用いて子宮内膜抗体に関して陰性であるこ
とが既知である血清を、陰性対照として試験した0反応性タンパク質を標準的検
出系を用いて出現させた。陽性血清抗原(これらは、63−67kD、 4O−
44kD、33−37kD、 57−59kD及び59−64kDの抗原である
)を、陰性血清抗原(これらは、陰性及び陽性血清に共通のものであって、30
−32kD、18−22kD、 47−50kD及び28−30kDの抗原が挙
げられる)と比較した。
次いで陽性血清に特異的な抗原に注目してその分子量及び等電点を算出した。言
い換えると、陽性血清試料についてのイムノプロ・ントにおいて示されたバンド
からイムノプロットにおける共通のノインドを除くことにより抗原を同定した。
目的とする抗原の測定距離(CI)を、標準5OS−PAGE低分子低分子量タ
ンパクカマ−カー混合物済の測定路M(1)と比較することにより、各断片の分
子量を測定した。クリケラトグラフ(CI?ICKETGRAPH・商標)ソフ
トウェア(クリケント・ソフトウェア、 Inc、市販)、及びエクセル(EX
CEL・商標)ソフトウェア(マイクロソフト市販)を用いて算出された適する
多項式曲線を用いて分子量を測定し、そしてキロダルトン(kD)で表示した0
両プログラムをマツキントツシ1 (Macintosh) 2コンピユーター
で実施した。
単離された抗原断片及び得られたデータを下記表■に列挙する。
各断片の分子量が狭い範囲で列挙されているのは、正確な値を得ることが既知方
法を用いる測定では困難であり、そして一般的に10%の変動が当該技術分野で
容認されているからである。
表 ■
m尤ニジ巳−L仁i(−一一五I慣[!、、、>”、、、ニー、、、−、、、、
、xi念東−A 1lL95−2 63−67 11A”B、 AN3CA 6
3−67 NA
Bt AN3CA 33−37 NA
Bs AN3CA 40 44 NA
B4 AN3CA 59−64 NA
C,1(ECIA 63−67 4.5C,HECIA 33−37 5.8
C3HECIA 40−44 4.6
C,HECIA 59−64 6.0
E、 T47D 63−67 4.5
Hz T47D 33−37 HA
Es T47D 40 44 4.6
E、 T47D 59−64 HA
ES T47D 57−59 NA
F、 CAOV3 63−67 4.5F! CAOV3 33−37 5.5
F3 CAOV3 40−44 4.6F4 CAOV3 59−64 6.0
”NA=検出不可
”kD=キロダルトン
@ 値はプラスマイナス1.0である
例2:バ夏引I」1羞1
1つ以上の抗原をトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝剤(pH8,3
)に添加して、本発明の粗緩衝化組成物を製造した。これらの組成物は、それら
を使用するまで又はアッセイで使用する際に固体支持体上に固定化されるまで、
適当な容器、例えば、試験キットで貯蔵してもよい。
例3:検II荒53 ゛の1!′1
本例は、どのようにして本発明の検出可能な標識子宮内膜抗体試薬が製造できる
かについての予期される具体例である。この試薬は、5−ジメチルアミノナフタ
レン−1−スルホニルクロリド、蛍光性部分で標識された子宮内膜抗原断片(上
記のように単離される)を含んで成るであろう。
3から5倍のモル量の過剰な5−ジメチルアミノナフタレン−1−スルホニルク
ロリドを、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝剤(25ミリモル、p
118.3)中の単離された抗原断片に添加することにより、試薬を製造できる
。添加前に、塩化物を最終容量の1%に等しいアセトンに溶解せしめた。反応を
、室温で1〜2時間進行せしめ、そして得られた混合物を緩衝剤(25ミリモル
、pH8,3)で透析したところ、所望の試薬が得られた。
例4: r −i のM−造。
本例は、本発明の子宮内膜抗体捕捉試薬の製造についての具体例である。
子宮内膜抗原の混合物(E、、E、、E、及びEs)を、例1に記載されるよう
に単離した。それらの抗原断片を、更に以下のように精製した。
無関係なタンパク質を、25%硫酸アンモニうムで沈殿させ、そして遠心分離に
より取り除いた。そのベレットを捨て、そして抗原断片を含む上清を更に硫酸ア
ンモニウムを40%まで用いて処理して遠心にかけ、そして得られたベレットを
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝剤(pH7,5)に再懸濁した。
この懸濁液を緩衝剤に対して透析した。
更に、その抗原を、ウォーターズPROTEINPAK(商標)I)EAEカラ
ムを使用してアニオン交換クロマトグラフィーにより精製した0次いでトリス(
ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝剤(0,02モル、pH8)及び塩化ナト
リウム勾配を用いて、その抗原断片をカラムより溶離した。これらの抗原は、塩
化ナトリウム0.3〜0.45モル間で溶離した。
得られた溶液をプロテアーゼインヒビターを含有するリン酸緩衝溶液でタンパク
130μg/■Lに希釈し、そして試料(100μL)をポリスチレンマイクロ
タイタープレートの各ウェルに添加して室温で2時間インキュベートした6次い
でそのプレートをリン酸緩衝溶液で3回洗浄した。プレート上の残りのパインデ
ィング部位を、リン酸緩衝溶液中ウシ血清アルブミン(3%)を用いて室温で2
時間処理することにより遮断した0次いでそのプレートを、リン酸緩衝溶液中ト
ウイーン(TWEEN・商1)20非イオン性界面活性剤(0,05%)の溶液
を用いて3回洗浄した。
血清試料を、リン酸緩衝溶液中トウィーン(TWEEN・商標)20(0,05
%)及びウシ血清アルブミン〔3%)の希釈剤で、1:5もしくは1:10に希
釈した。希釈した試料を、振盪しながら、室温で2時間プレートウェル中でイン
キュベートした。そのウェルを、トゥイーン(TWEEN・商標)20を含む洗
浄溶液で3回洗浄した。
ヤギ抗ヒトイムノグロブリンF (ab’ )!断片を西洋ワサビペルオキシダ
ーゼと結合させ、希釈剤で希釈し、そして0.2マイクロメートルフィルターを
介して濾過し、ウェルに添加して室温で1時間反応させた。
再びそのプレートを3回洗浄し、そして色素提供組成物(200μし)を各ウェ
ルに添加して約5分間反応させた。この組成物は、リン酸ナトリウム緩衝剤(1
0ミリモル、pH6,8)中、2−(4−ヒドロキシ−3−メトキシフェニル)
−4,5−ビス(4−メトキシフェニル)イミタソールロイコ色素(0,2ミリ
モル)、ポリ (ビニルピロリドン)(1,25%)、4′−ヒドロキシアセ)
・アニリド(5ミリモル)、ジエチレントリアミンペンタ酢酸キレート化M (
0,01ミリモル)及び過酸化水素(8ミリモル)を含有していた。
色素生成停止用溶液(100μL)を添加し、そして色素濃度を評価した。既知
陽性及び陰性血清試料より作成した較正曲線を用いて試験試料を評価した。
例5:5愚 の の
本例は、単離された子宮内膜抗原を用いて、イムノブロッティング方法により患
者の血清中に存在する子宮内膜抗体を検出する方法を具体的に説明するものであ
る。
例1記載の抗原断片を、5tottの且肛とに記載される最適イムノブロッティ
ング方法を用いて、ニトロセルロースストリップへ移した。移動用緩衝剤は、ト
リス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝剤(25ミリモル、pH8,3)、
グリシン(200ミリモル)及びメタノール(20%、HPLCグレード)から
成るものであった。移動を実施させるために、4℃、75ボルトで2時間処理し
た。移動完了後、非特異的タンパク質パインディング部位は、ゼラチン(3%)
、正常ヤギ血清(0,4%)及び塩化ナトリウム(500ミリモル)を含むトリ
ス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(20ミリモル、pH7,5)の「遮断性
」溶液を用いて24°Cで1時間処理して遮断した。次いで遮断されたニトロセ
ルロースを、塩化ナトリウム(500ミリモル)及びトウイーン(TWEEN・
商標)20非イオン性界面活性剤(0,05%)を含むトリス(ヒドロキシメチ
ル)アミノメタン(20ミリモル、pH7,5)を用いて、各々5分間ずつ、2
回洗浄した。次いでニトロセルロースストリップ及び希釈した血清試料(10+
mL)を24°Cで2時間インキュベートして接触させた。その血清を、ゼラチ
ン(1%)、塩化ナトリウム(500ミリモル)及びトゥイーン(TWEEト商
標)20非イオン性界面活性剤(0,05%)を含むトリス(ヒドロキシメチル
)アミノメタン(20ミリモル、p[17,5>でioo倍に希釈した。
子宮内膜抗体を含有すると信じられる血清(間接的免疫蛍光顕微鏡検査により検
出された)並びに子宮内膜症であることが既知である患者由来のものである血清
(腹腔検査により検出された)を試験した。また、同様の方法を用いて子宮内膜
抗体に関して陰性であることが既知である血清を、陰性対照として試験した。ま
た、子宮内膜抗体の存在もしくは不存在が、あらかじめ知られていない血清を試
験した(「盲目」試験)、これら「盲目」試験の結果を下記表■中アステリスク
(1)で示す。
血!インキエベーシテンした後、ニトロセルロースストリップを、上記トウイー
ン(TWEEN・商標)20を含をする緩衝液(30mL)で4回(各回5分間
)洗浄し、未複合体化物質を取り除いた。
次いでこれらのストリップを、固定化され→移動された抗原断片に結合した血清
子宮内膜抗体に向けられた抗ヒト抗体(患者の血清を希釈するのに用いられた溶
液40社中、結合体13.2μL)と接触させた状態で、24℃で2時間インキ
ュベートした。抗ヒト抗体は、検出用にアルカリ性ホスファターゼで標識された
ヤギ抗ヒトIgG(Hl及びL[)抗体を含んで成るものであった。その結合体
を、IMM[IN−BLOT(商標)アッセイキット(バイオランド・ラボラト
リーズ(BioRadLaborator4es))の一部として購入した。抗
体結合体インキュベーシヨンの完了後、ニトロセルロースストリップを上記トゥ
イーン(TWEEN・商標)20 II衝液で4回(各々5分間)洗浄し、そし
てトウイーン(TWEEN・商標)20を含まない上記緩衝液で1回(5分間)
洗浄して、未複合体化反応体及び過剰のトウィーン(TWEEN・商標)20非
イオン性界面活性剤を除去した。
ストリップ中に得られたバンドを検出するために、5−ブロモ−4−クロロ−3
−インドリルホスフェート及びニトロブルーテトラゾリウムの希釈液〔0,1モ
ルのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液50mL中各保存試薬50
0μLを含む、pH9,5)を添加した。
バンドを十分に発色させて(一般的には約20分間)、支持体を取り除き、そし
てストリップをイオン交換蒸留水で10分間洗浄して更なる発色を停止させた。
下記表■及び■は、上記アッセイを用いた血清スクリーニングの結果を示してい
る0表■中のデータを得るために用いられた抗原はリン酸緩衝溶液を用いて抽出
し、同様に表■のデータは、上記例1に記載されたショI!緩衝液を用いて抽出
した抗原を使用して得られた。
図面は、C!(40−44キロダルトン)及びC! (33−37キロダルトン
)の断片(各々r 42kD J及びr35kD」と図面中において同定される
)についてのストリップla、ib、2a及び2bにおけるイムノプロントハン
ドを示すものである。バンドIc、ld、2C及び2dは、陰性対照であり、上
記断片についてのバンドを示さない。
表■
D、 O/2 2/3
表■
0 「盲目J試験
例6:皮りm試lし乙バ/−友8(1)i丑鯉[L−俸pH度本例は、使い捨て
試験デバイス及びEIJSA免疫学的方法を用いる子宮内膜抗体の検出方法を具
体的に説明するものである。
材料:
HECIAセルライン(上記)より単離された非精製抗原(上記表Tに同定され
たC+、Ct及びC5断片を含む)を、ポリ〔スチレンーコ−3−(p−ビニル
ベンジルチオ)プロピオン酸〕から成る粒子(モル比97.59 : 2.41
、平均直径1.4■) (2,53%固体)に共有結合させて、本発明の粒子状
子宮内膜抗体捕捉試薬を製造した。
粒子状陰性対照試薬は、同一タイプの粒子(2,05%固体)上にα−カゼイン
を同様に固定化することにより製造した。
使用した使い捨て試験デバイスは、LOP[1ODYNE (商標)ポリアミド
微孔!(5m)膜(パル・コーポレーシヨン(Pail Corporatio
n))を備えた5URECELL (商標)試験デバイス(イーストマン・コダ
ック・カンパニー)であった、上記試験デバイスは3つの試験ウェルを担持して
おり、1つは陰性対照用、、そして2つは被検体用である。上記粒子状試薬(最
終固体量0.3%)を、試験デバイスの設定された試験ウェル膜上に塗布し、そ
して室温で一晩乾燥した。
使用した血清希釈組成物は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(100
ミリモル、p)113.0)、スクシニレートカゼイン(1%)、トゥイーン(
TWEEN・商標)20(0,05%)及びアラビアゴム(1%)(シのと同様
である。
洗浄液は、1−メチル−2−ピロリジノンcio%) 、N0NIDET(商標
)P−40(0,1%)、塩化ナトリウム(500ミリモル)、トウイーン(T
WEEト商標)20(0,25%)、リン酸ナトリウム、−塩基性(50ミリモ
ル、pH7,4) (シータス・コーポレーションより市販)、から成るもので
ある。
抗ヒト抗体は、ヤギ抗ヒトIgG(Hl及びLm)抗体であり、そして西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ(ジャクマン・イムノリサーチより市販)と結合せしめた。
ロイコ色素組成物は、リン酸ナトリウム緩衝剤(10ミリモル、pH6,8)中
、2−(4−ヒドロキシ−3−メトキンフエニlし)−4,5−ビス(4−メト
キシフェニル)イミダゾールロイコ色素(0,23ミリモル)、ポリ (ビニル
ピロリドン)(1,25%)、4′−ヒドロキシアセトアニリド(5ミリモル)
、ジエチレン−トリアミンペンタ酢酸キレート化剤(0,01ミリモル)及び過
酸化水素(8ミリモル)から成るものであった。
色素停止溶液は、アジ化ナトリウム(0,1%)を含んで成るものであった。
患者の血清試料(25μし)を、標準゛7ツセ・イスクィーズチューブ中の血清
希釈荊(2社)に添加して希釈した。フィルターチップをチューブに取り付けて
、そして希釈した試料の液滴の先端を試験デバイスの各ウェルに滴下した。流体
は、膜を介して流出させた。
希釈した( 1 : 10,000) !識抗ヒト抗体(40μL)を、各試験
ウェルに添加した。流体を膜を介して流出させ、そして試験ウェルを1分間イン
キュベートした9次いで各試験ウェルを洗浄液712回(250μL)洗浄した
。
次いで色素生成組成物(40μ!、)を各試験ウェルに添加しまた。流体を排水
せしめ、そして試験ウェルを2分間インキュベートした0次いで色素停止溶液(
80u I、)を添加し、続いて排水した。
目視可能な色素シグナルを評価し、そして評点を付けた(0が最低色素シグナル
であり、そして10が最高である)。また、透過濃度を、標]1!濃度測定方法
を用いて測定した。結果を下記表Vに示す。
透過濃度 0.02 0.057 0.015 0.023目視的結果 1 5
0 2.5
1 抗体陽性であることが既知である血清試料°1 抗体陰性であることが既知
である血清試料°n″ アッセイで用いられた試験ウェル数であり、n=2は、
表中の結果が、2つの試験ウェルのシグナルの平均値であることを表す。
本発明を、それらの好ましいa様を特に引用して詳細に記載して接関係がある技
術について引用することにより、本明細書に組み入れられる。
35kD −嘩 −・ ・−噌 −
1a Ib lc ld 2a 2b 2c 2d要約書
複数のタンパク質抗原断片が、上皮性腺癌細胞の細胞質より単離された。これら
のタンパク質抗原は、子宮内膜症の指標である子宮内膜抗体の検出に有用である
。上記抗原を、水不溶性支持体に付着させるか、または検出可能となるように標
識して、試薬を製造してもよい、子宮内膜抗体の検出は、抗原と被検体試料中の
芯体を反応させて、得られた複合体を検出することにより達成される。これらの
抗原は、診断試験キットにおける緩衝化組成物として供給できる。
手続補正書
平成 E年2月 を日
Claims (24)
- 1.上皮性腺癌細胞の細胞質より単離され、かつa.約63から約67キロダル トンの分子量を有する断片、b.約33から約37キロダルトンの分子量を有す る断片、c.約40から約44キロダルトンの分子量を有する断片、d.約31 から約35キロダルトンの分子量を有する断片、及びe.約57から約64キロ ダルトンの分子量を有する断片、から成る群より選ばれるタンパク質抗原。
- 2.上記63−67kD断片がRL95−2,AN3CA,HEC1A,T47 DもしくはCAOV3セルラインより単離され、 上記33−37kD断片がAN3CA,HEC1A,T47DもしくはCADV 3セルラインより単離され、 上記40−44断片がAN3CA,HEC1A,T47DもしくはCAOV3セ ルラインより単離され、 上記31−35断片がKLEセルラインより単離され、そして上記57−64断 片がAN3CA,HEC1A,T47DもしくはCAOV3より単離される請求 項1の抗原。
- 3.子宮内膜抗体の存在を検出するのに有用な緩衝化抗原性組成物であって、 上皮性腺癌細胞の細胞質より単離され、かつa.約63から約67キロダルトン の分子量を有する断片、b.約33から約37キログルトンの分子量を有する断 片、c.約40から約44キロダルトンの分子量を有する断片、d.約31から 約35キロダルトンの分子量を有する断片、及びe.約57から約64キロダル トンの分子量を有する断片、から成る群より選ばれるタンパク質抗原を含んで成 る組成物。
- 4.水溶性支持体に付着させたタンパク質抗原を含んで成る子宮内膜抗体捕捉試 薬であって、上記タンパク質抗原が、上皮性腺癌細胞の細胞質より単離され、か つ a.約63から約67キロダルトンの分子量を有する断片、b.約33から約3 7キロダルトンの分子量を有する断片、c.約40から約44キロダルトンの分 子量を有する断片、d.約31から約35キロダルトンの分子量を有する断片、 及びe.約57から約64キロダルトンの分子量を有する断片、から成る群より 選ばれる子宮内膜抗体捕捉試薬。
- 5.上記抗原が33−37kD断片、57−64kD断片、40−44kD断片 もしくはそれらの混合物である請求項4の試薬。
- 6.上記支持体がマイクロタイタープレートである請求項4の試薬。
- 7.上記支持体がポリマー粒子である請求項4の試薬。
- 8.上記支持体が微孔質膜である請求項4の試薬。
- 9.検出可能に標識されたタンパク質抗原を含んで成る水溶性子宮内膜抗体試薬 であって、上記タンパク質抗原が、上皮性腺癌細胞の細胞質より単離され、かつ a.約63から約67キロダルトンの分子量を有する断片、b.約33から約3 7キロダルトンの分子量を有する断片、c.約40から約44キロダルトンの分 子量を有する断片、d.約31から約35キロダルトンの分子量を有する断片、 及びe.約57から約64キロダルトンの分子量を有する断片、から成る群より 選ばれる水溶性子宮内膜抗体試薬。
- 10.蛍光原体、放射性同位体もしくは酵素で標識された請求項9の試薬。
- 11.ペルオキシダーゼ及びアルカリ性ホスファターゼから成る群より選ばれる 酵素で標識された請求項10の試薬。
- 12.1)上皮性腺癌細胞の細胞質より単離され、かつa.約63から約67キ ロダルトンの分子量を有する断片、b.約33から約37キロダルトンの分子量 を有する断片、c.約40から約44キロダルトンの分子量を有する断片、d. 約31から約35キロダルトンの分子量を有する断片、及びe.約57から約6 4キロダルトンの分子量を有する断片、から成る群より選ばれるタンパク質抗原 、並びに2)子宮内膜抗体に反応性である抗ヒト抗体、を含んで成る診断試験キ ット。
- 13.抗ヒト抗体が蛍光原体、放射性同位体もしくは酵素で標識された請求項1 2のキット。
- 14.上記抗原が水不溶性支持体に付着せしめられた請求項12のキット。
- 15.上記抗原と子宮内膜抗体の反応結果を検出するための手段を更に含んで成 る請求項12のキット。
- 16.微孔質膜を含んで成る使い捨て試験デバイスを更に含んで成る請求項12 のキット。
- 17.A.子宮内膜抗体を含有すると推測される被検体を、上皮性腺癌細胞の細 胞質より単離され、かつ a.約63から約67キロダルトンの分子量を有する断片、b.約33から約3 7キロダルトンの分子量を有する断片、c.約40から約44キロダルトンの分 子量を有する断片、d.約31から約35キロダルトンの分子量を有する断片、 及びe.約57から約64キロダルトンの分子量を有する断片、から成る群より 選ばれるタンパク質抗原、と接触せしめる工程、並びに B.上記被検体中の上記子宮内膜抗体の指標としていずれか得られた上記子宮内 膜抗体と上記抗原の複合体を検出する工程、を含んで成る子宮内膜抗体の検出方 法。
- 18.上記抗原が子宮内膜抗体捕捉試薬の一部として水不溶性支持体に付着せし められており、かつ得られた複合体が検出用にそれによって不溶化される請求項 17の方法。
- 19.上記支持体がマイクロタイタープレートである請求項18の方法。
- 20.上記支持体がポリマー粒子である請求項18の方法。
- 21.上記方法が、イムノプロットにより上記複合体を検出することによって実 施される請求項17の方法。
- 22.上記複合体が、上記子宮内膜抗体と反応性である検出可能に標識された抗 ヒト抗体と上記子宮内膜抗体の反応により検出される請求項17の方法。
- 23.上記抗ヒト抗体が蛍光原体、放射性同位体もしくは酵素で標識された請求 項22の方法。
- 24.上記被検体が血清である請求項17の方法。
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