JPH03202769A - 子宮内膜症診断の方法及び試薬 - Google Patents

子宮内膜症診断の方法及び試薬

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JPH03202769A
JPH03202769A JP2052863A JP5286390A JPH03202769A JP H03202769 A JPH03202769 A JP H03202769A JP 2052863 A JP2052863 A JP 2052863A JP 5286390 A JP5286390 A JP 5286390A JP H03202769 A JPH03202769 A JP H03202769A
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antigen
antibodies
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Nelson N H Teng
ネルソン・エヌ・エイチ・テン
Subba Rao Gunupudi
スバ・ラオ・グヌプデイ
Diane Feingersh
ダイアン・フエインガーシユ
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Adeza Biomedical Corp
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、子宮内膜症の試験管内での診断に、及びその
だめの方法及び試薬に関する。
背景の技術 子宮内膜症（Ｅ　ｎｄｏｍｅｔｒｉｏｓｉｓ）は、普通
子宮内に見出される組織が身体の他の領域で、例えば腹
腔内で増殖するという病気である。これらの増殖した組
織は毎月の内分泌サイクルに応答し、腹腔内出血、癒着
、月経困難、及び不妊をもたらす。
子宮内膜症の予備的診断は、一般に患者の不妊、月経困
難及び説明できない骨盤の痛みの経過に基づいて行なわ
れる。予備的診断の確認は、ラブロスコピー（Ｌ　ａｐ
ｒｏｓｃｏｐｙ）　、即ち腹腔に切開を作り且つ組織を
可視化及び生検する侵入法を用いて行なわれる。現在普
及している簡単で、非侵入式の試験管内診断法及び子宮
内膜症の徴候開始前に検知できる方法は存在しない。
子宮内膜症は自己免疫病のいくつかの特徴を有するよう
に見える。正常な子宮内膜組織に対する抗体は、マサ−
（Ｍａｔｈｕｒ）ら、オブステト・シネコール（Ｏｂｓ
ｔｅｔ、　Ｇｙｎｅｃｏｌ、）　５０．２５９（１９８
２）；バダウイー（Ｂ　ａｄａｗｙ）ら、オブステト・
シネコール　６３．２７１　（１９８４）；ワルイル（
Ｗｉｌｄ）ら、アン・Ｊ・レプロド・イミ！　／　ル”
ミクロビオル（Ａｍ、　Ｊ　、　Ｒｅｐｒｏｄ、　　Ｉ
　ｍｒｎｕｎｏｌ、　Ｍ　１ｃｒｏｂｉｏ１．）　８．
８４（１９８５）、及びアム、Ｊ、レプロド・イミュノ
ル・ミクロビオル　１３．６２　（１９８７）；チバル
（Ｃｈｉｂａｌ）ら、ファーチル・ステリル（Ｆ　ｅｒ
ｔｉｌ、　Ｓ　ｔｅｒｉｌ、）４６．４０ｇ　（１９８
６）；及びミータ（Ｍｅｅｋ）ら、アム、Ｊ、オプステ
ト・シネコール、１５８．１３６５（１９８８）に報告
されているように、子宮内膜症の患者の血清中に見出さ
れた。燐脂質、核酸及びヒストンを含む多くの抗原を、
自己抗体（ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ）の検知のために
試験したが、有用な臨床的関連は見出すことができなか
った。マサ−ら、ファーチル、ステリル、５０．８６０
　（１９８８）は、分子量３４ＫＤ及び２６ＫＤを有す
る２つの抗原は子宮内膜症と関連するということを報告
した。ワイルドら（上掲）は固定した子宮内膜、卵巣及
び胸部ガン腫細胞系統を抗原源として用い、良好な臨床
学的関連を報告した。この抗原は上皮細胞抗原、更に特
に細胞の細胞質成分であると推定された。しかしながら
特別な上皮細胞抗原は同定されていない。
血清抗体の、不死化された子宮内膜のガン臘細胞系統に
対する結合は、ワイルドら、アム、ツク。
イミュノ、レプロド（Ａｍ、　Ｓｏｃ、　　Ｉ　ｍ＋ｎ
ｕｎｏ、　Ｒｅｐｏｒｄ、）第８年金（Ｐｏｒｔｌａｎ
ｄ、　Ｍａｉｎｅ）　、６月１５〜１９日（１９８８午
）により報告された。子宮内膜症に特異的な抗原又は抗
−（子宮内膜症）抗体は報告されていない。子宮頚内、
子宮内膜、卵管、胸膜及び６膜に存在する高分子量の糖
蛋白質である卵巣ガン腫マーカーＣＡ１２５は、バルビ
エリ（Ｂ　ａｒｂｉｅｒｉ）ら、ファーチル・ステリル
、４５．６３０　（１９８６）に報告されているように
進んだ子宮内膜症の患者の血清中に高量で存在すること
が発見された。しかしながらＣＡ１２５の血清量は月経
中すべての患者において増大し、子宮内膜症を検知する
ための信頼できるマーカーでないことがわかった。
テリマア（Ｔｅｌｉｍａａ）ら、アム、Ｊ、オブステト
、シネコール、１６１，８６６　（１９８６）は、進行
した子宮内膜症の患者において増大量の子宮内膜分泌蛋
白ＰＰ１４を報告した。軽い子宮内膜症の場合、この蛋
白質の量は見かけ上健康な対照対象体で見出されるもの
から有意なほど増加しない。
Ｌ、Ｈ，スミス（Ｓ　ｍ１ｔｈ）ら、Ｊ、イミュノル、
メソッズ（Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）、１
０５．２６３〜２７３（１９８７）は、患者のリンパ球
及びヘテロミエローマ（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ）
融合パートナ−５ＨＭ−Ｄ３３を用いることによる、卵
巣ガンと関連した抗原に対する人間のモノクローナル抗
体（ｈＭＡｂｓ）を産生ずるハイブリドーマの生皮を報
告している（米国特許第４，５７４．１１６号）。産生
されるｈＭＡｂｓにはＭＳ２Ｂ６　　ｈＭＡｂが存在し
た。この刊行物は子宮内膜症組織とのいずれの結合も報
告していない。
発明の要約 子宮内膜症の患者における存在を決定するための本発明
の方法は、患者からの試料を抗−（子宮内膜症）抗体と
接触させ、そしてこの抗体の試料成分との結合を決定す
ることを含んでなる。試料は液体試料、特に血清試料又
は組織試料、例えば細胞のスミア（ｓｍｅａｒ）又は生
検体であってよい。
抗−（子宮内膜症）抗体はポリクローナル又はモノクロ
ーナルであってよい。好適なモノクローナル抗体は人間
のＭＳ２Ｂ６　１ｇＭ抗−（子宮内膜症）抗体（ＡＴＣ
ＣＨＢ９７６５が産生）である。
子宮内膜症の存在を検知するための他の方法は、患者に
おいて抗−（子宮内膜症）抗体を検知し、そして患者か
らの血清又は血漿試料を子宮内膜症抗原又は子宮内膜症
抗イデイオタイプ抗体と接触させ、そして子宮内膜症抗
原又は子宮内膜症抗イデイオタイプ抗体の、試料中の抗
体との結合を決定することを含んでなる。好適な子宮内
膜の抗原はＥＡ１０１Ａ、ＥＡ１０１Ｂ、及びＥＡ１０
１Ｃ抗原を含む。
生物格子（ｂｉｏｇｒａｔｉｎｇ）分析においては、試
料を、活性な子宮内膜症抗原の生物格子（本質的に光を
妨害しない回折格子図）をもつ支持体と接触させる。次
いで試料中の抗体の結合によって生皮する回折格子によ
って回折された光を決定する。
本発明の方法で使用するための免疫分析試薬及びこの試
薬を含むキットは特許請求される。免疫分析試薬は標識
されたＥＡ１０１Ａ、ＥＡ１０１Ｂ及びＥＡ１０１Ｃ抗
原を含む。それらはＥＡＩｏｌＡ、ＥＡ１０１Ｂ及びＥ
Ａ１０１Ｇ抗原、又は抗原の１つ又はそれ以上の混合物
が付着した不溶性担体を含む。キットは標識された抗−
（子宮内膜症）抗体、標識された又は不溶性の担持され
た子宮内膜症抗原例えばＥＡ１０１Ａ、ＥＡ１０１Ｂ、
ＥＡ１０１Ｃ抗原、子宮内膜症抗原の混合物、及び／又
は子宮内膜症抗イデイオタイプ抗体を含む。標識は蛍光
物質例えば蛍光体又は蛍光源、生物発光物質、化学発光
物質、放射線活性物質、酵素、発色物質、顔料、スピン
ラベル、及び含金属物質を含む。標識の決定は用いる特
別な標識に適した手段によって行なわれる。
発明の詳細 「抗−（子宮内膜症）抗体」は、子宮内膜症マーカーに
関する且つ子宮内膜症の診断に使用しうる抗体である。
「抗−（子宮内膜症）抗体」は、子宮内膜症抗原と優先
的に結合する且つ正常な子宮内膜組織と実質的に交叉反
応しないいずれかの種に由来するモノクローナル及びポ
リクローナル抗体を含むと定義される。
本明細書に用いる如き「抗体」とは、ＩｇＧ。
ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥの抗体、そして抗体
のＦａｂ及びＦ　（ａｂ’）！　７ラグメントを含む抗
体のフラグメント、半抗体、及び雑種誘導体を含む。
抗体はポリクローナル又はモノクローナルであってよい
。一般にモノクローナル抗体は本発明の方法で用いるの
に好適である。
「子宮内膜症抗原」とは、本明細書において子宮内膜症
エピトープ、或いは子宮内膜症に特徴的であるが正常な
（即ち子宮内膜症でない）子宮内膜組織に特徴的でない
エピトープを含む組織フラグメントであると定義される
。１つの例は優先的にＭＳ２Ｂ６　　ｈＭＡｂと結合す
るエピトープ又は蛋白質である。この定義には、異種の
組織フラグメント；精製された同種の蛋白質フラグメン
ト組成物；細胞系統からのＭＳ２Ｂ６結合蛋白質又はペ
プチド：及びエピトープの結合性にとって必須でない組
織酸分を含まない単離されたエピドーグが包含される。
「子宮内膜症マーカー」とは、抗−（子宮内膜症）抗体
と結合する子宮内膜症抗原中に存在するエピトープ又は
エピトープ数であると定義される。
「子宮内膜症抗イデイオタイプ抗体」とは、本明細書の
場合、抗−（子宮内膜症）抗体の結合部位と特異的に結
合し且つ抗−（子宮内膜症）抗体と結合する子宮内膜症
抗原と競合する抗イデイオタイプ抗体であると定義され
る。
本明細書に用いる如き「免疫分析」とは、子宮内膜症抗
体の、その子宮内膜症抗原結合パートナ−との、子宮内
膜症抗イデイオタイプ抗体の、その子宮内膜症抗体結合
パートナ−との、或いは子宮内膜症抗原のその子宮内膜
症抗体との優先的な結合性を用いる方法を意味するもの
と定義される。
本発明の範囲には、限定するものではないが、例えばサ
ンドウィッチ、競合、凝血、沈澱、トランジスタ・ブリ
ッジ・プローブ、顆粒分別、光妨害、光散乱、又は超音
波プローブ免疫分析を含む上述の工程を含んだすべての
免疫分析法が包含される。
適当な免疫分析は、標識として放射性同位体、酵素、或
いは蛍光源、発色団、又は化学発光物質を使用すること
ができる。
本明細書に用いる如き「生物格子（ｂｉｏｇｒａｔｉｎ
ｇ）Ｊとは、被覆を有し且つ実質的に均一な光散乱性を
有する実質的に平らな表面であると定義される。
この被覆は活性な及び不活性な結合剤の交互の領域から
なる回折格子模様を含んでなる。この領域は、活性な結
合剤が結合対のその反対のパートナ−と結合した時に回
折格子を形成する。そのような結合がなければ、有意な
光回折は起こらず、即ち回折角で検知される光エネルギ
ーはＯに近い最小値となる。結合が起こると、回折格子
模様における結合した物質の蓄積が光妨害の格子を形成
し、そして光散乱角で検知される光が試料中の結合パー
トナ−（被検体）の存在及び量に関連した大きい値にま
で増大する。
本明細書に用いる如き「光妨害」とは、光の吸収、反射
、散乱、屈折及び相変化を含む光が影響されるすべての
過程を含むと定義される。
本明細書に用いる如き「回折格子」とは、１つの又はそ
れ以上の免疫学的過程で形成される格子を含むものと定
義される。本発明の方法の場合、回折格子は不溶性の表
面上で光妨害格子を生成する被検体と、光を妨害しない
結合試剤を抱合させることによって形成される。本発明
の方法で生成する格子の種類は反射増巾格子、透過増巾
格子、反射粗格子、及び透過粗格子を含む。反射増巾格
子の場合、光は格子から反射され、そして反射光の増巾
は格子の空間的に可変の反射によって調節される。透過
増巾格子の場合、光は格子を通過し、そして透過光の増
巾は格子の空間的に可変の透過によって調整される。反
射粗格子の場合、光は格子から反射され、反射光の相は
格子の空間的に可変な屈折率によって調整される。透過
粗格子の場合、光は格子を透過し、透過光の相は格子の
空間的に可変な屈折率によって調整される。本発明の方
法において、回折格子はこれらの種類の格子の１つまた
はそれ以上として同時に機能させてもよく、またこれら
の格子種のすべては本発明の方法で作られる回折格子内
に包含される。
本発明の診断法は、子宮内膜症抗原又は抗−（子宮内膜
症）抗体を、適当に標識された試剤と結合させることを
含む。抗体はＡＴＣＣＨＢ９７６５ハイブリドーマから
得ることができ、或いはそれは子宮内膜症抗原から製造
することができる。
子宮内膜症抗原は、中性洗剤で抽出した子宮内膜症組織
の抽出物の、例えば通常の親和性カラム材料に結合した
ＭＳ２Ｂ６　　ｈＭＡｂを用いる親和性クロマトグラフ
ィーによって単離することができる。組織抽出物のカラ
ムでの処理及び子宮内膜症抗原のカラムからの流出は通
常の方法で行なうことができる。蛋白質を抽出及び精製
するための特別な方法は、それぞれ本明細書に参考文献
として引用される。Ｈ，デービス（Ｄ　ａｖｉｓ）ら、
キャンク・レス（Ｃａｎｅ、　Ｒｅｓ、）　４４．６１
４３〜６１４８　（１９８６）；Ｖ、ジョンソン（Ｊ　
ｏｈｎｓｏｎ）ら、キャンク・レス、主１．８５０〜８
５７　（１９８６）；及びＥ、フリートマン（Ｆ　ｒｉ
ｅｄｍａｎ）ら、キャンク・レス、主１．５１８９〜２
１９４（１９８６）に記述されている。
子宮内膜抗原は、組織培養媒体例えば上皮ガンｍｍ胞系
統例えば子宮内膜ガン腫（ＡＴＣＣ−ＨＴＢｌｌｌ）、
胸部ガン腫ＢＴ２０　（ＡＴＣＣ−ＨＴＢＩ　９）；Ｍ
ＣＦ−７（ＡＴＣＣ−ＨＴＢ２２）、卵巣ガン１１２７
７４号及びＣａ０Ｖ、（ＡＴＣＣ−ＨＴＢ７５）の培養
物から得ることができる。
それらは子宮内膜症を有する患者の血清から、例えば組
織培養物の処置に関して上述したような通常の親和性カ
ラム材料に結合したＭＳ２Ｂ６ｈＭＡｂを用いて単離し
てもよい。
ポリクローナル抗体はポリクローナル抗体の産生に対し
て使用されるいずれかの哺乳動物を用い、常法で製造す
ることができる。一般にウサギ、モルモット又はヤギが
適当である。抗体を産生ずるには、予じめ決められた量
の子宮内膜症抗原を生理学的食塩水溶液で適当な濃度に
希釈する。この希釈した溶液を、完全７０インド補助剤
と混合することによって更に希釈し、乳化液を製造する
。
次いでこの乳化液を哺乳動物に投与する。例えば、懸濁
液は腹腔内、筋肉内又は皮下経由により、０゜０５ｍｇ
／体重ｋｇから、投与毎に抗１［５ｍｇ程度の高量であ
ってよい最大の、致死に至らない投与量までの量でウサ
ギに投与することができ、そして投与は２〜ｌＯケ月の
間、隔週ごとに継続される。
抗体の力価が十分高くなった時、一般に最後の懸濁液の
投与から１〜２週間後に血液を哺乳動物から採取する。
この動物から採取した血液を遠心分離によって処理して
、抗体を含む血清を分離する。
ポリクローナル抗体は、単離されたエピトープ又はこの
エピトープを含むポリペプチド・シーケンスの、エピト
ープを変性しない常法による抗原蛋白質との共有結合に
よっても製造しうる。適当な結合法は、例えば本明細書
に参考文献として引用される米国特許第３．６５４．０
９０号、第４゜２１４．０４８号、第４．２８９．７４
７号、第４゜３０２．４３８号、第４．３１２．９４３
号、第４゜３７６．１１０号、及び第ＲＥ−３１．００
６号に記述されている。
次いでポリクローナル抗体の血清を、本明細書に参考文
献として引用されるミシエル（Ｍ　１ｓｈｅｌ　１）及
びシルギ（Ｓ　ｈｔｌｇｉ）　、細胞免疫学における選
別法、フリーマン（Ｆ　ｒｅｅｍａｎｓ　Ｓ　ａｎ　　
Ｆ　ｒａｎｃｉｓｃｏ）（１９８０）に記述されている
ような通常の親和性クロマトグラフィー技術で精製する
。親和性クロマトグラフィーに用いるのに適当な吸収剤
は、ＭＳ２Ｂ６　１ｇＭ抗体が共有結合している架橋ア
ガローズ及び架橋ポリアクリルアミドを含む。
これらの方法において、抗体溶液は燐蒙塩緩衝食塩水溶
液でカラムに適用され、そして抗体は２゜５Ｍ　　Ｎａ
５ＣＮ溶液（ｐＨ８，０）で流出させることができる。
抗体の濃縮は、所望により負圧透析又は限外濾過によっ
て達成することができる。
この抗体溶液は４℃又はそれ以下の湿度で安定である。
本発明の人間以外のモノクローナル抗体は、子宮内膜症
抗原又は抗原蛋白質と結合させたエピトープから製造し
、上述の如く精製し、そして常法により、一般にケーラ
ー（Ｋｏｈｌｅｒ）及びミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ）　、ネーチャー（Ｎ　ａｔｕｒｅ）、２５６．４９
５〜４９７　（１９７５）の方法に従って製造すること
ができる。極く最近の進歩はＪ。
ゴデイング（Ｇｏｄｉｎｇ）　、モノクローナル抗体：
理論と実際、アカデミツク・プレス（Ａ　ｃａｄｅ■ｉ
ｃＰ　ｒｅｓｓ、　Ｎ　ｅｗ　　Ｙ　ｏｒｋ）、５６〜
９７頁（１９８３）にまとめられている。一般にハイブ
リドーマ又はマウス又はラットを抗原で免疫化すること
によって準備される。雌のＡ／Ｊマウス【Ｈ−２８ハブ
ロタイブ、ジャクンン研究所（Ｊ　ａｃｋｓｏｎＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂａｒ　　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｍ
Ｅ）　］は好適であるけれど、他のマウス又はラット種
も使用しうる。免疫化のスケジュール及び抗原の懸濁液
中での濃縮は、有用な量の適当に準備された牌細胞及び
／又はリンパ球を産生ずる場合のようであるべきである
。懸濁された牌臓細胞は、適当な融合促進剤を用いるこ
とにより、適当な細胞系統からのマウス又はラットの骨
歯腫細胞と融合される。
これは例えばセンダイ・ウィルス、ポリエチレングリコ
ール又は電場であってよい。多くのマウスの骨髄腫細胞
系統は公知であり、一般に公共委員会の会員及び種々の
預託銀行例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（Ａ　ｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ
。
Ｍｄ、）から入手しうる。バルブ（Ｂａｌｂ）／ｃ骨髄
腫細胞系統は好適である。用いる骨髄腫細胞系統は、好
ましくは融合してない骨髄腫細胞が選択した媒体中で生
存せず、一般に雑種が生存するように媒体に敏感である
べきである。最も通常の種類は、酵素ヒポキサンチン・
グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼを欠き
、斯くしてＨＡＴ（ヒボキサンチン、アミノプテリン、
及びチミジン）培地によって支持されない８−アザグア
ニン耐性細胞系統である。用いる骨髄腫細胞系統は所謂
「非分泌」型のもの、即ちいずれの抗体も産生しないも
のであることも一般に好適であるが、分泌型のものも使
用しうる。好適な融合促進剤は平均分子量的１０００〜
４０００のポリエチレングリコール（商業的にはＰＥＧ
１００Ｏなどとして入手しうる）であるけれど、技術的
に公知の他の融合促進剤も使用しうる。
次いでハイブリドーマを含む各容器（ウェル）の上澄液
を、子宮内膜症と選択的に結合する抗体の存在に関して
検査する。選別に適当な方法はＪ。
ゴデイング（上掲、７２〜８４頁）に記述されている。
１つの適当な方法は不溶性支持体例えばミクロ価板ウェ
ルに結合した抗マウス免疫グロブリン及び標識された抗
原と培養上澄液の混合物間の競合を含み、不溶性支持体
に結合した標識の量を読んで、上澄液の、培養上澄液中
の抗体との結合を決定する。他の適当な方法は、選択さ
れた複基準が付着したニトロセルロース紙の層に培養上
澄液を点で適用し、この紙をゆすぎ、次いで紙を、紙に
結合したいずれかの抗体のＦｃ部分に結合する発色原標
識の抗体又は蛍光標識の抗体と接触させ、統いて紙をゆ
すいで結合してない標識された抗体を除去し、そして紙
を検査して結合してない発色原又は蛍光原が点を適用し
た場所で明確であるかどうかを決定する。自動ウェル読
み取り機を用いれば、不溶性の表面に付着した蛋白質に
結合する抗体を産生ずるハイブリドーマを含むウェルを
迅速に固定することができる。
所望のハイブリドーマを選別し且つクローンした後、得
られる抗体は適当な培地での試験管内培養、続く抗体の
上澄液からの回収によって製造することができる。他に
ハイブリドーマをマウスに、好ましくはシンゲネイック
（５ｙｎｇｅｎｅｉｃ）又は半シンゲネイックなマウス
に注射してもよい。ハイブリドーマは適当な培養時間後
に、抗体産生腫瘍を形成せしめるであろう。これらは所
望の抗体を、宿主マウスの血液及び抹消滲出液（腹水）
中に高濃度（約５〜２０　ｍｇ／　ｍ＜２）で産生ずる
であろう。
宿主マウスはその血液及び腹水中に正常な抗体も有する
けれど、正常な抗体の濃度は所望のモノクローナル抗体
の濃度の約５％にすぎない。
人間のモノクローナル抗体は本方法に使用することがで
きる。人間−人間のハイブリドーマＭＳ２Ｂ６は本明細
書に参考文献として引用されるり。
Ｈ，スミス（Ｓ　ｍ１ｔｈ）ら、Ｊ、イミュノル、メト
（Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　　Ｍｅｔｈ、）　　ｌ　　０５
．２６３〜２７３　　（１９８７）の方法に従って製造
した。ＭＳ２Ｂ６１ｇＭ抗体はこのハイブリドーマによ
り血清を含まない培地から産生され、モしてＪ、コデイ
ング（上掲、９８〜１１ｇ頁）に記述されているような
常法で精製される。人間−人間モノクローナル抗体の他
の製造法は、本明細書に参考文献として引用されるＲ、
コート（Ｃｏｔｅ）ら、ブロク、ナトル、アカド、サイ
、　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
）　、Ｕ、Ｓ、Ａ、８３，２９５９〜２９６３（１９８
６）；Ｍ、グラッシ−（Ｇ　１ｅｓｓｙ）　、キヤノン
・レス、４７．５１８１〜５１８８（１９８７）；ポラ
プークリステンセン（Ｂ　ｏｒｕｐ　−Ｃｈｒｉｓｔｅ
ｎｓｅｎ）ら、インド、Ｊ、キヤノン（Ｉｎｔ、Ｉ。
Ｃａｎｃ、）　３７．６８３〜６８８　（１９８６）；
及びＭ、ハスペル（Ｈａｓｐｅｌ）ら、キャンク、レス
。
４５．３９５１〜３９６１　　（１９８５）に示されて
いる。
抗イデイオタイプ抗体はＰ、チェ７（Ｃｈｅｎ）ら、Ｊ
、イクスブ、メト（Ｊ　、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、）　１
６２．４８７〜５００　（１９８５）に、並びにＰＣＴ
特許願第８５０２９０９号及びヨーロッパ特許願第１４
１７８３号に記述されているように子宮内膜症抗原から
製造することができる。子宮内膜症抗原に対するモノク
ローナル抗イデイオタイプ抗体は米国特許第４，５１３
，０８８号に記述されている方法によっても製造するこ
とができる。
ポリクローナル抗イデイオタイプ抗体は、例えば子宮内
膜症抗原で免疫化することによって得られる動物の血清
を、ＭＳ２Ｂ６　　ｈＭＡｂ抗体が技術的に良く知られ
た常法で共有結合されたカラム中を通過させることによ
って得ることができる。
ゆすいで残存する血清を除去した後、カラムを適当な緩
衝液例えば酢酸ナトリウム緩衝液で流出させて分離され
た抗イデイオタイプ抗体を除去し、そして流出液を透析
によって精製して小さい分子を常法により除去するとよ
い。
モノクローナルのイディオタイプ抗体は、精製した子宮
内膜症抗原で、又は抗−（子宮内膜症）抗体例えばＭＳ
２Ｂ６　　ｈＭＡｂ抗体で免疫化したマウスの雑種肺臓
細胞からクローンを選別し、且つＭＳ２Ｂ６　　ｈＭＡ
ｂ結合部位と結合する抗体を産生ずるクローンに対する
ウェルを選別することによって得ることができる。ミク
ロウェルに結合したＭＳ２Ｂ６　　ｈＭＡｂを、抗体−
抗原の結合を起こさせるのに十分な時間ハイプリドーマ
上澄液と共に培養し、この上澄液をウェルから除去し、
そしてウェルをゆすぐ。次いでこのウェルを、酵素で標
識したヤギ又はウサギの抗−１ｇ又は抗−ＩｇＭ抗体と
、抗体−抗原の結合を起こさせるのに十分な時間培養し
、そして残渣をゆすぎによってウェルから除去する。次
いで酵素の存在下に発色団又は蛍光体を生成する物質を
添加し、そして発色団又は蛍光体の存在をクローンの選
別の基準として使用する。対照ウェルも無関係のＩｇＭ
で試験しなければならない。ＭＳ２Ｂ６　　ｈＭＡｂに
対して活性を有し且つ無関係な人間のＭＡｂに対して活
性を有さない抗体だけが抗イデイオタイプの候補である
。好ましくはそれら子宮内膜症抗原のＭＳ２Ｂ６への結
合を禁止するか、又はそれと競合するように選択すべき
である。
本発明の抗体は診断法に対して有用である１つ又はそれ
以上の独特な性質を有する種々の残渣と結合することが
できる。この独特な性質は直接又は間接的に像を形成さ
せるために使用しうるいずれの検知可能な標識であって
もよい。抗体は放射性標識でき、或いは酵素、蛍光物質
例えば燐又は蛍光原、生物発光物質、化学発光物質、発
色団、顔料、スピン・ラベル、及び含金属物質で標識す
ることもできる。
本発明の放射性標識した抗体は試験管内での診断試験に
使用することができる。標識した抗体の比活性は半減期
、放射性標識の同位体純度、及び標識の抗体への導入法
に依存する。第Ａ表はいくつかの通常使用される同位体
、その比活性、及び半減期を表示する。一般に免疫分析
試験の場合、比活性が高ければ高いほど、感度は良好で
ある。
第　　Ａ　　表 目ｃ　　　　　　　６．２５ｘ　１０’　　　　　　　
５７２０％３Ｈ２，９１Ｘ　１０’　　　　　　　１２
．５午”Ｓ　　　　　　　　１．５０Ｘ　１０’　　　
　　　　　　８７Ｅ１’２”　Ｉ　　　　　　　　２．
１８Ｘ　１０″６０Ｅｉ３２Ｐ　　　　　　　　３．１
６Ｘ　１０’　　　　　　　　１４．３Ｅ１１３’　Ｉ
　　　　　　　　１．６２Ｘ　１０’　　　　　　　　
８．１日抗体を第Ａ表に示す放射性同位体で標識する方
法は一般に技術的に公知である。トリチウムでの標識法
は例えば米国特許第４．３０２．４３８号に記述されて
いる。ヨー素化、トリチウム標識、及び３６５標識法、
特にネズミのモノクローナル抗体に対して採用されるも
のは、Ｊ、ゴディング（上掲、１２４〜１２６頁）及び
これに示された引用されている文献に記述されている。
他の抗体のヨー素化法は、ハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）及
びグリーンウッド（Ｇ　ｒｅｅｎｗｏｏｄ）　、ネーチ
ャー、１４４．９４５　（１９６２）；デーピッド（Ｄ
　ａｖｉｄ）ら、バイオケム（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、）上
３，１０１４−１０２１　（１９７４）；及び米国特許
第３．８６７．５１７号及び第４．３７６．１１０号に
記述されている。
診断に特に有用である放射性標識元′素は例えば１２Ｊ
１目１、ｌ１ｌｌｎ１及び１′″Ｔｃを含む。抗体のヨ
ー素化法は、Ｆ、グリーンウッドら、バイオケム、Ｊ、
８９．１１４〜１２３　（１９６３）；Ｊ、？−チャロ
ニス（Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ）　、バイオケム、Ｊ、
１１３．２９９〜３０５　（１９６９）；及びＭ、モリ
ソン（Ｍｏｒｉｓｏｎ）ら、イミエノケム（Ｉ　ｍｍｕ
ｎｏｃｈｅｍ、）　ｆ３．２８９〜２９７　（１９７１
）に記述されている。１“Ｔｃの標識法は、Ｓ、パーチ
ール（Ｂ　ｕｒｃｈｉｅｌ）ら編、「腫瘍顕像化」のＢ
。
ローデス（Ｒｈｏｄｅｓ）ら「ガンの放射線免疫化学的
検知法」、メイソン（Ｍ　ａｓｓｏｎ、　Ｎ　ｅｗ　　
Ｙ　ｏｒｋ）、１１１−１２３　（１９８２）　、及び
これに引用されている文献に記述されている。抗体をＩ
ｌｌ　Ｉ　ｎで標識するのに適当な方法は、Ｄ、ナトウ
ィッチ（Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ）ら、Ｊ、イミュイル、メ
ト、６５、ｌ４７〜１５７　（１９８５）、サイエンス
（ＳｃｉｅｎＣｅ’）　２２０．６１３〜６１５　（１
９８３）、及びＪ、アブ、ラド（Ｊ　、　Ａｐｐ、　Ｒ
ａｄ、）　３５．５５４〜５５７　（１９８４）に及び
Ｒ，Ｇ、バラフリ−（Ｂ　ｕｃｋｌｅｙ）ら、Ｆ、Ｅ、
Ｂ、Ｓ、１６６．２０２〜２０４　（１９８４）に記述
されている。
酵素で標識した抗体は、試験管内診断試験に対して有用
である。適当な系、連続法及びそれを用いる基質反応の
例は、米国特許第３．６５４．０９０号、同第４．１２
４．０４８号、第４．２８９．７４７号、第４．３０２
，４３８号、第４．３１２．９４３号、第４．３７６．
１１（１、及び＃ＲＥ−３１，００６号、及びこれらに
引用されている参考文献に開示されている。他の適当な
系の例はベッセ（Ｐ　ｅｓｃｅ）　’ら、タリン、ダム
（ＣＩ　ｉｎ、　Ｃｈｅｍ、）１１．３５３〜３５９（
１９７４）及びＧ、ウィズダム（Ｗｉｓｄｏｍ）　、ク
リン、ダム　２２，１２４３（１９７６）に記述されて
いる。
好適な酵素の種類及び各種類に対する特別な例を第８表
に示す。
種類 ヒドロラーゼ ヌクレアーゼ アミダーゼ プリンデアミナーゼ ペプチダーゼ プロテイナーゼ エステラーゼ 鉄酵素 銅酵素 補酵素含有酵素 チトクローム還元酵素 イエロー酵素 ムターゼ デスモラーゼ オキシダーゼ ホスファターゼ 第 Ｂ表 □ アミラーゼ ポリヌクレオチダーゼ アルギナーゼ アデナーゼ アミノポリペブチダーゼ ペプシン リパーゼ カラターゼ チロシナーゼ アルコールデヒドロゲナーゼ コハク酸デヒドロゲナーゼ ジアホラーゼ グリオキサラーゼ アルドラーゼ グルコースオキシダーゼ 西洋ワサビのペルオキシダーゼ アルカリホスファターゼ 酸ホスファターゼ デヒドロゲナーゼ　　　　Ｇ６ＰＤＨ（グルコース　６
−ホスホデヒドロゲナーゼ） β−ガラクトシダーゼ ホスホリラーゼ ヘキソキナーゼ 適当な酵素の表示は、ホーク（Ｈａｗｋ）ら、実用生理
化学、マツフグロラーヒル（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、
　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ）　、３０６〜３９７買（１９５
４）に示されている。
蛍光原及び発色団酵素（選択した物質から蛍光又は発色
生成物を生成せしめる酵素）は有用な標識残基である。
抗体の抗原との結合能力を損なわすＩこ酵素を抗体に選
択的に抱合させるための方法及び酵素を蛋白質試剤に抱
合させる方法は記述的に良く知られている。適当な酵素
及びこれらを抗体に連続させる方法は、例えば本明細書
に参考文献として引用される１、チバタ（Ｃｈｉｂａｔ
ａ）　、固定化酵素、ハルステッド・プレス（Ｈａｌｓ
ｔｅｄ　　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ）　　（
１９７８）　；　Ａ−クアトレカサス（Ｃｕａｔｒｅｃ
ａｓａｓ）、Ｊ、バイオ、ダム（Ｊ、　　Ｂ　ｉｏ、　
　ＣｈｅＩＩｌ、）　　２４５．３０５９（１９７０）
；Ｍ、ウィルソン（Ｗ　ｉ　１ｓｏｎ）ら、免疫蛍光及
び関連染色技術の国際会議、Ｗ、ナツプ（Ｋ　ｕａｐｐ
）ら編、エルセピア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　Ａｍｓｔｅ
ｒｄａｍ）　、２１５〜２４４頁（１９７８）；Ｍ、サ
リバン（Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ら、アン、タリン、バイオ
ダム（Ａｎｎ。
Ｃｆｉｎ、　　Ｂ　１ｏｃｈｅ＋ａ、）主１．２２１〜
２４０（１９７９）；Ｈ，ニグリン（Ｎ　ｇｇｒｅｎ）
ら、メト・ビオル（Ｍｅｄ、　Ｂ　ｉｏｌ、）　５７．
１８７〜１９１　（１９７９）；Ｄ、ガドカリ（Ｇ６ｄ
ｋａｒ　ｉ　）ら、Ｊ、ピロル、メト（Ｊ　、　Ｖ　ｉ
ｒｏ　１　、　Ｍｅｔｈ、）上１．２１５〜２２４　（
１９８５）；Ｐ、チジュセン（Ｔｉｊｉｓｓｅｎ）ら、
アナル・バイオダム（Ａｎａｌ、　ＢｉｏｃｈＳａｔ、
）１３６．４５１−４５７　（１９８４）ｉＪ。
ツルタら、Ｊ、ヒストダム、シトケム（Ｈｉｓｔｏｃｈ
ｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、）　３３．７６７〜７７７
（１９８５）；Ｅ、イシカワ、Ｊ、イミュノアッセイ（
■ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）　４．２０９〜３２７　（１
９８３）；及び米国特許第４．１９０．４９６号に記述
されている。
好適な酵素及びこれに対する適当な物質は、西洋ワサビ
のペルオキシダーゼと０−７二二レンジアミン、ｍ−フ
ェニレンジアミン、０−ジアニシジン、及び４−クロル
−０−す７トール；β−ガラクトシダーゼと例えば４−
メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド、ｐ−
ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトース、ｐ−ニトロフ
ェノール、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトース
、及ヒ。−二トロフェノール；アルカリホスファターゼ
と例、ｔｌｆｐ−ニトロフェニルホスフェート、インド
キシルホスフェート、及び５−ブロム−３−クロルイン
ドキシルホスフェートを含む。
抗体を酵素標識するための適当な方法の例は、カルボジ
イミド、ジアルデヒド、及びグルタルアルデヒド２官能
性連続試剤の使用を含む。アミン基を介しての酵素の結
合は、蛋白質を無水の溶媒例えばジメチルホルムアミド
、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフ
ランなど中において塩化チオニル、Ｎ−ヒドロキシサク
シンイミド又は同ようの試剤で処理することによって達
成することができる。他の連結剤は例えばカルボジイミ
ド例えばｌ−エチル−３−（３−（Ｎ、Ｎ’ジメチルア
ミノ）プロピル）−力ルポジイミド、ｌ−シクロへキシ
ル−３−（２−モル７オリノニチル）カルボジイミドメ
チル−ｐ−トルエンスルホネート、サクシニミジル４−
（Ｎ−マレイミドエチル）−シクロヘキサン−１−カル
ボキシレート及びサクシニミジル３−（２−ピリジルジ
チオ）−プロピオネートを含む。
酵素の炭水化物残基をアルデヒドに酸化し、そして免疫
グロブリンのリシルアミノ基と反応させてシップ塩基を
生皮せしめてもよい。続く水素化ホウ素ナトリウムでの
還元は酵素と抗体の安定な結合を保証する。西洋ワサビ
のペルオキシダーゼは、Ｍ、ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ
）ら、免疫蛍光及び関連染色技術の国際会ＩＩＩ（上掲
）、２１５〜２４４頁（１９７８）の方法により免疫グ
ロブリンに効果的に連結することができる。
蛍光体及び発色団で標識された抗体は技術的に公知の標
準的な残基から製造しうる。抗体及び他の蛋白質は約３
１０ｎｍまでの波長の光を吸収するから、蛍光残基は３
１０ｎｍ以上、好ましくは約４００ｎｍ以上の波長で実
質的に吸収するように選択すべきである。種々の適当な
蛍光体及び発色団はストリア（Ｓ　ｔｒｙｅｒ）　、サ
イエンス　１６２．５２６　（１９６８）及びり、ブラ
ンド（Ｂ　ｒａｎｄ）ら、アン、レブ、バイオダム（Ａ
　ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、）４１．８４
３〜８６８　（１９７２）に記述されている。抗体は例
えば米国特許第３．９４０．４７５号、第４．２８９，
７４７号及び第４．３７６．１１０号に開示されるもの
のような常法によって蛍光発色基で標識することができ
る。
上述した望しい性質を多く有する蛍光体の１つの群は、
３．６−シヒドロキシー９−フェニルキサントヒトロー
ルに由来するフルオレラセン並びに３．６−ジアミツー
９−フェニルキサントヒトロール及びリッサニム（Ｌ　
ｉｓｓａｎｉｍｅ）ローダミンＢに由来するレサミン（
ｒｅｓａｍｉｎｅ）及びローダミンを含むキサンチン染
料である。９−ｏ−カルボキシフェニルキサントヒトロ
ールのローダミン及びフルオレラセン誘導体は９−ｏ−
カルボキシフェニル基を有する。反応性連続基例えばア
ミノ及びインチオシアネート基を有するフルオレラセン
化合物例えばフルオレラセンインチオシアネート及びフ
ルオレスカミンは容易に入手できる。蛍光化合物の他の
群はアミノ基をａ又はβ位に有するす７チルアミンであ
る。抗体はＪ、ゴデイング（上掲、２０８〜２４９頁）
に記述される方法によって蛍光体又は発色団で標識する
ことができる。本明細書における方法の好適な具体例は
、標識の信号を増大させるために、アビジン標識の及び
ビオチン標識の抗体及び試剤を使用する。
標識した試剤は、免疫組織病原学的染色組織を用いるこ
とにより、組織試料中の子宮内膜症抗原の存在を決定す
るために使用しうる。組織試料は例えばラグロスコピー
（Ｉａｐｒｏｓｃｏｐｙ）又は生検体から得ることがで
きる。組織又は細胞試料を準備し、そしてり、コス（Ｋ
ｏｓｓ）、診断細胞学とその組織病理学的基礎、リッピ
ンコット（Ｌ　ｉｐｐｉｎｃｏｔ５　Ｐｈ１ｌａｄｅｌ
ｐｈｉａ）　　（１９７７）　　；　Ｌ　、ルナ（Ｌｕ
ｎａ）　、陸軍病理学研究所の組織学的染色法手引き、
第３版、マツフグロラーヒル（１９６８）；及びＭ、ボ
ロウィッッ（Ｂ　ｏｒｏｗｉｔｚ）ら、Ｊ、ヒストダム
、シトケム　１且、１７１−１７４（１９８２）に記述
されているもののような標準的な方法によってスライド
に取りつける。一般には組織を迅速に凍結し、凍結した
切片を準備し、スライドに配置する。
染色工程において、抗−（子宮内膜症）抗体を試験試料
に適用する。抗−（子宮内膜症）抗体は水溶液において
スライド上の組織切片又は細胞のスミア（ｓｍｅａｒ）
に適用することができる。この溶液は好ましくは反応物
を保存し且つ結合反応を容易にするために適当な塩と緩
衝剤を含有する。
例えば溶液は蛋白質例えば牛の血清アルブミン（ＢＳＡ
）、燐酸塩緩衝剤溶液（ＰＢＳ）、及び穏やかな表面活
性剤を含有することができる。緩衝された溶液は、０．
００５〜０．１の燐酸塩モル濃度及び６．０〜８．０の
ｐＨを有する水性燐酸塩緩衝液中に１吹拭体１”ｌ　Ｏ
Ｏｐｇ／ｍ（１，好ましくはｌＯ〜２５μｇ／ｍＱを含
有することができる。０゜０１−０．５の燐酸塩モル濃
度及び７．２〜７．６のｐＨは好適である。１吹抜体溶
液を、抗原との結合が起こりうるまで細胞のスミアと接
触させて維持する。培養時間は温度に依存する。１８〜
４０℃の温度において、３０〜１８０分の培養時間が使
用できる。室温では１〜６０分、好ましくは５〜３０分
の培養時間であってよい。
次いで過剰な１吹抜体溶液を除去し、そしてスライドを
適当なゆすぎ溶液でゆすぐ。このゆすぎ溶液は０．１−
０．５の燐酸塩モル濃度、６〜８のｐＨを有する水性燐
酸塩緩衝溶液であってよい。
１吹拭体が標識されている場合、標識は直接又は間接的
に決定される。本発明の１つの好適な方法において、ビ
オチンで標識された１吹拭−（子宮内膜症）抗体が適用
される。次いで組織をアビジン標識のビオチン複合体と
接触させる。例えば１吹拭体がビオチンで標識されてい
るならば、好適なアビジンで標識されたビオチン複合体
はモル過剰量のアビジンをビオチニル化酵素と混合する
ことによって調製される。アビジン及びビオチン複合体
の交叉結合は各結合した抗体に対して標識信号の増巾を
引き起こす。この信号の増大は分析の感度を増大させる
。市販のアビジン−ビオチン標識系はベクター研究所（
Ｖ　ｅｃｔｏｒ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂ
　ｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ　）からのベクタスティ
ン（Ｖ　ｅｃｔａｓｔａｉｎ）　／系、例えばベクタス
ティン／ＡＢＣを含む。
アビジン又はビオチンは発光物質例えば燐又は蛍光原、
生物発光物質、化学発光物質、放射性物質、酵素、発色
団、顔料、スピンラベル、又は含金属物質のようないず
れかの通常の標識で標識することができる。これらの標
識は標識上の化学基に適当な通常の方法によってアビジ
ン又はビオチンに共有結合される。放射性同位体、蛍光
体及び酵素をアビジン又はビオチンに共有結合させる方
法は、例えば各標識を抗−（子宮内膜症）抗体に結合さ
せるために上述したものと同一の方法であってよい。
スライドは、試料中の抗原−抗体結合を決定するために
用いられる特別なアビジン−ビオチン複合体標識に対し
て適当な方法によって検査する。
これらの工程は常法である。例えば放射性標識を用いる
場合には、スライドをガイガー計数管で検査してスライ
ド上の残存放射線量を決定する。他に標識が燐又は蛍光
原であるならば、それは蛍光顕微鏡で検査することがで
きる。標識が発色団又は顔料であるならば、スライドを
通常光を用いる顕微鏡で検査しうる。抗−（子宮内膜症
）抗体がかなり結合している細胞は標識され、それらが
子宮内膜組織であることを示す。
本発明の好適な具体例において、ビオチン−アビジン複
合体は酵素標識を有する。適当な酵素及び物質系は本明
細書に参考文献として引用される米国特許第４．１９０
，４９６号及び第４．２０８゜４７９号に、またホウク
（Ｈａｗｋ）ら、実用生理化学（上掲）、３０６〜３０
７頁に記述されている。
選択される系は所望の識Ｂｌｌ特性を与えるように設計
される。好適な系はオキシドリダクターゼ例えば西洋ワ
サビのペルオキシダーゼとジアミノベンジジンのような
物質を使用する。西洋ワサビのペルオキシダーゼ及びジ
アミノベンジジンは存在する周囲の着色と強く対照的な
子宮内膜症の明確な着色又は染色を提供する。子宮内膜
症と正常な細胞をはっきり区別する基準を提供する他の
酵素−物質組合せ物はいずれでも使用することができる
。
ビオチン及びアビジンは、本発明の方法及び試剤におい
て随時交換し又は相互に代替してもよい。
この場合ビオチン及びアビジン誘導体間において、対応
するモル比の調整が必要である。アビジン−ビオチン信
号の増大は、ビオチンを標識した１次抗体を用いる組織
染色を参照して詳細に説明されている。好適なアビジン
−ビオチン標識の増大系の改変は行なうことができ、ま
たアビジン−ビオチン標識の増大系は体液試料分析、試
剤を不溶性担体に結合させた分析、競合分析、及びサン
ドウィッチ分析に対して標識された２次抗体を用いる免
疫組織化学的染色に使用することができる。そのような
明白な改変は本発明の精神及び範囲内である。
別の免疫組織化学的分析法の場合、１次抗体は抗−（子
宮内膜症）抗体の人間以外の抗体であり、標識されてい
ない。１次抗体は上述の如く試料中に存在する抗原に結
合し、過剰な抗体は除去される。２次抗体をビオチンで
標識する。この２次抗体は１次抗体を選別した抗体種と
選択的に結合する。この２次抗体は適当な水溶液中にお
いて２次抗体と細胞の抗原に結合したいずれかの１次抗
体との間の結合を可能にする十分な時間組織に適用され
る。一般に２次抗体は好ましくは１次抗体が一員である
免疫グロブリン種に、例えば１次抗体のＦｃ部分に結合
するモノクローナル抗体である。
Ｉ　ｇＭ、Ｉ　ｇＧ、Ｉ　ｇＧ、、、Ｉ　ｇＧｘｂ、Ｉ
　ｇＡ。
及び他の種の１次抗体の場合、それぞれのＦｃの部分又
は１次抗体に結合する２次抗体が選択される。
ビオチンは、ビオチンを１次抗体に結合させることに関
して上述したような常法に従い、抗体に対してモル過剰
量のビオチンを用い、好ましくは抗体に対して少くとも
１００：１のモル比のビオチンを用いて２次抗体に共有
結合される。ビオチンで標識された２次抗体は、好まし
くは元の１次抗体に対するビヒクルとして上述した燐酸
塩緩衝液である水溶液中において組織断片に適用される
。
次いでこの溶液を、１次抗体ともし存在するならば２次
抗体との間の結合を起こらせるのに十分な時間、スライ
ド上の細胞と接触させ、或いはこれと一緒に培養する。
好適な培養時間及び温度は、第１段階における組織試料
又は細胞スミアの、１次抗体溶液での処理に関して上述
したものに相当する。培養に続いて、過剰な２次抗体溶
液を除去し、そしてスライドを上述したもののような適
当なゆすぎ溶液でゆすぐ。好適なアビジンで標識された
ビオチン複合体は上述したように信号を増大させるため
に使用することができる。
本発明の試剤は、サンドウィッチ及び競合免疫分析に用
いて、血液又は他の体液中における子宮内膜症抗ｇエピ
トープを有する物質を検知することができる。この物質
の体液における存在は子宮内膜症を示唆する。
本発明の競合免疫分析の具体例は、子宮内膜症抗原の、
体液例えば血漿中の存在及び量を決定するための方法で
ある。この方法においては、試料を、標識された子宮内
膜症抗原又は標識された子宮内膜症抗イデイオタイプ抗
体の既知量と混合し、そしてこの混合物を、抗＝（子宮
内膜症）抗体の付着する不溶性担体と接触させる。抗−
（子宮内膜症）抗体の量は試料被検体及び標識された子
宮内膜症抗原又は子宮内膜症抗イデイオタイプ抗体のす
べてを結合するのに不十分である。この混合物を、抗原
−抗体結合を起こさせるのに十分な期間不溶性の担体と
接触させる。次いで不溶性担体上に結合して残留する標
識を測定する。標識は不溶性担体上で直接測定すること
ができる物理的に検知しうる標識であってよい。他に標
識は続く処理時に物理的に検知しうる標識を生皮する残
基であってよい。例えば標識が酵素標識であるならば、
不溶性担体を測定しうる蛍光体又は発色団を生皮するそ
の酵素に適した物質と接触させることができる。測定さ
れる標識の量は体液中の子宮内膜症抗体の量の逆関数で
ある。
好適な免疫分析は本発明のサンドウィッチ免疫分析であ
る。この方法は体液試料、例えば血液試料中の抗−（子
宮内膜症）抗体の存在及び量を決定する。この方法にお
いては体液を、子宮内膜症抗原又は子宮内膜症抗イデイ
オタイプ抗体が付着している不溶性担体と、抗原−抗体
結合を起こさせるのに十分な時間接触させ、そして試料
を担体かも除去する。次いで不溶性担体を抗１ｇ抗体（
即ち２次抗体）と接触させて、不溶性担体に結合したい
ずれかの試料抗体と結合させる。次いで不溶性担体上の
２次抗体の存在を決定する。この２次抗体は不溶性担体
上で直接測定しうる物理的に検知できる標識を有すこと
ができる。他に２次抗体は標識がなくてもよく、この場
合２次抗体は、不溶性担体を２次抗体と選択的に結合す
る標識された抗体（即ち３次抗体）と接触させ、結合し
てない標識されＩ；３次抗体を担体から除去し、そして
不溶性担体上の標識の存在を決定することによって測定
することができる。前述したようなアビジン−ビオチン
の信号増大は標識を増巾するために使用することができ
る。
本発明の他のサンドウィッチ免疫分析は、体液例えば血
液試料中の子宮内膜症抗原又は子宮内膜症抗イデイオタ
イプ抗体を決定する。この方法においては、体液を抗−
（子宮内膜症）抗体が付着する不溶性担体と、抗原−抗
体の結合を起こさせるのに十分な時間接触させ、そして
試料を担体から除去する。次いで不溶性の担体を抗＝（
子宮内膜症）抗体（即ち２次抗体）と接触させ、不溶性
担体に結合するいずれかの試料抗原又は抗イデイオタイ
プ抗体と結合させる。次いで不溶性担体上の２次抗体の
存在を決定する。この２次抗体は、不溶性担体上で直接
測定しうる物理的に検知できる標識を有すことができる
。他に２次抗体は標識がなくてもよく、この場合２次抗
体は、不溶性担体を２次抗体と選択的に結合する標識さ
れた抗体（即ち３次抗体）と接触させ、結合してない標
識された３次抗体を担体から除去し、そして不溶性担体
上の標識の存在を決定することによって測定することが
できる。前述したようなアビジン−ビオチンの信号増大
は標識を増巾するために使用することができる。
本発明の特ｊこ有利な免疫分析は生物格子を使用する。
生物格子法、材料及び装置は本明細書ｌ二参考文献とし
て引用される米国特許率４．６４７．５４４号及び第４
．８７６．２０８号に記述されている。この方法では、
試料を子宮内膜症抗原生物格子と、子宮内膜症抗原を試
料中の子宮内膜症抗体と結合させるのに十分な時間接触
させる。試料を生物格子表面から除去した後、結合反応
によって生皮した格子によって回折された光を検知し、
測定する。
抗体及び抗原試剤は常法によって不溶性担体に結合させ
ることができる。抗体の不溶性担体への結合法は米国特
許率３．５５１．５５５号、第３゜５５３．３１０号、
第４．０４８．２９８号、及び第ＲＥ−２９．４７４号
、及びＰ、チズセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）、生化学及び分
子生物学における研究技術：酵素免疫分析における実際
と理論、エルヤビア（１９８５）に例えば記述されてい
る。吸着による抗体のポリスチレンへの結合法は例えば
米国特許率３．６４６．３４２号及び第４．０９２．４
０８号に記述されている。これらの同一の方法は蛋白質
抗原を不溶性担体に結合させるのに適当である。
種々の材料が不溶性担体として使用できるが、抗体又は
抗原の表面への結合、試剤結合反応或いは存在を決定す
るために使用しうる他の反応を妨害しないこと、及び結
合反応の程度が主に考慮される。有機及び無機重合体は
、天然及び合成の双方が不溶性担体として使用しうる。
適当な重合体の例はポリエチレン、ボリグロビレン、ポ
リブチレン、ポリ（４−メチルブチレン）、ブチルゴム
、シラスチック重合体、ポリスチレン、ポリアミド、セ
ルロース及びセルロース誘導体（例えば酢酸セルロース
、ニトロセルロースなど）、アクリレート、メタクリレ
ート、ビニル重合体（例えばポリ酢酸ビニル、ポリ塩化
ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ弗化ビニルなど）、
ポリスチレン及びスチレングラ７ト共重合体、レーヨン
、ナイロン、ポリ酪酸ビニル、ポリホルムアルデヒドな
どを含む。不溶性担体として使用しうる他の材料は上記
重合体のラテックス、シリカゲル、シリコンウェハ、ガ
ラス、紙、不溶性蛋白質、金属、メタロイド、酸化金属
、磁性材料、半導体材料、セラミックスなどである。更
にゲルを形成する物質、例えば蛋白質例えばゼラチン、
リポ多糖類、珪酸塩、アガロース、ポリアクリルアミド
又はいくつかの水性相を形成する重合体例えばデキスト
ラン、ポリアルキレングリコール（炭素数２〜３のアル
キレン）或いは表面活性剤例えば両親媒性化合物例えば
燐脂質、長鎖（炭素数１２〜２４）アルキルアンモニウ
ム塩が包含される。
好適な担体はナイロン又はニトロセルロース膜を含んで
なる。多の診断用担体はポリスチレン、スチレン共重合
体例えばスチレン−アクリロニトリル共重合体、又はポ
リオレフィン例えばポリエチレン又はポリプロピレン、
及びアクリレート及びメタクリレート重合体及び共重合
体から製造される。抗体及び抗原試剤は吸着、イオン結
合、７アン・デル・ワールス吸着、静電的結合、又は他
の非共有結合によって不溶性担体に結合させることがで
き、或いはそれを共有結合によって不溶性担体に結合さ
せうる。本方法に対して特に有利な担体は複数のウェル
をもつミクロ力価板を含んでなる。このウェル表面又は
そこへのプラスチック製カップ挿入物は抗原又は抗体担
体を構成することができる。分析で蛍光測定を用いるこ
とが必要な場合には、ミクロ力価板又はウェル挿入物は
有利には光に対して不透明にし、ウェルに適用される励
起光が周囲のウェルの内容物に達しない又は影響しない
ようにする。
非共有結合法は米国特許第４．５２８．２６７号に記述
されている。抗体及び抗原を不溶性担体に共有結合する
方法は、本明細書に参考文献として引用される１、チバ
タ、固定化酵素（上掲）及びＡ、キュアトレカサス（Ｃ
ｕａｔｒｅｃａｓａｓ）、Ｊ、ビオ・ダム（Ｊ、　Ｂｉ
ｏ、　Ｃｈｅｍ、）　２４５．３０５９　（１９７０）
に記述されている。表面は米国特許第４．２１０．４１
８号に記述した方法に従い、例えばグルタルアルデヒド
を連結剤として用いることによって蛋白質で被覆し且つ
抗体又は抗原を連結することができる。更なる方法にお
いて、ウェルは遊離のインシアネート基を有する層例え
ばポリエーテルイソシアネートで被覆でき、抗体又は抗
原の水溶液中におけるそれへの適用は必要とされる結合
を生じさせる。依然更なる方法において、抗体又は抗原
は米国特許第３．７２０，７６０号に記述されるように
シアノゲンブロマイドでヒドロキシル化材料に結合させ
てもよい。
不溶性担体は好ましくは非特異的結合を減するために「
ブロック（ｂｌｏｃｋ）Ｊされている。適当なブロック
剤の選択は不溶性担体の種類によって決定される。例え
ばポリスチレン担体の場合、適当なブロック剤は水溶性
の非免疫性動物蛋白質及びポリアミノ酸を含む。適当な
水溶性の非免疫性動物蛋白質は牛（ＢＳＡ）、人間、ウ
サギ、ヤギ、ヒツジ、及びウマの血清アルブミン；及び
他の動物の蛋白質例えば胎生の血清、オバルプミン、フ
イーブリノーゲン、トロンビン、トラスフェリン、糖蛋
白質などを含む。適当な水溶性ポリアミノ酸は１種又は
それ以上のアミノ酸例えばりシン、グルタミン酸、アラ
ニン、ヒスチジン、メチオニン、プロリンなどの重合体
を含む。
同一のブロック剤はナイロン及びニトロセルロース担体
に対して使用することもできる。しかしながら、ニトロ
セルロース又はナイロン膜担体に対する好適なブロック
剤は脱脂ミルク又はカゼインである。これらの膜担体に
対する最適なブロック剤は５重量％の脱脂乾燥ミルク及
び非イオン性表面活性剤例えばポリオキシエチレン・ソ
ルビタン誘導体及びポリオキシエチレンエーテルを含有
する水溶液である。
生物格子の製造の場合、結合試剤に対する必要とされる
高結合親和性を有するいずれか平滑な表面はこの目的に
おいて使用することができる。限定するのではなくて明
確に説明する目的で、ポリシリコン被覆を有する磨かれ
た表面の半導体ウェハについて本方法を記述する。ここ
に同一の、同等の、又は同様の方法が他の高結合性の平
滑表面を有する結合試剤で回折格子の模様を製造するた
めに適用しうろことを理解すべきである。アルミニウム
、窒化珪素、二酸化珪素、単結晶珪素、及び特にポリシ
リコン表面の好適な不溶性担体を用いる場合、結合試剤
は簡単な吸着によって適用することができる。結合試剤
の不溶性担体表面への非共有結合的付着に対する１つの
方法において、子宮内膜症抗体又は子宮内膜症抗イデイ
オタイプ抗体は、表面を緩衝化された結合試剤の溶液中
に４〜４０℃、好ましくは２０〜２６℃で０．５〜１８
時間、好ましくは１〜３時間浸すことによって担体の表
面に適用される。次いでポリシリコン表面を緩衝化され
た食塩水溶液でゆすぎ、乾燥する。
結合試剤の緩衝溶液中での濃度は、ポリシリコン表面上
に所望の試剤密度を与えるように選択される。この結合
試剤溶液はｐ）１６．０〜９．５、好ましくは７．０〜
８．５の緩衝溶液中に結合試剤を０．０１−１００１１
１！Ｊ／ｍ１２、好ましくは１０ｕｇ〜５Ｏ■／ｒＭ：
を含有することができる。
適当なゆすぎ溶液は、０．０００１−０．２０の燐酸塩
モル濃度、６〜８のｐＨを有し且つ０．ＯＯ１〜０．１
重量％の非イオン性表面活性剤及び０゜０００１〜５．
０重量％の動物の血清アルブミンを含有する米国特許第
４，５２８，２６７号に記述されている如き水性燐酸塩
緩衝液である。適当な非イオン性表面活性剤はポリオキ
シエチレンエーテル（ＢＲＩＪ）例えばラウリル、セチ
ル、オレイル、ステアリル、及びトリデシルポオキシエ
チレンエーテル；ポリオキシエチレンソルビタン（ツウ
イーン）例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウ
レート、モノパルミテート、モノステアレート、モノオ
レエート及びトリオレエート；及び他のポリオキシエチ
レンエーテル（トリトン）を含む。好適な非イオン性表
面活性剤はポリオキシエチレンソルビタン例えばポリオ
キシエチレンソルビタンモノラウレート（ツウイーン２
０）である。
マスク（ｍａｓｋ）は半導体製造において通常の写真法
で製造される。例えば所望の線密度及び線巾の複数の回
折格子を有するマスクは写真と同様のフォトレジスト法
により石英ガラス又は他のＵＶ透明板上で製造すること
ができる。マスクの暗線は最終表面上に期待する活性な
結合試剤に相当する。
マスクを結合試剤の被覆を有するポリシリコン表面上に
置き、この表面を紫外線照射し、照射にさらされた結合
試剤部分の結合能力を実質的に減じ或いは好ましくは皆
無にする。正確な格子模様を製造するために、照射は被
覆した表面上に鋭い像を形成すべきである。半陰影は最
小にすべきである。好ましくはマスクを通過する紫外線
は、通常の投影技術を用いることにより、マスクを被覆
した表面と接触させないで表面被覆に鋭い像を与えるよ
うに焦点を合わせるべきである。
照射される抗体被覆を不活性化させるのに必要とされる
紫外線照射は、波長２５４ｎｍ及び出力８〜１４ワツｌ
”／ｃｍ”の紫外線１０秒〜６０分、好ましくは１〜５
分である。他の抗体結合試剤の結合部位を不活性化する
には照射時間及び／又は出力をいくらか調整することが
必要である。
照射される子宮内膜症抗原被覆を不活性化するのに必要
とされる紫外線照射は、波長２５４ｎｍ及び出力８〜１
４　ｍＷ　／　ｃｍ”の紫外線照射で１−６０分、好ま
しくは１〜５分である。他の抗原結合試剤の結合部位を
不活性化させるのには、照射時間及び／又は出力のいく
らかの調整が必要である。
この処理は照射領域における結合試剤の結合性を減じ又
は排除し、そして活性な結合試剤を、マスクの不透明な
領域に相当する回折格子模様で残こす。結合蛋白、質を
回折格子模様で有する被覆された基質含有領域を、各チ
ップが結合分析を行なうのに十分な寸法を有する位い小
さいチップに切断する。次いでこれらのチップを適当な
診断用担体例えば浸漬棒に取りつける。
本発明による生物格子結合分析法における第１段階は、
回折結合分析表面を、子宮内膜症抗イデイオタイプ抗体
又は子宮内膜症抗原の活性領域の、試料中の子宮内膜症
抗体との抱合を可能にする十分な期間患者の血液、血漿
、又は血清試料と接触させることを含んでなる。回折結
合分析表面は実質的に光を妨害しない子宮内膜症抗体の
光を妨害する模様を表面上に有する不溶性表面である。
次いでこの表面を試料から分離する。表面を好ましくは
例えば蒸留水又は脱イオン水でゆすぎ、そして過剰の水
を除去する。
次いで不溶性表面を光源からの光で照らし、そして不溶
性表面による光の回折を測定する。存在する子宮内膜症
抗体の濃度は測定した回折強度と関連する。
光回折の強度は、第Ａ表に示す範囲内の入射角αを与え
るように調節された上述した如き適当な光回折装置を用
いて測定される。回折された光の相対強度は格子をなす
１次結合試剤−被検体の抱合体の量の関数である。被検
体をある範囲の異なる既知濃度で含有する一連の調製し
た溶液を用いて上述の方法を繰返すことにより、回折さ
れた光の強度と関数的に関連した標準曲線を得る。次い
で被検体を含む試料で得られた読みを、既知濃度の被検
体を含む溶液で得られた曲線と比較することにより、試
料中の被検体の濃度を決定することができる。１次、２
次、３次などの回折強度を互いに及び反射光の強度と比
較すれば、格子結合試剤との抱合の程度が直接示される
。
本発明の試剤は、子宮内膜症抗原及びその標識された誘
導体、ミクロウェル、膜を含むそれに付着した子宮内膜
症抗原又は抗イデイオタイプ抗体を有する不溶性担体、
及び子宮内膜症抗原、子宮内膜症抗イデイオタイプ抗体
の活性及び不活性領域を含む。
本発明の試験キットは各試験において一緒に使用される
試剤の組合せ物である。本キットはこれに限定されるも
のでないが次の組合せ物を含む：ａ）不溶性担体に付着
した子宮内膜症抗原又は子宮内膜症抗イデイオタイプ抗
体及び標識された２吹拭体： ｂ）不溶性担体に付着した子宮内膜症抗体及び標識され
た子宮内膜症抗原又は子宮内膜症抗イディオタイプ抗体
： Ｃ）不溶性担体に付着した子宮内膜症抗体及び標識され
た子宮内膜症抗体；及び ｄ）子宮内膜症抗原又は子宮内膜症抗イデイオタイプ抗
体生物及び参照生物格子。
次の実施例は本発明を更に例示するが、これを限定する
ものではない。断らない限り温度はセラ氏であり、パー
セントは重量％とする。以前に行なわれた方法は過去形
で表示し、本明細書の実施に積極的に帰結される方法は
現在形で表示される。
実施例１ Ｍ５２Ｂ６　　ＩｇＭ抗体 人間ツバイブリド−７ＭＳ２Ｂ６　（ＡＴＣＣＨＢ　９
７６５）は血清を含まない培地１１％ヌトリドーマ（Ｎ
ｕｔｒｉｄｏｍａ）−Ｎ　Ｓを含むイスコベス（Ｉｓｃ
ｏｖｅｓ）　、ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）
　−？ンハイム（Ｍａｎｈｅｉｍ）］　で生長せしめら
れ、モしてＩｇＭを３２１７／１０’細胞／日の速度で
生皮する。約６０趨／ｍｆ２　１ｇＭを含む上澄液を、
３００．０００ダルトンの分子量排除を有する膜［アミ
コン（Ａｍｉｃ。
ｎ）］　を用いる限外濾過により１００倍に濃縮した。
ＭＳ２Ｂ６　　ＩｇＭを、１０８４Ｂ型液体クロマトグ
ラフ［ヒユーレット・パラカード（ＨｅｗｌｅｔｔＰａ
ｃｋａｒｄ）］及び００．７５７７．５ｃｍＴＳＫ−Ｄ
ＥＡＥ−５ＰＷカラム［ビオ・ラッド（Ｂｉｏ　Ｒａｄ
）］を用いるＨＰ　Ｉ　ＥＣで精製した。緩衝液Ａは０
゜０２Ｍ）リス、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８。
５からなった。緩衝液Ｂは０．０２Ｍ）リス、０゜６Ｍ
塩化ナトリウム、ｐＨ７，０からなった。カラムを緩衝
液Ａ中１０（ｖ／ｖ）％緩衝液Ｂで平衡化させ、試料を
適用した。次いでカラムを緩衝液Ａ中２５　（ｖ／ｖ）
％緩衝液Ｂで流出させた。流出したＩｇＭを濃縮し、液
体窒素中で凍結し且つ貯蔵した。最終生成物の純度は５
ＤＳ−ＰＡＧＥによると約９５％　ＩｇＭであった。
実施例２ 子宮内膜症抗原 子宮内膜症抗原を５ＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いるゲル電気
泳動によって単離する。より多量の抗原は、通常の親和
性カラム材料に結合させたＭＳ２Ｂ６ｈＭＡｂを用いる
ことにより、中性洗剤で抽出した子宮内膜症組織の抽出
物の親和性クロマトグラフィーによって得ることができ
る。組織抽出物のカラムでの処理及び子宮内膜症抗原の
カラムからの流出は常法によって行なうことができる。
蛋白質を抽出し且つ精製するのに適当な方法は、本明細
書に参考文献として引用されるＨ、デービス（Ｄａｖｉ
ｓ）ら、キャンク・レス、■、６１４３〜６１４８（１
９８６）；Ｖ、ジョンソン（Ｊ。
ｈｎｓｏｎ）ら、キャンク・レス４６．８５０−８５７
（１９８６）ｉ及びＥ、フリートマン（Ｆ　ｒ　ｉｅｄ
ｍａｎ）ら、キャンク・レス４６．５１８９〜５１９４
（１９８６）に記述されている。
実施例３ ポリクローナル抗−（子宮内膜症）抗体抗−（子宮内膜
症）抗体を、文献例えばストー９−（Ｓｔｏｌｌａｒ）
、メト、エンジム（Ｍｅｔｈ。
Ｅｎｚｙｍ、）７０．７０（１９８０）に記述された免
疫化技術及びスケジュールを用い、ウサギを実施例１に
記述した如く製造した子宮内膜症抗原で免疫化すること
により、誘導する。次いで例えばランデ（Ｌａｎｇｅ）
ら、タリン、イクスプ、イミユノル２５，１９１（１９
７６）及びピセッキー（Ｐｉｓｅｔｓｋｙ）ら、Ｊ、イ
ミュノル、メト土Ｌ１１８７（１９８１）に記述されて
いるように、モノクロナール抗体に対して用いたものと
同様の同相分析において抗血清を選別する。
抗血清のＩｇＧ画分を、子宮内膜症抗原の連結されたＣ
ＮＢ　ｒ−セファローズ４Ｂ［ファーマシア・７アイン
・ケミカルズ（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ　　Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ）］を用いる親和性クロマトグラフィーで
更に精製する。連結に用いた方法は、ゲル製造業者、「
親和性クロマトグラフィー」、ファーマシア・ファイン
・ケミカルズ、１５〜１８頁に推奨されているものであ
る。
カラムを２〜３倍容量の緩衝液（０，０１Ｍ　　ＰＢＳ
１ｐＨ７，２）で平衡化させ、次いで抗−（子宮内膜症
）抗体含有溶液をカラムに適用した。流出液の吸光度を
、蛋白が最早やカラムから通過しなくなるまで２８０ｎ
ｍで監視した。次いでカラムをＯ，１Ｍグリシン緩衝液
（ｐＨ２，５）で洗浄して、免疫親和性結合した抗−（
子宮内膜症）抗体を脱着させる。ピークの蛋白質画分を
集め、貯留し、そして多種の緩衝液を変化させて０．０
１Ｍ　　ＰＢＳ（ｐＨ７，２）に対し、４℃で２４〜３
６時間透析させる。
実施例４ モノクロナール子宮内膜症抗体 実施例２の方法によって得た精製子宮内膜症抗原を用い
て、子宮内膜症抗原に対するマウスのモノクロナール抗
体を、カル７しくＧａ１ｆｒｅ）及びミルスタイン（Ｍ
ｉｌｓｔｅｉｎ）、メト、エンジム７３．１（１９８１
）の標準法に従い、マウスを免疫化するための抗原とし
ての子宮内膜症抗原から得る。モノクロナール抗体を、
文献例えばランデら、タリン、イクスブ、イミュノル２
５，１９１（１９７６）及びビセツキーら、Ｊ、イミュ
ノル、メト４１，１８７（１９８１）に記述されている
技術の改変法で選別する。
マウスのモノクロナール抗体を、チズソン（Ｔｉｊｓｏ
ｎ）、酵素免疫分析の実際と理論、エルセピア・サイエ
ンス出版社（Ｅ　Ｉ　ｓ　ｅ　ｖ　ｉ　ｅ　ｒＳｃｉｅ
ｎｃｅ　　　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、　１０５〜１０
７頁（１９８５）の方法に従って蛋白質−Ａを結合させ
たセファローズ−４Ｂ（ファーマシア◆ファイン・ケミ
カルズ）を用いることにより、腹水液から又はハイブリ
ドーマ培養上澄液から精製する。
実施例５ 抗イデイオタイプ子宮内膜症抗体 抗−（子宮内膜症）抗体を、子宮内膜症抗原の代りに免
疫化剤として用いることにより、実施例３及び４の方法
に従ってポリクローナル及びモノクロナール抗イデイオ
タイプ抗体を準備する。最初の選別の基準は抗−（子宮
内膜症）抗体に対する結合である。
実施例６ ＩｆｆＳ　Ｉ　テ標識さしｆ：Ｍ５２　Ｂ　６１　ｇＭ
抗体１２％　■の標識化は、Ａ、ポルトン（Ｂｏｌｔｏ
ｎ）ら、バイオダム、Ｊ、１３３．５２９〜１０８３（
１９７４）に記述されるポルトン−ハンター（Ｈｕｎｔ
ｅｒ）を用いて達成した。試剤［アマーシヤム（Ａｍｅ
　ｒ　ｓ　ｈ　ａｍ）］　　２５０ｉｔＣｉを蒸発させ
、そして０．１Ｍホウ酸ナナトリウム緩衝液ｐＨ８，５
）に対して透析しｔ；実施例１のＨＰ　Ｉ　ＥＣ精製の
生成物を添加した。０℃で２０分後、ホウ酸塩緩衝液中
０．２Ｍグリシン０．５ｍＱを添加して反応を停止させ
た。導入されてないＩｔｓ　１を、ＩＺＳ　１で標識さ
れたＭＳ２Ｂ６ＩｇＭからセファデックスＧ−２５（７
アーマシア）での排除クロマトグラフィーにより分離し
た。１〜５μＣｉ　／　ｇの範囲の比活性が得られた。
実施例２．３．４及び５の抗原及び抗体を代替すること
により、それぞれ標識された子宮内膜症抗原、抗−（子
宮内膜症）ポリクロナール及びモノクロナール抗体、並
びに抗イデイオタイプ抗体を得　ｔこ　。
実施例７ 放射性ヨウ素で標識したＭＳ２Ｂ６１ｇＭ抗体１２５１
試剤を対応する＋２３７及び１３＋　１試剤で置き換え
る以外実施例２の方法を繰返すことにより、対応する＋
２Ｊで標識されたＭＳ２Ｂ６１ｇＭ及び１３１１で標識
されたＭＳ２Ｂ６１　ｇＭを得る。
実施例２．３．４及び５の抗原及び抗体を代替すること
により、それぞれ標識された子宮内膜症抗原、抗−（子
宮内膜症）ポリクローナル及びモノクロナール抗体、及
び抗イデイオタイプ抗体を得る。
実施例８ 酵素で標識されたＭＳ２Ｂ６１ｇＭ抗体次の如きＨ，ニ
グレン（Ｎｙｇｒｅｎ）ら、メト。
ビオル、５７．１８７〜１９１（１９７９）の方法に従
い、西洋ワサビのペルオキシダーゼを抗−（子宮内膜症
）抗体に抱合させた。西洋ワサビのペルオキシダーゼ［
ＨＲＰ、ｎ型又は■型、シグマ（Ｓｉｇｍａ）］　を、
００．２５％グルタルアルデヒドＧＡ１ポラロン（Ｐｏ
ｌａｒｏｎ）］　を含有する０゜０５Ｍ炭酸塩：炭酸水
素塩緩衝液（ｐＨ９，５）に溶解する。室温で２時間後
、過剰のＧＡを、０９１５Ｍ　　ＮａＣＱで平衡化させ
たセファデックスＧ−２５カラム（０，７Ｘ　１２ｃｍ
、　７アーマシア）によりＧＡ−ＨＲＰから分離する。
Ｇ　Ａ　−ＨＲ’　Ｐ複合体を第２段階においてＯ，１
５Ｍ　　ＮａＣ（＋含有の０．０５Ｍ炭酸塩：炭酸水素
塩緩衝液（ｐＨ９，５）中抗体と、異なるＨＲＰ比で４
℃下に１６〜６４時間混合する。次いでリシンを０．０
２Ｍの最終濃度まで添加することによって反応を停止す
る。
実施例２．３．４及び５の抗原及び抗体を代替すること
により、それぞれ標識された子宮内膜症抗原、抗−（子
宮内膜症）ポリクローナル及びモノクロナール抗体、及
び抗イデイオタイプ抗体を得る。
実施例９ 放射性金属で標識されたＭＳ２Ｂ６１ｇＭ抗体この方法
において、実施例１の抗体を、金属放射性核種とキレー
トを形成しうるキレート剤と抱合させた。ＤＴＰＡ（ジ
エチレントリアミンペンタ酢酸）の二環式無水物０　、
　ｌ　ｍｇ／　ｍ１２の懸濁液を乾燥溶媒例えばクロロ
ホルム、エーテル又は乾燥ＤＭＳＯ中で調製する。次い
で一部分を、ＤＴＰＡと免疫グロブリンのモル比をｌ＝
１とするのに十分なきれいで乾いた試験管に除去し、窒
素下に蒸発させる。この乾いたＤＴＰＡに、０．０１Ｍ
炭酸水素塩緩衝剤食塩溶液（ｐ　Ｈ７，０〜７．５）中
実施例１の抗体溶液（ｌ　Ｏ〜３０ｍｇ／ｍ１２）ｌ　
Ｏ〜２０ミクロ力価部分を添加し、内容物を０．５〜１
．０分撹拌する。結合させた蛋白質調製物を同一の緩衝
液で０．２ｍ１２まで希釈し、そしてセファデックスＧ
−５０ゲルを有する５ｃｍのゲル濾過カラム及び食塩水
流出剤を用いて精製する。結合効率は、０゜５Ｍ酢酸塩
緩衝剤溶液（ｐ　Ｈ６，０）中「キレート級」＋１ｌｌ
ｎを添加することにより精製前に決定する。次いで薄層
クロマトグラフィーを用いて、ＤＴＰＡ結合抗体を結合
効率の計算のためＩこ分離する。ＤＴＰＡ結合抗体は、
金属放射性核種目Ｊ　ｎ＋３　　！１２Ｂｉ　＋３　　
ＩＩ″’Ｔ　ｃ　、及び”Ｇ　ａ　＋３と結合して対応
するキレートを生皮させるために必要とれざるまで４℃
で貯蔵する。
実施例２．３．４及び５の抗原及び抗体を代替すること
により、それぞれ標識された子宮内膜症抗原、抗−（子
宮内膜症）ポリクローナル及びモノクロナール抗体、及
び抗イデイオタイプ抗体を得る。
実施例１Ｏ ビオチンで標識されたＭＳ２Ｂ６１　ｇＭ抗体ハスペル
（Ｈａｓｐｅｌ）、Ｍ、ら、キャンク。
レス、４５．３９５１〜３９６１（１９８５）の方法を
改変してビオチンでの標識化を行なった。１ｍｇ／ｍ（
ｌの実施例１のＨＰ　ｒ　ＥＣで精製した生成物をＯ，
０１Ｍ燐酸カリウム及び０．１５Ｍ塩化カリウム（ｐＨ
７，８）に対して透析した。ＤＭＳＯ中に１ｍｇ／ｍ１
２で溶解したビオチン：Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド
（シグマ）を溶解して、ビオチンとＩｇＭのモル比を３
０：１とした（分子量１８０゜０００の単量体ＩｇＭを
使用）。室温で撹拌しながら１５分後に、１Ｍ塩化アン
モニウムの１八。容量を添加し、そしてこの溶液を０．
０２％ナトリウムアジドに対して透析した。
実施例２．３．４及び５の抗原及び抗体を代替すること
により、それぞれ標識された子宮内膜症抗原、抗−（子
宮内膜症）ポリクローナル及びモノクロナール抗体、及
び抗イデイオタイプ抗体を得る。
実施例１１ 酵素で標識された抗−（子宮内膜症）抗体実施例１の方
法に従って製造した抗−（子宮内膜症）抗体を、本明細
書に参考文献として引用されるアブラミレス（Ａｖ　ｒ
　ａｍｅ　ａ　ｓ）、イミュノダム、６．４３（１９６
９）の−段グルタルアルデヒド法に従って、或いはＭ、
オサリバン（０″５ｕ１１ｉｖａｎ）ら、アナル、バイ
オダム、１００．１００（１９７９）の改変法に従って
アルカリ・ホスファターゼと抱合させる。
実施例２．３．４及び５の抗原及び抗体を代替すること
により、それぞれ標識された子宮内膜症抗原、抗−（子
宮内膜症）ポリクローナル及びモノクロナール抗体、及
び抗イデイオタイプ抗体を得る。
実施例１２ 抗体の被覆されたミクロ力価板 実施例１に記述した如く製造した抗体を０，０５Ｍ炭酸
塩緩衝液（ｐＨ９，６）で１０μｇ／ｎ＋Ｍまで希釈す
る。この１００μαを、イミュロン（ＩＭＭＵ　Ｌ　Ｏ
Ｎ、ｌ　ｆｉミクロカ価板Ｌダイナチク（Ｄｙｎａｔｅ
ｃｈ）の各ウェルに分散させる。このウェルに蓋をし、
室温で４時間又は４℃で終夜培養する。この板を洗浄緩
衝液（０，０２）リスＨＣＱ。
０．０１５Ｍ　　ＮａＣＱ、０．０５％ツウイーン２０
）で４回洗浄し、ウェルを使用毎に完全に満し且つ空に
する。次いで各ウェルにブロック剤溶液（０，０１Ｍ　
　ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０２％ＮａＮ、、ｐＨ７，
４）２００／ｊαを分散させ、室温で１時間培養するこ
とによって力価板をブロックする。次いでウェルを上述
した如き洗浄緩衝液で４回洗浄する。今やこの板は試料
の免疫分析に使用できる状態である。
実施例２．３．４及び５の抗原及び抗体を代替すること
により、それぞれ標識された子宮内膜症抗原、抗−（子
宮内膜症）ポリクローナル及びモノクロナール抗体、及
び抗イデイオタイプ抗体を含むミクロ力価板を得る。
実施例１３ サンドウィッチ免疫分析 試験には陽性及び陰性対照物を含ませる。陰性対照物は
子宮内膜症のないことが知られる患者の血清試料である
。男性の人間からの血清試料が使用できる。陽性対照物
は実施例２の抗原を含む試料であってよい。試料希釈液
中に無菌で希釈される子宮内膜症抗原を用いる基準は標
準曲線を与える。
実施例１２における如＜ＭＳ２Ｂ６抗体で調製したミク
ロ力価板を分析に使用する。それぞれ基準、試料、陽性
及び陰性対照物１００μＱを別々のウェル中に入れて、
室温で２時間培養する。この板を実施例１１に記述する
ように洗浄緩衝液で４回洗浄する。実施例１１における
如く調製したアルカリ・ホスファターゼ抱合のヤギの抗
−（子宮内膜症）抗体１００μＱを抱合緩衝液（０，０
２Ｍトリス−Ｈ（１２，ｐＨ８，０−０３Ｍ　　ＮａＣ
（ｉ、３゜０５％ツウイーン２０．５％ＢＳＡ％　０．
Ｃ１２％ＮａＮ５）で’／１０００に希釈する。各ウェ
ルに１００μＱを分散させ、室温で２時間培養する。力
価板を前述したように４回洗浄する。ｐ−ニトロフェニ
ルホスフェート（ＰＮＰＰ）４ｍｇ／ｍ（１を基質とし
て使用する。これを、０．１２ｍＭ　　ＭａＣ＜２．を
含む０．１８Ｍ２−アミノ−２−メチル−１−グロパノ
ール（ＡＭＰ）緩衝液（ｐＨ９，５）で希釈する。ミク
ロ力価板の各ウェルに１００ｐＱを分散させる。
室温で５分間培養した後、反応速度をミクロＤ／分単位
で、■−マックス（Ｍ　Ａ　Ｘ　ＴＭ）ミクロ力価板読
取り機［モレキュラー・デバイシーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　　Ｄｅｖｉｃｅｓ）］により４０５ｎｍで読む。
標準曲線は、反応速度の増加を、標準における子宮内膜
症抗原濃度の増加と関連づけることによって作製される
。未知試料はこの曲線から直接、或いは予じめ設定した
計算機プログラム（モレキュラー・デバイシーズ）を用
いて計算される。
ＭＧ２Ｂ６　Ｉ　ｇＭの血液要素（例えばＲＢＣ。
リンパ球、顆粒球、血小板）への結合に関して独立に試
験するために更なる試験を行なった。標準的な血液凝固
技術を用いることにより、５０μｇ／ｍＱのＭＳ２Ｂ６
ＩｇＭをスタンフォード・トランスヒユージョン・サー
ビス（Ｓ　ｔ　ａ　ｎ　ｆ　ｏ　ｒ　ｄＴｒａｎｓｆｕ
ｓｉｏｎ　　５ｅｒｖｉｃｅ）で試験してもらった。Ｍ
Ｓ２Ｂ６１ｇＭは次の抗原を表現する赤血球のパネルと
反応しなかった：血液型抗ｊＫＡ及びＢ；Ｒｈ抗ｇＤ、
ＣＳｃ、Ｅ及びｅ：ケル抗原に、に、にゝ、及びＪゝ、
：ダッフイー抗原Ｆ　ａ、及びＦ　ｂ、　、キッド抗原
Ｊ・、及びＪｂｋ、ルイス抗Ｗ　Ｌ　ｅ　”及びＬｅ’
；ＭＮ抗原Ｍ、Ｎ、Ｓ及びＳ；及びルテラン抗原Ｌ　ｕ
　’及びＬ　ｕ’；並びにＸ“１抗原。
実施例１４ 免疫ペルオキシダーゼの研究 外科市街又は解剖後に組織を得る。新しい組織を小片に
切断し、ホイルに巻き、モして埋植媒体へ移す直前まで
液体窒素中に貯蔵する。６ミクロンの低温切片を風乾し
、４°Ｃで貯蔵し、次いで使用直前に！、マツクリーン
（ＭｃＬｅａｎ）ら、Ｊ。
ヒストダム・シトダム、２２，１０７７〜１０８３（１
９７４ａ）の方法に従いＰＬＰ固着剤（０，５％バラホ
ルムアルデヒド、０．０７５Ｍ　　Ｌ−リシン、及び０
．０１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム）で固定する。切片を４
℃で１０分間固定し、次いでＰＢＳ中で洗浄する。いく
つかの組織はＧ、ウッド（Ｗｏｏｄ）ら、Ｊ、ヒストダ
ム、シトケム、２９．１１９６〜１２０４（１９８１）
の方法による内因性ビオチンのブロックを必要とする。
内因性ペルオキシダーゼの活性の抑制は、Ｊ、ケリー（
Ｋｅｌｌｅｙ）ら、Ｊ、イミュノル、メト、９６．１２
７〜１３２（１９８７）の方法によって行なわれる。ビ
オチンで標識されたＭＳ２Ｂ６ＩｇＭ又は対照のＩｇＭ
を用いる免疫ペルオキシダーゼ染色は以下に機運するよ
うにＷ、ハンコツク（Ｈａｎｃ　ｏ　ｃ　ｋ）ら、メト
、エンジモル、１２１，８２８〜８４８（１９８６）の
方法で行なわれる。切片を、ブロックするための１０％
胎牛胎生、３０μｇ／ｍａのビオチンで標識された抗体
、０．５μｇ／ｍＱのストレプタビジンーＨＲＰ（シグ
マ）、次いで０．０３％過酸化水素を含むｌ　ｍｇ／　
ｍ（２のジアミノベンジジン（シグマ）と共に連続的に
培養する（但し中間にはＰＢＳで洗浄）。１５分後にス
ライドを水洗し、ヘマトキサリンで対比染色し、そして
カバーをすべらせる。ビオチンで標識されたＭＳ２Ｂ６
１ｇＭによる陽性染色は顕微鏡により細胞上に褐色の染
色沈着として見られたが、ビオチンで標識された対照の
ＩｇＭは染色されなかった。
切片のパラホルムアルデヒド−リシン−過ヨウ素酸塩を
用いる固定は適当な組織の保存と抗原の染色を可能とす
る。グルタルアルデヒド（０，１％）及び中性ホルマリ
ン（２％）はいくつかの抗原の染色を保存するが、メタ
ノール固定は抗原の染色を破壊して有効でなかった。
実施例１５ 酵素免疫分析の検討 陽性対照物として実施例２の抗原を用いることによって
実施例１３の方法を繰返す。試料希釈液で無菌的に希釈
した子宮内膜症抗原を用いる基準は標準曲線を与える。
実施例４の抗体を用い、実施例１２における如く調製し
たミクロ力価板を分折に使用する。
標準曲線は、反応速度の増加を、標準における子宮内膜
症抗原濃度の増加と関連づけることによって作製される
。未知試料はこの曲線から直接、或いは予じめ設定した
計算機プログラム（モレキュラー・デバイシーズ）を用
いて計算される。
実施例１６ ＥＡ１０１子宮内膜症抗原の調製 ＥＡ１０１子宮内膜症抗原はＥＡ１０１Ａ、ＥＡ１０１
Ｂ及びＥＡ１０１Ｇの組合せ物である。
ＥＡ１０１Ａ及びＥＡ１０１ＢはＥＡ１０１Ｄとして言
及される培地抽出物から得られる両分である。
この方法による子宮内膜症の検知法は、上皮細胞が１〜
ｌＯ％胎牛血清又は無血清培地からなる組織培養培地を
用いて試験管内で生長せしめられている培地或いは上皮
細胞の単層培養物（ＥＡｌｏｌＣ）から単離されるある
抗［（ＥＡ１０１Ａ及びＥＡ１０１Ｂ）に対して抗体の
量を測定することを含む。上皮細胞系統は卵巣ガン腫に
由来した。
ここに同様の抗原は胸、結腸、及び膵臓のガンにも存在
する。この検討におけるすべての実験結果は、卵巣上皮
ガン腫細胞系統２７７４号が他の細胞系統に比べて、よ
り多くの抗原を産生ずるように見えるから、この細胞系
統を用いて得た。
ＥＡ１０１Ｄの単離： 上皮細胞系統を、１−１０％の胎生血清を含むＭＥＭの
培地中で３〜７時間生長させ、そして培地を集め、ＩＥ
Ｃ遠心分離機で２０００ｒｐｍ下に１０分間遠心分離し
、透明な上澄液を次の方法のいずれか１つで処理した。
ｉ）培地を燐酸塩緩衝食塩に対して透析し、次いでアミ
コンＹＭＩＯ膜を用いる限外濾過によって濃縮した。次
いで濃縮した溶液を親和性クロマトグラフィーによって
分画した。
■）培地を５０％飽和硫酸アンモニウム溶液で沈殿させ
、モして３０００ｒｐｍで遠心分離した。
沈殿をＰＢＳに溶解し、ＰＢＳに対して透析した。
透析した調製物を親和性クロマトグラフィーで分画した
。
ｉｉ）培地を冷アセトンで２０°Ｃ下に沈殿させ、遠心
分離した。沈殿を乾燥し、ＰＢＳに溶解し、そして親和
性クロマトグラフィーにより分画した。
ｉｖ）培地を脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥し、
そして少量の水に溶解し、冷アセトンで２０°Ｃに沈殿
させ、そして遠心分離した。沈殿を水に溶解し、凍結乾
燥した。この凍結乾燥した粉末を親和性クロマトグラフ
ィーで分解した。
１Ｏ１Ａ及びｌ０ＩＢの親和性クロマトグラフィーでの
分離： 培地から得られた試料をＰＢＳで平衡化させたアフィゲ
ル・ブルー（Ａｆ　ｆ　ｉｇｅ　ｌ　　Ｂｌｕｅ）カラ
ムに適用し、結合してない（通流する）蛋白質を集め、
そしてアミコンＹＭＩＯ限外濾過膜により濃縮した。こ
の画分をＥＡ１０１Ｂとして言及する。結合した蛋白質
をＰＢＳＢｉ１２Ｍ塩化ナトリウム溶液で留出させ、Ｐ
ＢＳに対して透析し、次いでアミコンＹＭＩＯの限外濾
過によって濃縮した。濃縮した蛋白質を親和性カラムに
適用してアルブミンを除去した。このカラムはヤギー抗
−牛の血清アルブミン抗体（親和性精製）をシアノゲン
゛フロマイトで活性化させたセファローズ４Ｂに連結さ
せることによって準備した。アルブミンの除去後に得ら
れる抗原をＥＡ１０１Ａとして言及する。
１０１Ｃの単離： 上皮細胞の単層培養からの細胞蛋白質を、７エイ（Ｆｅ
ｙ）ら、Ｊ、セル、ビオル９８．１９７３（１９８４）
に記述されているように抽出する。蛋白質を、０．１％
トリトン−Ｘ１００を含むＰＩＰＥＳ緩衝液により４°
Ｃで１０分間分離した。次いで抗原を次のように抽出物
から単離した。第一に抽出物をＰＢＳに対して透析し、
次いで残るトリトンＸ−１００を５Ｍ−２ビオビーズを
通過させて除去する。トリトンＸ−１００の除去後の抗
原調製物を、ゲル濾過によって更に濾過し、５０ＫＤ以
下の分子量の蛋白質を除去する。ＥＡ１０１Ｃとして言
及されるより高い分子量は、子宮内膜症の患者の血清中
に抗体を検出する抗原として使用される。
実施例１７ ＥＡ１０１子宮内膜症抗原 子宮内膜症患者の血清中に存在する抗体と反応する活性
抗原は、７６５％５ＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電
気泳動及びウェスタン・プロッティング（Ｗｅｓｔｅｒ
ｎ　　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）により蛋白質をＥＡｌＯＩＡ
、ＥＡ１０１Ｂ及びＥＡｌｏｌＣから分離することで特
徴づけられる。ＥＡ１０１調製物を５ＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルに５〜２０μｇの濃度で適用し、そしてレムリ（Ｌａ
ｅｍｍｌｉ）、１０モル、ビオル、■、５７４（１９７
３）の方法を用いることにより、マイティー（Ｍｉｇｈ
　ｔ　ｙ）小ゲル電気泳動装置［ヘファー・サイエンテ
ィフィック社（Ｈｏｅｆｅｒ　　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
　　Ｃｏ、）］での電気泳動に供した。蛋白質を、タウ
ビン（Ｔｏｗｂｉｎ）ら、ブロク、ナトル、アカド、サ
イ、（Ｕ、Ｓ−Ａ、）７６．４３５０（１９７３）の方
法によってニトロセルロース膜に移した。このプロット
をＰＢＳ中１％ＢＳＡ。
１％カゼイン及び１％脱脂ミルク粉末で飽和させ、次い
で患者の血清と反応させ、Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｂ　Ｓ　Ａ（
１％）−ツウイーン２０（０，５％）で２０〜４０倍希
釈した。血清は生検により子宮内膜症が確認された患者
又は見かけ上健康な患者からのものであった。次いで特
別な抗原を、ビオチニル化抗−人間■ｇＧ　［ＰＢＳ−
ツウイーン２０（０，０５％）で５００倍希釈］、次い
でストレプタビジン西洋ワサビのペルオキシダーゼ、更
に４−クロル−１−ナフトール（トリス緩衝食塩水中０
．０５％、ｐＨ７゜６）及び過酸化水素（０，０１５％
）と反応させることによって同定した。プロット上にお
いて着色バンドにより可視化される抗原の分子量を、分
子量基準の対数を相対的易動性（Ｒｆ）に対してプロッ
トすることによって得られた標準曲線から決定すること
ができた。
これらの実験結果に基づくと、次の抗原は子宮内膜症の
患者の血清と反応し、対照の血清と反応しないから、子
宮内膜症の患者の血清中の抗体を検知するのに最も重要
であり且つ有意である。
ＥＡ１０１Ａニア３ＫＤ ＥＡＩ　ＯＩＢ　：　５０．２ＫＤ及び５７．７ＫＤＨ
Ａ１０１Ｃ：６５．７ＫＤ及び１４５．３ＫＤＨＡ１０
１Ｄ：９６．８ＫＤ、１５２ＫＤ及び１７３ＫＤ。
実施例１８ 子宮内膜症免疫分析 抗Ｊ）；（ＥＡ１０１Ａ％ＥＡ１０１Ｂ、及びＥＡＩｏ
ｌＧを別々に或いは０．１〜ｌＯｐｇ／被覆緩衝液ｍＱ
の範囲の濃度の異なる組合せで、抗原溶液と共に４℃で
１６時間又は室温で４時間培養することによりり９６の
ウェルのミクロ力価板上を被覆する。この力価板をトリ
ス緩衝食塩水（ＴＢＳ）で２回洗浄し、次いでＴＢＳＩ
％ＢＳＡと共に３７℃で２時間培養して残存する結合点
をブロックする。次いで力価板をＴＢＳ−ツウイーン２
０（０゜０５％）で４回洗浄する。
実施例１９ 子宮内膜症のエリサ分析 患者の血清を血清希釈液（ＰＳＢ−１％ＢＳＡＯ１５％
ツウイーン２０−３００ｍＭ塩化ナトリウム）で５０〜
８００倍に希釈し、この１００〜２００．ｕｌｌｉ／ウ
ェルを実施例１８に記述しｔ；ミクロ力価板に添加した
。この板を３７℃で２時間培養した。（培養時間は１５
分から３時間まで変えることができ、そして温度は室温
であってよい）。
培養後、力価板を０．０５％ツウイーン２０を含有する
トリス緩衝食塩水で洗浄し、そして抱合体としてのアル
カリホスファターゼ抱合のヤギー抗−人間１ｇＧ１００
〜２００μＱと共に培養した。
活性は基質としてのｐ−ニトロフェニルホスフェートと
反応させることによって決定した。
子宮内膜症の患者の血清における特別な抗体の量は力価
板上に抗原が被覆されていない場合に得られる値を差し
引くことによって決定される。
実施例２０ 子宮内膜症抗原の回折生物格子の調製 ０．１重量％ナトリウムアジド保存剤を含む０１１Ｍ燐
酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）で希釈された子宮内膜症抗原
（ＥＡ１０１抗原、ＥＡ１０１Ｂ抗原、ＥＡ１０１Ｃ抗
原、又はこれらのｌ：ｌ：ｌのモリ比のもの）の溶液中
に、ポリシリコン被覆のシリコンウェハを２時間又は終
夜浸す。次いでウェハを抗原溶液から除去し、緩衝食塩
水でゆすぎ、乾燥する。
線巾ｗ２５μｍ及び線間隔ｄ２５μｍを有する一連の回
折格子線をもつマスクをＵｖ照射具［カール・サス・マ
スク・アリブナ−（Ｋａｒｔ　　５ｕｓｓ　　Ｍａｓｋ
　　Ａｌｉｇｎｅｒ）中に配置し、波長２５４ｎｍ及び
強度９．６ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を３分間照射する。
次いでウェハを、２．５重量％のスクロース、０．２５
重量％の牛の血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．１重量
％のナトリウムアジドを含む０．１Ｍ燐酸塩緩衝溶液（
ＰＢＳＸｐＨ７，４）中に浸し、過剰のものを除去し、
そしてウェハを乾燥する。
次いでこのウェハを、子宮内膜症抗原の回折格子模様を
表面に有する四角いチップに切断し、そしてポリエチレ
ンの浸漬棒表面上に取りつけた。
実施例２１ 子宮内膜症生物格子免疫分析 実施例２０のポリシリコンのチップ生成物の表面に患者
の血清を添加し、１時間培養した。血清を除去し、チッ
プを蒸留水で完全にゆすぎ、そして過剰の水を除去する
。活性な子宮内膜症抗原の回折格子模様は血清中の子宮
内膜症抗体と結合する。
次いでヘリウム−ネオンレーザ−からの６３２゜８ｎｍ
の波長を有する単色光を用いて、格子によって回折され
た光の強度を測定する。
子宮内膜症抗体を既知量で含有する陽性の対照物を用い
て上記工程を繰返して参照点カットオフ（ｃｕｔ　　ｏ
ｆｆ）を確立し、これと患者の血清試料で得られた回折
光の強度を比較して、子宮内膜症の存在又は不存在を決
定する。
実施例２２ 子宮内膜症エリザ免疫分析 エリザ・ミクロ力価板を、実施例１８の方法に従い、３
μｇ／ｍＱの子宮内膜症抗原の濃度を用いて、子宮内膜
症抗［ＥＡｌｏｌＡで被覆した。エリザ免疫分析を、実
施例１９の方法に従い、子宮内膜症の存在又は不存在を
確めるために腹腔鏡で検査した患者からの血清を用いて
行なった。患者の血清を血清希釈剤で１００倍に希釈し
、そしてＶ−マクスカ価板読み機により結果を得た。試
料中の抗体量はｍ　ＯＤ　／分の単位で得た。７ｍ０Ｄ
／分以下の値は陰性と考え、７以上の値を陽性と考えた
。陽性の値は７〜１５０ｍ０Ｄ／分で変化した。結果を
第０表に示す。
第０表 子宮内膜症上ＩＪす試験の結果 患者　　　　子宮内膜症　　　　対照 全数　　　　　６２１３４ 真の陽性　　　３９ 真の陰性　　　　　　　　　　　１０６偽りの陽性　　
　　　　　　　　　２８偽りの陰性　　２３ 感度二６３％　　特異性＝７９％ 実施例２３ 子宮内膜症エリザ免疫分析 正常な患者及び子宮内膜症以外の既知の婦人科学的変調
をもつ患者からの血清を用いて実施例１９の方法を繰返
した。結果を第り表に示す。
第り表 、ｙａｓｔ　　　　　　　　ｉ艷　真の陰性　偽りの陽
性ＰＩＤ　　　　　　　　　　４０　　　３５　　　　
　　５ガン（ＧＹＮ）　　　　　７　　　　６　　　　
　１正常　　　　　　　４１　　３６　　　　５不妊　
　　　　　　２５　　２１　　　　４ＧＹＮ変調　　　
　１９　　１３　　　　６ＳＬＥ　　　　　　　　　　
　２　　　　　２　　　　　　０妊娠　　　　　　　１
３　　１２　　　　１Ｐｒｅ−ｅｃｌａｍｐｓｉａ　　
　ｌ　０　　　８　　　　２ＰＩＤ−骨盤炎症病 ５ＬＥ−全身的紅斑性狼癒 本発明の主なる特徴および態様は以下のとおりである。
１、（ａ）　　患者からの試料を抗−子宮内膜症抗体と
接触させ、そして （ｂ）　　この抗体の試料成分との結合を決定する、こ
とを特徴とする患者における子宮内膜症の存在を決定す
る方法。
２．試料が体液である上記ｌの方法。
３、試料が血液試料である上記２の方法。
４、試料が組織試料である上記ｌの方法。
５、試料が細胞スミアである上記４の方法。
６、抗−（子宮内膜症）抗体を標識する上記ｌの方法。
７、抗＝（子宮内膜症）抗体がポリクローナル抗体であ
る上記ｌの方法。
８、抗−（子宮内膜症）抗体がモノクローナル抗体であ
る上記１の方法。
９、抗−（子宮内膜症）抗体が人間のモノクローナル抗
体である上記１の方法。
１０、抗−（子宮内膜症）抗体がＭＳ２Ｂ６１ｇＭ抗体
である上記９の方法。
１１、（ａ）患者からの血清試料を子宮内膜症抗原又は
子宮内膜症抗イデイオタイプ抗体と接触させ、そして （ｂ）子宮内膜症抗原又は子宮内膜症抗イデイオタイプ
抗体の、試料中の抗体との結合を決定する、ことを特徴
とする患者における子宮内膜症の存在を決定する方法。
１２、子宮内膜症抗原又は子宮内膜症抗イデイオタイプ
抗体が担体に結合されている上記１１の方法。
１３、子宮内膜症抗原又は子宮内膜症抗イデイオタイプ
抗体が標識されている上記１１の方法。
１４、抗−（子宮内膜症）抗体を含んでなる子宮内膜症
を検知するための免疫分析キット。
１５、抗−（子宮内膜症）抗体が標識されている上記１
４の免疫分析キット。
１６、標識が放射性標識である上記１５の免疫分析キッ
ト。
１７、抗−（子宮内膜症）抗体がポリクローナル抗体で
ある上記１４の免疫分析キット。
１８、抗−（子宮内膜症）抗体がモノクローナル抗体で
ある上記１４の免疫分析キット。
１９、抗−（子宮内膜症）抗体が人間のモノクローナル
抗体である上記１４の免疫分析キット。
２０、抗−（子宮内膜症）抗体がＭＳ２Ｂ６１ｇＭ抗体
である上記１４の免疫分析キット。
２１、子宮内膜症抗原と優先的に結合する抗体。
２２、人間のモノクローナル抗体である上記２１の抗体
。
２３、上記２２の抗体としてのＭＳ２Ｂ６１ｇＭ抗体。
２４、標識残基に抱合された上記２１の抗体。
２５、ＥＡ１０１Ａ抗原、ＥＡ１０１Ｂ抗原、Ｅ１０１
抗原、又はこれらの混合物からなる子宮内膜症抗原。
２６、不溶性担体に結合せしめられた上記２５の子宮内
膜症抗原から本質的になる子宮内膜症抗原試薬。
２７、不溶性担体がミクロウェルである上記２６の子宮
内膜症抗原試薬。
２８、上記２５の抗原の活性な及び無活性化された領域
を変更することを含んでなる生物格子。
２９、上記２１の抗原の活性な及び無活性化されな領域
を変更することを含んでなる生物格子。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）患者からの試料を抗−子宮内膜症抗体と接触
    させ、そして （ｂ）この抗体の試料成分との結合を決定する、 ことを特徴とする患者における子宮内膜症の存在を決定
    する方法。 ２、（ａ）患者からの血清試料を子宮内膜症抗原又は子
    宮内膜症抗イデイオタイプ抗体と接触させ、そして （ｂ）子宮内膜症抗原又はその子宮内膜症抗イデイオタ
    イプ抗体の、試料中の抗体との結合を決定する、 ことを特徴とする患者における子宮内膜症の存在を決定
    する方法。 ３、抗−（子宮内膜症）抗体を含んでなる子宮内膜症を
    検知するための免疫分析キット。４、子宮内膜症抗原と
    優先的に結合する抗体。 ５、ＥＡ１０１Ａ抗原、ＥＡ１０１Ｂ抗原、Ｅ１０１抗
    原、又はこれらの混合物からなる子宮内膜症抗原。 ６、不溶性担体に結合せしめられた特許請求の範囲５の
    子宮内膜症抗原から本質的になる子宮内膜症抗原試薬。 ７、特許請求の範囲５の抗原の活性な及び無活性化され
    た領域を変更することを含んでなる生物格子。 ８、特許請求の範囲４の抗原の活性な及び無活性化され
    た領域を変更することを含んでなる生物格子。
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