JPH04252196A - 心筋梗塞免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【共出願との関係】この出願は、１９８７年７月２１日
出願の出願連続番号７６，０３８の部分的な継続である
ところの、１９８９年１月２３日出願の出願連続番号２
９９，２７７の部分的な継続であるところの、１９９０
年１月１９日出願の共出願連続番号０７／４６７，８３
７の部分的な継続である。

【０００２】

【発明の分野】本発明は、内因性変換因子により作用し
そして急性症の出来事の攻撃時に体液中に放出されると
ころの、生物学的標識の免疫学的診断測定に関する。よ
り詳細には、本発明は、２種以上の生物学的標識（これ
は、該急性の出来事が起きてからの時間の長さの診断お
よび見積りに関係しているか否かに拘らず）の比率に関
する免疫学的測定および計算に関する。

【０００３】もう１つの具体例において、本発明はまた
、心筋梗塞の改良された免疫学的診断方法に関する。

【０００４】

【発明の背景】急性症の診断は、特に病気の急性段階中
に濃度が急激に変化する場合、しばしば、病気の標識、
例えば血清の如き生物学的流体の酵素およびホルモンの
、異常なレベルを基としている。例えば、酵素クレアチ
ンキナーゼ（ＣＫ、ＡＴＰ：クレアチンＮ−ホスホトラ
ンスフェラーゼ）は、ＡＴＰからクレアチンへのホスフ
ェート基の可逆的移動を触媒している。これは、通常、
Ｍ−サブユニットおよびＢ−サブユニットとして同定さ
れる２つのサブユニットから成る二量体として存在して
いる。ＣＫ−ＭＢは、急性心筋梗塞と関連しており、そ
して上記出来事がない場合、痕跡濃度でのみ血清中に存
在している。血清中でのＣＫ−ＭＢイソエンチームの発
現は、従って、心筋梗塞の発病を示すものである。正常
な患者の血清中には、ＣＫ−ＭＭイソ型は測定し得る量
でのみ存在しているが、急性心筋梗塞後は、有意に増大
した濃度で存在している。ＣＫイソエンチームを測定す
ることによる急性心筋梗塞の発病を決定するための分析
法は知られている。

【０００５】酵素およびホルモンの如き蛋白質の生物学
的活性および物性は、その分子の構造的性質によって決
定される。これらの性質は、しばしば、体液中に存在し
ている内因性交換因子によって修飾される。上記変換は
、生物学的活性の損失、或は該分子の電気泳動的流動性
の如き物性の変化を生じさせるか、或は生じさせなくて
もよい。この変換生産物は、急性症の攻撃の直後には元
の分子と共存していてもよいが、時間が経過するにつれ
て、変換された蛋白質のみが体液中に見いだされるよう
になる。

【０００６】体液中の蛋白質標識を免疫学的に測定する
数多くの試験が開発された。上記免疫測定法は、しばし
ば、分析物の未変性形態と、この分析物の変化した形態
との区別に関しては、選択性を示さない。例えば、ＣＫ
−ＭＭの未変性および変化した形態の両方は、抗（ＣＫ
−ＭＭ）抗体を用いて免疫学的に測定される。生物定量
技術は、従来から、酵素活性を測定するために用いられ
てきた。酵素標識の変化した形態が不活性である場合、
酵素活性の測定は、この系中の活性酵素のレベルに関し
て、生じる変化の適当な測定値を与える。免疫測定法は
、より便利な方法を与えはするが、測定すべき部分と選
択的に結合する抗体を有しているか否かに依存している
。変化した蛋白質生成物が未変性の標識蛋白質と若干の
み異なる場合、抗体を用いることでは、未変性形態と変
化した形態とを区別することはできなく、この抗体は、
両方の部分と反応して、誤差のある結果を与える。 免疫測定法に関する努力は、一般に、未変性の蛋白質標
識とそしてその変化した形態と、一緒に、特異的に結合
する抗体の開発（一般に、誘導された形態のみと結合す
る抗体は避けられている）に向けられていた。

【０００７】

【従来技術の説明】急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の攻撃を受
けたとき、ＣＫの数種のイソエンチームを含む病気標識
が、損傷を受けた心筋組織から放出され、そして循環血
液に入る。ＣＫ−ＭＢおよびＣＫ−ＭＭの量は、ＡＭＩ
の攻撃を受けた後循環中で増大することは知られている
。いくつかの例外はあるが、ＣＫ−ＭＭおよびＣＫ−Ｍ
Ｂのレベルは、ＡＭＩの攻撃後、３〜６時間以内に異常
になる。ＡＭＩにより放出される他の標識は、ミオグロ
ビン、ミオシン、乳酸脱水素酵素、シトレートシンテタ
ーゼおよびミオシン軽鎖である。これらの後者の標識は
、ＣＫ−ＭＢ測定よりも優れたいくつかの長所を有して
いる、何故ならば、血栓崩壊剤処理を行っていない場合
には胸の痛みを受けた後１８〜２４時間経つまで、ＣＫ
−ＭＢが最大値に達しないからである。

【０００８】ＣＫ−ＭＭＡ、即ち心筋層組織の如き組織
中に存在するＣＫ−ＭＭのイソ型は、２つのＭ鎖（各々
末端リジン基を有する）のホモ二量体である（Ｊａｆｆ
ｅ他、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　７４（１）：１０５−
１０９　（１９８６）。ＣＫ−ＭＭＡが血漿中に放出さ
れた後、１つの鎖からの末端リジン基は、変換因子（こ
れはまだ同定されていない）によって急速に除去されて
、ＣＫ−ＭＭＢ、即ち１つの鎖上に末端リジン基を有す
るイソ型を生じさせる。もう１つの末端リジン基の引き
続く開裂により、第三イソ型、ＣＫ−ＭＭＣ、即ち主要
最終形態を生じさせる。

【０００９】ＣＫ−ＭＭの種々のイソ型を表すためにい
くつかの矛盾した命名法が用いられてきており、そして
本特許で用いる命名法はＪａｆｆｅ他（上記）が示唆し
た命名法である。クレアチンキナーゼイソエンチームＣ
Ｋ−ＭＭは、少なくとも３種の酵素活性を示すイソ型（
ＣＫ−ＭＭＡ、ＣＫ−ＭＭＢおよびＣＫ−ＭＭＣ）に分
けられる。ＣＫ−ＭＢは、更に、Ｗｅａｖｅｒ他、Ｃｌ
ｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　Ａｃｔａ．　７５：３７７　（１
９７７）；Ｃｈａｐｅｌｌｅ他、　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅ
ｍ．　２６：４５７−４６２　（１９８０）；Ｙａｓｍ
ｉｎｅｈ他、　Ｊ．　Ｌａｂ．　Ｃｌｉｎ．　Ｍｅｄ．
　９８：１０９−１１８　（１９８１）；Ｆａｌｔｅｒ
他，　Ｃｌｉｎ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１４：３−７　
（１９８１）：Ｇｅｏｒｇｅ他、　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　
Ｃｈｅｍ．　２５９：２６６７−２６７４　（１９８４
）；およびＰａｎｔｅｇｈｉｎｉ他、　Ｃｌｉｎ．　Ｃ
ｈｅｍ．　Ａｃｔａ．　１５５：１−１０　（１９８６
）によって報告されている電気泳動による２つの酵素活
性を示すイソ型（ＣＫ−ＭＢＡおよびＣＫ−ＭＢＢ）に
分けられる。心筋梗塞後の時間当たりのＣＫ−ＭＭイソ
型の血清濃度が、Ｍｏｒｅｌｌｉ他、　Ｃｉｒｃｕｌａ
ｔｉｏｎ　６７（６）：１２８３−１２８９　（１９８
３）；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ他、　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏ
ｎ　７１（２）：３６３−３６９　（１９８５）；Ｊａ
ｆｆｅ他、　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　７４（１）：１
０５−１０９　（１９８６）；およびＷｕ他、　Ｃｌｉ
ｎ．　Ｃｈｅｍ．　３３（３）：３５８−３６２　（１
９８７）によって研究され、そしてこれらの著者の数人
は、急性心筋梗塞に苦しんでいない患者の血清中にＣＫ
−ＭＭイソ型が存在してはいるが、ＣＫ−ＭＭのサブ型
の分析は急性心筋梗塞の初期の診断において有益である
ことを示唆している。

【００１０】米国特許番号３，９３２，２２１には、イ
ソエンチーム−抗体複合体を用いた、体組織または体液
中のイソエンチームのレベルを測定するための免疫沈澱
操作の使用が記述されており、この方法のための適切な
目的物としてのクレアチンキナーゼを含む大部分の種類
の体の酵素を列挙している。この特許中には、ＣＫ−Ｍ
Ｍの変化した形態を区別することのできるＣＫ結合形態
は、全く記述されていない。米国特許番号４，１０５，
４９９には、心臓発作に関する迅速検定のため、ＣＫ−
ＭＢを血清からカラムクロマトグラフィーで分離するこ
とが記述されており、そして米国特許番号４，０４６，
６３４には、イオン交換クロマトグラフィーによるＣＫ
イソエンチームの分離が開示されている。米国特許番号
４，２６０，６７８には、ＣＫ−ＭＭまたはＣＫ−ＢＢ
に特異的な固定化抗体を用い、そしてこの固定化酵素の
活性を試験することから成る、血清中のクレアチンキナ
ーゼ酵素を測定するためのアフィニティーカラム操作が
記述されている。

【００１１】最近、ＣＫ−ＢＢもまた、損傷を受けた心
臓の筋肉から血液の流れの中にしみだすことも報告され
ている（Ｕｓｕｉ、　Ａｋｉｈｉｋｏ他、Ｊａｐａｎｅ
ｓｅ　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ、（１
９８９）　５３：９５ー１００）。他の人達（Ｖｉｌｌ
ａｒｒｅａｌ−Ｌｅｖｙ、　Ｇ他　（１９８７）　１４
４；１１１６ー１１２７）は、ヒトのＣＫ−ＢＢがＣ末
端リジン基を有していると報告している。血清中のＣＫ
−ＢＢの劣化に関してはいかなる報告もなされていない
。

【００１２】

【発明の要約】急性症の出来事が生じてからの時間的経
過を測定するための本発明の方法は、（ａ）第一および
第二分析物セット（各々のセットは、一過的に上昇した
物質、その内因的に変化した形態、およびそれらの組み
合わせから成る群から選択される少なくとも１つを含み
、ここで該第一および第二分析物セットは同じでない）
の血漿または血清濃度を免疫学的に測定し、そして（ｂ
）この第一および第二分析物セットの比率を測定するこ
とを含む。この分析物セットは、この分析物セットの濃
度を測定することで、一過的に上昇した物質、およびこ
の一過的に上昇した物質の内因的に変化した形態の濃度
が決定されるように選択される。従って、この第一およ
び第二分析物セットの比率は、その急性な出来事の発生
からの時間的経過に関する指示を提供する。

【００１３】この第一および第二分析物セットにより所
望の情報が得られるように経験的に予め決定された、関
係しているか或は無関係の、個々の物質を算定すること
ができる。好適な具体例において、ＭＩ−ＰＡ、即ち酵
素活性を有する心筋梗塞に関係した蛋白質、およびＭＩ
−ＤＢ、即ち心筋梗塞に関係した蛋白質を測定する。

【００１４】二者択一的に、該第一および第二分析物セ
ットは、一過的に上昇した物質、および内因性変換因子
により変化したその物質の誘導イソ型として関係してい
るところの、物質の一族の算定を可能にする。好適な具
体例において、ＣＫ−ＭＭのイソ型、ＣＫ−ＭＢのイソ
型、ＣＫ−ＢＢのイソ型、例えば全体のＣＫ−ＭＭおよ
びＣＫ−ＭＭＣ；ＣＫ−ＭＢＢ、および全体のＣＫ−Ｍ
Ｂおよび全体のＣＫ−ＢＢおよびＣＫ−ＢＢＡを免疫学
的に測定する。

【００１５】本発明のもう１つの面は、心筋梗塞の発病
を決定するための免疫測定法である。発病およびＡＭＩ
後の時間的経過を測定するためのハイブリドーマ、標識
した薬剤、およびキットも記述する。

【００１６】

【発明の詳細な記述】この方法は、急性症の出来事に苦
しんでいると見られる患者からの液体標本中の第一分析
物セットおよび第二分析物セットの免疫学的測定に関す
る。各々の分析物セットは、一過的に上昇した生物学的
物質およびその内因的に変化した形態から成る群から選
択される少なくとも１つを含んでいる（ここで、この第
一および第二分析物セットは同じでない）。この第一お
よび第二分析物セットは、その分析物セットの濃度を測
定することで、一過的に上昇した物質、およびその一過
的に上昇した物質の内因的に変化した形態の濃度が決定
されるように選択される。即ち、一緒に測定した該第一
および第二分析物セットの成分の濃度は、直接か或は計
算した後、一過的に上昇した物質の初期濃度、およびこ
の一過的に上昇した物質の内因的に変化した形態を与え
る。該一過的に上昇した物質の内因的に変化した形態は
、その一過的に上昇した物質の内因的に変化した形態の
濃度を測定するか、或はその急性症の出来事における同
じ地点で放出されそして同じ速度で分解するもう１つの
一過的に上昇した物質の内因的に変化した形態の濃度を
測定することによって計算できる。

【００１７】この第一および第二の一過的に上昇する物
質は異なっていてもよく、例えば、一過的に上昇する物
質ＭＩ−ＰＡ（これは、内因性変換因子によりＭＩ−Ｐ
ＢおよびＭＩ−ＰＣに劣化すると信じられている）の測
定、およびＭＩ−ＤＢ（これは、その一過的に上昇した
物質ＭＩ−ＤＡの誘導生産物であると信じられている）
である。二者択一的に、この第一および第二の一過的に
上昇した物質は同じであってもよく、例えば、ＣＫ−Ｍ
Ｍ、ＣＫ−ＭＢまたはＣＫ−ＢＢのイソ型の測定である
。好適な具体例において、この分析物セットの少なくと
も１つには、一過的に上昇した物質が含まれ、もう１つ
には、一過的に上昇した物質の内因的に変化した形態が
含まれ、そしてこのセットの１つ以下の場合、一過的に
上昇した物質および内因的に変化した形態が含まれる。 この第一および第二セットは同じではないが、しかし各
々の異なるセットは、ＣＫ−ＭＭＡ、ＣＫ−ＭＭＢ、Ｃ
Ｋ−ＭＭＣおよびそれらの混合物；ＣＫ−ＭＢＡ、ＣＫ
−ＭＢＢおよびそれらの混合物；或はＣＫ−ＢＢＡ、Ｃ
Ｋ−ＢＢＢ、ＣＫ−ＭＭＣおよびそれらの混合物；から
成る群から選択される。

【００１８】本発明の測定方法を実施するためには、そ
の特異性のため免疫学的方法が最も便利であり、そして
ここで用いる言葉「免疫測定法」は、抗原と、第二材料
（例えば、結合相手、通常抗原との結合部位を有する抗
体または抗体フラグメント）（これは、優先的に抗体の
エピトープと結合する）との優先的結合を用いたいずれ
かの方法を意味すると定義される。ここで用いる優先的
結合は、選択的および一般に特異的な結合相手間の結合
を表している。本発明の範囲に含まれるものは、この段
階を含む全ての免疫測定法であり、これには、制限する
ものではないが、サンドイッチ、競争、ディップスティ
ック、免疫凝集、免疫抽出、免疫沈澱、免疫拡散、免疫
抑制、トランジスターブリッジプローブ、粒子分類分け
、光妨害、光散乱、および超音波プローブ免疫測定など
が含まれる。ここで用いる免疫学的測定は、この分析物
セットの少なくとも１つを、抗原とその結合相手との優
先的結合を基として測定することを意味している。特に
、特別なイソ型またはイソ型の組み合わせが免疫測定法
により検出されることを意図している。酵素分析物に関
して、イソ型の一族の全濃度が、その酵素基質の劣化速
度を基とした酵素分析により検出され得る。

【００１９】ここで用いる「一過的に上昇した物質」は
、急性症の出来事、例えば心臓発作、発作が起きたとき
、或は外傷性の損傷、例えば骨折または血腫が生じたと
き有意に増大した量で放出される蛋白質、糖蛋白質、酵
素などの如き生物学的物質（これは、正常時にはこのよ
うに増大した量では存在していなく、そして内因性変換
因子により時間と共に分解する）である。種々の急性症
の出来事が、ここで教示した方法を用いて測定され得る
。しかしながら、明確にするためでありそして限定する
ことを意図したものではないが、その急性症の出来事が
心筋梗塞である場合を参照にして本発明を更に詳しく説
明する。

【００２０】ここで用いる「誘導物質」は、１種以上の
内因性変換因子の作用を受けて、一過的に上昇した生物
学的物質が変化した形態である。

【００２１】ここで用いる物質の「一族」は、一過的に
上昇した物質およびその誘導イソ型を表す。

【００２２】言葉「イソ型」は、一過的に上昇した物質
の各々、およびその一過的に上昇した物質に対する内因
性変換因子の作用で生じるいずれかの誘導物質を表す。 例えば、一過的に上昇した物質の一族がＭＩ−Ｐである
場合、ＭＩ−ＰＡが一過的に上昇した物質であり、そし
てＭＩ−ＰＢが誘導物質である。ＭＩ−ＰＡおよびＭＩ
−ＰＢの各々は、ＭＩ−Ｐのイソ型である。組み合わせ
のイソ型は、２種以上のイソ型、即ちＭＩ−ＰＡ＋Ｂを
構成する。一過的に上昇した物質の一族がＣＫ−ＭＭで
ある場合、ＣＫ−ＭＭＡは一過的に上昇した物質であり
、そしてＣＫ−ＭＭＢおよびＣＫ−ＭＭＣが誘導物質で
ある。 ＣＫ−ＭＭＡ、ＣＫ−ＭＭＢおよびＣＫ−ＭＭＣの各々
、並びにＣＫ−ＭＢＡおよびＣＫ−ＭＢＢはイソ型の一
族である。

【００２３】本発明の方法は、ＣＫ−ＢＢもまた血清中
で劣化することの発見を導いた。従って、ＣＫ−ＢＢイ
ソ型の一族も存在している。加うるに、Ｃ末端のリジン
がＢおよびＭサブユニットの両方により同時に損失して
いない場合、４つのイソ型のＣＫ−ＭＢが存在している
。ここで用いる言葉「ＣＫイソ型」は、ＣＫ−ＭＭのイ
ソ型、ＣＫ−ＭＢのイソ型およびＣＫ−ＢＢのイソ型を
表すために用いられる。

【００２４】ここで用いる下記の言葉は、種々のＣＫイ
ソ型のために用いられる。ＣＫ−ＭＭＡは、ＣＫ−ＭＭ
の未劣化の、組織に特異的なイソ型を表す。ＣＫ−ＭＭ
Ｂは、ＣＫ−ＭＭの中間的な、部分的に劣化したイソ型
で表す。ＣＫ−ＭＭＣは、ＣＫ−ＭＭの完全に劣化した
、血清に特異的なイソ型を表す。ＣＫ−ＭＢＡは、ＣＫ
−ＭＢの未劣化の、組織に特異的なイソ型を表す。ＣＫ
−ＭＢＢは、ＣＫ−ＭＢの完全に劣化した、血清に特異
的なイソ型を表す。ＣＫ−ＭＢＣは、Ｍ鎖は劣化してい
るがＢ鎖は劣化していないＣＫ−ＭＢの中間的イソ型を
表す。ＣＫ−ＭＢＤは、Ｂ鎖は劣化しているがＭ鎖は劣
化していないＣＫ−ＭＢの中間的イソ型を表す。ＣＫ−
ＢＢＡは、ＣＫ−ＢＢの未劣化の、組織に特異的なイソ
型を表す。ＣＫ−ＢＢＢは、ＣＫ−ＢＢの中間的な、部
分的に劣化したイソ型で表す。ＣＫ−ＢＢＣは、ＣＫ−
ＢＢの完全に劣化した、血清に特異的なイソ型を表す。

【００２５】本発明による分析法に従うべき急性の病気
過程において、一過的に上昇した物質は、興味の持たれ
ている急性症の出来事が生じたとき、有意な量で放出さ
れる。この初期の上昇した濃度は、この初期の一過的に
上昇した物質に対して内因性変換因子が作用するにつれ
て減少する。内因性変換因子の作用によりそれから誘導
される物質は、各々、逐次的様式で一過的に上昇し、そ
のとき、この各々は内因性変換因子により創作された後
、代謝させる。

【００２６】ここで用いる言葉「抗体」には、分類Ｉｇ
Ｇ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥの抗体、お
よびＦａｂを含む抗体のフラグメントおよびハイブリッ
ド誘導体、並びに抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントが
含まれると定義される。言葉「抗−（ＭＩ−ＰＡ）抗体
」は、ここでは、選択的にＭＩ−ＰＡ蛋白質と結合する
抗体を表すと定義される。言葉「抗−（ＭＩ−ＤＢ）抗
体」は、ここでは、選択的に、酵素活性を有するＭＩ−
ＤＢ蛋白質と結合する抗体を表すと定義される。言葉「
抗−（ＣＫ−ＭＭＡ）抗体」は、ここでは、選択的に、
ＣＫ−ＭＭＡと結合するが、ＣＫ−ＭＭＢまたはＣＫ−
ＭＭＣイソ型とは有意な量で結合しない抗体を表すと定
義される。同様に、言葉「抗−（ＣＫ−ＭＭＢ）抗体」
は、ここでは、選択的に、ＣＫ−ＭＭＢと結合するが、
ＣＫ−ＭＭＡまたはＣＫ−ＭＭＣイソ型とは有意な量で
結合しない抗体を表すと定義され、そして言葉「抗−（
ＣＫ−ＭＭＣ）抗体」は、ここでは、選択的に、ＣＫ−
ＭＭＣと結合するが、ＣＫ−ＭＭＡまたはＣＫ−ＭＭＢ
イソ型とは有意な量で結合しない抗体を表すと定義され
る。言葉「抗−（ＣＫ−ＭＭＡ＋Ｂ）抗体」は、ここで
は、選択的に、ＣＫ−ＭＭＡおよびＣＫ−ＭＭＢと結合
するが、ＣＫ−ＭＭＣイソ型とは有意な量で結合しない
抗体を表すと定義される。抗−（ＣＫ−ＭＭＡ＋Ｂ）は
、単クローン抗体、或は抗−（ＣＫ−ＭＭＡ）抗体と抗
−（ＣＫ−ＭＭＢ）抗体との混合物から成ることができ
る。言葉「抗−（ＣＫ−ＢＢＡ）抗体」は、ここでは、
選択的に、ＣＫ−ＢＢＡと結合するが、ＣＫ−ＢＢＣイ
ソ型とは有意な量で結合しない抗体を表すと定義される
。 同様に、言葉「抗−（ＣＫ−ＢＢＢ）抗体」は、ここで
は、選択的に、ＣＫ−ＢＢＢと結合するが、ＣＫ−ＢＢ
ＡまたはＣＫ−ＢＢＣイソ型とは有意な量で結合しない
抗体を表すと定義され、そして言葉「抗−（ＣＫ−ＢＢ
Ｃ）抗体」は、ここでは、選択的に、ＣＫ−ＢＢＣと結
合するが、ＣＫ−ＢＢＡまたはＣＫ−ＢＢＢイソ型とは
有意な量で結合しない抗体を表すと定義される。言葉「
抗−（ＣＫ−ＢＢＡ＋Ｂ）抗体」は、ここでは、選択的
に、ＣＫ−ＢＢＡおよびＣＫ−ＢＢＢと結合するが、Ｃ
Ｋ−ＢＢＣイソ型とは有意な量で結合しない抗体を表す
と定義される。同様に、言葉「抗−（ＣＫ−ＢＢＢ＋Ｃ
）抗体」は、ここでは、選択的に、ＣＫ−ＢＢＢおよび
ＣＫ−ＢＢＣと結合するが、ＣＫ−ＢＢＡイソ型とは有
意な量で結合しない抗体を表すと定義される。

【００２７】ＣＫ−ＭＢＡ（ＣＫ−ＭＢ２としても知ら
れている、組織に特異的なイソ型のＣＫ−ＭＢである）
は、心筋梗塞中に放出され、そして内因的にＣＫ−ＭＢ
Ｂイソ型（ＣＫ−ＭＢ１としても知られている）に変換
されるところの、一過的に上昇する物質である。ＣＫ−
ＢＢに特異的な市販抗体（例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ．　およびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　
Ｍａｎｈｅｉｍから入手可能）は、両方のイソ型と結合
し、そして全ＣＫ−ＭＢ（ＣＫ−ＭＢＡ＋Ｂ）が測定さ
れる。ＣＫ−ＭＭに特異的な市販抗体（例えば、Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ．　およびＢｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｈｅｉｍから入手可能）もまた、両
方のイソ型と結合し、そして全ＣＫ−ＭＢ（ＣＫ−ＭＢ
Ａ＋Ｂ）が測定される。

【００２８】抗（ＣＫ−ＭＢＢ）で表される本発明の新
規な抗体は、優先的に、ＣＫ−ＭＢＢイソ型と結合し、
そしてＣＫ−ＭＢＡと一緒には有意な量で結合しない。 好適なＣＫ−ＭＢＢ抗体は、ＨＢ９９１４が生産する単
クローン抗体である。好適なＣＫ−ＭＢＢ抗体はまた、
抗−（ＣＫ−ＭＭＣ）抗体である。

【００２９】本発明のもう１つの新規な抗体は、抗−Ｃ
Ｋ−ＢＢＡ抗体である。抗体１４として表される本発明
の好適な抗体は、抗−ＣＫ−ＢＢＡ抗体である。抗体１
４はまた、抗−ＣＫ−ＭＢＡ抗体である。

【００３０】ＭＩ−ＰＡは、心筋梗塞が生じたとき放出
され、その発病を示唆するところの、分子量が約７０，
０００であると考えられている蛋白質に似た物質である
。ＭＩ−ＰＡは、細胞質のマレイン酸脱水素酵素として
実験的に同定された。これは、優先的に、本発明の新規
な抗（ＭＩ−ＰＡ）抗体と結合する。

【００３１】ＭＩ−ＤＢは、分子量が約５５，０００の
蛋白質に似た物質である。これは、一過的に上昇した物
質、ＭＩ−ＤＡ（これは、心筋梗塞のときに放出される
）から誘導されると信じられている。ＭＩ−ＤＢは、優
先的に、本発明の新規な抗（ＭＩ−ＤＢ）抗体と結合す
る。

【００３２】この方法の１つの面は、急性の病気が起き
たとき、例えば心筋梗塞の診断のために用いられる試験
である。２つの免疫学的に測定された分析物セットの計
算された比率を評価することで、この心筋梗塞が生じて
からの時間的経過の見積もりが得られ、そして医者に対
して、好適な治療過程に関する情報を与える。例えば、
ｔＰＡ（組織プラスミノゲン活性化剤）治療は、急性の
心筋梗塞の発生に非常に近いとき、最適に有効である。 ｔＰＡの治療に関する減少した効果、および上記治療の
高コストは、急性の心筋梗塞が起きてから実質的な時間
が経過した場合、その使用に対して影響を及ぼし得る。 本方法の使用は、該急性心筋梗塞の攻撃からの時間的経
過を見積もるための簡単で有効な方法を提供する。

【００３３】本方法に従って、サンプルを免疫学的に分
析して、第一および第二分析物セットの各々の濃度を測
定する。各々の分析物のセットは、個々に、一過的に上
昇した物質、その内因的に変化した形態、およびそれら
の組み合わせから成る群から選択される少なくとも１員
を含む。この第一および第二分析物セットは同じではな
い。一過的に上昇した物質の変換速度は、分析される物
質、そしてそれらに影響を与える内因性変換因子に従っ
て変化する。該第一および第二分析物セットの比率が決
定された後、標準曲線と比較する数字が得られ、これに
よって、その急性出来事からの時間的経過の見積もりが
得られる。この特定の標準曲線は、その急性出来事、分
析する分析物、および使用する試薬に従って変化する。 上記標準曲線の作成は、ここに示す教示を鑑みて、本分
野の技術の範囲内である。

【００３４】従来技術の方法に従って、急性症の出来事
の指示を与える特定の分析物または分析物の一族の絶対
的濃度が測定される。この急性の病気の過程がその理想
型と一致している患者において、信頼できるデータが得
られる。しかしながら、ある個人は、一貫して、分析物
質の有意に増大したか、或は減少したレベルを有してい
る。その個人の基準値として減少したＣＫ−ＭＭレベル
を有する患者では、ＣＫ−ＭＭ水準が実質的に上昇（ひ
どい急性心筋梗塞を示唆）しており、そして大部分の人
にとって「正常な」標準の範囲内にあるＣＫ−ＭＭ値を
有することとなる。ここに記述する測定方法は、個人の
中の上記物質の変換により存在が増大した急性症の出来
事を示唆する物質と、一定に存在している生産物との比
較を提供するものである。本測定方法および操作の使用
は、単に上記物質の絶対的濃度と言うよりはむしろ、測
定物質の相対的濃度に関する個別化した示唆を提供する
ものである。

【００３５】本測定法は、第一および第二分析物セット
の各々の免疫学的測定値を提供する。各々のセットは、
一過的に上昇した物質および／または少なくとも１種の
誘導生産物から成る。一番目および二番目の一過的に上
昇した物質は、異なっていてもよいか、或は同一であっ
てもよい。しかしながら、この第一および第二分析物セ
ットは同一でなくてもよい。

【００３６】本方法の好適な具体例において、一番目の
一過的に上昇した物質含む第一分析物、および二番目の
一過的の上昇した物質の内因的に変化した形態を含む第
二分析物の存在を定量する。特に好適な具体例において
、該第一分析物はＭＩ−ＰＡであり、そして該第二分析
物はＭＩ−ＤＢである。

【００３７】この第一分析物は、一過的に上昇した物質
を含んでいてもよく、そして該第二分析物は該第一分析
物および少なくとも１種のその内因的に変化した形態か
ら成る。上記測定法の例は、その第一分析物としてＣＫ
−ＭＭＡを測定し、そしてその第二分析物としてＣＫ−
ＭＭＡ＋Ｂを測定する定量法である。もう１つの具体例
において、該第一分析物セットは、一過的に上昇した物
質およびその内因的に変化した形態であってもよく、そ
して該第二分析物が内因的に変化した形態であってもよ
い。上記分析法の例は、第一分析物質としてのＣＫ−Ｍ
ＢＡ＋Ｂであり、そして第二分析物としてのＣＫ−ＭＢ
Ｂである。二者択一的に、該第一分析物は、一過的に上
昇した物質を構成していてもよく、そして該第二分析物
がその物質の内因的に変化した形態である。上記定量法
の例は、第一分析物としてＣＫ−ＭＭＡを測定し、第二
分析物としてＣＫ−ＭＭＣを測定するか、或は第一分析
物としてＣＫ−ＢＢＡおよび第二分析物としてＣＫ−Ｂ
ＢＣを測定する分析方法である。

【００３８】この２つの分析物セットは、「第一」およ
び「第二」分析物セットとして示してはいるが、このよ
うな表示は単に参考例を明白にするためであると理解さ
れたい。これらのセットはいかなる便利な順序で分析さ
れてもよい。

【００３９】全ての測定システム用として、一過的に上
昇した物質を測定することが必須ではないことも本分野
の技術者にとって明らかであろう。該第一および第二セ
ットの両方が、急性の出来事の攻撃時に放出される一過
的に上昇した物質の内因的に変化した形態から成る（こ
こで、第一および第二分析物のセットの比率が、この急
性症の出来事の攻撃からの時間的経過に関する指示を与
える限り、第一および第二セットは同じではない）分析
法を提供するのが望ましい。イソ型の種々の組み合わせ
が、その組み合わせが一過的に上昇する物質の放出から
の時間的経過を示すようにな第一および第二分析物のセ
ットであるように選択できることは本分野の技術者にと
って明らかであろう。上記方法の例である２つの測定法
は、第一分析物としてのＣＫ−ＭＭＢおよび第二分析物
としてのＣＫ−ＭＭＣの測定、或は第一分析物としての
ＣＫ−ＭＭＢおよび第二分析物としてのＣＫ−ＭＭＢ＋
Ｃの測定である。

【００４０】本発明の方法は、充分な結合特異性を示す
ところの、単クローン抗体、多クローン抗体、アフィニ
ティー精製された抗体、或はそれらの混合物を用いるこ
とができる。一般に、単クローン抗体および単クローン
抗体の混合物が好適である。それらを含有する試薬抗体
およびキットもまた本発明の一部である。

【００４１】急性の生物学的出来事からの時間的経過を
測定するための本測定方法は、（ａ）第一分析物セット
および第二分析物セットの各々（各々のセットは、一過
的に上昇した物質、その内因的に変化した形態、および
それらの組み合わせから成る群から選択され、ここで該
第一および第二分析物セットは同じでない）の血清濃度
を測定し、そして（ｂ）この第一および第二分析物セッ
トの比率を測定することを含む。この第一および第二分
析物セットの比率は、その急性な出来事の発生からの時
間的経過に関する指示を提供する。好適には、該第一お
よび第二分析物セットは、ＭＩ−ＰＡ、ＭＩ−ＤＢ、全
ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＭＭＡ、ＣＫ−ＭＭＢ、ＣＫ−ＭＭ
Ｃ、全ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＭＢＢ、ＣＫ−ＢＢＡ、ＣＫ
−ＢＢＢ、ＣＫ−ＢＢＣ、全ＣＫ−ＢＢ、並びにそれら
の組み合わせから成る群から選択される。

【００４２】血清または血漿中のＭＩ−ＤＢの濃度を測
定するための本発明の抗−（ＭＩ−ＤＢ）抗体試薬を使
用し、それによって急性の心筋梗塞の発病を診断ことも
また本発明の一部である。ＭＩ−ＤＢは、血清中には正
常時に存在していないか、或は効果的には存在していな
いほどの少量で正常時に存在している一過的に上昇する
蛋白質である。ＭＩ−ＤＢは、今日利用できるいかなる
指示剤よりも敏感でそして正確な急性心筋梗塞指示剤を
提供する。

【００４３】急性の生物学的出来事が生じてからの時間
的経過を測定するための本方法は、一過的に上昇した蛋
白質、その内因的に変化した形態、およびそれらの組み
合わせから成る群から選択される第一分析物の濃度を測
定し、そして一過的に上昇した蛋白質、その内因的に変
化した形態、およびそれらの組み合わせから成る群から
選択される第二分析物の濃度を測定し（ここで、この第
一および第二分析物のセットは同一ではない）、そして
この第一および第二分析物セットの比率を測定すること
を含む。

【００４４】本発明の１つの特定の具体例には、抗−（
ＭＩ−ＤＢ）抗体を患者の血漿または血清に接触させて
、このサンプル中のＭＩ−ＤＢを該抗体と結合させる段
階が含まれる。本発明のサンドイッチ免疫測定法におい
て、試薬ＭＩ−ＤＢ蛋白質または抗−（ＭＩ−ＤＢ）抗
体を、適切な不溶支持体と直接もしくは間接的に結合さ
せることによって不溶化させる。サンプル中のＭＩ−Ｄ
Ｂを測定するための競争測定法が使用できる。ＭＩ−Ｄ
Ｂの免疫学的測定は、急性の心筋梗塞の発生に関する敏
感な指示を提供する。誘導物質の測定およびＭＩ−Ｄと
誘導物質との比率の計算を一緒に行うと、上記測定によ
り、心筋梗塞の発生からの時間的経過に関する指示が得
られる。１つの具体例において、サンプル中のＣＫ−Ｍ
ＭおよびＣＫ−ＭＭＣの各々を測定する。好適な具体例
において、サンプル中のＭＩ−ＰＡおよびＭＩ−ＤＢを
測定する。もう１つの好適な具体例において、全ＣＫ−
ＭＢおよびＣＫ−ＭＢＢを測定する。更にもう１つの好
適な具体例において、組織に特異的なＣＫ−ＭＢ（ＣＫ
−ＭＢＡ）或は組織に特異的なＣＫ−ＢＢ（ＣＫ−ＢＢ
Ａ）を測定する。

【００４５】本発明の１つの代替具体例には、抗−（Ｃ
Ｋ−ＭＭＡ）抗体を患者の血清、好適には血漿に接触さ
せて、このサンプル中のＣＫ−ＭＭＡを該抗体と結合さ
せる段階が含まれる。本発明の方法のもう１つの面には
、抗−（ＣＫ−ＭＭＡ＋Ｂ）抗体または抗−（ＣＫ−Ｍ
ＭＡ）抗体と抗−（ＣＫ−ＭＭＢ）抗体との混合物を患
者のサンプルに接触させて、このサンプル中のＣＫ−Ｍ
ＭＡおよびＣＫ−ＭＭＢを該抗体と結合させる段階が含
まれる。

【００４６】ＣＫ−ＭＭに対する抗体は、この分析にお
ける特異的抗−（ＣＫ−ＭＭイソ型）抗体と一緒に用い
られ得る。ＣＫ−ＭＢに対する抗体は、同様の様式で抗
−（ＣＫ−ＭＢＢ）抗体と一緒に用いられ、ＣＫ−ＭＢ
Ｂ、ＣＫ−ＭＢＡ＋ＢおよびＣＫ−ＭＢＢが定量され得
る。ＣＫ−ＭＭイソ型のための上記サンドイッチ免疫測
定法の１つにおいて、ＣＫ−ＭＭイソ型が抗−（ＣＫ−
ＭＭ）抗体によって結合させられる。特定のＣＫ−ＭＭ
イソ型に対する抗体が、この抗−（ＣＫ−ＭＭ）抗体と
結合する特定のイソ型を測定するために用いられる。例
えば、抗−（ＣＫ−ＭＭ）抗体は、不溶支持体と結合し
、そしてこのサンプル中の該ＣＫ−ＭＭイソ型は、抗体
−抗原結合を可能にするのに充分な時間、この結合した
抗体を該サンプルと接触させることによって不溶化する
。この不溶支持体上のＣＫ−ＭＭ分析物を、次に、標識
した抗−（ＣＫ−ＭＭイソ型）抗体、或は標識した抗−
（ＣＫ−ＭＭイソ型）抗体の混合物と選択的に結合させ
て、興味の持たれているイソ型またはイソ型類を測定す
る。この具体例は、（ａ）サンプルまたはその水希釈液
を、この溶液中の抗体とＣＫ−ＭＭ化合物とを結合させ
るのに充分な時間、抗−（ＣＫ−ＭＭ）抗体と結合する
不溶支持体に接触させ、そしてその水溶液を除去し、（
ｂ）該不溶支持体と結合するＣＫ−ＭＭイソ型またはイ
ソ型類と抗体との結合を可能にするのに充分な時間、該
不溶支持体を、標識した抗−（ＣＫ−ＭＭイソ型）抗体
の溶液に接触させ、そしてこの支持体から溶液を除去し
、そして（ｃ）この不溶支持体に結合したところの、標
識した抗体を測定することを含む。ＣＫ−ＭＭイソ型の
ための代替サンドイッチ測定法において、選択的に結合
する抗体、即ち抗−（ＣＫ−ＭＭＡ）抗体または他の抗
−（ＣＫ−ＭＭイソ型）抗体は、該不溶支持体と結合す
る。特異的に結合するＣＫ−ＭＭイソ型分析物は、サン
プルを、該抗体で覆った不溶支持体に接触させることに
よって不溶化する。該不溶支持体と結合した分析物は、
標識した抗−（ＣＫ−ＭＭ）抗体と結合させることによ
って測定できる。この標識した抗−（ＣＫ−ＭＭ）抗体
の具体例は、（ａ）サンプルまたはその水希釈液を、こ
の溶液中の抗体とＣＫ−ＭＭイソ型またはイソ型類とを
結合させるのに充分な時間、抗−（ＣＫ−ＭＭイソ型）
抗体と結合する不溶支持体に接触させ、そしてその水溶
液を除去し、（ｂ）該不溶支持体と結合するＣＫ−ＭＭ
イソ型またはイソ型類と抗体との結合を可能にするのに
充分な時間、該不溶支持体を、標識した抗−（ＣＫ−Ｍ
Ｍ）抗体の溶液に接触させ、そしてこの支持体から溶液
を除去し、そして（ｃ）この不溶支持体に結合したとこ
ろの、標識した抗体を測定することを含む。

【００４７】ここでの本測定法の更にもう１つの具体例
において、特定の抗−（ＣＫ−ＭＭイソ型）抗体は、捕
捉用抗体および標識用抗体の両方として働く。上記方法
は、（ａ）サンプルまたはその水希釈液を、この溶液中
の抗体とＣＫ−ＭＭイソ型またはイソ型類とを結合させ
るのに充分な時間、抗−（ＣＫ−ＭＭイソ型）抗体と結
合する不溶支持体に接触させ、そしてその水溶液を除去
し、（ｂ）該不溶支持体と結合するＣＫ−ＭＭイソ型ま
たはイソ型類と抗体との結合を可能にするのに充分な時
間、該不溶支持体を、標識した抗−（ＣＫ−ＭＭイソ型
）抗体の溶液に接触させ、そしてこの支持体から溶液を
除去し、そして（ｃ）この不溶支持体に結合したところ
の、標識した抗体を測定することを含む。

【００４８】ＣＫ−ＢＢに対する抗体は、単独、或はＣ
Ｋ−ＭＢイソ型を定量するために上述したのと同様な、
抗−（ＣＫ−ＭＢ）抗体との組み合わせで、用いること
ができる。イソ型のＣＫ−ＢＢ族を定量するために、上
述したのと同様の分析法が使用できる。

【００４９】該分析物が酵素活性を有している場合、不
溶支持体と結合する材料の活性が測定できる。このよう
な酵素活性測定に関する具体例において、この不溶支持
体を、酵素の存在下、物理的に検出可能な生産物、例え
ば発色団を生じさせる基質または他の材料と接触させる
。

【００５０】本発明の競争免疫測定法において、選択的
に結合する抗体、特に抗−（ＭＩ−ＰＡ）抗体、抗−（
ＭＩ−ＤＢ）抗体、抗−（ＣＫ−ＭＭ）抗体、或は１種
以上の抗−（ＣＫ−ＭＭイソ型）抗体が、該不溶支持体
と結合する。１つの具体例において、該不溶支持体を、
サンプルとこのサンプルを定量するために用いる標識し
た試薬の分析物との混合物と接触させ、そして溶液中に
残存しているか、或は該不溶支持体に結合している標識
材料を測定する。この具体例は、（ａ）抗体と分析物と
を結合させるのに充分な時間、サンプルと予め決められ
た量の標識した試薬の分析物との混合物を、抗−（分析
物）抗体と結合する不溶支持体に接触させ、そして液相
から該不溶支持体を分離し、そして（ｂ）該不溶支持体
上に存在しているか、或は該液相に残存している標識し
た分析物の量を測定することを含む。

【００５１】もう１つの具体例において、分析される分
析物が粘着している不溶支持体を、サンプルと分析され
る特定の一過的に上昇した物質または誘導物質の分析物
に相当する標識した抗−（分析物）抗体との混合物に接
触させ、そしてこの溶液中に残存しているか、或は該不
溶支持体と結合しているその標識された材料を測定する
。この具体例は、（ａ）抗体と分析物とを結合させるの
に充分な時間、サンプルと予め決められた量の標識した
抗−（分析物）抗体との混合物を、試薬ＣＫ−ＭＭイソ
型が結合する不溶支持体に接触させ、そして液相から該
不溶支持体を分離し、そして（ｂ）該不溶支持体上に存
在しているか、或は該液相に残存している標識した抗−
（分析物）抗体の量を測定することを含む。上述したの
と同様の分析法が、ＣＫ−ＢＢイソ型に特異的な抗体を
用いたイソ型のＣＫ−ＢＢ族の定量に用いられ得る。

【００５２】上記方法において、該試薬分析物を有する
不溶支持体またはそれに結合した抗体は、本発明の重要
な一部である。

【００５３】抗−（ＭＩ−Ｐ）抗体、抗−（ＭＩ−Ｄ）
抗体、抗−（ＣＫ−ＭＢ）抗体、抗−（ＣＫ−ＭＢＢ）
抗体、抗−（ＣＫ−ＭＭ）抗体、抗−（ＣＫ−ＭＭイソ
型）抗体、抗−（ＣＫ−ＢＢ）抗体、および抗−（ＣＫ
−ＢＢイソ型）抗体と，それらの個々の蛋白質結合相手
との結合に適切な培養時間は、１６〜４０℃の範囲の温
度で１〜２４０分間であり、好適な接触時間は、２０〜
２６℃の範囲の温度で少なくとも１５分間である。

【００５４】幅広い種類の化合物が固体状の支持体とし
て用いられるが、最初に考えるべきことは、その表面に
抗体または蛋白質を結合させること、それを展開させる
ために用いられる標識物と試薬との反応を干渉しないこ
と、および展開させた標識の検査を干渉しないことであ
る。特に、蛍光もしくは色素スペクトルを測定する場合
、この不溶支持体は干渉を与えるべきではない。

【００５５】天然および合成の両方の有機および無機ポ
リマー類が固体状支持体として用いられ得る。適切なポ
リマー類の例には、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポ
リブチレン、ポリ（４−メチルブチレン）、ブチルゴム
および他の合成ゴム類、シリコンゴムおよびシラスティ
ック（ｓｉｌａｓｔｉｃ）ポリマー類、ポリエステル、
ポリアミド、セルロースおよびセルロース誘導体（例え
ば、酢酸セルロース、ニトロセルロースなど）、アクリ
レート類、メタアクリレート類、ビニルポリマー類（例
えば、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニ
リデン、ポリフッ化ビニリデンなど）、ポリスチレンお
よびスチレングラフト共重合体、スチレン−アクリロニ
トリル共重合体、レーヨン、ナイロン、ポリビニルブチ
ラート、ポリホルムアルデヒドなどが含まれる。不溶支
持体として用いられ得る他の材料は、シリカゲル、シリ
コンウエハー、ガラス、紙、不溶蛋白質、金属、メタロ
イド、金属酸化物、磁気材料、半導体材料、サーメット
などである。加うるに、ゲルを生じる物質、即ちゼラチ
ンの如き蛋白質、リポポリサッカライド、シリケート、
アガロース、ポリアクリルアミド、或はいくつかの水相
を生じさせるポリマー類、例えばデキストラン、ポリア
ルキレングリコール（２〜３個の炭素原子を有するアル
キレン）または界面活性剤、例えば両染性化合物、例え
ばホスホリピッド、長鎖（１２〜２４個の炭素原子）ア
ルキルアンモニウム塩などが含まれる。

【００５６】本発明の好適な診断上の支持体は、ポリス
チレン、スチレン−（ビニルモノマー）共重合体、例え
ばスチレン−アクリロニトリル共重合体を含むスチレン
共重合体、ポリオレフィン類、例えばポリエチレンおよ
びポリプロピレン、並びにアクリレートおよびメタアク
リレートポリマー類および共重合体を含有している。特
に好適な支持体は、特別な形態の磁化可能な材料を含む
。上記磁化可能な固体状支持体による通常の干渉は、反
応段階の各々に磁化可能な粒子を加えることによって小
さくすることができる。各々の段階で生じる磁気干渉は
、ほとんど同等にすることができ、従って、有効的に排
除される。磁化可能な粒子は、磁石を用いてこの粒子を
集めることによって、血清または他の溶液から容易に分
離され得る。

【００５７】抗体の結合部位を有意に減少させることな
く、そして該支持体の表面からの抗体の有意な脱離を生
じさせることなく、該液体および洗浄溶液から該不溶支
持体を分離することを可能にする程充分に、結合させる
ところの、いずれかの結合方法で、該抗体と該支持体と
を結合させることができる。非共有結合は、吸着、イオ
ン結合、ウァンデルワールス力、静電結合、および他の
非共有結合により達成され得る。該抗体はまた、共有結
合により該支持体と結合させ得る。本操作のための特に
優位な支持体は、多数のウエルを有するミクロタイター
プレートから成る。このウエルの表面、或はその中の他
の材料のニトロセルロースまたはプラスチック製キャッ
プ挿入物で、この抗体支持体を構成させることができる
。

【００５８】不溶支持体の表面への抗体の非共有結合的
粘着に関する操作において、この抗体材料を、緩衝水溶
液中で、支持体、例えばポリスチレン製ミクロタイター
のウエルまたはそのための個々のポリスチレン製挿入ウ
エルの表面に施すことができる。この表面を、最初に、
メタノールの如き洗浄液で奇麗にした後、乾燥する。こ
の緩衝させた抗体溶液を該ウエルまたは挿入カップ中に
置き、そして吸着が生じるまで、例えば４〜４０℃、好
適には２０〜２６℃の温度で、２〜１８時間、好適には
１６〜１８時間室温で培養する。このウエルを、次に、
薄い食塩水ですすいだ後、乾燥する。不溶支持体に共有
結合的に粘着した抗体に関する他の操作は、Ｉ．　Ｃｈ
ｉｂａｔａ著「固定化酵素」（ＩＭＭＯＢＩＬＬＩＺＥ
Ｄ　ＥＮＺＹＭＥＳ）、Ｈａｌｓｔｅｄ　Ｐｒｅｓｓ，
　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７８およびＡ．　Ｃｕａｔ
ｒｅｃａｓａｓ、　Ｊ．　Ｂｉｏ．　Ｃｈｅｍ．　２４
５：３０５９　（１９７０）（これらの全体の内容はこ
こでは参照に入れられる）に記述されている。この表面
を蛋白質でコートした後、例えば連結剤としてグルタル
アルデヒドを用いた米国特許番号４，２１０，４１８に
記載されている操作を用いて、抗体と連結させ得る。代
替操作において、このウエルは、遊離イソシアネート基
、例えばポリエーテルイソシアネートを有する層でコー
トできる。水溶液中での該抗体のそれへの適用は、要求
される結合を与える。もう１つの操作において、米国特
許番号３，７２０，７６０に記載されているような臭化
シアノゲンによって、該抗体はヒドロキシル化された材
料に連結され得る。更にもう１つの操作において、スタ
フィロコッカスプロテインＡを該不溶支持体に結合させ
た後、この抗体のＦＣ鎖を該プロテインＡと結合させる
ことができる。

【００５９】固体状表面からの溶液の除去は、すすぎ用
溶液を用いることで容易に行われる。ＣＫ−ＭＭおよび
ＣＫ−ＢＢ酵素が存在しているこのすすぎ用溶液、サン
プル、および全ての工程溶液は、好適には、該酵素を安
定化させるためのＥＤＴＡの如きキレート剤、そしてそ
れをもう１つの形態に変換させ得るいずれかの変換因子
を含有しているべきである。従って、ＥＤＴＡを含有し
ている血漿は、サンプルとして、血清よりも好適である
。しかしながら、短期間０〜４℃で血清サンプルを保存
することで、一過的に上昇した物質がその変化した形態
に更に変換するのが防止される。適切なすすぎ用溶液は
、燐酸塩のモル濃度が約０．０１〜０．０５であり、ｐ
Ｈが６〜８であり、そして約０．０１〜０．０１重量％
の非イオン系界面活性剤を含有している燐酸緩衝水溶液
である。適切な非イオン系界面活性剤には、ポリオキシ
エチレンエーテル類（ＢＲＩＪ）、例えばラウリル、セ
チル、オレイル、ステアリル、およびトリデシルポリオ
キシエチレンエーテル類；ポリオキシエチレンソルビタ
ン類（ＴＷＥＥＮ）、例えばポリオキシエチレンソルビ
タンのモノラウリン酸エステル、モノパルミチン酸エス
テル、モノステアリン酸エステル、モノオレイン酸エス
テルおよびトリオレイン酸エステル；並びに他のポリオ
キシエチレンエーテル類（ＴＲＩＴＯＮ）などが含まれ
る。好適な非イオン系界面活性剤は、４０個のエチレン
オキサイド単位を有するオクチルフェノキシポリエトキ
シエタノール（ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−４０５、　Ｒｏｈｍ
　ａｎｄ　Ｈａａｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｐｈｉｌａｄ
ｅｌｐｈｉａ、　ＰＡ）である。

【００６０】第二抗体−抗原結合を用いる具体例におい
て、本質的に過剰な第二抗体を用いてこの結合化を行う
以外は、第一結合−抗原結合化に関して上述したのと同
様な様式で、不溶表面を支持体に接触させる。

【００６１】本発明の全ての具体例における最終段階は
、不溶材料上または溶液中のどちらかに存在している抗
体または標識したＣＫイソ型の測定である。この抗体ま
たはＣＫイソ型の測定様式は、使用する各々の種類の標
識した試薬に関して異なる。標識測定のための操作は、
例えば上記Ｖｏｌｌｅｒ他、ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹＳ
　ＦＯＲ　ＴＨＥ　８０ｓ、　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：　
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐａｒｋ　Ｐｒｅｓｓ　（１９
８１）に記述されているように、本分野で良く確立され
ている。

【００６２】測定すべき標的部分が、該不溶支持体と結
合した未標識の抗体である場合、この標的部分を測定す
る好適な方法は、該不溶支持体を、標識したプロテイン
Ａ、或は該一次抗体と結合するところの、標識した第二
抗体の溶液に接触させることを含む。適切な抗体には、
一次抗体のＦｃ部分と結合する標識した第二抗体が含ま
れる。

【００６３】他の抗体および標識したプロテインＡのＦ
ｃ部分に結合する単クローンおよび多クローン第二抗体
の両方は、容易に、商業的に入手可能である。該一次抗
体の標識化に関して上述したのと同様な方法で、これら
に、特徴のある標識付けを行うことができる。適切な実
施例は、Ｃａｔｔｙ他著「ヒトの免疫グロブリンに対す
る単クローン抗体のための特別な参照を伴う免疫測定法
における抗血清」（Ａｎｔｉｓｅｒａ　ｉｎ　Ｉｍｍｕ
ｎｏａｓｓａｙｓ　ｗｉｔｈ　Ｓｐｅｃｉａｌ　Ｒｅｆ
ｅｒｅｎｃｅ　ｔｏ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏ
ｂｕｌｉｎｓ）、ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹＳ　ＦＯＲ　
ＴＨＥ　８０’ｓ（上記）１３３−１５３頁およびそこ
に引用したある出版物（これらの全体の内容物はここで
は参照に入れられる）に記述されている。

【００６４】本発明の好適な具体例において、標識した
抗体または標識した試薬分析物の存在および量が測定さ
れる。直接観察されるか或は測定され得る標識が最も容
易に測定され、そしてこの分析の効率を増大させるため
の、幅広い種類のマニュアル、半自動および自動分析機
が利用できる。上記標識の例は、放射能カウンティング
装置によって測定できる放射能標識；スペクトロフォト
メーターで可視的に観察できるか或は測定できる顔料、
染料または他の発色団；スピン標識分析機で測定できる
スピン標識；および紫外線光下で可視化するか或は標準
フルオロメーターで測定できる蛍光部分などである。こ
の標識は、発光物質、例えば燐光を発する物質またはフ
ルオロゲン、生物発光物質、化学発光物質または金属含
有物質であり得る。

【００６５】酵素標識または酵素標識用システムを用い
ることで、増幅および背景からの大きな区別が達成され
得る。この物質は、好適な測定可能生産物を生じさせる
ように選択される。色素原およびフルオロゲン酵素が好
適である。これらは、各々色素原およびフルオロゲンを
生じる基質として知られている酵素である。

【００６６】好適な色素原基質および酵素は、西洋わさ
びペルオキシダーゼの如きオキシドレダクターゼ類、お
よび識別できる色を生じるジアミノベンジジンの如き基
質を利用するものである。識別できる色を与える場合、
酵素−色素原を生じる他のいかなる基質の組み合わせも
使用できる。

【００６７】利用できるフルオロゲン基質と酵素との組
み合わせは、米国特許番号４，１９０，４９６など（こ
れらの内容はここでは参照に入れられる）に記載されて
いる。好適なフルオロゲン酵素およびそれに相当する適
切な基質には、西洋わさびのペルオキシダーゼ（このた
めの適切な基質はホモバニリン酸または４−ヒドロキシ
−３−メトキシフェニル酢酸である）、ベータ−ガラク
トシダーゼ（このための適切な基質は４−メチルウンベ
リフェリル−ベータ−Ｄ−ガラクトシドである）、アル
カリ性ホスファターゼ（このための適切な基質は４−メ
チルウンベリフェリルホスフェート、他のウンベリフェ
リルホスフェート類、例えば４−カルボキシウンベリフ
ェリルホスフェート、およびウンベリフェリルホスフェ
ート４−カルボキシアルキルエステル類などである）が
含まれる。

【００６８】色素原またはフルオロゲンを展開させるた
め、該不溶支持体を、１０−２〜１０−１０モル、好適
には１０−４〜１０−５モル濃度の基質を含有している
基質の水溶液と接触させる。この基質溶液中の好適な追
加的試薬および緩衝剤には、例えば２−アミノ−２−メ
チル−１−プロパノール緩衝剤および塩化マグネシウム
が含まれる。

【００６９】この基質溶液を、蛍光反応生成物が生じる
のに充分な時間、該不溶支持体と一緒に培養する。１８
〜４０℃の温度で、５〜２４０分の培養期間が用いられ
得る。好適には、この温度は２０〜２６℃の範囲であり
、そして培養期間は３０〜９０分間である。

【００７０】より一層の増幅のため、ビオチン−アビジ
ン複合体を用いた免疫ペルオキシダーゼ方法が用いられ
得る。この操作では、ビオチン標識した抗体が用いられ
る。一次抗体に酵素を結合させるために上述したのと同
様の通常の操作により、抗体に対して大過剰モルのビオ
チン、好適には少なくとも１００：１のビオチンと抗体
とのモル比を用いて、このビオチンを該第二抗体に共有
結合的に結合させる。好適なビオチン−アビジン複合体
には、アビジンとビオチン化された酵素が含まれる。こ
の酵素は前述した酵素の１つであり得る。免疫ペルオキ
シダーゼを用いたアビジン−ビオチン系は、Ｈｕｓ他、
Ｊ．　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．　２
９（４）：５７７−５８０（１９８１）、　Ａｍ．　Ｊ
．　Ｃｌｉｎ．　Ｐａｔｈ．　７５（５）：７３４−７
３８　（１９８１）およびＡｍ．　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　
Ｐａｔｈ．７５（６）：８１６−８２１　（１９８１）
に記述されている。アビジン−ビオチン系に適用するシ
ステムもまた、Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ、　Ｉｎｃ．、　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　Ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉａから商業的に入手可能であり、そして彼ら
の顧客用文献中に記述されている。

【００７１】１つのシステムにおいて、ビオチン標識し
た抗体を結合させるための、すすいだ支持体を、アビジ
ン−（標識したビオチン）複合体に接触させる。大過剰
モル量のアビジンと、ビオチン化した酵素とを混合する
ことにより、好適なアビジン−ビオチン複合体が得られ
る。このような複合体は、ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ、　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　ＣＡから得ら
れるＶｅｃｔａｓｔａｉｎ＼　ＡＢＣである。このビオ
チンはまた、他の通常の標識、例えば発光物質、例えば
燐光を発する物質またはフルオロゲン、生物発光物質、
化学発光物質、放射能物質、或は酵素、発色団、顔料、
スピン標識、または金属含有物質で標識を付けることが
できる。これらの標識を、この標識の化学基に適当であ
り、そして抗体試薬に対して同様の標識を適用するため
に上述した通常の操作により、該ビオチンに共有結合的
に結合させる。

【００７２】該不溶支持体に抗体を施すために上述した
ＰＢＳ溶液の如き適切な緩衝水溶液中で、該アビジン−
ビオチン複合体を、該不溶支持体に施す。該アビジン−
ビオチン複合体を、もし有れば、該支持体上に存在して
いるビオチンと結合させるのに充分な時間、この複合体
の溶液を施す。この段階の後、過剰のアビジン−ビオチ
ン複合体溶液を除去し、そして例えば上述したようなす
すぎ用溶液の如き適切なすすぎ用溶液で、この不溶支持
体を好適にすすぐ。

【００７３】次に、この不溶支持体を、使用した特別な
アビジン−ビオチン複合体標識に適切な操作により、検
査する。これらの操作は通常どうりである。例えば、放
射能標識を用いる場合、ガイガーカウンターを用いてこ
の不溶支持体を検査して、該不溶支持体上に残留してい
る放射能のレベルを測定することができる。二者択一的
に、この標識が燐光を発する物質またはフルオロゲンで
ある場合、これは蛍光顕微鏡を用いて検査できる。この
標識が発色団または顔料の場合、この不溶支持体は通常
の光を用いた顕微鏡で検査できる。

【００７４】最終段階が、該不溶支持体に結合したＭＩ
−Ｐ、ＭＩ−ＤまたはＣＫイソ型の酵素活性測定である
具体例において、該ＭＩ−Ｐ、ＭＩ−ＤまたはＣＫ酵素
の存在下、物理的に検出可能な生産物を生じさせる基質
の水溶液に、この不溶支持体を接触させることができる
。適切な基質は米国特許番号３，９９４，７８３、４，
０１２，２８５、４，０６７，７７５および４，２６０
，６７８（これらの特許の全体の内容およびそこに挙げ
られている特許および他の出版物もここではその全体が
参照に入れられる）中に記載されている。１つの操作に
おいて、ＣＫは、ＡＤＰからＡＴＰへの燐酸基転移を特
異的に触媒する。ヘキソキナーゼは、グルコース−６−
ホスフェートへのＡＴＰとグルコースの燐酸化を触媒す
るために用いられる。その後、グルコース−６−ホスフ
ェートは、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナ
ーゼ（Ｇ６ＰＤ）の存在下酸化されそしてＮＡＤ還元さ
れて、６−ホスホグルコネートおよびＮＡＤＨになる。 時間がかかる培養の終わりに、ニトロブルーテトラゾリ
ウム（ＮＢＴ）を加える。ＮＡＤＨはＮＢＴを還元して
、５３０ｎｍに最大吸収を有する着色したホルマザンを
生じさせる。１−メトキシフェナジンメトスルフェート
（ＭＰＭＳ）はホルマザン生産を触媒する。この操作は
、Ｎａｃｈｌａｓ他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１
：３１７　（１９６０）に記述されており、従って、こ
のＤＡＴＡ−ＺＹＭＥ試薬は、Ｄａｔａ　Ｍｅｄｉｃａ
ｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、　Ｉｎｃ．，　２０１６　
Ｅａｓｔ　Ｒａｎｄｏｌ　Ｍｉｌｌ　Ｒｏａｄ、　Ａｒ
ｌｉｎｇｔｏｎ、　ＴＸから入手可能である。

【００７５】免疫学的に測定した第一および第二分析物
セットの比率を決定し、そして標準曲線と比較するため
の数値を与える。この標準曲線は、急性の出来事、分析
された分析物、および使用した試薬に従って変化する。 上記標準曲線の作成は、ここでの教示を鑑みて本分野の
技術の範囲内である。この計算された比率は、その急性
な出来事が起きてからの時間的経過の見積もりを提供す
る。例えば、血清または血漿サンプル中のＭＩ−ＰＡを
測定することによって心筋梗塞の診断ができる。このサ
ンプル中のＭＩ−ＰＡおよびＭＩ−ＤＢの比率は、その
心筋梗塞からの時間的経過の見積もりを提供する。

【００７６】二者択一的に、この２つの分析物セットは
、各々、ＣＫ−ＭＭＡ、ＣＫ−ＭＭＢおよびＣＫ−ＭＭ
Ｃ、或はＣＫ−ＢＢＡ、ＣＫ−ＢＢＢおよびＣＫ−ＢＢ
Ｃの少なくとも１つを含んでいる。この２つの分析物セ
ットは同じでなくてもよい。例えば、この第一分析物セ
ットがＣＫ−ＭＭＣから成り、そして第二分析物セット
が全ＣＫ−ＭＭ、或は代替ＣＫ−ＭＭサブ型であっても
よい。梗塞の時間は、この測定を基にして正確に見積も
られ得る。例えば、患者が最近ＡＭＩにかかっていた場
合、全体のＣＫ−ＭＭ：ＣＫ−ＭＭＣの比率は比較的大
きくなる、何故ならば、内因性変換因子が、大きなＣＫ
−ＭＭＡの流入をＣＫ−ＭＭＢおよびＣＫ−ＭＭＣに変
換したからである。この患者が最近ＡＭＩにかかってい
ない場合、全ＣＫ−ＭＭ：ＣＫ−ＭＭＣの比率は正常な
内因性変換速度を反映する。梗塞時に放出されるＣＫ−
ＢＢの劣化によって生じるパターンが同様な様式で使用
できる。

【００７７】一般に、ここで使用できる２種類の抗体試
薬が存在している。１つの種類は、一過的に上昇した物
質またはその誘導物質、即ち抗−（ＭＩ−ＰＡ）、抗−
（ＭＩ−ＤＢ）、抗−（ＣＫ−ＭＭＡ）、抗−（ＣＫ−
ＭＭＢ）、抗−（ＣＫ−ＭＭＣ）、或は抗−（ＣＫ−Ｂ
ＢＡ）、抗−（ＣＫ−ＢＢＢ）、抗−（ＣＫ−ＢＢＣ）
のどれかの特異的イソ型と結合する。２番目の種類は、
ＣＫ−ＭＭＡおよびＣＫ−ＭＭＢの両方と優先的に結合
するがＣＫ−ＭＭＣまたはＣＫ−ＭＢとは有意に結合し
ない物質の一族の２つ以上のイソ型、即ち抗−（ＣＫ−
ＭＭＡ＋Ｂ）と優先的に結合する。同様に、もう１つの
好適な抗体は、ＣＫ−ＢＢＡおよびＣＫ−ＭＢＡの両方
と優先的に結合するが、ＣＫ−ＢＢＣまたはＣＫ−ＭＢ
Ｃとは有意に結合しない。抗体は多クローンまたは単ク
ローン体であり得る。

【００７８】多クローン抗体は、多クローン抗体製造の
ために利用されるいずれかの哺乳類を用いて、通常の操
作により製造できる。一般に、ラビット、モルモットま
たはヤギが適切である。抗体の製造において、予め決め
た量の抗原を、適切な濃度の生理学的食塩水で希釈する
。この希釈した溶液を、更に、それをフロインド完全ア
ジュバンドと混合することによって希釈して、エマルジ
ョンを製造する。次に、この懸濁液を哺乳類に投与する
。例えば、腹こう内、筋肉内または皮下ルートで、０．
０５〜最大量（全ての投与において非致死量は５ｍｇの
抗原に匹敵する量であり得る）をラビットに投与でき、
そしてこの投与は２〜１０カ月間２週間毎に継続され得
る。この抗体のタイターが充分に高くなったとき、即ち
一般に、この懸濁液の最終目標投与１〜２週間後、この
動物から血液を取り出す。この動物から採取した血液を
、遠心分離で処理して、該抗体を含有している血清を分
離する。

【００７９】次に、この多クローン抗体血清を、Ｍｉｓ
ｈｅｌｌおよびＳｈｉｌｇｉ著「細胞免疫学における選
択方法」（ＳＥＬＥＣＴＥＤ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　
ＣＥＬＬＵＬＡＲ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）Ｓａｎ　Ｆ
ｒａｎｃｉｓｃｏ：Ｆｒｅｅｍａｎ　（１９８０）（こ
の全体の内容はここでは参照に入れられる）に記述され
ているような通常のアフィニティークロマトグラフィー
技術を用いてアフィニティー精製する。アフィニティー
クロマトグラフィーで用いられる適切な吸収剤には、選
択された抗原−結合抗体が共有結合的に結合する架橋し
たアガロースおよび架橋したポリアクリルアミド類が含
まれる。所望の分離を行うために、このカラム分離操作
を繰り返してもよい。

【００８０】これらは操作において、ホスフェートで緩
衝させた食塩水溶液中の抗体溶液をこのカラムに入れた
後、抗体を、ｐＨが８．０の２．５Ｍ　ＮａＳＣＮ溶液
で溶離させ得る。望まれるならば、抗体の濃縮は、負圧
透析または限外濾過法により達成され得る。この抗体溶
液は、４℃以下の温度で安定である。

【００８１】本発明の単クローン抗体は、一般的に、Ｋ
ｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ　
２５６：４９５−４９７　（１９７５）に従って通常の
方法によって製造される。より最近の応用可能な操作は
、Ｇｏｄｉｎｇ著「単クローン抗体：原理および応用」
（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲ
ＩＮＣＩＰＬＥＳ　ＡＮＤ　ＰＲＡＣＴＩＣＥ）、Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ：　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１
９８３）およびそこに引用されている参考例（その全体
の内容はここでは参照に入れられる）を参照のこと。

【００８２】ハイブリドーマは、適当な抗原性物質を用
いてマウスまたはラットを免疫化することによって製造
できる。メスのＡ／Ｊマウス（Ｈ−２ａハプロタイプ、
Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂａｒ
　Ｈａｒｂｏｒ，　ＭＥ）が好適であるが、他のマウス
またはラット種も用いられると見なされる。免疫化の日
程および該懸濁液中の抗原の濃度は、有益な量の、適切
に開始させた脾臓球および／またはリンパ球を生産する
ような濃度とする。

【００８３】適切な融合プロモーターを用いて、この懸
濁させた脾臓細胞を、適切な細胞系から得られるマウス
またはラットの骨髄腫細胞と融合させる。好適な融合プ
ロモーターは、平均分子量が約１０００〜４０００のポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ１０００などとして商業
的に入手可能）であるが、本分野で知られている他の融
合プロモーター、例えばセンダイウイルス（Ｓｅｎｄａ
ｉ　Ｖｉｒｕｓ）または電界も使用できる。次に、この
融合した細胞を適切に培養する。

【００８４】数多くのマウス骨髄腫細胞系が知られてお
りそして例えば官学団体の１員および種々の寄託銀行、
例えばＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍｄ
．などから入手できる。Ｂａｌｂ／Ｃ骨髄腫細胞系が好
適である。この使用する骨髄腫細胞系は、好適には、未
融合の骨髄腫細胞は選択的媒体中で生存しないがハイブ
リッドは生存するような、中間的な敏感性を示すもので
ある。最も通常の種類は、抗８−アザグアニン細胞系（
これは、酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシ
ル・トランスフェラーゼが不足しており、従ってＨＡＴ
（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）
媒体によって支持されない）である。使用する骨髄腫細
胞系として、分泌型のものも使用できるが、いわゆる「
非分泌」型のもの（ここでは、これはいかなる抗体も生
産しない）が一般に好適である。

【００８５】ハイブリドーマの入っている各々の容器ま
たはウエル中の上澄み液に関して、興味の持たれている
分析物とは選択的に結合するが、望まれていない物質と
は結合しない抗体の存在を検査する。スクリーニングに
適切な操作は、Ｇｏｄｉｎｇ　（上記、７２−８４頁）
に記述されている。１つの適切な方法は、不溶支持体（
例えばミクロタイターのトレイのウエル）に結合する抗
マウス免疫グロブリンと、標識した抗原および培養上澄
み液から成る混合物との間の競争を含むものである。代
替方法は、不溶化した抗マウス免疫グロブリンと、標識
した抗原および培養上澄み液から成る混合物との間の競
争を含むものである。この不溶支持体に結合した標識の
量を確かめて、この培養上澄み液中の抗体を有する上澄
み液中の分析物との結合を定量する。もう１つの適切な
操作は、選択されたイソ型が粘着しているニトロセルロ
ースゲルの層に、斑点で培養上澄み液を施し、このゲル
層をすすぎ、ゲル層に結合したいずれかの抗体のＦｃ部
分と結合するところの、発色原標識した抗体もしくは蛍
光標識した抗体に、該ゲル層を接触させ、このゲル層を
すすいで、未結合の標識した抗体を除去し、そしてこの
ゲル層を検査して、この斑点が施されたとき、発色原ま
たはフルオロゲンが明らかに結合したか否かを測定する
ことから成る。自動的トレイ読み取り装置が、該不溶表
面に粘着した蛋白質と結合する抗体を生じさせるハイブ
リドーマを有するウエルを迅速に同定するために用いら
れ得る。

【００８６】ここで有益な抗体を生産するハイブリドー
マの製造は既に記述した。本発明の新規な抗体を分泌す
る特定のハイブリドーマは、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ
　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ
）、　Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　ＭＤに、下記のように寄託
した：抗−（ＭＩ−ＰＡ）抗体を生産するハイブリドー
マを１９８８年１１月１７日寄託し、そして受託番号Ｈ
Ｂ９９１３が与えられ、抗−（ＭＩ−ＤＢ）抗体を生産
するハイブリドーマを１９８８年１１月１７日寄託し、
そして受託番号ＨＢ９９１２が与えられ、抗−（ＣＫ−
ＭＭＣ）抗体を生産するハイブリドーマを１９８８年１
１月１７日寄託し、そして受け入れ番号ＨＢ９９１４が
与えられ、抗−（ＣＫ−ＢＢＡ）抗体を生産するがＣＢ
−ＢＢＣとは有意な量で反応しないハイブリドーマを１
９９０年７月１７日寄託し、そして受託番号ＨＢが与え
られた。

【００８７】所望のハイブリドーマを選択してクローン
化した後、適切な媒体中インビトロで培養し、続いて上
澄み液から抗体を回収することによって、その得られた
抗体を製造することができる。二者択一的に、このハイ
ブリドーマを、マウス、好適には同系もしくは半同系の
マウス中に注射することができる。このハイブリドーマ
は、適切な培養期間後、腫瘍を生じる抗体の形成をもた
らす。これによって、高濃度の所望抗体（約５〜２０ｍ
ｇ／ｍＬ）が、宿主マウスの血液流および腹こうしみ出
し物（腹水）中で得られる。この宿主マウスはまた、そ
れらの血液および腹水中に正常な抗体を有しているが、
この正常な抗体の濃度は、該所望単クローン抗体の濃度
の約５％のみである。

【００８８】本発明の抗体および抗原は、診断方法に有
益な種々の部分と連結させ得る。一般に、上記診断上の
標識用部分を抗体に結合させるための適切な操作はまた
、免疫診断の目的のための抗原にその部分を結合させる
ためにも使用できる。

【００８９】本発明の診断方法のいくつかの具体例にお
いて、標識を付けた抗体試薬を用いる。この抗体試薬に
標識を付ける、即ち、溶液中或は固体状表面上に存在す
る抗体を確認するか、或は定量するため、観察できるか
または測定できるところの、区別的な部分に対して、化
学的に結合させる。診断操作における使用のための、本
発明の抗体と結合できるリガンドおよび基には、それら
が結合する抗体を、他の抗体と区別するために使用でき
るところの、物理的または化学的特徴を有する構成要素
、化合物または生物学的材料が含まれる。

【００９０】本発明の抗体の放射能標識した抗体と一緒
に用いる放射能標識の比放射能は、その放射能標識の半
減期および同位体純度、および該抗体への放射能標識の
組み込み方に依存している。表Ａに、通常に用いられて
いるいくつかの同位体、それらの比放射能および半減期
を列挙する。免疫測定試験において、一般に、比放射能
が高ければ高い程感受性が高くなる。

【００９１】

【表１】

【００９２】表Ａ中に挙げた同位体の如き、放射能活性
を示す同位体で、抗体を標識するための操作は、一般に
、本分野で公知である。トリチウム標識のための操作は
、例えば米国特許番号４，３０２，４３８に記述されて
いる。 ネズミの単クローン抗体のために特に適合したヨウ素化
、トリチウム標識および３５Ｓ標識操作は、Ｇｏｄｉｎ
ｇ著「単クローン抗体：原理および応用」（ＭＯＮＯＣ
ＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：　ＰＲＩＮＣＩＰ
ＬＥＳＡＮＤ　ＰＲＡＣＴＩＣＥ）Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：
　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　１２４−１２６　
（１９８３）およびそこに引用してある参考文献に記述
されている。抗体をヨウ素化するための他の操作は、Ｈ
ｕｎｔｅｒおよびＧｒｅｅｎｗｏｏｄ、　Ｎａｔｕｒｅ
．　１４４：９４５　（１９６２）およびＤａｖｉｄ他
、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３：１０１４−１０２
１　（１９７４）および米国特許番号３，８６７，５１
７および４，３７６，１１０に記述されている。

【００９３】酵素で標識された抗体が特に有益である。 抗体の酵素標識のための適切な操作は、米国特許番号３
，６５４，０９０、４，２１４，０４８、４，２８９，
７４７、４，３０２，４３８、４，３１２，９４３、４
，３７６，１１０およびＲＥ−３１，００６、およびそ
こに引用されている参考文献などに記述されている。他
の適切なシステムの例は、Ｐｅｓｃｅ他、　Ｃｌｉｎ．
　Ｃｈｅｍ．　２０（３）：３５３−３５９　（１９７
４）およびＷｉｓｄｏｍ、　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　
２２：１２４３　（１９７６）に記述されている。表Ｂ
は、適切な酵素の種類を表しており、そして各々の種類
のための特定の例を示している。

【００９４】

【表２】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　表Ｂ　　　　　　　　　　　　種類
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　酵素の例ヒドロラーゼ類　カルボヒドラーゼ類　
　　　　　　アミラーゼ類ヌクレアーゼ類　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ポリヌクレ
オチダーゼアミダーゼ類　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　アルギナーゼプリン・デ
アミナーゼ類　　　　　　　　　　　　　　　　　　ア
デナーゼペプチダーゼ類　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　アミノポリペプチダーゼプロ
テイナーゼ類　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　ペプシンエステラーゼ類　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　リパーゼ類鉄酵素
類　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　カタラーゼ銅酵素類　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　チ
ロシナーゼ類補酵素含有酵素類　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　アルコール・デヒドロゲナ
ーゼチトクローム還元酵素　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　スクシニック・デヒドロゲナーゼ黄色酵
素類　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　ジアホラーゼムターゼ類　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　グリ
オキサラーゼデモラーゼ類　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　アルドラーゼオキシダ
ーゼ類　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　グルコースオキシダーゼ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　西洋わさびペルオキシダーゼ他の酵素類　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　ベータ−ガラクトシダーゼ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　ホスファターゼ類　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　ホスホリラーゼ類　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　ヘキソキナーゼ類これらのおよび他の適切な酵素類
は、Ｈａｗｋ他著「応用生理化学」（ＰＲＡＣＴＩＣＡ
ＬＰＨＹＳＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）
、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ　３０
６−３９７頁　（１９５４）に記述されている。

【００９５】フルオロゲン酵素（この酵素の存在下、選
択された基質が蛍光生産物を生じる）はまた、高度に有
益な標識用の一部である。抗原と結合する抗体の能力を
損なうことなしに、酵素を抗体に選択的に結合させるた
めの方法は、本分野でよく知られている。それらを抗体
に連結させるための適切な酵素および操作は、Ｗｉｌｓ
ｏｎ他著「西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）を
抗体に結合させるための過ヨウ素酸方法における最近の
発展」（Ｒｅｃｅｎｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉ
ｎ　ｔｈｅ　ｐｅｒｉｏｄａｔｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏ
ｒ　ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ　ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ
　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　（ＨＲＰＯ）　ｔｏ　ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ）、ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＣＯ
ＮＦＥＲＥＮＣＥ　ＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＦＬＵＯＲＥＳ
ＣＥＮＣＥＡＮＤ　ＲＥＬＡＴＥＤ　ＳＴＡＩＮＩＮＧ
　ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ．、Ｗ．　Ｋｎａｐｐ他編集、
　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　２１５−
２４４頁　（１９７８）；Ｓｕｌｌｉｖａｎ他「酵素免
疫測定法：再調査」（Ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓ
ｓａｙ：　ａ　ｒｅｖｉｅｗ）Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１６：２２
１−２４０　（１９７９）および米国特許番号４，１９
０，４９６などに記述されている。好適なフルオロゲン
酵素およびそれに相当する適切な基質には、西洋わさび
ペルオキシダーゼ（このための適切な基質はホモバニリ
ン酸または４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル酢酸
である）、ベータ−ガラクトシダーゼ（このための適切
な基質は４−メチルウンベリフェリル−ベータ−Ｄ−ガ
ラクトシドである）、およびアルカリ性ホスファターゼ
（このための適切な基質は４−メチルウンベリフェリル
ホスフェート、他のウンベリフェリルホスフェート類、
例えば４−カルボキシウンベリフェリルホスフェート、
およびウンベリフェリルホスフェート４−カルボキシア
ルキルエステル類などである）が含まれる。

【００９６】この抗体の酵素標識のための適切な操作の
例には、カルボジイミド類、ジアルデヒド類、および二
官能連結剤の使用が含まれる。アミド基を通しての酵素
の結合は、該蛋白質を塩化チオニル、Ｎ−ヒドロキシス
クシニミドまたは同様の薬剤で、無水の溶媒、例えばジ
メチルホルムアミド、ジオキサン、ジメチルスルホキサ
イド、テトラヒドロフランなど中で処理することによっ
て達成され得る。代替の連結剤には、カルボジイミド類
、例えば１−エチル−３−（３−Ｎ，Ｎ’−ジメチルア
ミノ−プロピル）カルボジイミドまたはメチル−ｐ−ト
ルエンスルホン酸１−シクロヘキシル−３−（２−モル
ホリノエチル）カルボジイミドが含まれる。

【００９７】酵素の炭水化物部分を酸化させてアルデヒ
ドを生じさせた後、免疫グロブリンのリシルアミノ基と
反応させて、シッフ塩基を生じさせることもできる。水
素化ホウ素ナトリウムを用いた還元で、酵素と抗体の安
定な連結を生じさせる。上記Ｗｉｌｓｏｎの方法を用い
て、西洋わさびペルオキシダーゼは、抗体と一緒に有効
に免疫グロブリンと結合できる。

【００９８】蛍光標識した抗体は、本分野で公知の標準
蛍光部分から製造できる。抗体および他の蛋白質は約３
１０ｎｍ以下の波長を有する光を吸収するため、３１０
ｎｍ以上、好適には４００ｎｍ以上の波長に実質的な吸
収を有する蛍光部分を選択すべきである。種々の適切な
、蛍光を発する物質がＳｔｒｙｅｒ、　Ｓｃｉｅｎｃｅ
　１６２：５２６　（１９６８）およびＢｒａｎｄ他「
構造のための蛍光試験」（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐ
ｒｏｂｅｓ　ｆｏｒ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、Ａｎｎｕ
ａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
　４１：８４３−８６８　（１９７２）に記述されてい
る。本発明の抗ＡＤＰ抗体は、例えば米国特許番号３，
９４０，４７５、４，２８９，７４７および４，３７６
，１１０などに記述されているような通常の操作で、蛍
光基を用いて標識が付けられる。

【００９９】上述した望ましい数多くの特性を有する、
蛍光を発する物質の１つの群は、キサンテン染料（これ
には３，６−ジヒドロキシ−９−フェニルキサントヒド
ロールおよびレサミン類（ｒｅｓａｍｉｎｅｓ）から誘
導される蛍光物質が含まれる）、そして３，６−ジアミ
ノ−９−フェニルキサンチドロールおよびリサミンロダ
ミンＢから誘導されるロダミン基である。このロダミン
、および９−ｏ−カルボキシフェニルキサントヒドロー
ルの蛍光誘導体は、９−ｏ−カルボキシフェニル基を有
している。反応性を示す連結基、例えばアミノおよびイ
ソチオシアネート基を有する蛍光化合物、例えばフルオ
レサミンおよびフルオレセインイソチオシアネートは容
易に入手できる。

【０１００】もう１つの群の蛍光化合物は、アルファま
たはベータ位にアミノ基を有しているナフチルアミン類
である。このナフチルアミノ化合物に含まれるものは、
１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−
アニリノ−８−ナフタレンスルホネートおよび２−ｐ−
トルイジニル−６−ナフタレンスルホネートである。他
の染料には、３−フェニル−７−イソシアナトクマリン
；アクリジン類、例えば９−イソチオシアナトアクリジ
ンおよびアクリジンオレンジ；Ｎ−［ｐ−（２−ベンゾ
キサゾリル）フェニル］マレイミド；ベンゾキサジオゾ
ール類、例えば４−クロロ−７−ニトロベンゾ−２−オ
キサ−１，３−ジアゾールおよび７−（ｐ−メトキシベ
ンジルアミノ）−４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，
３−ジアゾール；スチルベン類、例えば４−ジメチルア
ミノ−４’−イソチオシアナトスチルベンおよび４−ジ
メチルアミノ−４’−マレイミドスチルベン；Ｎ，Ｎ’
−ジオクタデシルシクロキサカルボキシアミン−ｐ−ト
ルエンスルホネート；ピレン類、例えば８−ヒドロキシ
−１，３，６−ピレントリスルホン酸、１−ピレン酪酸
、メロシアニン５４０、ローズベンカル、２，４−ジフ
ェニル−３（２Ｈ）−フラノン、ｏ−フタルデヒド、並
びに他の容易に入手可能な蛍光分子が含まれる。 これらの染料は、活性を示す官能基を有するか、或はこ
のような官能基を容易に導入することができる。

【０１０１】例えば、Ｇｏｄｉｎｇ著「単クローン抗体
：原理および応用」（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩ
ＢＯＤＩＥＳ：　ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ　ＡＮＤ　ＰＲ
ＡＣＴＩＣＥ）、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ　Ｐｒｅｓｓ、　２０８−２４９頁　（１９８３）に
記述されている操作によって、抗体類は蛍光色素で標識
できる。蛍光色素の濃度は、Ｇｏｄｉｎｇ（２２９頁）
の表に従って選択される。例えば、ＤＭＳＯ中のフルオ
ロセインイソシアネート（１．０ｍｇ／ｍＬ）またはロ
ダミンイソシアネート（１０．０ｍｇ／ｍＬ）を調製し
た後、撹拌しながら、この蛋白質溶液に所望容積（全蛋
白質溶液の容積の１〜１０％）を滴下する。この反応を
２時間進行させ、光をさえぎる。０．１％のＮａＮ３の
入っているＰＢＳ中のＳＥＰＨＡＤＥＸＧ−２５ゲルを
用いてゲル濾過することによって、未反応の或は加水分
解した蛍光色素を分離することで、該生成物を精製する
。この接合体の吸収を２８０ｎｍおよび可視領域のその
最大波長（フルオロセイン化した抗体に関しては４９５
ｎｍであり、ロダミン化した抗体に関しては５５０ｎｍ
である）で測定する。蛍光色素と蛋白質の比率は、上記
Ｇｏｄｉｎｇ（２２４−２２５頁）の操作に従って計算
する。接合体は、使用まで光から保護しながら４℃で保
存する。この抗体溶液の濃度が１ｍｇ／ｍＬ未満の場合
、ＢＳＡをこの溶液に加えて、最終濃度を１ｍｇ／ｍＬ
にする。

【０１０２】本発明の１つの具体例において、抗体を共
有結合的にアビジンまたはビオチンに結合させ得る。適
切な結合操作は、二官能架橋剤を通しての架橋を含むも
のである。適切な二官能化合物が、Ｐｅｔｅｒｓ他、　
Ａｎｎ．　Ｒｅｖ．　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　４６：５２３
　（１９７７）に記載されている。アルキルイミド化物
（ａｌｋｙｌ　ｉｍｉｄａｔｅｓ）は、蛋白質によりそ
れらに与えられた官能基の中で、高い度合の特異性を示
す。この反応は第一級アミノ基に特異的である。適切な
連結剤の例には、アミドエステル類、例えばジメチルマ
ロニミデート（ｄｉｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｉｍｉｄａ
ｔｅ）、アジド類、例えばイムノ基と容易に反応してア
ミド結合を生じるタルトリルジアジドのアシルアジドが
含まれる。ジハロゲン化アリール（例えば、１，５−ジ
フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、または４，４’
−ジフルオロ−３，３’−ジニトロフェニルスルホン）
、グルタルアルデヒド、塩酸１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）−カルボジイミド、ジマレイミ
ド、混合無水物、ｍ−マレアミドベンゾイルのＮ−ヒド
ロキシスクシニミドエステル、および他の公知の架橋剤
。

【０１０３】前述の試薬は、本質的に不可逆的結合を与
える。官能基、例えばジスルフィドまたはグリコールを
有する二官能試薬が使用できる。これらは、望まれるな
らば、架橋反応後分解させ得る結合を提供する。このよ
うな試薬には、３，３’−ジチオビスプロピオンイミド
ジメチル、プロピオンイミドスクシニミジル、Ｎ−（３
−フルオロ−４，６−ジニトロフェニル）−シスタミン
、タルトリルジアジド、タルトリルジ（グリシラジド）
およびタルトリルジ（エプシロン−アミノカプロイラジ
ド）が含まれる。

【０１０４】他の例において、これらの試薬それら自身
の間で直接結合を生じさせ得る。例えば、抗体とビオチ
ンとは、各々の材料上の官能基を通して結合できる。特
定の例として、ビオチンは、過ヨウ素酸塩で処理した後
、抗体と反応し、ビオチンとアビジンとの結合を抑制し
ないか、或はこの抗体の免疫学的活性を妨害しないで、
シッフ塩基の形成を生じる。

【０１０５】二官能架橋剤を用いた公知の技術には、次
のものが含まれる：（ａ）１段法のグルタルアルデヒド
結合、Ａｖｒａｍｅａｓ、　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．　
６：４３　（１９６９）；（ｂ）２段法のグルタルアル
デヒド結合、Ａｖｒａｍｅａｓ、　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅ
ｍ．　８：１１７５　（１９７１）；および（ｃ）ジマ
レイミド結合、Ｋａｔｏ他、　Ｅｕｒｏ．　Ｊ．　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．　６２：２８５　（１９６６）。

【０１０６】Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ他、　Ｊ．　Ａｐｐｌ
．Ｒａｄ．　３５（６）：５５４−５５７　（１９８４
）およびＢｕｃｋｌｅｙ他、Ｆｅｄ．　Ｅｕｒ．　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　１６６（１）：２０２−２０
４　（１９８４年１月）の操作に従って、金属性の放射
性核種で抗体に標識を付けることができる。この操作に
おいて、この抗体は、キレート剤、例えば該金属性の放
射性核種とキレートを形成することのできるジエチレン
トリアミンペンタ酢酸などと結合する。ＤＴＰＡ（ジエ
チレントリアミンペンタ酢酸）の二環状無水物の０．１
ｍｇ／ｍＬ懸濁液を、乾燥溶媒、例えばクロロホルム、
エーテルまたは乾燥ＤＭＳＯ中で調製する。ＤＴＰＡと
免疫グロブリンとのモル比が１：１になるのに充分な一
定量を、奇麗にした乾燥試験管に取り出した後、窒素下
で蒸発させる。ｐＨが７．０〜７．５の食塩水中の０．
０５Ｍの重炭酸塩緩衝液中の、使用抗体溶液（１０〜２
０ｍｇ／ｍＬ）の一部１０〜２０ミクロリットルを、該
乾燥ＤＴＰＡに加えた後、この内容物を０．５〜１．０
分間撹拌する。この連結した蛋白質の調製物を、同じ緩
衝溶液で希釈して０．２ｍＬにした後、食塩水溶離剤を
用いて、ＳＥＰＨＡＤＥＸ　Ｇ−５０ゲルの入っている
５ｃｍのゲル濾過カラムを用いて精製する。この連結の
効率を、ｐＨが６．０の０．５Ｍ酢酸塩緩衝溶液中の「
キレートグレード」の１１１Ｉｎを添加することによっ
て精製する前に、測定する。この連結効率を計算するた
め、抗体に連結したＤＴＰＡを分離する薄層クロマトグ
ラフィーを用いた。このＤＴＰＡを連結した抗体は、金
属性の放射性核種との結合に必要となるまで、４℃で保
存できる。

【０１０７】他の適切な標識の例は、Ｖｏｌｌｅｒ他、
　ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹＳ　ＦＯＲ　ＴＨＥ　８０ｓ
、　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐ
ａｒｋ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８１）および米国特許番号
４，２２０，４５０および３，９６０，８３４（これら
の全体の内容およびここに引用してある参考例は、ここ
では参照に入れられる）に記述されている。 上記例の１つは、ＭｃＣａｐｒａ、　Ｑｕａｒｔｅｒｌ
ｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　２０：４８５　（１９６６）、　
米国特許番号４，２２０，４５０およびＶｏｌｌｅｒ（
上記、１１３−１２５頁）に記述されている化学発光標
識である。

【０１０８】標識された抗原試薬も、本発明の測定法で
使用できる。この言葉「抗原」は、ここでは、エピトー
プ、或はこのエピトープを含む組織フラグメント（これ
は優先的に該測定用抗体と結合する）を表す。不均質組
織フラグメント、精製均一系フラグメント組成物、およ
びエピトープ結合特性にとって必須でない組織成分を含
有していない、単離されたエピトープが含まれる。

【０１０９】抗−（ＭＩ−ＰＡ）抗体または抗−（ＭＩ
−ＤＢ）抗体をそれぞれ用いて、中性の界面活性剤で抽
出され、そして通常のアフィニティーカラム材料と結合
するところの、心臓組織の抽出物をアフィニティークロ
マトグラフィーにかけることにより、該ＭＩ−ＰＡおよ
びＭＩ−ＤＢ抗原が単離され得る。このカラムを用いた
組織抽出物の処理およびこのカラムからの該抗原の溶離
は、通常の操作で行われ得る。蛋白質を抽出しそして精
製するための適切な方法は、Ｈ．　Ｄａｖｉｓ他、　Ｃ
ａｎｃ．　Ｒｅｓ．　４６：６１４３−６１４８　（１
９８６）；Ｖ．　Ｊｏｈｎｓｏｎ他、　Ｃａｎｃ．　Ｒ
ｅｓ．　４６：８５０−８５７　（１９８６）；および
Ｅ．　Ｆｒｉｅｄｍａｎ他、　Ｃａｎｃ．　Ｒｅｓ．　
４６：５１８９−５１９４　（１９８６）（これらの各
々の全体の内容は、その全体が参照に入れられる）に記
述されている。

【０１１０】Ｖａｉｄｙａ他、　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ．　７９０：２３０−２３７
　（１９８４）の方法により、全ＣＫ−ＭＭ心臓抽出物
からＣＫ−ＭＭＡイソ型が得られる。Ｖａｉｄｙａ（上
記）の方法によってＣＫ−ＭＭＢイソ型およびＣＫ−Ｍ
ＭＣイソ型を得た後、Ｐｅｒｒｙｍａｎ他、Ｃｌｉｎ．
　Ｃｈｅｍ．　３０：６６２　（１９８４）（これらの
各々の開示はここではその全体が参照に入れられる）の
方法によりＣＫ−ＭＭＡをＣＫ−ＭＭＢおよびＣＫ−Ｍ
ＭＣに変換する。

【０１１１】精製したＣＫ−ＢＢＡは、Ｄｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ、Ｄａｌｌａｓ　ＴＸを含む給源から商業的に
入手可能である。ＣＫ−ＢＢＣは、精製したＣＫ−ＢＢ
Ａとカルボキシペプチダーゼとを、このイソ型の劣化を
終結させるために適切な条件下で、一緒にすることによ
って製造できる。

【０１１２】本発明の競争測定法の具体例において、標
識したＭＩ−ＰＡ、ＭＩ−ＤＢ、ＣＫ−ＭＭＡ、ＣＫ−
ＭＭＢ、ＣＫ−ＭＭＣ、ＣＫ−ＭＭＡ＋Ｂ、ＣＫ−ＭＭ
Ａ＋Ｃ、ＣＫ−ＭＭＢ＋Ｃ、および／またはＣＫ−ＭＭ
Ａ＋Ｂ＋Ｃが用いられる。一般に、標識した抗体を製造
するため、これらの蛋白質と上述した標識とを結合させ
ることができ、そしてこの標識部分を該抗体に付着させ
るための共有結合方法は、標識した蛋白質を製造するた
めの方法と同じである。酵素を標識した試薬および放射
能標識した試薬が特に有益である。

【０１１３】以下に示す特定的であるが非制限的実施例
により本発明を更に詳しく説明する。温度は摂氏で与え
られており、そして特に示されていない限り濃度は重量
％である。ここで、実施のため推定的に簡略化した実施
例は現在形で表し、そして実験室で行ったところの実験
を実施するため簡略化した実施例は過去形で表す。

【０１１４】

【実施例】実施例１ 抗原の製造 心臓組織の抽出物を、Ｖａｉｄｙａ他、　Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．　Ａｃｔａ　７９０：２３０−２３７　（１９８４
）の方法か、或はＧｒａｃｅおよびＲｏｂｅｅｒｔｓ、
　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　Ａｃｔａ　１２３：５９−
７１　（１９８２）の方法によるＣＫ−ＭＢから製造し
た。ＣＫ活性の最大値を基にして集めた画分は、若干の
蛋白質が混入している比較的純粋なＣＫイソエンチーム
類を含有していた。抗体類は種々の画分に対して上昇し
た（これらは一般に、蛋白質もしくはイソエンチームの
初期の形態で豊富に存在しており、即ち内因性変換因子
で変化していなかった）。これらの画分を、精製した画
分のインビトロ変換により、他の形態に変換させてもよ
い。

【０１１５】ゲル電気泳動により、特定の混入した非Ｃ
Ｋ蛋白質が、精製した抗原と一緒に残存していることが
観察された。Ｖａｉｄｙａの方法により得られたところ
の、クロマトグラフィーで分別したピーク１および２を
、単クローン抗体製造のために用いた。混入している蛋
白質の２つ、即ちＭＩ−ＰＡ（分子量が約７０，０００
の蛋白質）とＭＩ−ＤＢ（分子量が約５５，０００の蛋
白質）と特異的に結合する抗体を製造した。

【０１１６】実施例２ 単クローン抗−（ＭＩ−ＰＡ）抗体および抗−（ＭＩ−
ＤＢ）抗体の製造 １．　　免疫化プロトコル 年令が８週間のメスのＡ／Ｊマウス、Ｈ−２ａハプロタ
イプ（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂ
ａｒ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＭＥ）を用い、完全フロインド
アジュバンド中に乳化したところの、実施例１に従う精
製したＣＫ−ＭＭイソ型画分２５μｇを腹こう内注射す
ることによって開始した。５週間および８．５週間後、
更に、１０μｇの精製画分を静脈注射した。最終追加免
疫化３日後、このマウスをと殺した後、融合のため脾臓
を取り出した。

【０１１７】２．　　細胞融合 その免疫化したマウスから得られた脾臓細胞を、融合剤
としてポリエチレングリコール（ＮＥＮ　Ｐｒｏｄｕｃ
ｔｓ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）を用いたＫｏｈｌｅｒ
およびＭｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９
５−４９７　（１９７５）の記述と本質的に同様にして
、Ｂａｌｂ／Ｃ骨髄腫細胞系と融合した。この融合した
細胞を、９６個のウエルを有する培養プレート中で培養
した後、５容積％のＣＯ２を含有している大気中３７℃
で保温した。

【０１１８】３．　　抗体のスクリーニング個々のウエ
ルから得た培養上澄み液を、融合８日後、固相放射能免
疫測定法を用いて、ＣＫ−ＭＭに特異的な抗体をスクリ
ーニングした。ヤギの抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐａｌ−Ｆ
ｒｅｅｚｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、　Ｒｏｇｅｒｓ
、　ＡＲ）を既にコートしてある９６個のウエルを有す
るプレート（ＩＭＭＵＬＯＮ　ＩＩ、　Ｄｙｎａｔｅｃ
ｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ａｌｅｘａｎｄｒｉ
ａ、　ＶＡ）中、クロマトグラフィーで分別（５０，０
００ｃｐｍ）した画分Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩとして得ら
れた一定容積の１２５Ｉ標識した蛋白質と一緒に、１０
０μＬ（ミクロリットル）容積の培養上澄み液を培養し
た。室温で２〜３時間培養した後、ＴＷＥＥＮ−ＰＢＳ
で３回このプレートをすすぎ、乾燥ブロットした後、こ
の結合したトレーサーの放射能をガンマカウンターで計
量した。

【０１１９】ＧｒａｃｅおよびＲｏｂｅｒｔｓ、　Ｃｌ
ｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　Ａｃｔａ　１２３：５９−７１　
（１９８２）の方法により、心臓組織を均質化すること
によってヒトの心臓抽出物を調製した。変化させた変換
状態に対して内因性変換因子をインビトロで作用させる
ことによって、該材料を変換させた。ＣＫ−ＭＭＡ、Ｃ
Ｋ−ＭＭＢおよびＣＫ−ＭＭＣを分離する電気泳動法に
より、この変換度を測定した。ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＭＭ
ＡおよびＣＫ−ＭＢから作成される目盛りも用いた。未
変換および変換した心臓抽出物に対する比較反応性を基
にして、心臓組織の構成成分と反応した抗体は同定され
たが、該変換因子によって変化しなかった測定部位は同
定されなかった。変換因子により変化した測定部位以外
の、心臓抽出物の構成成分と反応する抗体は、未変換お
よび変換した心臓抽出物に対する異なる反応性を基準に
して同定された。

【０１２０】４．　　培養拡張およびハイブリドーマク
ローン化 ＣＫ−ＭＭ、ＭＩ−ＰＡ、ＭＩ−ＤＢおよびＣＫ−ＭＭ
Ｃに対して特異的な抗体を生産するハイブリドーマ培養
物を、２４個のウエルを有する培養プレートおよび２５
ｃｍ２の組織培養フラスコ中で拡張させた。制限希釈に
よるクローン化を続いて行った後、特定の抗体を分泌す
るクローン化したハイブリドーマを更に拡張させた。

【０１２１】５．　　腹水の製造 不完全フロインドアジュバンドを用いて開始したところ
の、年令が８週間のメスのＣＡＦ／Ｊマウス（Ｊａｃｋ
ｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　ＢａｒＨａｒｂ
ｏｒ、　ＭＥ）に、１０５〜１０６個のハイブリドーマ
細胞を腹こう内注射した。１０〜１４日後、腹水を取り
出した。

【０１２２】６．　　単クローン抗体の精製腹水を遠心
分離にかけ、細胞および廃石を除去した。同容量の１，
１，２−トリクロロ−１，２，２−トリフルオロエタン
（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、　Ｐａｒｉｓ、　ＫＹ）
を、この細胞が入っていない腹水と一緒にした後、１０
〜２０分間激しく撹拌した。この混合物を遠心分離して
、脂質層から抗体含有腹水を分離した。この脂質を抽出
した腹水を、熱処理（５６℃、３０分間）し、０．１％
のＮａＮ３を加えた後、−２０℃で保存するか、或は更
に精製した。 更に一層の精製に関して、５０％飽和硫酸アンモニウム
で腹水を沈澱させ、遠心分離した後、この沈澱物を、ｐ
Ｈが７．２の１５ｍＭ　ＮａＣｌ含有２０ｍＭの燐酸塩
緩衝液に対して透析した。ＤＥＡＥクロマトグラフィー
に関しては、ＩｇＧ単クローン抗体が豊富な画分を得る
ため１段の溶離を行った。カラムにＤＥ５２（Ｗｈａｔ
ｍａｎ、　Ｅｎｇｌａｎｄ）を充填し、２０ｍＭの燐酸
塩緩衝液、ｐＨが７．２の１５ｍＭ　ＮａＣｌで平衡に
した後、４ｎｇの蛋白質：１ｍＬのＤＥ５２母液の比率
で、透析した単クローン抗体調剤を入れた。同じ緩衝液
を用いてこれを溶離させ、全抗体活性の９０％以上が結
合しないで溶離された。しかしながら、異なる単クロー
ン抗体が、溶離パターンに関していくらか異なる挙動を
示したと見られる。従って、溶離に関しては、段階に分
けて塩の濃度を増量することが推奨される。

【０１２３】実施例３ 単クローン抗−（ＭＩ−ＰＡ）および抗−（ＭＩ−ＤＢ
）抗体反応性の評価ＭＩ−ＰＡおよびＭＩ−ＤＢの変化
は、ＣＫ−ＭＭイソ型の変化と似ている。

【０１２４】実施例１と同様にして、心臓抽出物を製造
した後、Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　３０：６６２　（１
９８４）に記述されているのと同様に、カルボキシペプ
チダーゼで処理した。カルボキシペプチダーゼ処理時間
を変えたときの効果を表Ｃに示す。

【０１２５】実施例２に従って製造したラビットの抗−
（ＭＩ−ＰＡ）および抗−（ＭＩ−ＤＢ）抗体を各々、
磁性を示すラテックス粒子（ポリスチレン粒子、Ｓｅｒ
ａｇｅｎ、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ）上に
固定した。公知の方法によりヤギの抗ラビット（ＩｇＧ
）抗体をラテックス上に受態吸収させる。次に、ラビッ
ト抗−（ＭＩ−ＰＡ）および抗−（ＭＩ−ＤＢ）抗体を
反応させて、固相ラビット抗−（ＭＩ−ＰＡ）および抗
−（ＭＩ−ＤＢ）抗体をそれぞれ得た。この固相の懸濁
液（１００μＬ）と、変換因子を含有しているヒトの血
清にさらしたＣＫ−ＭＭＡのサンプルとを、３７℃で異
なる期間混合する。実施例１１の操作に従って製造され
た１２５Ｉ標識単クローン抗体も加える（１分間当たり
１００〜１３０，０００カウント）。免疫学的定量操作
は下記の通りである：１．　　定量試薬を室温にする。

【０１２６】２．　　各々の標準、対照および患者のサ
ンプルに関して、二本の試験管にラベルを付ける。

【０１２７】３．　　各々の標準、対照およびサンプル
の２５μＬをピペットで各々の試験管の底に直接移す。

【０１２８】４．　　実施例１１の操作に従って製造し
た１２５Ｉ標識抗体試薬１００μＬをピペットで各々の
試験管の底に移す。

【０１２９】５．　　固定化したラビットの抗−（ＭＩ
−ＰＡ）抗体を含有している固相試薬を、穏やかに混合
した後、この懸濁液の２５μＬをピペットで各々の試薬
管に移す。

【０１３０】６．　　試験管たてを振とうして、その内
容物をよく混合する。

【０１３１】７．　　１５０〜１７０ｒｐｍの回転機上
、室温で１５分間試験管を培養する。

【０１３２】８．　　１ｍＬの洗浄用緩衝液を全ての試
験管に分配する。

【０１３３】９．　　試験管をマグネチックラック中に
置く。

【０１３４】１０．　　全ての試験管から液体を吸引す
るかまたはデカンテーションする。

【０１３５】１１．　　ヨウ素１２５に適切に合わせた
ウインドで１分間、ガンマカウンター中、全ての試験管
を測定する。

【０１３６】１２．　　結果を計算する。全ての標準に
関して、分当たりの平均カウント数（ＣＰＭ）を計算す
る。ｙ軸にＣＰＭを取りそしてｘ軸にＭＩ−ＰＡおよび
ＭＩ−ＤＢ濃度を取ったグラフ上に標準曲線をプロット
する。最も適合した曲線を引く。この標準曲線から各々
のサンプルの濃度を読み取る。

【０１３７】以下に示すように分離したＣＫ−ＭＭイソ
型の電気泳動分離で得られた結果と、上記結果とを比較
した。各々の解凍した血清サンプルに、ｐＨが７．４の
１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液中２００ｍＭのＥＤＴ
Ａ、１００ｍＭのＭＥＴの入っている緩衝液５０μＬを
加えた。次に、このサンプルの１μＬを、Ｃｏｒｎｉｎ
ｇ　Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｔｒａｃｅ　の特別な目的のため
の電気泳動フィルム、１％のアガロース（Ｃｏｒｎｉｎ
ｇ、　Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ、　カタログ番号４
７０１０４）の各々のウエルに入れる。電気泳動用緩衝
液は、９７％（ｖ／ｖ）の５０ｍＭ　トリスＢａｒｂｉ
ｔａｌ緩衝液、ｐＨ９．１５（Ｇｅｌｍａｎ　Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ、　Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ、　ＭＩ、Ｈｉｇ
ｈ　Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ、　製品番号
５１１０４）、および３％（ｖ／ｖ）のＰＯＬＹＢＵＦ
ＦＥＲ　９６（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａ
ｗａｙ、　ＮＪ、製品番号１７−０７１４−０１）から
成っていた。電気泳動は、１８０ボルト、４℃で９０分
間行う。その後、ゲルに１ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇ　ＣＡ
ＲＤＩＯＴＲＡＫ−ＣＫ試薬（Ｃｏｒｎｉｎｇ、　カタ
ログ番号４７００６９）を塗り、３７℃で２０分間保温
した後、６０℃で１５分間乾燥する。乾燥したゲルを、
ＨＥＬＥＮＡ　ＡＵＴＯ　ＳＣＡＮＮＥＲで検査し、Ｈ
ＥＬＥＮＡ　ＱＵＩＣＫ　ＱＵＡＮＴ　ＩＩＩを用いて
マニュアルに従ってピークの積分を行う。

【０１３８】得られた結果を表Ｃに示す。

【０１３９】

【表３】

【０１４０】＊カルボキシペプチダーゼ処理時間　　Ｃ
ｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　３０：６６２　（１９８４）。

【０１４１】抗−（ＭＩ−ＤＢ）抗体を基としたこの試
験は、濃度に関してＣＫ−ＭＭＡおよびＣＫ−ＭＭＢの
両方と平行にある物質の程度を示すことが、このデータ
により示されている。ＭＩ−ＰＡ抗体を基とした試験は
、ＣＫ−ＭＭＡの濃度と平行にある物質の程度を示す。 このデータによりまた、未変性の蛋白質が内因性変換因
子と接触したままでいると、分析物対の量に対する未変
性蛋白質の量の比が減少することが示されている。

【０１４２】実施例４ ＭＩ−ＰＡ抗原の精製 実施例２の操作に従って得られるＭＩ−ＰＡ蛋白質と特
異的に結合するところの、ＡＴＣＣ　ＨＢ９９１３が生
産する単クローン抗−（ＭＩ−ＰＡ）抗体を、本分野で
通常の操作により、セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
）に結合させて、ＭＩ−ＰＡに特異的に結合するアフィ
ニティーカラムのゲルを生じさせる。

【０１４３】抗−（ＭＩ−ＰＡ）抗体と結合するセファ
ローズゲル２５ｍＬをカラムに充填する。２〜３倍容積
の緩衝液（０．１５ＭのＰＢＳ、ｐＨ７．２）を用いて
上記カラムを平衡にした後、このカラムに血清溶液を入
れる。その後、ｐＨが７．２のＰＢＳ緩衝液を用いて、
このカラムを１０回洗浄する。

【０１４４】溶離する緩衝液（酢酸ナトリウム、ｐＨ４
．０）の流速は１５〜２０ｍＬ／時である。ＭＩ−ＰＡ
抗原を含有している溶離した画分を、ピークの活性がな
くなるまで集め、これから、抗−（ＭＩ−ＰＡ）抗体が
特異的に結合するＭＩ−Ｐが得られる。

【０１４５】その後、ｐＨが７．２のＰＢＳ緩衝液の１
０倍容積で、このカラムを洗浄する。

【０１４６】このＭＩ−ＰＡ抗原は、約７０，０００の
分子量を有する蛋白質である。これは実験的に、細胞質
もしくはミトコンドリアのマレイン酸デヒドロゲナーゼ
として同定された。

【０１４７】実施例５ ＭＩ−ＤＢ抗原の精製 抗−（ＭＩ−ＰＡ）抗体の代わりに抗−（ＭＩ−ＤＢ）
抗体を用いることで相当するＭＩ−ＤＢ蛋白質を得る以
外は、実施例４の操作の繰り返し。

【０１４８】このＭＩ−ＤＢ蛋白質は約５５，０００の
分子量を有している。

【０１４９】実施例６ 多クローン抗−（ＭＩ−ＰＡ）抗体 １．　　文献、例えばＳｔｏｌｌａｒ「酵素学の方法」
（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）７０
：７０（１９８０）中に記述されている免疫化技術およ
び日程を用いて、実施例４の操作に従って製造したＭＩ
−ＰＡ抗原に対する多クローン抗血清をラビット中で誘
発させる。例えばＬｎａｇｅ　他、　Ｃｌｉｎ．　Ｅｘ
ｐ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　２５：１９１（１９７６）お
よびＰｉｓｅｔｓｋｙ他、Ｊ．　Ｉｍｍｕｎ．　Ｍｅｔ
ｈ．　４１：１８７　（１９８１）に記述されているよ
うに、単クローン抗体に使用されるのと同様の固相定量
法で、この抗血清をスクリーニングする。この初期のス
クリーニング基準は、ＭＩ−ＰＡ抗原との結合性である
。

【０１５０】２．　　次に示すクロマトグラフィー分離
において、全ての溶液は、好適には、ＣＫ−ＭＭイソ型
を安定化させるためのキレート剤、例えばＥＤＴＡを含
有しているものとする。「アフィニティークロマトグラ
フ：原理および方法」（ＡＦＦＩＮＩＴＹＣＨＲＯＭＡ
ＴＯＧＲＡＰＨ：　ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ　ＡＮＤ　Ｍ
ＥＴＨＯＤＳ）Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ、　ＡＢ、　Ｂｏｘ　１７５　Ｓ−７５１
０４、　Ｕｐｐｓｕｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ　（１９７１
）（この全内容はここではその全体が参照に入れられる
）に記述されている操作により、カラムを調製する。こ
のカラムに、下記のようなＭＩ−ＰＡイソ型と結合する
セファローズゲル２５ｍＬを充填する：冷凍乾燥したＣ
ＮＢｒ−セファローズ４Ｂ粉体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
を１ｍＭのＨＣｌ中で１５分間膨張させる。このゲルを
、焼結ガラスフィルター（間げき率Ｇ−３）上、ゲル１
ｇ当たり（乾燥重量）全体で２００ｍＬの１ｍＭＨＣｌ
を用いて洗浄する。一定分量で数回これを行い、連続し
た添加の合間に、上澄み液を吸引除去する。各々１ｍＬ
のゲルに対して、実施例４の操作に従って製造したＭＩ
−ＰＡ５ｍｇを、ＥＤＴＡ含有連結用緩衝液（０．１Ｍ
のＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．３、０．５ＭのＮａＣｌ含有
）中に溶解する。このゲルを連結用緩衝液で洗浄し、過
剰分を吸引して除去した後、この酵素溶液を該ゲルと混
合する。撹拌しないで、この混合物を一晩４℃に放置す
る。このゲルを、その後、ｐＨが８．０の１Ｍエタノー
ルアミン含有遮断用緩衝液中に室温で２時間入れる。次
に、このゲルを該連結用緩衝液、即ち０．５ＭのＮａＣ
ｌの入っているｐＨが４．０の０．１Ｍの酢酸緩衝液で
洗浄し、そして連結用緩衝液で２回洗浄する。ここで、
酵素蛋白質−セファローズ接合体が準備でき、そしてこ
れは４〜８℃で保存できる。この緩衝溶液に、静菌薬と
して臭化シアノゲンを加えることができる。

【０１５１】３．　　２〜３倍容積の緩衝液（０．１５
ＭのＰＢＳ、ｐＨ７．２）でこのカラムを平衡にした後
、このカラムにサンプルを入れる。抗体を含有している
溶離した画分を、ピーク活性がなくなるまで集める。こ
のカラムを、ｐＨが７．２の０．１５ＰＢＳ緩衝液の１
０倍容積で洗浄する。

【０１５２】４．　　その後、このカラムを洗浄して免
疫親和力結合した抗体を除去する。このピーク画分を、
多様緩衝液変化で、０．１５Ｍ　ＰＢＳ、ｐＨ７．２に
対して４℃で２４〜３６時間透析する。

【０１５３】実施例７ 多クローン抗−（ＭＩ−ＤＢ）抗体 実施例６に記述した免疫化技術および日程を用い、実施
例５の操作に従って製造されたＭＩ−ＤＢ抗原に対する
多クローン抗血清を、ラビット中で誘発させる。ＭＩ−
ＰＡの代わりにＭＩ−ＤＢを用い、実施例６と同様の固
相測定法で、この抗血清をスクリーニングして、多クロ
ーン抗−（ＭＩ−ＤＢ）抗体を得る。

【０１５４】実施例８ 多クローン抗−（ＣＫ−ＭＭ）抗体の製造フロインドア
ジュバンド中の精製したＣＫ−ＭＭイソエンチーム（Ｄ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｄａｌｌａｓ、　ＴＸ）２５０
μｇ（ミクログラム）を用いて、２週間の間隔で注射す
ることによりラビットまたはヤギを免疫化する。免疫化
１０週間後、抗体活性に関して試験出血を検査する。許
容される抗体タイターが得られるまで数カ月に渡って抗
血清を採取する。一般的には、ＧｏｍｅｚおよびＷｉｃ
ｋｓの米国特許番号４，３５３，９８２の操作に従って
、多クローン抗体を精製する。抗体は、ＣＫ−ＭＭの全
てのイソ型、ＣＫ−ＭＭＡ、ＣＫ−ＭＭＢ、およびＣＫ
−ＭＭＣ、並びにコンタミとして存在している他の蛋白
質と反応する。

【０１５５】実施例９ 多クローン抗−（ＣＫ−ＭＭイソ型）抗体の製造Ｖａｉ
ｄｙａ他、　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａＡｃｔａ．７９０：２３０−２３７　（１９
８４）の方法により、全ＣＫ−ＭＭ心臓抽出物からＣＫ
−ＭＭＡイソ型が得られる。Ｖａｉｄｙａ（上記）の方
法によって、ＣＫ−ＭＭＢイソ型およびＣＫ−ＭＭＣイ
ソ型が得られた後、Ｐｅｒｒｙｍａｎ他、　Ｃｌｉｎ．
　Ｃｈｅｍ．　３０：６６２　（１９８４）の方法によ
り、ＣＫ−ＭＭＡをＣＫ−ＭＭＢおよびＣＫ−ＭＭＣに
変換する。ＭＩ−Ｐ抗原の代わりにそれぞれＣＫ−ＭＭ
Ａイソ型、ＣＫ−ＭＭＢイソ型、およびＣＫ−ＭＭＣイ
ソ型を用いて実施例６の操作を繰り返して、抗−（ＣＫ
−ＭＭ）抗体の混合物を含有している抗血清を得る。

【０１５６】実施例６の段階３のカラムを、ｐＨが７．
２の０．１５ＰＢＳ緩衝液の１０倍容積で洗浄する。そ
の後、免疫親和力結合している抗体を除去するため、こ
のカラムを蒸留水で洗浄する。この排出した容積と同じ
容積の、ＨＰＬＣグレードの蒸留水をこのカラム中に流
し、そして６時間で溶離を停止する。次に、１５〜２０
ｍＬ／時の速度で更に、蒸留水を用いてこのカラムを溶
離させ、溶離したサンプルおよび保持されているピーク
画分を採取する。このピーク画分を、多様緩衝液変化で
、０．１５Ｍ　ＰＢＳ、ｐＨ７．２に対して４℃で２４
〜３６時間透析する。

【０１５７】抗−（ＣＫ−ＭＭＡ）抗体を分離するため
、ＣＫ−ＭＭＢ、ＣＫ−ＭＭＣおよびＣＫ−ＭＢと結合
するアフィニティーカラムを用い、該溶離剤を用いてこ
の操作を繰り返し、ＣＫ−ＭＭＢ、ＣＫ−ＭＭＣおよび
ＣＫ−ＭＢイソ型とは有意に結合しない抗−（ＣＫ−Ｍ
ＭＡ）抗体を含有している最終的な溶離剤を得る。

【０１５８】抗−（ＣＫ−ＭＭＢ）抗体を分離するため
、ＣＫ−ＭＭＡ、ＣＫ−ＭＭＣおよびＣＫ−ＭＢと結合
するアフィニティーカラムを用い、該溶離剤を用いてこ
の操作を繰り返し、ＣＫ−ＭＭＡ、ＣＫ−ＭＭＣおよび
ＣＫ−ＭＢイソ型とは有意に結合しない抗−（ＣＫ−Ｍ
ＭＢ）抗体を含有している最終的な溶離剤を得る。

【０１５９】抗−（ＣＫ−ＭＭＣ）抗体を分離するため
、ＣＫ−ＭＭＡ、ＣＫ−ＭＭＢおよびＣＫ−ＭＢと結合
するアフィニティーカラムを用い、該溶離剤を用いてこ
の操作を繰り返し、ＣＫ−ＭＭＡ、ＣＫ−ＭＭＢおよび
ＣＫ−ＭＢイソ型とは有意に結合しない抗−（ＣＫ−Ｍ
ＭＣ）抗体を含有している最終的な溶離剤を得る。

【０１６０】実施例１０ 多クローン抗−（ＣＫ−ＭＭイソ型）抗体の製造ＣＫ−
ＭＭイソ型の画分の代わりに、完全フロインドアジュバ
ンド中に乳化させた精製ＣＫ−ＭＭイソ型を用いて、実
施例２の免疫化プロトコルを繰り返す。Ｖａｉｄｙａ他
、　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ
ａ　Ａｃｔａ．７９０：２３０−２３７　（１９８４）
の方法により、ＣＫ−ＭＭＡが得られる。Ｖａｉｄｙａ
（上記）の方法によって、ＣＫ−ＭＭＢイソ型およびＣ
Ｋ−ＭＭＣイソ型が得られた後、Ｐｅｒｒｙｍａｎ他、
　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　３０：６６２　（１９８４
）の方法により、ＣＫ−ＭＭＡをＣＫ−ＭＭＢおよびＣ
Ｋ−ＭＭＣに変換する。融合８日後の固相放射能免疫測
定法を用いて、ＣＫ−ＭＭに対して特異的な抗体に関す
るスクリーニングを行い、実施例２の細胞融合およびス
クリーニング操作を繰り返す。培養拡張、ハイブリドー
マのクローン化、腹水の製造、および単クローン抗体の
精製は、同様に、実施例２の操作に従う。 抗体のスクリーニングは、一般に、実施例９の操作に従
う。ＣＫ−ＭＭＡ、ＣＫ−ＭＭＢ、ＣＫ−ＭＭＣ、ＣＫ
−ＭＭＡ＋Ｂ、ＣＫ−ＭＭＡ＋Ｃ、およびＣＫ−ＭＭＢ
＋Ｃに対する抗体を製造する。

【０１６１】実施例１１ 多クローンおよび単クローン抗体の放射能標識Ｆｒａｋ
ｅｒ他、　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅ
ｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　８０：８４９　（１９７８）、
米国特許番号４，６２４，９１６に記述されているよう
な修飾（これらの内容はここではその全体が参照に入れ
られる）の「イオドゲン」方法を用いて、多クローンお
よび単クローン抗体を１２５Ｉ標識する。

【０１６２】実施例１２ 磁化可能粒子の固定化 磁化可能粒子を、Ｓｅｒａｄｙｎｅ、　Ｉｎｃ．　（Ｉ
ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ　４６２６６）から入
手した。Ｔｉｊｓｓｅｎ、　「酵素免疫測定法の実施お
よび理論」（ＰＲＡＣＴＩＣＥ　ＡＮＤ　ＴＨＥＯＲＹ
　ＯＦＥＮＺＹＭＥＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹＳ）を修飾
した受動吸収および免疫化学固定化技術の組み合わせに
より、単クローン抗体をこれらの粒子上に固定化した。 Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅ
ｒｓ　Ｂ．Ｖ．　（１９８５）、　３０１−３１１頁、
これらの内容はここではその全体が参照に入れられる。

【０１６３】実施例１３ 磁化可能粒子を使用した試験方法 ＣＫ−基質（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ
）と共に臨床化学スペクトロホトメーター、ＡＢＡ−１
００（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｎ
ｏｒｔｈ　Ｃｈｉｃａｇｏ、　ＩＬ　６００４８）を用
いた。

【０１６４】試験サンプルの第一部分中のＣＫの酵素活
性を測定した。この試験サンプルのもう１つの部分を、
ヤギの抗−（マウスＩｇＧ）抗体を固定化させた磁化可
能粒子０．０１μｇを含む固相試薬と反応させた。ＣＫ
−ＭＭＣに特異的な単クローン抗体（ハイブリドーマＡ
ＴＣＣ　ＨＢ９９１４から誘導）の希釈液を、このサン
プルとの反応に先立って、該粒子に加えた。反応後、こ
の粒子を沈降させた後、上澄み液の酵素活性を測定した
。２つの活性測定値の差は、除去したＣＫ−ＭＭの量に
比例していた。ＣＫ−ＭＭＣ：全ＣＫの比率は、ＡＭＩ
が生じてからの時間的経過を見積もるために使用できる
。この梗塞が近い場合、この比率は小さくなる。

【０１６５】実施例１４ ＭＩ−ＤＢ抗体を用いた推奨診断 以下に示す試験結果は、抗−（ＭＩ−ＤＢ）抗体を用い
たＭＩ−ＤＢ分析物の測定に関する臨床的有用性を示し
ている。心筋梗塞にかかっていると思われる患者から一
連の標本を採取し、米国特許番号４，６２４，９１６に
記載されている免疫放射能ＱＵＩＣＫ−ＭＢ測定法（Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ．、　１９００　
ＷｙａｔｔＤｒｉｖｅ、　Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒａ、　
ＣＡ　９５０５４）で試験した。ＬＤ異常を検査するた
め電気泳動法を用いた。ＬＤのイソエンチーム画分１と
２の比率が反転したときを、急性の梗塞が最近生じたこ
との指示とした。ＣＫ−ＭＢに関する３．３ＥＵ／Ｌ以
上の一過的上昇は、急性心筋梗塞を示唆しているもので
ある。分析物ＭＩ−ＤＢ濃度が２０％（＝２００ＥＵ／
Ｌ）であるときは異常である。

【０１６６】抗体濃度が制限されていることを除いて実
施例１３の操作に従う。

【０１６７】

【表４】

【０１６８】（ａ）　　最も高い標準の％、おおよそ１
０００ＥＵ／Ｌと同等。

【０１６９】（ｂ）　　ＣＫ−ＭＢと比較して、より早
くＭＩ−ＤＢにより検出されるところの、可能性のある
再梗塞。

【０１７０】（ｃ）　　ＣＫ−ＭＢレベルはまだ降下し
ているが、より早くＭＩ−ＤＢにより検出されるところ
の、再梗塞を生じる患者。

【０１７１】（ｄ）　　ＭＩ−ＤＢによる早い検出。

【０１７２】（ｅ）　　患者は、ＬＤイソエンチーム異
常（ＬＤ）急動を示し、これは、ＡＭＩに関する遅延確
認を示していた。ＣＫ−ＭＢ測定で正常なサンプル、Ｍ
Ｉ−ＤＢ測定で異常なサンプル。

【０１７３】実施例１５ サンドイッチ免疫測定法 制限した量の、固定化した一次抗体を用いて、実施例１
４の操作を繰り返す。このサンドイッチ免疫測定法は、
最近起きた梗塞のみを決定するためにするために設計し
たものである。固定化した一次抗体、即ち抗−（ＭＩ−
ＰＡ）抗体の量を制限し、そして低レベルのＭＩ−ＰＡ
のみを示すように設計されている。正常時、ＭＩ−ＰＡ
は患者の血清中に存在していないか、或は効能的には存
在していない程の低いレベルでのみ存在している。この
梗塞の初期段階で、ＭＩ−ＰＡのレベルが上昇する。こ
の測定法のデザインにより、ＭＩ−Ｐのレベルが上昇す
ると、この固相が飽和されてくるため、この上昇した量
は該液相中に存在するようになる。２番目の抗体は、１
２５Ｉ標識したＭＩ−ＤＢ、即ち実施例１１の操作に従
う生産された抗−（ＭＩ−ＤＢ）抗体である。

【０１７４】この固相が全てのＭＩ−ＰＡと結合できる
場合、該液相中に過剰分は存在していなく、そしてこの
標識した抗−（ＭＩ−ＤＢ）抗体の全ては該固相と結合
するために利用され得る。ＣＫのレベルが上昇するにつ
れて、この標識した抗体の上昇量は液相中に存在するよ
うになる。この設計により、該分析物対のレベルが高く
かつ全ＣＫのレベルが低いときのみ、高レベルの結合活
性を示す。下記の結果が得られた。

【０１７５】

【表５】

【０１７６】ここで見られるように、いかなる与えたパ
ーセントレベルの分析物対でも、分当たりの最大カウン
ト数が全ＣＫのレベルで生じる。全ＭＩにおけるいかな
るより一層の上昇もカウント数の減少を生じさせる。

【０１７７】実施例１６ ＣＫ−ＭＭＣ免疫測定法 ハイブリドーマＡＴＣＣ　ＨＢ９９１４が生産した単ク
ローン抗−（ＣＫ−ＭＭＣ）抗体を、血漿サンプル中の
ＣＫ−ＭＭＣ測定のための一次抗体として使用する。２
番目の抗体は標識したヤギの抗−（ＣＫ−ＭＭ）抗体で
ある。全ＣＫ−ＭＭ測定のための分析に関しては、ラビ
ットの抗−（ＣＫ−ＭＭ）が一次抗体であり、そして２
番目の抗体は標識したヤギの抗−（ＣＫ−ＭＭ）抗体で
ある。表Ｆに示す結果が得られた。予測されていた如く
、全ＣＫ−ＭＭが減少するにつれてＣＫ−ＭＭＣのパー
セントは上昇した。

【０１７８】

【表６】

【０１７９】（ａ）　　患者Ａ、ＤおよびＥで見られと
ころの、高ＣＫ−ＭＢ値としてこれらの高い値から減少
する電気泳動比は、後期段階の梗塞を表している。

【０１８０】（ｂ）　　初期段階の梗塞を有する患者Ｂ
およびＣに、ＣＫ−ＭＭＣの低い全パーセントが見られ
た。

【０１８１】実施例１７ ＣＫ−ＭＢＢ免疫測定法 ヤギの抗−（マウスＩｇＧ）抗体が固定化してある磁化
可能な粒子に、ＣＫ−ＭＢＢに対して特異的な単クロー
ン抗体（ハイブリドーマＡＴＣＣ　ＨＢ９９１４から誘
導）の希釈液を加えた。ヤギの抗−（マウスＩｇＧ）抗
体が固定化してある磁化可能な粒子のもう１つの一定分
量に、ＣＫ−ＭＭに対して特異的な単クローン抗体（Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ．、　Ｓａｎｔａ
　Ｃｌａｒａ　ＣＡから商業的に入手可能）の希釈液を
加えた。実施例１１に記述したのと同様にして、抗−（
ＣＫ−ＢＢ）抗体（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｍ
ｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉ
ｎｃ．、Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒａ　ＣＡから商業的に入
手可能）を１２５Ｉで標識した。抗−（ＣＫ−ＭＭ）抗
体および抗−（ＣＫ−ＢＢ）抗体は、ＣＫ−ＭＢＡおよ
びＣＫ−ＭＢＢイソ型の両方と結合し、そしてこの分析
法において、抗−（ＣＫ−ＭＢＡ＋Ｂ）抗体として機能
する。

【０１８２】抗−（ＣＫ−ＭＭ）をコートした磁化可能
粒子２５０μＬを有する固相試薬、および１００μＬの
１２５Ｉ抗−（ＣＫ−ＢＢ）抗体と、上記試験サンプル
の一部とを反応させて、ＣＫ−ＭＢＡ＋Ｂの濃度を測定
した。抗−（ＣＫ−ＭＢＢ）をコートした磁化可能粒子
２５０μＬを有する固相試薬、および１００μＬの１２
５Ｉ抗−（ＣＫ−ＢＢ）抗体と、上記試験サンプルのも
う一部とを反応させて、ＣＫ−ＭＢＢの濃度を測定した
。２０分後、この粒子を沈澱させ、上澄み液を吸引した
後、結合したカウント数を測定した。ＣＫ−ＭＢＢ：全
ＣＫ−ＭＢ（ＣＫ−ＭＢＡ＋Ｂ）の比率は、ＡＭＩが生
じてからの時間的経過を見積もるために使用できる。こ
の梗塞が近い場合、この比率は小さくなる。

【０１８３】実施例１８ 単クローン抗−（ＣＫ−ＢＢイソ型）抗体の製造実施例
１と同様にして心臓組織から精製したＣＫ−ＭＢを抗原
として用いた。免疫化、細胞融合、細胞培養および抗体
スクリーニング拡張、およびハイブリドーマクローン化
は、実施例２と同様にして行った。抗体に関するスクリ
ーニングは、ＣＫ−ＢＢＡおよびＣＫ−ＢＢＢ（ＣＫ−
ＢＢＡとカルボキシペプチダーゼとの反応を通してイン
ビトロで製造）を分析物として用いた免疫計量測定法で
行った。ミクロタイタープレート上に上澄み液または腹
水を固定化した後、標識として多クローンラビット１２
５Ｉ−抗−ＣＫ−ＢＢ、ヤギの抗−ラビット（ＩｇＧ）
複合体または１２５Ｉ−ヤギ抗−ＣＫ−ＭＭを用いた。 １２５Ｉ誘導体は、実施例１１と同様にして製造した。 多クローンラビット抗−ＣＫ−ＢＢを製造するため、実
施例８と同様にして、精製したＣＫ−ＢＢ（Ｄｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、　Ｄａｌｌａｓ、　ＴＸ）を用いた。ハイブ
リドーマ（番号１４として表される）から下記の結果が
得られた。

【０１８４】

【表７】

【０１８５】表中に示した結果から見られるように、Ｃ
Ｋ−ＢＢＡイソ型とは優先的に反応するがＣＫ−ＢＢＣ
イソ型とは実際上反応しない抗体を、ハイブリドーマ１
４が分泌した。このように、カルボキシペプチダーゼと
の反応に先行しているイソ型に対して、この抗体は特異
的である。この結果は驚くべきことである、何故ならば
、ＣＫ−ＢＢの劣化は文献中に報告されていなかったか
らである。

【０１８６】本発明の特徴および態様は以下のとうりで
ある。

【０１８７】１．　　（ａ）　　血清もしくは血漿サン
プル中の、一過的に上昇した物質、上記一過的に上昇し
た物質の内因的に変化した形態、およびそれらの組み合
わせから成る群から選択される少なくとも１つを含む第
一分析物セットの濃度を測定し、（ｂ）　　このサンプ
ル中の、一過的に上昇した物質、上記一過的に上昇した
物質の内因的に変化した形態、およびそれらの組み合わ
せから成る群から選択される少なくとも１つを含む第二
分析物セットの濃度を測定し（ここで、この分析物セッ
トの濃度が、一過的に上昇した物質およびこの一過的に
上昇した物質の内因的に変化した形態の濃度を決定する
）、そして（ｃ）　　該第一と第二分析物セットの比率
を測定する（ここで、この第一および第二分析物セット
の比率が、急性な出来事が生じてからの時間的経過の指
示を与える）、ことを含む、患者に急性な生物学的出来
事が起きてからの時間的経過を測定するための免疫測定
方法。

【０１８８】２．　　該第一および第二分析物セットの
各々がＣＫ−ＭＭＡ、ＣＫ−ＭＭＢ、ＣＫ−ＭＭＣ、Ｃ
Ｋ−ＭＢＡ、ＣＫ−ＭＢＢ、ＭＩ−ＰＡ、ＭＩ−ＤＢ、
およびそれらの組み合わせから成る群から選択される第
１項記載の方法。

【０１８９】３．　　該第一および第二分析物セット中
の該一過的に上昇した物質が同一でない第１項記載の方
法。

【０１９０】４．　　該第一および第二分析物セットが
、（ａ）　　１つの分析物セットがＭＩ−ＰＡでありそ
してもう１つの分析物セットがＭＩ−ＤＢである；（ｂ
）　　１つの分析物セットがＣＫ−ＭＭＡ＋Ｂ＋Ｃであ
りそしてもう１つの分析物セットがＣＫ−ＭＭＣである
；（ｃ）　　１つの分析物セットがＣＫ−ＭＭＡ＋Ｂで
ありそしてもう１つの分析物セットがＣＫ−ＭＭＣであ
る；（ｄ）　　１つの分析物セットがＣＫ−ＭＢＡ＋Ｂ
でありそしてもう１つの分析物セットがＣＫ−ＭＢＢで
ある；（ｅ）　　１つの分析物セットがＣＫ−ＭＢＡ＋
Ｂでありそしてもう１つの分析物セットがＣＫ−ＭＢＡ
である；（ｆ）　　１つの分析物セットがＣＫ−ＭＢＡ
でありそしてもう１つの分析物セットがＣＫ−ＭＢＢで
ある；そして （ｇ）　　１つの分析物セットがＣＫ−ＢＢＡでありそ
してもう１つの分析物セットがＣＫ−ＢＢＣである；か
ら成る群から選択される第２項の方法。

【０１９１】５．　　該急性生物学的出来事が心筋梗塞
である第１項記載の方法。

【０１９２】６．　　（ａ）　　血清サンプル中のいず
れかのＭＩ−ＤＢと抗体とを結合させるのに充分な時間
、血清サンプルを抗（ＭＩ−ＤＢ）抗体と接触させ、そ
して（ｂ）　　抗（ＭＩ−ＤＢ）抗体と結合したＭＩ−
ＤＢを測定する、ことを含む、心筋梗塞の発病を測定す
る方法。

【０１９３】７．　　該抗（ＭＩ−ＤＢ）抗体を不溶支
持体に結合させ、ＭＩ−ＤＢと抗（ＭＩ−ＤＢ）抗体と
を結合させるのに充分な時間、該不溶支持体を該血清サ
ンプルに接触させ、そして該不溶支持体に結合したＭＩ
−ＰＡの量を測定する第６項の方法。

【０１９４】８．　　ＭＩ−ＤＢを不溶支持体に結合さ
せ、ＭＩ−ＤＢと抗（ＭＩ−ＤＢ）抗体とを結合させる
のに充分な時間、該不溶支持体を、該血清サンプルと標
識したＭＩ−ＤＢとの混合物に接触させ、そして該不溶
支持体上の標識の量または該混合物中に残存する標識の
量を測定する第６項の方法。

【０１９５】９．　　ＣＫ−ＭＭイソ型と抗（ＣＫ−Ｍ
Ｍイソ型）抗体とを結合させるのに充分な時間、該血清
サンプルを抗（ＣＫ−ＭＭイソ型）抗体に接触させ、そ
して抗（ＣＫ−ＭＭイソ型）抗体と結合した該ＣＫ−Ｍ
Ｍイソ型を測定することを含む、血清サンプル中のＣＫ
−ＭＭイソ型のレベルの測定方法。

【０１９６】１０．　　該ＣＫ−ＭＭイソ型がＣＫ−Ｍ
ＭＡ、ＣＫ−ＭＭＢ、およびＣＫ−ＭＭＣから成る群か
ら選択される第９項の方法。

【０１９７】１１．　　抗（ＣＫ−ＭＭイソ型）抗体を
不溶支持体に結合させ、そして該不溶支持体に結合した
ＣＫ−ＭＭイソ型の量を測定する第９項の方法。

【０１９８】１２．　　受託番号がＡＴＣＣ　ＨＢ９９
１３のハイブリドーマ。

【０１９９】１３．　　第１２項のハイブリドーマによ
って生産される抗体。

【０２００】１４．　　受託番号がＡＴＣＣ　ＨＢ９９
１２のハイブリドーマ。

【０２０１】１５．　　第１４項のハイブリドーマによ
って生産される抗体。

【０２０２】１６．　　受託番号がＡＴＣＣ　ＨＢ９９
１４のハイブリドーマ。

【０２０３】１７．　　第１６項のハイブリドーマによ
って生産される抗体。

【０２０４】１８．　　受託番号がＡＴＣＣ　ＨＢ　　
　　　　　　の抗ＣＫ−ＢＢＡ抗体を生産するハイブリ
ドーマ。

【０２０５】１９．　　第１８項のハイブリドーマによ
って生産される抗体。

【０２０６】２０．　　心筋梗塞の発病或は心筋梗塞が
おきてからの時間的経過のどちらかを測定するための、
適切な容器中の、抗（ＭＩ−ＰＡ）抗体、抗（ＭＩ−Ｄ
Ｂ）抗体、抗（ＭＩ−ＤＢ）抗体、抗（ＣＫ−ＭＭＡ）
抗体、抗（ＣＫ−ＭＭＢ）抗体および抗（ＣＫ−ＭＭＡ
＋Ｂ）抗体から成る群から選択される抗体を含む免疫測
定キット。

【０２０７】２１．　　サンプルを抗ＣＫ−ＢＢＡと相
互作用させ、そして結合する抗体の量を測定することを
含む、サンプル中のＣＫ−ＢＢＡ量の測定方法。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　（ａ）　　血清もしくは血漿サンプル
   中の、一過的に上昇した物質、上記一過的に上昇した物
   質の内因的に変化した形態、およびそれらの組み合わせ
   から成る群から選択される少なくとも１つを含む第一分
   析物セットの濃度を測定し、（ｂ）　　このサンプル中
   の、一過的に上昇した物質、上記一過的に上昇した物質
   の内因的に変化した形態、およびそれらの組み合わせか
   ら成る群から選択される少なくとも１つを含む第二分析
   物セットの濃度を測定し（ここで、この分析物セットの
   濃度が、一過的に上昇した物質およびこの一過的に上昇
   した物質の内因的に変化した形態の濃度を決定する）、
   そして（ｃ）　　該第一と第二分析物セットの比率を測
   定する（ここで、この第一および第二分析物セットの比
   率が、急性な出来事が生じてからの時間的経過の指示を
   与える）、ことを含む、患者に急性な生物学的出来事が
   起きてからの時間的経過を測定するための免疫測定方法
   。
2. 【請求項２】　　（ａ）　　血清サンプル中のいずれか
   のＭＩ−ＤＢと抗体とを結合させるのに充分な時間、血
   清サンプルを抗（ＭＩ−ＤＢ）抗体と接触させ、そして
   （ｂ）　　抗（ＭＩ−ＤＢ）抗体と結合したＭＩ−ＤＢ
   を測定する、ことを含む、心筋梗塞の発病を測定する方
   法。
3. 【請求項３】　　ＣＫ−ＭＭイソ型と抗（ＣＫ−ＭＭイ
   ソ型）抗体とを結合させるのに充分な時間、該血清サン
   プルを抗（ＣＫ−ＭＭイソ型）抗体に接触させ、そして
   抗（ＣＫ−ＭＭイソ型）抗体と結合した該ＣＫ−ＭＭイ
   ソ型を測定することを含む、血清サンプル中のＣＫ−Ｍ
   Ｍイソ型のレベルの測定方法。
4. 【請求項４】　　受託番号がＡＴＣＣ　ＨＢ９９１３の
   ハイブリドーマ。
5. 【請求項５】　　請求項４のハイブリドーマによって生
   産される抗体。
6. 【請求項６】　　受託番号がＡＴＣＣ　ＨＢ９９１２の
   ハイブリドーマ。
7. 【請求項７】　　請求項６のハイブリドーマによって生
   産される抗体。
8. 【請求項８】　　受託番号がＡＴＣＣ　ＨＢ９９１４の
   ハイブリドーマ。
9. 【請求項９】　　請求項８のハイブリドーマによって生
   産される抗体。
10. 【請求項１０】　　受託番号がＡＴＣＣ　ＨＢ　　　　
    　　　　の抗ＣＫ−ＢＢＡ抗体を生産するハイブリドー
    マ。
11. 【請求項１１】　　請求項１０のハイブリドーマによっ
    て生産される抗体。
12. 【請求項１２】　　心筋梗塞の発病或は心筋梗塞がおき
    てからの時間的経過のどちらかを測定するための、適切
    な容器中の、抗（ＭＩ−ＰＡ）抗体、抗（ＭＩ−ＤＢ）
    抗体、抗（ＭＩ−ＤＢ）抗体、抗（ＣＫ−ＭＭＡ）抗体
    、抗（ＣＫ−ＭＭＢ）抗体および抗（ＣＫ−ＭＭＡ＋Ｂ
    ）抗体から成る群から選択される抗体を含む免疫測定キ
    ット。
13. 【請求項１３】　　サンプルを抗ＣＫ−ＢＢＡと相互作
    用させ、そして結合する抗体の量を測定することを含む
    、サンプル中のＣＫ−ＢＢＡ量の測定方法。