JP2597013B2

JP2597013B2 - 妊娠誘発高血圧および子かんのイムノアツセイおよび試薬

Info

Publication number: JP2597013B2
Application number: JP1239775A
Authority: JP
Inventors: アンドルー・イー・セニエイ; ネルソン・エヌ・エイチ・テン
Original assignee: アデザ・バイオメディカル・コーポレーション
Priority date: 1988-09-15
Filing date: 1989-09-14
Publication date: 1997-04-02
Anticipated expiration: 2012-04-02
Also published as: GR3018101T3; DE68924818T2; EP0359274B1; CA1338899C; DE68924818D1; AU623678B2; ES2079366T3; ATE130437T1; JPH02115767A; EP0359274A3; US5079171A; AU4131689A; IL91639A0; EP0359274A2

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、妊娠の間の妊娠誘発高血圧（PIH）または
子かん前症を検出する方法、試薬およびキットに関す
る。とくに、本発明は、全血、血清または血漿の試料と
内皮細胞の障害のためのマーカー、例えば、細胞フィブ
ロネクチンの存在について試験することによる、PIHま
たは子かん前症の決定に関する。

本発明は、要約すれば、次の通りである：妊娠誘発高
血圧（PIH）および子かんは、サンドイッチイムノアッ
セイまたは競合イムノアッセイを使用して、妊娠した女
性の血液、血漿または血清の試料中の内皮細胞マーカー
の存在を同定することによって決定される。試料中の細
胞フィブロネクチンマーカーは、抗（細胞フィブロネク
チン）抗体との結合により決定される。これらの方法の
ための試薬も本発明の１つの面である。

子かん前症、子かんおよび妊娠誘発高血圧（PIH）
は、増大した血圧、タンパク質尿、および浮腫により特
性づけられる。これらの疾患の原因および性質は、部分
的にのみ理解されているに過ぎない。子かん前症および
PIHは、しばしば、同一疾患を表示するために使用され
る。用語「子かん前症（preeclmpsia）」は、以後、説
明を明瞭とする目的で、限定を意図しないで、子かん前
症、妊娠誘発高血圧および子かんを広く包含するために
使用する。子かん前症は米国において比較的希であると
考えられているが、診断の基準および研究の人口に依存
して、妊娠女性の２〜35％で世界的に起こっている。子
かん前症からの死亡はレドマン（Redman）C.の最近の報
告（Brit.Med.J.296:1209−1210（April,1988））にお
いて子かんからのそれらにほぼ等しい。しかしながら、
これらの状態た、状態が進行してしまうまで、しばしば
不明瞭であり、そしてこれらの状態の診断はしばしば不
可能であった。この状態の早期の診断のための信頼性あ
る試験は、非常に要求されている。

子かん前症におけるプロスタグランジンの役割の外観
は、フリードマン（Fiedman）、S.、Obstet Gynecol.7
1:122−137（1988）により発表された。PIHおよび子か
ん前症のための代謝のマーカーの母系液（maternal fl
uid）の検査は、2,3−ジノル−６−ケトPGF_１αの尿レ
ベルはこの状態の間に増加することが明らかにされた、
Ob/Gyn Topcs、2:5（1987）。血液中の他の物質のレベ
ルは、また、研究されてきた。

ある数の研究は、これらの病気のプロセスの間の血液
中のフィブロネクチンのレベルの一般的増加に集中され
た：例えば、グラニンガー（Graninger）、W.ら、Euro
q.J.Obstet.Gynec.Reqrod.Bil.、19:223−229（198
5）；ヘス（Hess）、L.ら、Obstret.Gynecol.68:25−28
（1986）；ラザルチック（Lazarchick）、J.ら、Am.J.O
b.Gyn.154:1050−1052（1986）；エリクセン（Erickse
n）、H.ら、Acto.Obstet.Gynecol.Scand.66:25−28（19
87）；およびサレ（Saleh）ら、Obstet.Gynecol.71:719
（1988）。血液中のフィブロネクチンのレベルはPIHお
よび子かん前症とともにより高くなることが報告されて
いるが、増加の程度は各固体および妊娠の段階とともに
変化し、そして単独と考えられ、病気の信頼性ある診断
のインジケーターではなかった。シバイ（Sibai）、B.
ら、Contemq.Ob/Gyn.57（Feb.1988）は、PIHを予知する
信頼性ある手段および発生を減少する有効な方法のため
の研究を続けていることを報告している。しばらくし
て、臨床医は、なお、管理を統制するために血圧の基準
を使用し続けている。

子かん前症で観測される増大したフィブロネクチンの
レベルが内皮の障害を示唆することは、バチア（Bhati
a）、R.ら、Am.J.Obstet.Gynecol.157:106−108（198
7）により仮定された。より最近、ロバーツ（roberts）
（Ob.Gyn.News.221（Nov.1987））は、子かん前症が内
皮細胞の障害に基本的に関係する病気のプロセスである
ことを示唆する証拠が高血圧の疾患でないことを示唆し
た。

ヒト細胞フィブロネクチンと優先的に結合し、そして
細胞フィブロネクチンおよび血漿フィブロネクチンを区
別することができるモノクローナル抗体は、キーン（Ke
en）J.ら、Mol.Biol.Med.2:15−27（1984）により記載
されている。胚および大人ヒト組織中の細胞フィブロネ
クチンの独特Ed配列と結合するモノクローナル抗体は、
バーチオ（Vartio）T.ら、J.CellSci.88:419−430（198
7）により記載されている。ヒトフィブロネクチン中に
存在する独特アミノ酸ストレッチは、グトマン（Gutma
n）A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84:7179−7182（19
87）により報告されている。ペータース（Peters）J.
ら、Am.Rev.Resqir.Dir.138:167−174（1988）は、ヒト
細胞フィブロネクチン中に存在する29アミノ酸の独特非
相同ストレッチに対応するエクストラタイプIIIドメイ
ン（ED1）ペプチドの合成、この領域と結合する抗体、
およびこれらの抗体で開発されたELISAイムノアッセイ
を記載している。開示されているペプチド配列は、次の
単一の文字の略字を使用すると、TYSSPEDGIHELFPAPDGEE
DTAELQGGCである：アラニン（Ａ）、システイン
（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン
（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、プロリ
ン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニ
ン（Ｔ）、およびチロシン（Ｙ）。

子かん前症、妊娠誘発高血圧（PIH）および子かん
は、サンドイッチイムノアッセイまたは競合イムノアッ
セイを使用して、妊娠した女性の血液、血漿または血清
の試料中の内皮細胞マーカーの存在を同定することによ
って決定される。

１つの実施態様において、試料中の内皮細胞マーカー
の存在は、試料を抗（内皮細胞マーカー）抗体と接触さ
せ、そして前記抗体と内皮細胞マーカーとの結合を決定
することによって決定される。試料は第１抗（内皮細胞
マーカー）抗体が付着した不溶性支持体と十分な時間接
触させて抗原−抗体結合を起こさせることができる；次
いで、不溶性支持体は第２抗（内皮細胞マーカー）抗体
と十分な時間接触させて抗原−抗体結合を起こさせるこ
とができる；そして不溶性支持体上の第２抗（内皮細胞
マーカー）抗体の存在を決定することができる。第２抗
（内皮細胞マーカー）抗体は、物理学的検出標識を有す
るすることができる。あるいは、この方法は試料および
第２抗（内皮細胞マーカー）抗体を、第１抗（内皮細胞
マーカー）抗体が付着した不溶性支持体と、十分な時間
接触させて抗原−抗体結合を起こさせ、そして不溶性支
持体上の第２抗（内皮細胞マーカー）抗体の存在を決定
することからなる。内皮マーカーは細胞フィブロネクチ
ンであり、そして抗（内皮細胞マーカー）抗体は抗（細
胞フィブロネクチン）抗体であるすることができる。２
つの異なる抗（内皮マーカー）抗体を使用し、そして一
方が抗（細胞フィブロネクチン）抗体であるとき、第２
抗体は非（交差反応性）抗体または抗（フィブロネクチ
ン）抗体であることができる。

本発明の１つの競合方法は、抗（内皮細胞マーカー）
抗体が付着した不溶性支持体を、試料および前記支持体
に付着した抗（内皮細胞マーカー）抗体のすべてと結合
するために不十分である量の標識した内皮細胞マーカー
の混合物を接触させ、そして不溶性支持体に結合した標
識した内皮細胞マーカーの量または前記混合物中に残る
た内皮細胞マーカーの量を決定することからなる。別の
競合実施態様において、この方法は内皮細胞マーカーが
付着した不溶性支持体を、試料および前記支持体に付着
した内皮細胞マーカーのすべてと結合するために不十分
である量の標識した抗（内皮細胞マーカー）抗体の混合
物と接触させ、そし不溶性支持体に結合した標識した抗
（内皮細胞マーカー）抗体の量または前記混合物中に残
る標識した抗（内皮細胞マーカー）抗体の量を決定する
ことからなる。

本発明の試薬は、不溶性試薬支持体に付着した抗（内
皮細胞マーカー）抗体および不溶性試薬支持体に付着し
た内皮細胞マーカーからなる。

本発明の１つの試験キットは、不溶性支持体に付着し
た抗（内皮細胞マーカー）抗体、例えば、抗（細胞フィ
ブロネクチン）抗体および標識した抗（内皮細胞マーカ
ー）抗体、例えば、標識した抗（細胞フィブロネクチ
ン）抗体からなる。他のキットは、不溶性支持体に付着
した抗（フィブロネクチン）抗体および標識した抗（細
胞フィブロネクチン）抗体からなる。なおほかのキット
は、不溶性支持体に付着した抗（内皮細胞マーカー）抗
体および標識した内皮細胞マーカーからなる。他のキッ
トは、不溶性支持体に付着した内皮細胞マーカーおよび
標識した抗（内皮細胞マーカー）抗体からなる。

試薬は、キットにおいて適当な形態で、例えば、別の
容器、パッケージ、など中に存在することができる。

本発明の目的は、サンドイッチイムノアッセイまたは
競合イムノアッセイを使用して妊娠した女性の血液、血
漿または血清の試料中の内皮細胞マーカーの存在を同定
することによって、子かん前症、妊娠誘発高血圧（PI
H）および子かんを検出することである。

用語「内皮細胞マーカー」は、ここで使用するとき、
妊娠した女性が子かん前症、PIHまたは子かんの過程ま
たは状態を有するとき、彼女の血液中に存在し、そして
正常の妊娠の間有意の量で存在しない、化学物質または
物質を意味する。用語「抗（内皮細胞マーカー）抗体」
は、ここで使用するとき、内皮細胞マーカーと優先的に
結合し、そして正常の妊娠において存在する血液成分と
有意に結合しない抗体（親和精製したポリクローナル抗
体またはモノクローナル抗体）を意味する。

１つの内皮細胞マーカーは、内皮細胞フィブロネクチ
ン、以後細胞フィブロネクチンと呼ぶ、である。細胞フ
ィブロネクチンは、子かん前症、PIHまたは子かんの病
気の過程において破壊または混乱される内皮細胞から誘
導する。それは、肝炎由来である血漿フィブロネクチン
と、あるいは胎児細胞から由来する胎児フィブロネクチ
ンと区別される。胎児フィブロネクチンは妊娠の間の母
系血液中に有意の量で存在しない。用語「抗（細胞フィ
ブロネクチン）抗体）は、ここで使用するとき、内皮細
胞フィブロネクチンと優先的に結合するが、血漿フィブ
ロネクチンと有意に結合しない、抗体（親和精製したポ
リクローナル抗体およびモノクローナル抗体）を包含す
ると定義される。

用語「抗（フィブロネクチン）抗体」は、ここで使用
するとき、血漿フィブロネクチンおよび内皮細胞フィブ
ロネクチンを包含する血液の合計のフィブロネクチン成
分と結合するか、あるいは細胞フィブロネクチンのみと
結合する、抗体を包含すると定義される。

用語「抗体」は、ここで使用するとき、クラスIgG、I
gM、IgA、IgDおよびIgEの抗体、および抗体の結合性断
片、半抗体、およびハイブリッド誘導体（例えば、抗体
のＦ（ab）およびＦ（ab′）_２断片、これに限定されな
い）を包含すると定義される。

用語「優先的に結合する」は、ここで使用するとき、
10％以下、好ましくは５％以下の交差反応性を有する抗
体および抗体の断片を包含すると定義される。

本発明の方法において、血液試料を患者から普通の方
法より集める。それは毛管または静脈から集めることが
できる。それは排気した容器中に抜き出し、ヘパリン、
クエン酸ナトリウムまたはEDTAと混合し、そして遠心し
て細胞を除去し、血漿を得る。それを凝固させ、そして
血漿を凝固から分離することができる。それを吸収材
料、例えば、紙により吸収し、そして乾燥することがで
きる。

内皮細胞マーカーの検出は、任意の適当な方法により
決定することができる。免疫学的方法は、特異性をもつ
ため、この方法の実施に最も便利であり、そして用語
「イムノアッセイ」は、ここで使用するとき、内皮細胞
マーカーが第２物質、結合相手、通常抗体または内皮細
胞マーカーのエピトープと選択的に、好ましくは優先的
に結合する抗原結合部位を有する他の物質と、優先的に
結合する性質を使用する方法を意味すると定義される。
本発明の範囲内に、次のものが包含されるが、これらの
限定されない：この工程を含むすべてのイムノアッセイ
方法、例えば、サンドイッチイムノアッセイ、競合イム
ノアッセイ、凝集、沈澱、トランジスターブリッジプロ
ーブ、粒子分類、光混乱、光混乱、および超音波プロー
ブイムノアッセイ。適当なイムノアッセイは、標識とし
て、放射性同位元素、酵素、または蛍光、発色、または
化学発光物質を使用することができる。

１つの好ましい実施態様において、試料を抗（内皮細
胞マーカー）抗体が付着した不溶性支持体と接触させ
て、試料中の内皮細胞マーカーの結合および捕捉をおこ
なう。次いで、不溶性支持体を不溶性支持体に付着する
内皮細胞マーカーと結合する非標識または標識抗体と接
触させて、捕捉した内皮細胞マーカーを標識しかつ測定
する。例えば、抗（内皮細胞マーカー）抗体を不溶性支
持体に付着し、そして標識または非標識抗（内皮細胞マ
ーカー）抗体を使用して捕捉した抗原を標識することが
できる。

本発明の方法および試薬において好ましい内皮細胞マ
ーカーはフィブロネクチンであり、そして以後の本発明
の説明はしばしば試料中の細胞フィブロネクチンの検出
を参照し、これは明瞭さを目的とし、限定を意味しな
い；本発明は、患者の血液、血清または血漿中の内皮細
胞マーカーの検出を包含する。

子かん前症、PIHまたは子かんを決定する１つの方法
は、妊娠の患者から血液、血漿または血清の試料を取
り、そして試料中の内皮細胞マーカーの存在を決定する
ことからなる。試料中の内皮細胞マーカーの存在は、試
料を抗（内皮細胞マーカー）抗体と接触させ、そして抗
体と内皮細胞マーカーとの結合を決定することによって
決定することができる。これは、試料を第１抗（内皮細
胞マーカー）抗体が付着した不溶性支持体と十分な時間
接触させて抗原−抗体結合を起こさせ、そして不溶性支
持体を第２抗（内皮細胞マーカー）抗体十分な時間接触
させて抗原−抗体結合を起こさせ、そして不溶性支持体
上の第２抗（内皮細胞マーカー）抗体の存在を決定する
工程により達成することができる。第２抗（内皮細胞マ
ーカー）抗体は、物理学的検出標識を有することができ
る。あるいは、これは試料および第２抗（内皮細胞マー
カー）抗体の混合物を第１抗（内皮細胞マーカー）抗体
が付着した不溶性支持体と十分な時間接触させて抗原−
抗体結合を起こさせ、そして不溶性支持体上の第２抗
（内皮細胞マーカー）抗体の存在を決定することによっ
て達成することができる。

本発明の好ましい実施態様において、内皮細胞マーカ
ーは細胞フィブロネクチンである。この場合において、
この方法は試料を抗（細胞フィブロネクチン）抗体を十
分な時間接触させて抗（細胞フィブロネクチン）抗体と
の抗原−抗体結合を起こさせ、そして前記結合の存在を
決定することからなる。この方法は、試料を抗（細胞フ
ィブロネクチン）抗体が付着した不溶性支持体と十分な
時間接触させて抗原−抗体結合を起こさせ、不溶性支持
体を抗（フィブロネクチン）抗体と十分な時間接触させ
て抗原−抗体結合を起こさせ、そして不溶性支持体上の
抗（フィブロネクチン）抗体の存在を決定する工程から
なる。抗（フィブロネクチン）抗体は物理学的検出標識
を有することができる。抗（フィブロネクチン）抗体
は、抗（細胞フィブロネクチン）抗体であることができ
る。１つの実施態様において、不溶性支持体に付着した
抗（細胞フィブロネクチン）抗体は第１抗（細胞フィブ
ロネクチン）抗体であり、そして抗（フィブロネクチ
ン）抗体は第１抗（細胞フィブロネクチン）抗体と有意
に交差反応しない第２抗（細胞フィブロネクチン）抗体
である。

別の方法において、工程は試料および抗（フィブロネ
クチン）抗体の混合物を抗（細胞フィブロネクチン）抗
体が付着した不溶性支持体と十分な時間接触させて抗原
−抗体結合を起こさせ、そして不溶性支持体上の抗（フ
ィブロネクチン）抗体の存在を決定することからなる。
抗（フィブロネクチン）抗体は物理学的検出標識を有す
ることができ、抗（細胞フィブロネクチン）抗体は第１
抗（細胞フィブロネクチン）抗体であることができ、そ
して抗（フィブロネクチン）抗体は有意に交差反応しな
い第２抗（細胞フィブロネクチン）抗体であることがで
きる。

他の方法は、試料を抗（フィブロネクチン）抗体を付
着した不溶性支持体と十分な時間接触させて抗原−抗体
結合を起こさせ、不溶性支持体を抗（細胞フィブロネク
チン）抗体と十分な時間接触させて抗原−抗体結合を起
こさせ、そして不溶性支持体上の抗（細胞フィブロネク
チン）抗体の存在を決定する工程からなる。抗（細胞フ
ィブロネクチン）抗体は物理学的検出標識を有すること
ができる。あるいは、工程は試料および抗（細胞フィブ
ロネクチン）抗体の混合物を抗（フィブロネクチン）抗
体が付着した不溶性支持体と十分な時間接触させて抗原
−抗体結合を起こさせ、そして不溶性支持体上の抗（細
胞フィブロネクチン）抗体の存在を決定することからな
る。この別の実施態様において、抗（フィブロネクチ
ン）抗体は物理学的検出標識を有することができる。

本発明の競合イムノアッセイの実施態様は、抗（内皮
細胞マーカー）抗体が付着された不溶性支持体を、試料
および前記支持体へ付着した抗（内皮細胞マーカー）抗
体のすべてと結合するために不十分である量の標識した
内皮細胞マーカーの混合物と接触させ、そして不溶性支
持体に結合した標識した内皮細胞マーカーの量または前
記混合物中に残る標識した内皮細胞マーカーの量を決定
することからなる。この方法の好ましい実施態様は、抗
（細胞フィブロネクチン）抗体が付着した不溶性支持体
を、試料および前記支持体に付着した抗（細胞フィブロ
ネクチン）抗体のすべてと結合するために不十分である
量の標識した細胞フィブロネクチンの混合物と接触さ
せ、そして不溶性支持体に結合した標識した細胞フィブ
ロネクチンの量または前記混合物中に残る標識した細胞
フィブロネクチンの量を決定することからなる。

本発明の別の競合イムノアッセイは、内皮細胞マーカ
ーが付着した不溶性支持体を、試料および前記支持体に
付着した内皮細胞マーカーのすべてと結合するために不
十分である量の標識した抗（内皮細胞マーカー）抗体の
混合物と接触させ、そして不溶性支持体に結合した標識
した抗（内皮細胞マーカー）抗体の量または前記混合物
中に残る標識した抗（内皮細胞マーカー）抗体の量を決
定することからなる。本発明の好ましい実施態様は、細
胞フィブロネクチンが付着した不溶性支持体を、試料お
よび前記支持体に付着した細胞フィブロネクチンのすべ
てと結合するために不十分である量の標識した抗（細胞
フィブロネクチン）抗体の混合物とを接触させ、そして
不溶性支持体に結合した標識した標識した抗（細胞フィ
ブロネクチン）抗体の量または前記混合物中に残る標識
した抗（細胞フィブロネクチン）抗体の量を決定するこ
とからなる。

抗（内皮細胞マーカー）抗体は、内皮細胞マーカー、
例えば、細胞フィブロネクチンから、好ましくは高度に
精製した細胞フィブロネクチンから、普通の抗血清（ポ
リクローナル）またはモノクローナル技術により得るこ
とができる。抗（血漿フィブロネクチン）抗体は、血漿
フィブロネクチンから、普通の抗血清（ポリクローナ
ル）技術またはモノクローナル技術により得ることがで
きる。

ヒト細胞フィブロネクチンと優先的に結合し、そして
細胞フィブロネクチンと血漿フィブロネクチンとの間を
区別することができる適当なモノクローナル抗体は、キ
ーン（Keen）Ｊら、Mol.Bil.Med.2:15−27（1984）に記
載されている。胚および大人ヒト組織中の細胞フィブロ
ネクチンの独特Ed配列は、バルチオ（Vartio）、T.ら、
J.CellSci.88:419−430（1987）に記載されている。ヒ
ト細胞フィブロネクチンと優先的に結合するポリクロー
ナル抗体およびモノクローナル抗体の調製に使用するこ
とができる独特アミノ酸ストレッチは、グトマン（Gutm
an）A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A、84:7179−7182
（1987）に記載されている。ペータース（Peters）J.
ら、Am.Rev.Resqir.Dis.138:167−174（1988）は、ヒト
細胞フィブロネクチン中に存在する29アミノ酸の独特非
相同ストレッチに対応するエクストラタイプIIIドメイ
ン（ED1）ペプチドの合成、この領域と結合する抗体、
およびこれらの抗体で開発されたELISAイムノアッセイ
を記載している。開示されているペプチド配列は、次の
単一の文字の略字を使用すると、TYSSPEDGIHELFPAPDGEE
DTAELQGGCである：アラニン（Ａ）、システイン
（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン
（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、プロリ
ン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニ
ン（Ｔ）、およびチロシン（Ｙ）。これらの刊行物に報
告されている抗体の各々は、本発明の方法において抗
（内皮細胞マーカー）抗体として使用することができ、
そして上に記載する刊行物の各々の全体の内容をここに
引用によって加える。

ポリクローナル抗（細胞フィブロネクチン）抗体は、
動物、例えば、ウサギ、モルモット、ラットまたはヤギ
の濃縮した細胞フィブロネクチンで免疫化し、免疫化し
た動物から血清を取り出し、そして免疫グロブリンを血
清から、硫酸アンモニウム沈澱により分離することによ
って得ることができる。本発明の方法において有用な主
な抗体は、IgG主なIgM抗体であるが、IgD、IgEおよびIg
A抗体は、また、入手可能である感染、十分な量で使用
することができる。次いで、細胞フィブロネクチンの抗
体を、普通の親和クロマトグラフィー技術、例えば、次
の文献に記載されているものを使用して親和精製する：
ミシェル（Mishell）およびシルギ（Shilgi）、細胞免
疫学的において選択した方法（SELECTED METHODS IN
CELLULAR IMMUNOLOGY）、サンフランシスコ:Freeman
（1980）、ゴウディング（Goding）、J.、モノクローナ
ル抗体：原理および実施（MONOCLONAL ANTIBODIES:PRI
NCIPLES AND PRACTICE）、ニューヨーク:Academic P
ress pp111−114（1983）、およびパリク（parikh）、
I.C EN（August 26、1985）（それらの各々の全体を
ここに引用によって加える）。親和クロマトグラフィー
において使用のために適当な吸収体は、細胞フィブロネ
クチン抗体が共有結合した、架橋したアガロースおよび
架橋したポリアクリルアミドを包含する。血漿フィブロ
ネクチンと交差反応する抗体を除去するため、抗体血清
を血漿フィブロネクチンが結合されているカラムに通過
させる。次いで、残りの抗体を含有するする溶離液の部
分を細胞フィブロネクチンのカラムに通過させ、そして
溶離して親和精製した抗体を得ることができる。

これらの方法において、抗体溶液をカラムにリン酸塩
緩衝液中で適用し、そして抗体は2.5モルのNaSCN溶液、
pH8.0、で溶離することができる。抗体の濃縮は、必要
に応じて、マイナスの圧力の透析または限外濾過により
達成することができる。この方法の反復は所望の純度を
達成するために要求されることがある。カラム分離の反
復は、所望のカラムの分離および純度が達成されるま
で、続ける。

モノクローナル抗体の抗（細胞フィブロネクチン）抗
体は、グラフレ（Glafre）およびミルステイン（Milste
in）、メソッズ・イン・エンジモロジー（Methods Enz
ymol.）、73:1（1981）の方法により、マウスを細胞フ
ィブロネクチンで免疫化して脾細胞をハイブリダイゼー
ションのために得ることができる。適当な方法はゴウデ
ィング（Goding）、J.（supra、pp56−97）（その内容
全体をここに引用によって加える）。胎児フィブロネク
チンに、また、結合する細胞フィブロネクチンの産生の
ため、マツウラ（matuura）H.およびハコモリ（hakomor
i）S.、（supra）の方法に従い、腫瘍フィブロネクチン
のかわりに胎児フィブロネクチンを使用することができ
る。これらの抗体の調製に適当な手順は、本出願人によ
る1987年11月17日提出の米国特許出願第121,895号（そ
の内容全体をここに引用によって加える）に記載されて
いる。

ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両者
の抗（フィブロネクチン）の変異型は、よく知られてお
り、そして商業的に入手可能であるか、あるいは公に入
手可能なハイブリドーマの受託所から入手可能である。
例えば、抗（合計のフィブロネクチン）モノクローナル
抗体は、ATCC HB 91（アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション（American Type Culture Collect
ion,Rockville,Maryland）からクローンの試料から誘導
することができる。このような抗体は、また、日本国特
許出願6009126号（DIALOGデータベースのファイル351、
WPI Acc.No.85−161617/27）および米国特許第4,325,8
67号に記載されている。

本発明の装置、キットおよび方法における使用に適当
な、優勢的に結合する抗体断片は、それぞれのモノクロ
ーナル抗体またはポリクローナル抗体から、普通の酵素
または化学的断片化方法によりつくることができる。適
当な方法は、例えば、次の文献に記載されている：チジ
セン（Tijssen）、P.、生化学および分子生物学におい
て実験室の技術：酵素イムノアッセイの実施および（LA
BORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLEC
ULAR BIOLOGY:PRACTICE AND THEORIES OF ENZYME
IMMUNOASSYAS）、ニューヨーク:Elsevier（1985）。

抗体の試薬は不溶性支持体に普通の方法により結合す
ることができる。抗体を不溶性支持体に結合する方法
は、例えば、米国特許第3,551,555号、米国特許第3,55
3,310号、米国特許第4,048,298号および再発行第29,474
号、およびチジセン（Tijssen）（supra pp297−32
8）。抗体をポリスチレンに吸着により結合する方法
は、例えば、米国特許第3,646,346号および米国特許第
4,092,408号に記載されている。

種々の材料を不溶性支持体として使用することがで
き、主な考察は抗（細胞フィブロネクチン）抗体または
抗（フィブロネクチン）抗体の表面への結合、試薬間の
干渉の不存在、あるいは結合反応の存在および程度を決
定するために使用することができる他の反応である。有
機および無機のポリマー、両者は自然および合成、を不
溶性支持体として使用することができる。適当ポリマー
の例は、次のものを包含する：ポリエチレン、ポリプロ
ピレン、ポリブチレン、ポ（４−メチルブチレン）、ブ
チルゴム、シラスチックポリマー、ポリエステル、ポリ
アミド、セルロースおよびセルロース誘導体（例えば、
酢酸セルロース、ニトロセルロースなど）、アクリレー
ト、メタクリレート、ビニルポリマー（例えば、ポリ酢
酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポ
リフッ化ビニルなど）、ポリスチレンおよびスチレング
ラフトコポリマー、レーヨン、ナイロン、ポリビニルブ
チレート、ポリホルムアルデヒドなど。不溶性支持体と
して使用することができる他の材料は、上のポリマーの
ラテックス、シリカゲル、ケイ素ウェーファー、ガラ
ス、紙、不溶性タンパク質、金属、メタロイド、金属酸
化物、磁性材料、半導体材料、セラミックなどである。
さらに、ゲルを形成する物質、リポ多糖、ケイ酸塩、ア
ガロース、ポリアクリルアミド、またはいくつかの水性
相を形成するポリマー、例えば、デキストラン、ポリア
ルキレングリコール（２〜３個の炭素原子のアルキル）
または界面活性剤、例えば、アンフォフィリック（amph
ophilic）化合物、例えば、ホスホリピド、長鎖（12〜2
4個の炭素原子）のアルキルアンモニウム塩などが包含
される。

好ましい支持体は、ナイロンまたはニトロセルロース
膜からなる。別の診断支持体は、ポリスチレン、スチレ
ンコポリマー、例えば、スチレン−アクリロニトリルコ
ポリマー、またはポリオレフィン、例えば、ポリエチレ
ンまたはポリプロピレン、およびアクリレートおよびメ
タクリレートのポリマーおよびコポリマーから作られ
る。抗（細胞フィブロネクチン）抗体、他の抗体試薬、
および細胞フィブロネクチン試薬は不溶性支持体に、吸
着、イオン結合、ファンデルワールス吸着、静電結合、
または他の非共有結合により結合することができる。こ
の方法にとくに有利な支持体は、複数のウェルを有する
マイクロタイタープレートからなる。ウェルの表面また
はその中のプラスチックのカップのインサートは抗原ま
たは抗体の支持体を構成することができる。決定は蛍光
測定の使用を必要とする場合、マイクロタイタープレー
トまたはウェルのインサートは有利には光に対して不透
明であって、ウェルに加える励起光が取り囲む内容物に
到達しないか、あるいは影響を及ぼさないようにする。

非共有結合のための方法は、米国特許第4,528,267号
に記載されている。不溶性支持体へ抗体および抗原を共
有結合するための方法は、イチロー・チバタ（Ichiro
Chibata）、固定化酵素（IMMOBILIZED ENZYMES）、Hal
sted Press:ニューヨーク（1978）およびA.クアトレカ
サス（Cuatrecasas）、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、245:3059（197
0）（その内容全体をここに引用によって加える）に記
載されている。表面をタンパク質で被覆し、そして米国
特許第4,210,418号に記載されている方法に従い、カッ
プリング剤として、例えば、グルタルアルデヒドを使用
して、抗体または抗原と結合することができる。なお他
の方法において、ウェルは遊離のイソシアネート基を有
する層、例えば、ポリエーテルイソシアネートで被覆
し、そして水溶液中の抗体または抗原をそれに適用して
必要な結合を実施する。なお他の方法において、抗体ま
たは抗原をヒドロキシル化に米国特許第3,720,760号に
記載されているようにシアン化臭素によりカップリング
することができる。

不溶性支持体は、好ましくは、「遮断（block）」し
て非特異的結合を減少する。適当な遮断剤の選択は、不
溶性支持体のタイプにより決定する。例えば、ポリスチ
レンの支持体について、適当な遮断剤は水溶性非免疫動
物のタンパク質を包含する。適当な水溶性非免疫動物の
タンパク質は、次のものを包含する：ウシ血清アルブミ
ン（BSA）、ヒト、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、およびウマ
の血清アルブミン；カゼインおよび非脂肪ミルク；オバ
ルブミン、糖タンパク質など。

同一の遮断剤は、また、ナイロンおよびニトロセルロ
ースの支持体を使用することができる。しかしながら、
ニトロセルロースまたはナイロンの支持体のための好ま
しい遮断剤は非脂肪ミルクまたはカゼインである。これ
らは膜の支持体のための最適な遮断剤は、１〜５重量％
の非脂肪乾燥ミルク、および非イオン性界面活性剤、例
えば、ポリオキシエチレンソルビタンの誘導体およびポ
リオキシエチレンエーテルを含有する水溶液である。

本発明の標識した抗（細胞フィブロネクチン）抗体、
抗（フィブロネクチン）抗体および抗（抗体）試薬は、
標識をタンパク質に取り付ける普通の方法により、好ま
しくは抗体結合部位を適当に保護して調製することがで
きる。標識はタンパク質の試薬に、化学的または物理学
的結合により結合またはカップリングすることができ
る。本発明の抗体へ結合することができる配位子および
基は、次のものを包含する：それらが結合する試薬を試
験すべき試料中の化合物および材料と区別することがで
きる、物理学的または化学的特性を有する、元素、化合
物または生物学的物質。

本発明の放射線標識した抗（フィブロネクチン）抗体
または抗（細胞フィブロネクチン）抗体は、生体外診断
の試験のために使用することができる。標識した抗体の
比活性は、放射性標識の半減期、アイソトープの純度お
よび標識を抗原または抗体中に組み込む方法に依存す
る。表Ａはいくつかの商業的に使用されているアイソト
ープ、それらの比活性および半減期を記載する。イムノ
アッセイ試験において、より高い比活性は、一般に、感
受性がよりすぐれる。

表Ａに記載する放射性アイソトープを使用する標識の
手順は、一般に、知られている。トリチウムの標識つけ
の手順は、例えば、米国特許第4,302,438号に記載され
ている。抗体のためにことに応用されるヨウ素化、トリ
チウムの標識つけおよび³⁵Sの標識つけの手順は、ゴウ
ディング（Goding）（supra、pp124−126）およびその
中に引用されている参考文献に記載されている。抗体を
ヨウ素化する他の手順は、次の参考文献に記載されてい
る：ハンター（Hunter）およびグリーンウッド（Greenw
ood）、ネイチャー（Nature）、144:945（1962）、デイ
ビッド（David）ら、バイオケミストリー（Biochemistr
y）13:1014−1021（1974）、および米国特許第3,867,51
7号および米国特許第4.376,110号。適当な系、カップリ
ングが手順およびそれらとの基質の反応の例は、例え
ば、次の参考文献に記載されている：米国特許再発行第
31,006号、米国特許第BI 3,654,090号、米国特許第4,2
14,048号、米国特許第4,302,048号、米国特許第4,302,4
38号、米国特許第4,312,943号、米国特許第4,376,110
号、およびその中の参考文献。他の適当な系の例は、ペ
セ（Pesce）ら、クリニカル・ケミストリー（Clin.Che
m.）20:353−359（1974）およびウィスダム（Wisdom）
G.クリニカル・ケミストリー（Clin.Chem.）22:1243（1
976）に記載されている。

標識つけに記載することができる適当な酵素のクラス
のリスト、および各クラスについて特定の例は次のとお
りである：適当な酵素のリストは、ハウム（Hawk）ら、実際の生
理学的化学（PRACTICAL PHYSIOLOGIACAL CHEMISTR
Y）、ニューヨーク:McGraw−Hill pp306−397（1954）
に記載されている。

蛍光発生および発色の酵素（蛍光性または発色性生成
物を生成する選択した基質の存在下の酵素）は、有用な
標識つけ部分である。抗体の抗原と結合する能力を損傷
しないで抗体に酵素を選択的に接合し、そして酵素をタ
ンパク質の試薬に接合する方法は、この分野においてよ
く知られている。

適当な酵素およびそれらを抗体にカップリングする手
順は、例えば、次の参考文献に記載されている：イチロ
ー・チバタ（Ichiro Chibata）、固定化酵素（IMMOBIL
IZED ENZYMES（supra）;A.クアトレカサス（Cuatoreca
sas）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（J.Biol.Chem.）、（supra）；ウィルソン（Wilso
n）ら、免疫蛍光および関連する着色技術における国際
会議（INTERNATIONAL CONFERENCE IN IMMUNOFLUORES
CENCE AND RELATED STAINING TECHNIQUES）、W.ナ
ック（Knaqq）ら編、アムステルダム:Elsevier pp215
−244（1978）；スリビアン（Sullivan）、M.ら、Annal
s of Clinical Biochemstry、16:221−240（197
9）；ニグレン（Nygren）、H.ら、Medical Bilogy、5
7:187−191（1979）；ガドカリ（Gadkari）、D.ら、Jou
rnal of Virological Methods、10:215−224（198
5）；チジセン（Tijssen）、P.ら、アナリティカル・バ
イオケミストリー（Analyt.Biochem.）、136:451−457
（1984）；ツルタ（Tsuruta）ら、The Journal of H
istochemical and Cytochemistry、33:767−777（198
5）；イシカワ（ishikawa）、E.、Journal of Immuno
assay、4:209−327（1983）；および米国特許第4,190,4
96号（上の参考文献の内容全体をここに引用によって加
える）。

好ましい酵素およびそれらに対応する適当な基質は、
ホースラデッシュペルオキシダーゼを包含し、そのため
に適当な基質はｏ−フェニレンジアミン、ｍ−フェニレ
ンジアミン、ｏ−ジアニシジン、および４−クロロ−α
−ナフトールである。それらは、また、β−ガラクトシ
ダーゼを包含し、そのために適当な基質は、例えば、４
−メチルウベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド、ｐ−
ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトース、ｐ−ニトロフ
ェノール、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトー
ス、およびｏ−トノロフェノールである。それらはアル
カリ性ホスファターゼを包含し、それらのために適当な
基質は、例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、イ
ンドキシルホスフェート、および５−ブロモ−３−クロ
ロインドキシルホスフェートである。

抗体を標識する酵素について適当な手順の例は、カー
ボジイミド、ジアルデヒド、およびグルタルアルデヒド
の二官能性カップリング基を包含する。アミン基を経る
酵素の連結は、タンパク質を塩化チオニル、Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドおよび同様な試薬で無水溶媒、ジメ
チルホルムアミド、ジオキサン、ジメチルスルホキシ
ド、テトラヒドロフランなど中で処理することによって
達成することができる。別のカップリング剤は、カーボ
ジイミド、例えば、１−エチル−３−（３−（N,N′−
ジメチルアミノ）プロピル）−カーボジイミド、１−シ
クロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カーボジ
イミドメチル−ｐ−トルエンスルホネート、スクシミジ
ル４−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネートを包含
する。

酵素の炭水化物部分は、また、アルデヒドに酸化し、
そして免疫グロブリンのリシルアミノ基と反応させてシ
ッフ塩基を形成することができる。ホウ水素化ナトリウ
ムを使用する還元は、酵素および抗体の安定な連結を行
う。ホースラデッシュペルオキシダーゼと抗体は、免疫
グロブリンヘウイルソン（Wilson）（supra］の方法に
より効果的に連結することができる。

蛍光団および発色団標識抗体は、この分野において知
られている標準の方法により調製することができる。抗
体および他のタンパク質は約310nmまでの波長を有する
光を吸収するので、蛍光部分は310nm以上、好ましくは4
00nm以上の波長において実質的な吸収を有するように選
択すべきである。種々の適当な蛍光体および発色団は、
ストリアー（Stryer）、サイエンス（Science）、162:5
62（1968）およびブランド（Brand）L.ら、Annual Rev
iew of Biochemistry、41:843−868（1972）に記載さ
れている。抗体は蛍光発色団で普通の方法、例えば、米
国特許第3,940,475号、米国特許第4,289,747号および米
国特許第4,376,110号に開示されている方法により標識
することができる。

上に記載するある数の所望の性質を有する蛍光体の１
つの群は、次のとおりである：キサンテン色素、これは
3,6−ジヒドロキシ−９−フェニルキサントヒドロール
およびレサミンから誘導されたフルオレセインおよび3,
6−ジアミノ−９−フェニルキサントヒドロールおよび
リサミンローダミンＢから誘導されたローダミン。９−
ｏ−カルボキシフェニルキサントヒドロールのローダミ
ンおよびフルオレセイン誘導体は、９−ｏ−カルボキシ
フェニル基を有する。反応性カップリング基、例えば、
アミノおよびイソシアネート基を有するフルオレセイン
化合物、例えば、フルオレセインイソチアシアネートお
よびフルオレスカミンは容易に入手可能である。フルオ
レセイン化合物の他の群は、αまたはβ位置にアミノ基
を有する。

抗体はフルオロクロームまたは発色団でゴウディング
（Goding）、J.（supra、っ208−249）に記載されてい
る手順により標識することができる。

本発明の方法において使用する抗体は、本発明の１つ
の実施態様においてアビジンまたはビオチンに共有結合
することができる。適当な結合手順は、二官能性架橋剤
による架橋を包含する。適当な二官能性化合物は、ペー
タース（Perters）K.ら、Ann.Rev.Biochem.46:523（197
7）に記載されている。

他の場合において、結合は試薬それら自体の間で直接
形成することができる。例えば、抗体はアビジンにそれ
ぞれの物質上の官能基により結合することができる。特
定の例として、アビジンは過ヨウ素酸で処理し、そして
抗体と反応させて、ビオチン対アビジンの結合を阻害せ
ずに、あるいは抗体の免疫学的活性を遮断しないで、シ
ッフ塩基を形成することができる。

二官能性架橋剤を使用する既知の技術は、次のものを
包含する：（あ）１工程のグルタルアルデヒドの連結、
アブラメアス（Avrameas）、S.Immunochemistry、6:43
（1969）；（ｂ）２工程のグルタルアルデヒド連結、ア
ブラメアス（Avrameas）、S.Immunochemistry、8:1175
（1971）；およびジマレイミド連結、カトー（Kato）K.
ら、Euro.J.Biochm.62:285（1966）。

抗体は、金属のラジオヌクレオチドで、次の参考文献
に記載されている方法に従って標識することができる：
ハナトウィッチ（Hanatowich）D.ら、Journal of App
lied Radiation、35:554−557（1984）およびバクレイ
（Buckley）R.ら、Federation of European Biochem
ical Societies、166:202−204（Jan.1984）。

本発明のイムノアッセイの１つの実施態様は、不溶性
支持体として、抗（細胞フィブロネクチン）抗体または
抗（フィブロネクチン）抗体が、直接にあるいはヤギ抗
マウス抗体により付着したポリスチレンを使用する。そ
れを水性β−ガラクトシダーゼ、例えば、リン酸塩緩衝
液（PBS）、pH6〜８、好ましくは7.2〜7.6で希釈した試
料と、試料中の細胞フィブロネクチンを不溶性支持体上
の抗体と十分時間接触させ、次いで試料を支持体から除
去する。インキュベーション時間は、実質的な結合を起
こさせるために十分であるべきであり、時間は温度に依
存する。適当なインキュベーション時間は、16〜40℃の
範囲の温度において約30〜240時間であり、好ましい接
触加熱は20〜26℃の範囲の温度において少なくとも60分
である。次いで、残留する試料溶液は支持体からすすぎ
溶液の使用により除去する。普通のすすぎ溶液を使用す
ることができる。適当なすすぎ溶液は米国特許第4,528,
267号に記載されている。それは、0.0001〜0.05のリン
酸塩のモル濃度、６〜８のpHを有し、そして0.001〜0.1
重量％の非イオン性界面活性剤を含有する水性リン酸塩
緩衝液である。適当な非イオン性界面活性剤は、次のも
のを包含する：ポリオキシエチレンエーテル（BRIJ、例
えば、ラウリル、セチル、オレイル、ステアリル、およ
びトリデシルポリオキシエチレンエーテル）；ポリオキ
シエチレンソルビタン（TEEN、例えば、ポリオキシエチ
レンソルビタルモノラウレート、モノパルミテート、モ
ノステアレート、モノオレート、およびトリオレエー
ト）；および他のポリオキシエチレンエーテル（例え
ば、TRITON）。

次いで、不溶性支持体をその上の補足された細胞フィ
ブロネクチンと結合する第２抗体、サンドイッチ抗体、
と接触させる。標識しないサンドイッチ抗体を使用する
場合、サンドイッチ抗体と結合すしかつ物理学的検出標
識を有する第３抗体を、普通の方法で使用してサンドイ
ッチ抗体を決定することができる。

種々の標識を上に記載した。明瞭のためかつ限定を意
図しないで、この方法の引き続く工程を、酵素、好まし
くは発色酵素または蛍光発生酵素で標識した、抗（細胞
フィブロネクチン）抗体ついて説明する。用語「発色酵
素（chromogenicenzyme）」は、ここにおいて、適当な
基質と発色体生成物を生成する酵素を意味する。用語
「蛍光発生（fluorogenic）酵素」は、ここにおいて、
適当な基質と蛍光体生成物を生成する酵素を意味する。

サンドイッチ抗体は水溶液で不溶性支持体に適用す
る。この溶液は、好ましくは、反応成分を保存しかつ結
合反応を促進するための適当な塩類または緩衝剤を含有
する。例えば、この溶液はウシ血清アルブミン（BS
A）、リン酸塩緩衝液（PBS）、および温和な界面活性
剤、例えば、前述のすすぎ溶液中で使用するポリオキシ
エチレンソルビタンを含有することができる。インキュ
ベーションは十分時間続けて、必要に応じて不溶性支持
体へ付着している、露出した細胞フィブロネクチンのエ
ピトープとサンドイッチ抗体が結合できるようにする。

次いで、サンドイッチ抗体の溶液を不溶性支持体から
除去し、そして支持体をすすぎ溶液、例えば、前述のも
の、ですすいで残留する結合しない標識した物質を除去
する。

サンドイッチ抗体が標識されていない場合、サンドイ
ッチ抗体に選択的に結合する、酵素標識抗体または他の
結合剤を、水溶液中において不溶性支持体に適用する。
この溶液は、好ましくは、反応成分を保存しかつ結合反
応を促進するための適当な塩類または緩衝剤を含有す
る。例えば、この溶液はウシ血清アルブミン（BSA）、
リン酸塩緩衝液（PBS）、および温和な界面活性剤、例
えば、前述のすすぎ溶液中で使用するポリオキシエチレ
ンソルビタンを含有することができる。インキュベーシ
ョンは十分時間続けて、必要に応じて不溶性支持体へ付
着している、露出した細胞フィブロネクチンのエピトー
プとサンドイッチ抗体が結合できるようにする。

本発明のサンドイッチ法の次の工程において、不溶性
支持体を基質の水溶液と接触させ、前記基質は酵素の存
在下に反応して溶液中に蛍光性化合物または発色性化合
物を放出する。転化することができる適当な基質および
酵素は、例えば、米国特許第4,190,496号および米国特
許第4,528,267号に記載されている。支持体は10^-2〜10
^-10モル濃度の基質を含有するする水溶液と接触させ
る。10^-4〜10^-6の基質のモル濃度は好ましい。基質溶液
中の好ましい追加の試薬および緩衝剤は、２−アミノ−
２−メチル−１−プロパノール緩衝剤、トリス、および
塩化マグネシウムを包含する。

基質溶液は不溶性支持体を十分な時間インキュベーシ
ョンして、蛍光体または発色体を生ずる反応を起こさせ
る。18〜40℃の温度において、５〜240時間のインキュ
ベーション時間を使用することができる。好ましくは、
温度は20〜26℃の範囲内であり、そしてインキュベーシ
ョン時間は30〜120分である。

次いで、溶液中の蛍光体または発色体のレベルを測定
する。基質溶液中の蛍光体または発色体のレベルを決定
するための装置および方法は、この分野において普通に
使用されているものである。溶液中の蛍光体または発色
体のレベルは、不溶性支持体上の酵素の濃度の関数であ
り、そして酵素の濃度は試料中の細胞フィブロネクチン
の量の関数である。細胞フィブロネクチンの濃度は、溶
液の蛍光体または発色体のレベルを、既知濃度の蛍光体
を含有する対照溶液を使用して得られた蛍光体または発
色体のレベルと比較することによって決定することがで
きる。

本発明のイムノアッセイ法の膜の実施態様において、
抗（フィブロネクチン）抗体が付着している不溶性支持
体を、水性緩衝液、例えば、リン酸塩緩衝液（PBS）、p
H6〜８、好ましくは7.2〜7.6で希釈した血液、血清また
は血漿の試料と十分な時間接触させて、試料中の細胞フ
ィブロネクチンを不溶性支持体上の抗（フィブロネクチ
ン）抗体と結合させる。結合のために要求される時間
は、貫流系において非常にわずかである。適当なインキ
ュベーション時間は、16〜40℃の範囲内の温度において
20分までであり、好ましい接触時間は１分より短く、最
適には10秒〜２分である。

次いで、不溶性支持体は、サンドイッチ抗体である抗
（細胞フィブロネクチン）抗体と接触させる。サンドイ
ッチ抗体は、標識または非標識であることができる。非
標識抗体を使用する場合、サンドイッチ抗体と結合しか
つ物理学的検出標識を有する第２抗体を普通の方法で使
用して、サンドイッチ抗体を決定することができる。

種々の標識を上に記載した。明瞭の目的でかつ限定を
意図しないで、この方法の引き続く工程を、酵素、好ま
しくは発色体酵素で標識した、抗（細胞フィブロネクチ
ン）抗体について説明する。

サンドイッチ抗体を水溶液中で不溶性支持体に適用す
る。この溶液は、好ましくは、反応成分を保存しかつ結
合反応を促進するために適当な塩類および緩衝剤を含有
する。例えば、この溶液はウシ血清アルブミン（BS
A）、リン酸塩緩衝液（PBS）、および温和な界面活性
剤、例えば、前述のすすぎ溶液中で使用するポリオキシ
エチレンソルビタンを含有することができる。インキュ
ベーションは十分な時間続けて、必要に応じて不溶性支
持体へ付着している、露出した細胞フィブロネクチンの
エピトープとサンドイッチ抗体が結合できるようにす
る。

次いで、サンドイッチ抗体の溶液を必要に応じて不溶
性支持体から除去し、そして支持体をすすぎ溶液、例え
ば、前述のもの、ですすいで残留する結合しない標識し
た物質を除去する。

サンドイッチ抗体が標識されていない場合、サンドイ
ッチ抗体に選択的に結合する、酵素標識抗体または他の
結合剤を、水溶液中において不溶性支持体に適用する。
この溶液は、好ましくは、反応成分を保存しかつ結合反
応を促進するための適当な塩類または緩衝剤を含有す
る。例えば、この溶液はウシ血清アルブミン（BSA）、
リン酸塩緩衝液（PBS）、および温和な界面活性剤、例
えば、前述のすすぎ溶液中で使用するポリオキシエチレ
ンソルビタンを含有することができる。インキュベーシ
ョンは十分な時間続けて、必要に応じて不溶性支持体へ
付着している、露出した細胞フィブロネクチンのエピト
ープと標識した抗（細胞フィブロネクチン）抗体が結合
できるようにする。好ましいインキュベーションの時間
および温度は、不溶性化した試薬の抗（細胞フィブロネ
クチン）抗体を細胞内フィブロネクチン抗原（またはそ
の複合体）との結合について記載したようなものであ
る。

次いで、標識抗体の溶液を不溶性支持体から除去し、
そして支持体をすすぎ溶液、例えば、前述のもの、です
すいで残留する結合しない標識した物質を除去する。

本発明のサンドイッチ法の次の工程において、不溶性
支持体を基質の水溶液と接触させ、前記基質は酵素の存
在下に反応して溶液中に発色性化合物を放出する。転化
することができる適当な基質および酵素は、例えば、米
国特許第4,190,496号および米国特許第4,528,267号に記
載されている。支持体は10^-2〜10^-10モル濃度の基質を
含有するする水溶液と接触させる。10^-4〜10^-6の基質の
モル濃度は好ましい。基質溶液中の好ましい追加の試薬
および緩衝剤は、２−アミノ−２−メチル−１−プロパ
ノール緩衝剤、トリス、および塩化マグネシウムを包含
する。

基質溶液は不溶性支持体を十分な時間インキュベーシ
ョンして、蛍光体または発色体を生ずる反応を起こさせ
る。18〜40℃の温度において、１〜20分を使用すること
ができる。好ましくは、温度は20〜26℃の範囲内であ
り、そしてインキュベーション時間は２〜５分である。
膜上の発色体のレベルは反射計またはデンシトメーター
を使用して測定することができる。

本発明のキットは、サンプリング装置、サンプリング
装置とともに輸送および貯蔵のための緩衝液の組み合わ
せ；本発明の試薬を付着させてを有する支持体；本発明
の試薬のバイアル、はくのパッケージまたは他の容器；
およびそれらの組み合わせからなる。はくのパッケージ
中の不溶性支持構造体の各々はバイアルまたは他のパッ
ケージ中の他の試薬を組み合わせることができる。それ
らは、また、別のバイアルまたは他のパッケージ中の他
の任意の試薬、例えば、停止試薬と組み合わせることが
できる。

本発明の試薬は、不溶性支持体に付着した抗（内皮細
胞マーカー）抗体、好ましくはここで抗（内皮細胞マー
カー）抗体は抗（細胞フィブロネクチン）抗体である；
および不溶性支持体に付着した内皮細胞マーカー、好ま
しくは内皮細胞マーカーは細胞フィブロネクチンであ
る；を包含する。

本発明の１つの試験キットは、不溶性支持体に付着し
た抗（内皮細胞マーカー）抗体および標識した抗（内皮
細胞マーカー）抗体を包含する。不溶性支持体へ付着し
た抗（内皮細胞マーカー）抗体および標識した抗（内皮
細胞マーカー）抗体は、好ましくは有意に交差反応性で
はない、抗（細胞フィブロネクチン）抗体である。

他の試験キットは、不溶性支持体へ付着した抗（細胞
フィブロネクチン）抗体および標識した抗（フィブロネ
クチン）抗体からなる。なお他のものは、不溶性支持体
へ付着した抗（フィブロネクチン）抗体および標識した
抗（細胞フィブロネクチン）抗体からなる。なお他の試
験キットは、不溶性支持体へ付着した抗（内皮細胞マー
カー）抗体および標識した内皮細胞マーカーからなり、
ここで抗（内皮細胞マーカー）抗体は抗（細胞フィブロ
ネクチン）抗体であることができ、そして標識した内皮
細胞マーカーは標識した細胞フィブロネクチンであるこ
とができる。なおさらに他の試験キットは、不溶性支持
体に付着した内皮細胞マーカーおさらに標識した抗（内
皮細胞マーカー）抗体からなり、ここで内皮細胞マーカ
ーは細胞フィブロネクチンであり、そして標識した抗
（内皮細胞マーカー）抗体は標識した抗（細胞フィブロ
ネクチン）抗体であることができる。

本発明は、さらに、次の非限定的実施例により例示す
る。特記しない限り、温度はセ氏で記載し、そしてパー
セントは重量による。構成的にここにおける実施に変形
した実施例は現在時制で記載し、そして前以て実施に変
形した実験室の実験を表す実施例は過去の時制で記載さ
れている。

実施例１ポリクローナル抗（細胞フィブロネクチン）抗体細胞フィブロネクチンはヒト内皮細胞から精製する
（EngvallおけるRouslanti、Int.J.Cancer、20:1−５
（1977）。

抗（細胞フィブロネクチン）抗体をウサギにおいて、
文献（例えば、Stollar、Methods of Engymology、7
0:70（1980））に記載されている免疫化技術およびスケ
ジュールを使用し、細胞フィブロネクチン抗原でウサギ
を免疫化して引き出す。抗血清はモノクローナル抗体に
ついて使用されたものに類似する固相アッセイにおいて
スクリーニングする（例えば、Lngeら、Clin.Exp.Immun
ol.25:191（1976）およびPsetkyら、J.Immun.Methods.4
1:187（1981））。

抗血清のIgG分画を、細胞フィブロネクチンをカップ
リングしたCNBr−セファローズ（Sepharose）4B（Pharm
acia Fine Chemicals）を使用する親和クロマトグラ
フィーにより、さらに精製する。カップリングのために
使用する方法は、ゲルの製造業（者、アフィニティー・
クロマトグラフィー（AFINITY CHROMATOGRAPY）、Phar
macia Fine Chemicals、pp15−18）により推奨される
ものである。

このカラムを２〜３体積の緩衝液（0.01モルのPBS、p
H7.2）と平衡化し、次いで抗（細胞フィブロネクチン）
抗体含有溶液をカラムに適用する。溶離液の吸収性を、
カラムをタンパク質がもはや通過しなくなるまで、280n
mにおいて監視する。次いで、カラムを0.1モルのグリシ
ン緩衝液、pH2.5で洗浄して、免疫親和結合した抗（細
胞フィブロネクチン）抗体を脱着する。ピークの分画を
集め、プールし、そして多数回緩衝液を交換して、0.01
モルのPBS、pH7.2に対して24〜36時間４℃において透析
する。

高い純度を望む場合、親和精製したIgGを血漿フィブ
ロネクチン結合親和カラムを、前述の手順により、通過
させて、血漿フィブロネクチンと交差反応するであろう
抗体を除去した。

実施例２モノクローナル抗体抗（内皮細胞マーカー）抗体実施例の手順により得られた精製した内皮細胞フィブ
ロネクチンを使用して、ガルフレ（Galfre）およびミル
ステイン（Milstein）、メソッズ・イン・エンジモロジ
ー（Methods Enzymol.）、73:1（1981）およびマツラ
（Marsurra）、H.およびハコモリ（Hakomori）、S.ら
（supra）の標準の手順に従い、マウスの免疫化のため
に細胞フィブロネクチンを抗原として使用して、細胞フ
ィブロネクチンに対するマウスモノクローナル抗体を得
た。モノクローナル抗体は、文献、例えば、Lngeら、Cl
in.Exp.Immunol.25:191（1976）およびPsetkyら、J.Imm
un.Methods.41:187（1981）に記載されている技術の変
更を使用してスクリーニングする。

マウスモノクローナル抗体は、腹水またはハイブリド
ーマの培養上澄み液から、プロテイン−Ａ結合セファロ
ーズ−4B4B（Pharmacia Fine Chemicals）を使用し
て、チジソン（Tijsson）、酵素イムノアッセイの実施
および理論（PRACTICE AND THEORY OF ENZYME IMM
UNOASSYAS）、ElsevierScience Publisers、pp105−10
7（1985）の手順に従い精製する。

実施例３ポリクローナル抗体被覆マイクロタイタープレート実施例１に記載するように調製し、そしてさらに精製
して血漿フィブロネクチンの交差反応性を除去した、ウ
サギ抗（細胞フィブロネクチン）抗体を、0.05モルの炭
酸塩緩衝液、pH9.6中で10μg/mlに希釈する。100μを
イムロン（IMMULON）IIマイクロタイタープレート（Dyn
atech）のウェルの各々中に分散する。プレートをカバ
ーし、そして室温において４時間または４℃において一
夜インキュベーションする。プレートを洗浄緩衝液（0.
02モルのトリス−HCl、0.015モルのNaCl、0.05％のツイ
ーン−20）で４回洗浄し、ウェルを充填し、そして最終
使用でウェルを完全に空にする。次いで、プレートを各
ウェル中に200μの遮断溶液（0.01モルのPBS、１％の
BSA、0.02％のNaN₃、pH7.4）を分配し、そして室温にお
いて１時間インキュベーションする。次いで、ウェルを
４回前述の洗浄緩衝液で洗浄する。プレートはここで試
料のイムノアッセイのために準備されてる。

実施例４モノクローナル抗体被覆マイクロタイタープレートヤギＦ（ab′）_２抗マウスIgG抗体（Tago）を0.05モ
ルの炭酸塩緩衝液、pH9.6、中に10μg/mlに希釈する。1
00μをイムロン（IMMULON）IIマイクロタイタープレ
ート（Dynatech）のウェルの各々中に分散する。プレー
トをカバーし、そして室温において４時間または４℃に
おいて一夜インキュベーションする。プレートを実施例
４におけるように洗浄緩衝液で４回洗浄する。次いで、
プレートを実施例３に記載する遮断溶液を各ウェル中に
分配することによって遮断する。実施例２におけるよう
に調製したマウスモノクローナル抗細胞フィブロネクチ
ンを、0.01モルのPBS−１％のBSA、pH7.4で1/500に希釈
する。100μの溶液を遮断したマイクロタイタープレ
ートの各ウェル中に分配する。ウェルをインキュベーシ
ョンし、カバーし、室温において２時間または４℃にお
いて一夜インキュベーションする。次いで、プレートを
前述の洗浄緩衝液で４回洗浄し、次いで試料のイムノア
ッセイのために準備される。

実施例５酵素標識した抗（細胞フィブロネクチン）抗体実施例１または実施例２の手順に従って調製した抗
（細胞フィブロネクチン）抗体を、１工程のグルタルア
ルデヒドの方法に従いアルカリ性ホスファターゼと接合
する（Avrameas、Immunochemistry、6:43（1969））。

実施例６サンドイッチイムノアッセイ陽性および陰性の対照をこの試験において含める。陽
性の対照は、既知濃度の精製したヒト細胞フィブロネク
チンであり、アッセイの範囲内に入るように適切に希釈
する（モノクローナル基づくアッセイについて20ng/ml
〜５μg/ml）。陰性の対照は試料の希釈物である。アッ
セイの標準は既知フィブロネクチン濃度の精製したヒト
細胞フィブロネクチンであり、系統的に希釈して、20ng
〜10μg/mlの範囲の標準曲線を作成する。

試料の希釈物は、1988年９月15日提出の同時継続出願
第244,984号（その内容全体をここに引用によって加え
る）に記載されている、抗プロテアーゼカクテルであ
る。それはフィブロネクチン含有試料を輸送および貯蔵
の間タンパク質分解から保護する。この溶液は0.05モル
のトリス−HCl、pH7.4;0.15モルのNaCl、0.02％のNa
N₃、１％のBSA、500カリクレイン単位/mlのアプロチニ
ン、１ナノモルのフッ化フェニルメチルスルホニル（PM
SF）および５ミリモルのEDTAから成っていた。

血液試料を患者から採取し、そして処理して血漿また
は血漿の試料を生成する。

実施例３または４におけるように調製したマイクロタ
イタープレートをアッセイに使用する。100μの各標
準、試料、陽性および陰性の対照を別々のウェル中に入
れ、そして室温において２時間インキュベーションす
る。プレートを実施例３および４に記載する洗浄緩衝液
で４回洗浄する。100μの実施例５におけるように調
製したアルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗（細胞フィ
ブロネクチン）を、接合緩衝液（0.2モルのトリス−HC
l、pH8、0.3モルのNaCl、0.05％のツイーン20、５％のB
SA、0.02％のNaN₃）中で1/1000に希釈する。100μを
各ウェルに分配し、そして室温において２時間インキュ
ベーションする。プレートを４回前述のように洗浄す
る。4mg/mlのｐ−ニトロフェニルホスフェート（PNPP）
を基質として使用する。これを0.18モルのの２−アミノ
−２−メチル−１−プロパノール（AMP）緩衝液、pH9.5
および0.12ミリモルのMgCl₂中で希釈する。100μをマ
イクロタイタープレートの各ウェルに分配する。室温に
おいて５分インキュベーションした後、反応速度（ミリ
−OD/分）を405nmでＶ−MAX^R力学的プレート読取装置
（Molecular Devuce）により読む。

増加する反応速度を標準における増加する細胞フィブ
ロネクチン濃度と関係づけることによって、標準曲線を
構成した。未知のものは、この曲線から直接計算する
か、あるいはプリ−セットコンピュータープログラム
（Molecular Devuce）を使用して計算した。

本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。

１、工程：ａ）血液、血漿または血清の試料を妊娠した患者から取
り、そしてｂ）試料中の内皮細胞マーカーの存在について決定す
る、からなることを特徴とする、子かん前症、妊娠誘発高血
圧または子かんを決定する方法。

２、試料中で内皮細胞マーカーの存在は、ａ）試料を抗（内皮細胞マーカー）抗体と接触させ、そ
してｂ）抗体と内皮細胞マーカーとの結合を決定する、ことによって決定する、記第１項記載の方法。

３、工程：ａ）試料を第１抗（内皮細胞マーカー）抗体が付着した
不溶性支持体と十分な時間接触させて抗原−抗体結合を
起こさせ、ｂ）前記不溶性支持体を第２抗（内皮細胞マーカー）抗
体とを十分な時間接触させて抗原−抗体結合を起こさ
せ、そしてｃ）前記不溶性支持体上の第２抗（内皮細胞マーカー）
抗体の存在を決定する、からなる、上記第２項記載の方法。

４、第２抗（内皮細胞マーカー）抗体は物理学的検出標
識を有する、上記第３項記載の方法。

５、工程：ａ）試料および第２抗（内皮細胞マーカー）抗体の混合
物を第１抗（内皮細胞マーカー）抗体が付着した不溶性
支持体と十分な時間接触させて抗原−抗体結合を起こさ
せ、そしてｂ）前記不溶性支持体上の第２抗（内皮細胞マーカー）
抗体の存在を決定する、からなる、上記第２項記載の方法。

６、第２抗（内皮細胞マーカー）抗体は物理学的検出標
識を有する、上記第６項記載の方法。

７、抗（内皮細胞マーカー）抗体は抗（細胞フィブロネ
クチン）抗体である、上記第１項記載の方法。

８、工程：ａ）試料を抗（細胞フィブロネクチン）抗体と十分な時
間接触させて、抗（細胞フィブロネクチン）抗体との抗
原−抗体結合を起こさせ、そしてｂ）前記結合の存在を決定する、からなる、上記第７項記載の方法。

９、工程：ａ）試料を抗（細胞フィブロネクチン）抗体が付着した
不溶性支持体と十分な時間接触させて抗原−抗体結合を
起こさせ、ｂ）前記不溶性支持体を抗（フィブロネクチン）抗体と
十分な時間付着させて抗原−抗体結合を起こさせ、そし
てｃ）前記不溶性支持体上の抗（フィブロネクチン）抗体
の存在を決定する、からなる、上記第８項記載の方法。

10、抗（フィブロネクチン）抗体は物理学的検出標識を
有する、上記第９項記載の方法。

11、抗（フィブロネクチン）抗体は抗（細胞フィブロネ
クチン）抗体である、上記第９項記載の方法。

12、前記不溶性支持体に付着した抗（細胞フィブロネク
チン）抗体は第１抗（細胞フィブロネクチン）抗体であ
り、そして抗（フィブロネクチン）抗体は第１抗（細胞
フィブロネクチン）抗体と有意に交差反応しない第２抗
（細胞フィブロネクチン）抗体である、上記第11項記載
の方法。

13、工程：ａ）試料および抗（フィブロネクチン）抗体の混合物を
抗（細胞フィブロネクチン）抗体が付着した不溶性支持
体と十分な時間接触させて抗原−抗体結合を起こさせ、
そしてｂ）前記不溶性支持体上の抗（フィブロネクチン）抗体
の存在を決定する、からなる、上記第８項記載の方法。

14、前記抗（フィブロネクチン）抗体は物理学的検出標
識を有する、上記第13項記載の方法。

15、前記抗（細胞フィブロネクチン）抗体は第１抗（細
胞フィブロネクチン）抗体であり、そして前記抗（フィ
ブロネクチン）抗体は有意に交差反応しない第２抗（細
胞フィブロネクチン）抗体である、上記第13項記載の方
法。

16、工程：ａ）試料を抗（フィブロネクチン）抗体が付着した不溶
性支持体と十分な時間接触させて抗原−抗体結合を起こ
させ、ｂ）前記不溶性支持体を抗（細胞フィブロネクチン）抗
体と十分な時間接触させて抗原−抗体結合を起こさせ、
そしてｃ）前記不溶性支持体上の抗（細胞フィブロネクチン）
抗体の存在を決定する、からなる、上記第７項記載の方法。

17、前記抗（細胞フィブロネクチン）抗体は物理学的検
出標識を有する、上記第16項記載の方法。

18、工程：ａ）試料および抗（細胞フィブロネクチン）抗体の混合
物を抗（フィブロネクチン）抗体が付着した不溶性支持
体と十分な時間接触させて抗原−抗体結合を起こさせ、
そしてｂ）前記不溶性支持体上の抗（細胞フィブロネクチン）
抗体の存在を決定する、からなる、上記第７項記載の方法。

19、前記抗（細胞フィブロネクチン）抗体は物理学的検
出標識を有する、上記第18項記載の方法。

20、工程：ａ）抗（内皮細胞マーカー）抗体が付着した不溶性支持
体を、試料および前記支持体に付着した抗（内皮細胞マ
ーカー）抗体のすべてと結合するために不十分である量
の標識した内皮細胞マーカーの混合物と接触させ、そし
てｂ）前記不溶性支持体に結合した標識した内皮細胞マー
カーの量または前記混合物中に残る標識した内皮細胞マ
ーカーの量を決定する、からなる、上記第２項記載の方法。

21、工程：ａ）抗（細胞フィブロネクチン）抗体が付着した不溶性
支持体を、試料および前記支持体に付着した抗（細胞フ
ィブロネクチン）抗体のすべてと結合するために不十分
である量の標識した細胞フィブロネクチンの混合物と接
触させ、そして（ｂ）前記不溶性支持体に結合した標識した細胞フィブ
ロネクチンの量または前記混合物中に残る標識した細胞
フィブロネクチンの量を決定する、からなる、上記第21項記載の方法。

22、工程：ａ）内皮細胞マーカーが付着した不溶性支持体を、試料
および前記支持体に付着した内皮細胞マーカーのすべて
と結合するために不十分である量の標識した抗（内皮細
胞マーカー）抗体の混合物と接触させ、そしてｂ）前記不溶性支持体に結合した標識した抗（内皮細胞
マーカー）抗体の量または前記混合物中に残る標識した
抗（内皮細胞マーカー）抗体の量を決定する、からなる、上記第２項記載の方法。

23、細胞フィブロネクチンが付着した不溶性支持体を、
試料および前記支持体に結合した細胞フィブロネクチン
のすべてと結合するために不十分である量の標識した抗
（細胞フィブロネクチン）抗体の混合物と接触させ、そ
してｂ）前記不溶性支持体に結合した標識した抗（細胞フィ
ブロネクチン）抗体の量または前記混合物中に残る標識
した抗（細胞フィブロネクチン）抗体の量を決定する、からなる、上記第22項記載の方法。

24、不溶性試薬支持体に付着した抗（内皮細胞マーカ
ー）抗体からなることを特徴とする、子かん前症、妊娠
誘発高血圧または子かんを決定するための試薬。

25、前記抗（内皮細胞マーカー）抗体は抗（細胞フィブ
ロネクチン）抗体である、上記第24項記載の試薬。

26、不溶性試薬支持体に付着した内皮細胞マーカーから
なることを特徴とする、子かん前症、妊娠誘発高血圧ま
たは子かんを決定するための試薬。

27、前記内皮細胞マーカーは細胞フィブロネクチンであ
る、上記第26項記載の試薬。

28、不溶性支持体に付着する抗（内皮細胞マーカー）抗
体および標識した抗（内皮細胞マーカー）抗体からなる
ことを特徴とする、子かん前症、妊娠誘発高血圧または
子かんを決定するための試験キット。

29、不溶性支持体に付着した抗（内皮細胞マーカー）抗
体および標識した抗（内皮細胞マーカー）抗体は、抗
（細胞フィブロネクチン）抗体である、上記第28項記載
の試験キット。

30、不溶性支持体に付着した抗（内皮細胞マーカー）抗
体および標識した抗（内皮細胞マーカー）抗体は、有意
に交差反応しない抗（細胞フィブロネクチン）抗体であ
る、上記第29項記載の試験キット。

31、不溶性支持体に付着した抗（細胞フィブロネクチ
ン）抗体および標識した抗（フィブロネクチン）抗体か
らなることを特徴とする、子かん前症、妊娠誘発高血圧
または子かんを決定するための試験キット。

32、不溶性支持体に付着した抗（フィブロネクチン）抗
体および標識した抗（細胞フィブロネクチン）抗体から
なることを特徴とする、子かん前症、妊娠誘発高血圧ま
たは子かんを決定するための試験キット。

33、不溶性支持体に付着した抗（内皮細胞マーカー）抗
体および標識した内皮細胞マーカーからなることを特徴
とする、子かん前症、妊娠誘発高血圧または子かんを決
定するための試験キット。

34、抗（内皮細胞マーカー）抗体は抗（細胞フィブロネ
クチン）抗体であり、そして標識した内皮細胞マーカー
は標識した細胞フィブロネクチンである、上記第33項記
載の試験キット。

35、不溶性支持体に付着した内皮細胞マーカーおよび標
識した抗（内皮細胞マーカー）抗体からなることを特徴
とする、子かん前症、妊娠誘発高血圧または子かんを決
定するための試験キット。

36、内皮細胞マーカーは細胞フィブロネクチンであり、
そして標識した抗（内皮細胞マーカー）抗体は標識した
抗（細胞フィブロネクチン）抗体である、上記第35項記
載の試験キット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭60−91264（ＪＰ，Ａ) ＩＮＴ．Ｊ．ＧＹＮＡＥＣＯＬ．ＯＢＳＴＥＴ．，ＶＯＬ．25，ＮＯ．５, （1987），Ｐ．441−444 ＡＭ．Ｊ．ＯＢＳＴＥＴ．ＧＹＮＥＣＯＬ．，ＶＯＬ．150，ＮＯ．７, （1984），Ｐ．885−887 ＡＭ．Ｊ．ＯＢＳＴＥＴ．ＧＹＮＥＣＯＬ．，ＶＯＬ．157，ＮＯ．２, （1987），Ｐ．331−336 ＯＢＳＴＥＴ．ＧＹＮＥＣＯＬ．，ＶＯＬ．71，ＮＯ．５，（1988），Ｐ. 719−722 ＡＣＴＡ．ＯＢＳＴＥＴ．ＧＹＮＥＣＯＬ．ＳＣＡＮＤ．，ＶＯＬ．66，ＮＯ．１，（1987），Ｐ．25−28 ＡＭ．Ｊ．ＯＢＳＴＥＴ．ＧＹＮＥＣＯＬ．，ＶＯＬ．157，ＮＯ．１, （1987），Ｐ．106−108

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ）血液、血漿または血清試料を妊娠し
た患者から採取し、そしてｂ）該試料中の細胞フイブロネクチンの存在を検出す
る、ことを特徴とする、子かん前症、妊娠誘発高血圧または
子かんの検出方法。
【請求項２】試料中の細胞フイブロネクチンの存在を、ａ）試料を抗−細胞フイブロネクチン抗体と接触さ
せ、そしてｂ）該抗体と細胞フイブロネクチンとの結合を検出す
る、ことによって検出する、特許請求の範囲第１項記載の方
法。
【請求項３】ａ）試料を抗−細胞フィブロネクチン抗
体が付着した不溶性支持体と、抗原−抗体結合を起こさ
せるのに十分な時間接触させ、ｂ）該不溶性支持体を抗−フィブロネクチン抗体と、
抗原−抗体結合を起こさせるのに十分な時間接触させ、
そしてｃ）該不溶性支持体上の抗−フィブロネクチン抗体の
存在を検出する、工程からなる特許請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項４】ａ）試料を抗−フィブロネクチン抗体が
付着した不溶性支持体と、抗原−抗体結合を起こさせる
のに十分な時間接触させ、ｂ）該不溶性支持体を抗−細胞フィブロネクチン抗体
と、抗原−抗体結合を起こさせるのに十分な時間接触さ
せ、そしてｃ）該不溶性支持体上の抗−細胞フィブロネクチン抗
体の存在を検出する、工程からなる特許請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項５】ａ）細胞フィブロネクチンが付着した不
溶性支持体を、試料および該支持体に結合した細胞フィ
ブロネクチンのすべてと結合するのには不十分である量
の標識した抗−細胞フィブロネクチン抗体の混合物と接
触させ、そしてｂ）該混合物中に残存する標識した抗−細胞フィブロ
ネクチン抗体の量を検出する、ことからなる特許請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項６】不溶性試薬支持体に付着した抗−細胞フイ
ブロネクチン抗体または細胞フイブロネクチンからなる
ことを特徴とする、子かん前症、妊娠誘発高血圧または
子かんの検出試薬。
【請求項７】不溶性支持体に付着した第１の抗体および
標識した第２の抗体からなり、該第１および第２の抗体
のうちの一方が抗−細胞フイブロネクチン抗体であり、
そして他方の抗体が抗−フイブロネクチン抗体である、
子かん前症、妊娠誘発高血圧または子かんの検出のため
の試験キツト。
【請求項８】不溶性支持体に付着した細胞フイブロネク
チンおよび標識した抗−細胞フィブロネクチン抗体から
なる、子かん前症、妊娠誘発高血圧または子かんの検出
のための試験キツト。