JP2000074917A - ジアセチルポリアミンの測定法及びキット - Google Patents
ジアセチルポリアミンの測定法及びキットInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 試料中のジアセチルポリアミンをイムノアッ
セイにより特異的に測定する方法及び該方法に使用する
キットを提供することを目的とする。 【解決手段】 癌患者の尿サンプル等の試料を、あらか
じめアミンオキシダーゼなどの一級アミノ基を修飾でき
る酵素で処理して、該試料中のジアセチルスペルミン、
ジアセチルスペルミジン等のジアセチルポリアミンをイ
ムノアッセイによって測定することにより、該試料中に
存在する夾雑物質であるポリアミン及びモノアセチルポ
リアミンの測定値への悪影響を抑えて、該試料中のジア
セチルポリアミンを特異的にかつ感度よく測定すること
ができる。
セイにより特異的に測定する方法及び該方法に使用する
キットを提供することを目的とする。 【解決手段】 癌患者の尿サンプル等の試料を、あらか
じめアミンオキシダーゼなどの一級アミノ基を修飾でき
る酵素で処理して、該試料中のジアセチルスペルミン、
ジアセチルスペルミジン等のジアセチルポリアミンをイ
ムノアッセイによって測定することにより、該試料中に
存在する夾雑物質であるポリアミン及びモノアセチルポ
リアミンの測定値への悪影響を抑えて、該試料中のジア
セチルポリアミンを特異的にかつ感度よく測定すること
ができる。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、試料中のジアセチ
ルポリアミンをイムノアッセイにより測定する方法およ
び該方法に使用するキットに関するものである。
ルポリアミンをイムノアッセイにより測定する方法およ
び該方法に使用するキットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】癌患者の尿サンプル中のポリアミン濃度
は健常者の尿サンプル中の当該濃度より高値を示すこと
から、ポリアミンが癌の診断用マーカーとして期待され
ていたが、偽陽性、偽陰性共に多く観察され、ポリアミ
ンが癌の診断用マーカーとして臨床検査上採用されるに
は至っていない。しかし最近、ジアセチルスペルミン、
ジアセチルスペルミジンなどのポリアミンのジアセチル
体（ジアセチルポリアミン）が、癌の診断、治療効果の
判定及びマーカーとして有用であることが報告されてい
る（J. Cancer Res. Clin. Oncol., 121:317-319(199
5)、 J. Cancer Res. Clin. Oncol., 123:539-545(199
7))。
は健常者の尿サンプル中の当該濃度より高値を示すこと
から、ポリアミンが癌の診断用マーカーとして期待され
ていたが、偽陽性、偽陰性共に多く観察され、ポリアミ
ンが癌の診断用マーカーとして臨床検査上採用されるに
は至っていない。しかし最近、ジアセチルスペルミン、
ジアセチルスペルミジンなどのポリアミンのジアセチル
体（ジアセチルポリアミン）が、癌の診断、治療効果の
判定及びマーカーとして有用であることが報告されてい
る（J. Cancer Res. Clin. Oncol., 121:317-319(199
5)、 J. Cancer Res. Clin. Oncol., 123:539-545(199
7))。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来、ポリアミン、ジ
アセチルポリアミンなどのポリアミン類の測定は高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法が主流であるもの
の、多数の検体サンプルを短時間で処理できない、測定
機器のメンテナンス及び精度管理が煩雑であるなどのＨ
ＰＬＣ法に共通する問題を有し、必ずしも満足し得る方
法ではなかった。
アセチルポリアミンなどのポリアミン類の測定は高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法が主流であるもの
の、多数の検体サンプルを短時間で処理できない、測定
機器のメンテナンス及び精度管理が煩雑であるなどのＨ
ＰＬＣ法に共通する問題を有し、必ずしも満足し得る方
法ではなかった。
【０００４】このようなＨＰＬＣ法に代わり、イムノア
ッセイも種々検討されてきたが、尿サンプル中には測定
目的のジアセチルポリアミンと構造類似の夾雑物質が多
数存在し、ジアセチルポリアミンのみに特異的な抗体を
通常の免疫手法で取得することは困難なことであった。
このため、イムノアッセイに使用する抗体は、アフィニ
ティ精製により基質特異性を改善してからでないと使用
することができず（生化学、６９巻，７号，８９８頁
（１９９７年）、J. Biochem., 121 1134-1138(199
7)）、このようなアフィニティ精製の手間等が臨床検査
で実際に使用する際のネックとなっていた。
ッセイも種々検討されてきたが、尿サンプル中には測定
目的のジアセチルポリアミンと構造類似の夾雑物質が多
数存在し、ジアセチルポリアミンのみに特異的な抗体を
通常の免疫手法で取得することは困難なことであった。
このため、イムノアッセイに使用する抗体は、アフィニ
ティ精製により基質特異性を改善してからでないと使用
することができず（生化学、６９巻，７号，８９８頁
（１９９７年）、J. Biochem., 121 1134-1138(199
7)）、このようなアフィニティ精製の手間等が臨床検査
で実際に使用する際のネックとなっていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ジアセチルポリ
アミンをイムノアッセイにて測定する場合、交差反応性
が問題となるポリアミン及びモノアセチルポリアミンを
アミンオキシダーゼ等の酵素により一級のアミノ基を修
飾することで交差反応性を減少させることができ、もっ
て目的とするジアセチルポリアミンを特異的に、かつ感
度よく測定できることを知見し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、サンプル中のジアセチルポリアミ
ンをイムノアッセイにより測定する方法において、測定
に供するサンプルを一級アミンを修飾できる酵素を用い
て処理することを特徴とする、ジアセチルポリアミンの
測定法及びそれに使用するキットに関するものである。
点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ジアセチルポリ
アミンをイムノアッセイにて測定する場合、交差反応性
が問題となるポリアミン及びモノアセチルポリアミンを
アミンオキシダーゼ等の酵素により一級のアミノ基を修
飾することで交差反応性を減少させることができ、もっ
て目的とするジアセチルポリアミンを特異的に、かつ感
度よく測定できることを知見し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、サンプル中のジアセチルポリアミ
ンをイムノアッセイにより測定する方法において、測定
に供するサンプルを一級アミンを修飾できる酵素を用い
て処理することを特徴とする、ジアセチルポリアミンの
測定法及びそれに使用するキットに関するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明方法で使用するサンプル
は、ジアセチルポリアミン、特にジアセチルスペルミン
および／またはジアセチルスペルミジンを含有するもの
であれば特に制限されない。そのようなサンプルを具体
的に例示すれば、尿、血清等を例示することができ、特
に尿サンプルが使用に好適である。
は、ジアセチルポリアミン、特にジアセチルスペルミン
および／またはジアセチルスペルミジンを含有するもの
であれば特に制限されない。そのようなサンプルを具体
的に例示すれば、尿、血清等を例示することができ、特
に尿サンプルが使用に好適である。
【０００７】本発明では、このようなイムノアッセイに
使用するサンプルを一級アミンを修飾できる酵素を用い
て処理することを特徴としている。一級アミンを修飾で
きる酵素としては、ジアセチルポリアミンと構造類似の
夾雑物質、特にポリアミン及びモノアセチルポリアミン
中の一級アミンを修飾（たとえば、酸化、アミノ基転
移、脱水素など）できる酵素であれば特に限定されな
い。そのような酵素を具体的に例示すれば、アミンオキ
シダーゼ、アミノトランスフェラーゼまたはデヒドロゲ
ナーゼを単独または組み合わせて使用すればよい。
使用するサンプルを一級アミンを修飾できる酵素を用い
て処理することを特徴としている。一級アミンを修飾で
きる酵素としては、ジアセチルポリアミンと構造類似の
夾雑物質、特にポリアミン及びモノアセチルポリアミン
中の一級アミンを修飾（たとえば、酸化、アミノ基転
移、脱水素など）できる酵素であれば特に限定されな
い。そのような酵素を具体的に例示すれば、アミンオキ
シダーゼ、アミノトランスフェラーゼまたはデヒドロゲ
ナーゼを単独または組み合わせて使用すればよい。
【０００８】酵素の使用形態としては、精製酵素、粗精
製酵素、未精製酵素などいずれの形態であってもよい。
たとえば、酵素としてアミンオキシダーゼを利用する場
合には、動物血清、特にウシ血清からの調製品またはウ
シ血清そのものを使用することができる。酵素処理は、
サンプル中に酵素を添加して、必要により撹拌しながら
１０〜４０℃で１０分〜４時間程度インキュベーション
することにより行うことができる。なお、上記酵素処理
はイムノアッセイ前に行うのが好ましいが、イムノアッ
セイと同時に行っても構わない。
製酵素、未精製酵素などいずれの形態であってもよい。
たとえば、酵素としてアミンオキシダーゼを利用する場
合には、動物血清、特にウシ血清からの調製品またはウ
シ血清そのものを使用することができる。酵素処理は、
サンプル中に酵素を添加して、必要により撹拌しながら
１０〜４０℃で１０分〜４時間程度インキュベーション
することにより行うことができる。なお、上記酵素処理
はイムノアッセイ前に行うのが好ましいが、イムノアッ
セイと同時に行っても構わない。
【０００９】酵素処理されたサンプル中のジアセチルポ
リアミンのイムノアッセイによる測定は、公知の方法ま
たはそれに準じて行うことができる。すなわち、使用す
る抗体としては、遊離のジアセチルポリアミンに結合
し、それらを測定できるものであれば、モノクローナル
抗体、ポリクローナル抗体のいずれの抗体であってもよ
い。特に、本発明においてはサンプルの酵素処理を特徴
としており、ジアセチルポリアミンのみに特異的な抗体
を使用する必要はなく、ジアセチルポリアミンと構造類
似の夾雑物質（たとえば、ポリアミン、モノアセチルポ
リアミンなど）と多少の交差反応性を有する抗体であっ
ても本発明で使用可能である。そのような抗体の調製は
既に報告されており、その公知の方法に準じて、または
それを改良して行うことができる（生化学、６９巻，７
号，８９８頁（１９９７年）、J. Biochem., 121 1134-
1138(1997)）。
リアミンのイムノアッセイによる測定は、公知の方法ま
たはそれに準じて行うことができる。すなわち、使用す
る抗体としては、遊離のジアセチルポリアミンに結合
し、それらを測定できるものであれば、モノクローナル
抗体、ポリクローナル抗体のいずれの抗体であってもよ
い。特に、本発明においてはサンプルの酵素処理を特徴
としており、ジアセチルポリアミンのみに特異的な抗体
を使用する必要はなく、ジアセチルポリアミンと構造類
似の夾雑物質（たとえば、ポリアミン、モノアセチルポ
リアミンなど）と多少の交差反応性を有する抗体であっ
ても本発明で使用可能である。そのような抗体の調製は
既に報告されており、その公知の方法に準じて、または
それを改良して行うことができる（生化学、６９巻，７
号，８９８頁（１９９７年）、J. Biochem., 121 1134-
1138(1997)）。
【００１０】使用する抗体は、抗体そのものでもよい
が、活性フラグメントを使用することもできる。活性フ
ラグメントとしては、Ｆ（ａｂ’）2 、Ｆａｂ’、Ｆａ
ｂなどの各種フラグメントで、測定上の機能が失われて
いないものであればよい。これら活性フラグメントの調
製は、精製抗体に対してパパイン、ペプシン、トリプシ
ン処理などの公知の方法を適用することで行うことがで
きる（例えば、「免疫生化学研究法（続生化学実験講座
５）」、日本生化学会編、８９頁（１９８６年）参
照）。
が、活性フラグメントを使用することもできる。活性フ
ラグメントとしては、Ｆ（ａｂ’）2 、Ｆａｂ’、Ｆａ
ｂなどの各種フラグメントで、測定上の機能が失われて
いないものであればよい。これら活性フラグメントの調
製は、精製抗体に対してパパイン、ペプシン、トリプシ
ン処理などの公知の方法を適用することで行うことがで
きる（例えば、「免疫生化学研究法（続生化学実験講座
５）」、日本生化学会編、８９頁（１９８６年）参
照）。
【００１１】このようにして調製された抗体またはその
活性フラグメントは、必要により選択した測定方法に適
した形態に修飾し、本発明に使用する。抗体の修飾は、
それぞれ常法に従って行うことができる。例えば、固相
化抗体を調製する場合、使用できる担体の材質として
は、抗体との結合性の高いものであれば特に制限され
ず、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、スチレン
−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−無水マレイン
酸共重合体、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリア
クリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン
などの合成有機高分子化合物、デキストラン誘導体（セ
ファデックスなど）、アガロースゲル（セファロース、
バイオゲルなど）、セルロース（ペーパーディスク、濾
紙など）などの多糖類、ガラス、シリカゲル、シリコー
ンなどの無機高分子化合物が挙げられ、これらはアミノ
基、アミノアルキル基、カルボキシル基、アシル基、水
酸基などの官能基を導入したものであってもかまわな
い。
活性フラグメントは、必要により選択した測定方法に適
した形態に修飾し、本発明に使用する。抗体の修飾は、
それぞれ常法に従って行うことができる。例えば、固相
化抗体を調製する場合、使用できる担体の材質として
は、抗体との結合性の高いものであれば特に制限され
ず、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、スチレン
−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−無水マレイン
酸共重合体、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリア
クリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン
などの合成有機高分子化合物、デキストラン誘導体（セ
ファデックスなど）、アガロースゲル（セファロース、
バイオゲルなど）、セルロース（ペーパーディスク、濾
紙など）などの多糖類、ガラス、シリカゲル、シリコー
ンなどの無機高分子化合物が挙げられ、これらはアミノ
基、アミノアルキル基、カルボキシル基、アシル基、水
酸基などの官能基を導入したものであってもかまわな
い。
【００１２】担体の形状としては、マイクロタイタープ
レート、ディスクなどの平板状、ビーズなどの粒子状、
試験管、チューブなどの管状、その他繊維状、膜状など
が例示され、測定法に応じて適宜選択することができ
る。固相担体への抗体の固定化は、物理的吸着法、イオ
ン結合法、共有結合法、包括法など公知の方法（例えば
「固定化酵素」千畑一郎編、昭和５０年３月２０日、
（株）講談社発行参照）を用いて行えばよい。このよう
にして得られた固相試薬は、非特異的結合を抑制するた
めに、ＢＳＡ、糖、スキムミルクなどの通常のブロッキ
ング剤を用いてブロッキング処理を施してもよい。
レート、ディスクなどの平板状、ビーズなどの粒子状、
試験管、チューブなどの管状、その他繊維状、膜状など
が例示され、測定法に応じて適宜選択することができ
る。固相担体への抗体の固定化は、物理的吸着法、イオ
ン結合法、共有結合法、包括法など公知の方法（例えば
「固定化酵素」千畑一郎編、昭和５０年３月２０日、
（株）講談社発行参照）を用いて行えばよい。このよう
にして得られた固相試薬は、非特異的結合を抑制するた
めに、ＢＳＡ、糖、スキムミルクなどの通常のブロッキ
ング剤を用いてブロッキング処理を施してもよい。
【００１３】また、標識化抗体または標識化抗原を調製
する場合、使用する標識体としては、放射性同位体（32
Ｐ、3 Ｈ、14Ｃ、125 Ｉなど）、酵素（β−ガラクトシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼな
ど）、補酵素・補欠分子族（ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、
ビオチン、ヘムなど）、蛍光色素（フルオレセイン誘導
体、ローダミン誘導体など）、金属粒子（金、銀、白金
など）などを使用することができる。抗体または抗原の
標識化は、選択した標識剤に適した公知の方法（例えば
「続生化学実験講座５免疫生化学研究法」（株）東京化
学同人、（１９８６年発行）第１０２〜１１２頁参照）
に従って行えばよい。また、アビジン−ビオチン等を介
して抗体または抗原を標識することもできる。
する場合、使用する標識体としては、放射性同位体（32
Ｐ、3 Ｈ、14Ｃ、125 Ｉなど）、酵素（β−ガラクトシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼな
ど）、補酵素・補欠分子族（ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、
ビオチン、ヘムなど）、蛍光色素（フルオレセイン誘導
体、ローダミン誘導体など）、金属粒子（金、銀、白金
など）などを使用することができる。抗体または抗原の
標識化は、選択した標識剤に適した公知の方法（例えば
「続生化学実験講座５免疫生化学研究法」（株）東京化
学同人、（１９８６年発行）第１０２〜１１２頁参照）
に従って行えばよい。また、アビジン−ビオチン等を介
して抗体または抗原を標識することもできる。
【００１４】イムノアッセイで採用する測定手順として
は、競合法、凝集法など公知の手順のいずれであっても
よい。採用した測定手順の具体的な操作法に関しては、
たとえば下記の文献を参照することができる。 (a) 入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（（株）講
談社、昭和５４年５月１日発行） (b) 石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）
（（株）医学書院、１９８２年１２月１５日発行） (c) 臨床病理 臨時増刊 特集第５３号「臨床検査のた
めのイムノアッセイ−技術と応用−」（臨床病理刊行
会、１９８３年発行） (d) 「バイオテクノロジー事典」（（株）シーエムシ
ー、１９８６年１０月９日発行）
は、競合法、凝集法など公知の手順のいずれであっても
よい。採用した測定手順の具体的な操作法に関しては、
たとえば下記の文献を参照することができる。 (a) 入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（（株）講
談社、昭和５４年５月１日発行） (b) 石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）
（（株）医学書院、１９８２年１２月１５日発行） (c) 臨床病理 臨時増刊 特集第５３号「臨床検査のた
めのイムノアッセイ−技術と応用−」（臨床病理刊行
会、１９８３年発行） (d) 「バイオテクノロジー事典」（（株）シーエムシ
ー、１９８６年１０月９日発行）
【００１５】(e) 特公平６−４３９９８号公報、特開昭
５５−１５１００号公報、特開昭５２−１４８６２０号
公報及び特開昭５４−９１２９６号公報 (f) 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.70」(Immunochemica
l techniques (Part A)) (g) 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.73」(Immunochemica
l techniques (Part B)) (h) 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.74」(Immunochemica
l techniques (Part C)) (i) 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.84」(Immunochemica
l techniques (Part D:Selected Immunoassay)） (j) 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.92」(Immunochemica
l techniques (Part E:Monoclonal Antibodies and Gen
eral Immunoassay Methods)) ［（ｆ）〜（ｊ）はアカデミックプレス社発行］
５５−１５１００号公報、特開昭５２−１４８６２０号
公報及び特開昭５４−９１２９６号公報 (f) 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.70」(Immunochemica
l techniques (Part A)) (g) 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.73」(Immunochemica
l techniques (Part B)) (h) 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.74」(Immunochemica
l techniques (Part C)) (i) 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.84」(Immunochemica
l techniques (Part D:Selected Immunoassay)） (j) 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.92」(Immunochemica
l techniques (Part E:Monoclonal Antibodies and Gen
eral Immunoassay Methods)) ［（ｆ）〜（ｊ）はアカデミックプレス社発行］
【００１６】このような公知の測定手順の中から競合法
を例に挙げて具体的に説明すれば、固相化抗ジアセチル
ポリアミン抗体に対し、酵素処理したサンプル中の遊離
のジアセチルポリアミンと一定濃度の標識化ジアセチル
ポリアミンとを競合反応させ、固相と液相を分離（ＢＦ
分離）後、いずれか一方の相の標識量を測定すること
で、サンプル中の遊離のジアセチルポリアミンを検出ま
たは定量することができる。
を例に挙げて具体的に説明すれば、固相化抗ジアセチル
ポリアミン抗体に対し、酵素処理したサンプル中の遊離
のジアセチルポリアミンと一定濃度の標識化ジアセチル
ポリアミンとを競合反応させ、固相と液相を分離（ＢＦ
分離）後、いずれか一方の相の標識量を測定すること
で、サンプル中の遊離のジアセチルポリアミンを検出ま
たは定量することができる。
【００１７】本発明のキットは、少なくとも、抗ジアセ
チルポリアミン抗体と一級アミンを修飾できる酵素を構
成試薬として含有する。上記競合法を例に挙げ、実施す
るためのキットの構成試薬を具体的に説明すれば、たと
えば次のものが例示される。 固相化抗ジアセチルポリアミン抗体 標識化ジアセチルポリアミン 一級アミンを修飾できる酵素
チルポリアミン抗体と一級アミンを修飾できる酵素を構
成試薬として含有する。上記競合法を例に挙げ、実施す
るためのキットの構成試薬を具体的に説明すれば、たと
えば次のものが例示される。 固相化抗ジアセチルポリアミン抗体 標識化ジアセチルポリアミン 一級アミンを修飾できる酵素
【００１８】この構成試薬において、標識として西洋ワ
サビペルオキシダーゼを用いる場合には、たとえば次の
構成をとり得る。 固相化抗ジアセチルポリアミン抗体 西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化ジアセチルポリア
ミン 一級アミンを修飾できる酵素 また、上記試薬の他に、必要により、発色試薬、反応停
止用試薬、標準抗原試薬、サンプル希釈用試薬などの各
試薬から状況に応じ適宜選択し、測定のための構成試薬
とすることもできる。なお、一級アミンを修飾できる酵
素はサンプル希釈用試薬の中に含有させることも可能で
ある。
サビペルオキシダーゼを用いる場合には、たとえば次の
構成をとり得る。 固相化抗ジアセチルポリアミン抗体 西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化ジアセチルポリア
ミン 一級アミンを修飾できる酵素 また、上記試薬の他に、必要により、発色試薬、反応停
止用試薬、標準抗原試薬、サンプル希釈用試薬などの各
試薬から状況に応じ適宜選択し、測定のための構成試薬
とすることもできる。なお、一級アミンを修飾できる酵
素はサンプル希釈用試薬の中に含有させることも可能で
ある。
【００１９】
【発明の効果】本発明者は、数十匹以上のマウスに免疫
を行い、ジアセチルスペルミンに対する抗血清の特異性
を検定したが、ジアセチルスペルミンに対する反応性を
１とした場合、Ｎ1 −アセチルスペルミジンに対する交
差反応性が３００分の１より低い特異性を有する抗血清
を調製することはできなかった。これは、ジアセチルス
ペルミンとＮ1 −アセチルスペルミジンは構造類似の化
合物であり、しかも低分子量の化合物であることから、
ジアセチルスペルミンのみに特異性を有する抗体を免疫
化学的な手法で取得するには限界があると考えられる。
を行い、ジアセチルスペルミンに対する抗血清の特異性
を検定したが、ジアセチルスペルミンに対する反応性を
１とした場合、Ｎ1 −アセチルスペルミジンに対する交
差反応性が３００分の１より低い特異性を有する抗血清
を調製することはできなかった。これは、ジアセチルス
ペルミンとＮ1 −アセチルスペルミジンは構造類似の化
合物であり、しかも低分子量の化合物であることから、
ジアセチルスペルミンのみに特異性を有する抗体を免疫
化学的な手法で取得するには限界があると考えられる。
【００２０】したがって、このような特異性の低い抗体
を使用した場合、たとえば、イムノアッセイで使用する
抗ジアセチルスペルミン抗体のＮ1 −アセチルスペルミ
ジンに対する交差反応性がジアセチルスペルミンの３０
０分の１程度であっても、健常人の尿中には、ジアセチ
ルスペルミンの約３０倍のＮ1 −アセチルスペルミジン
が存在するため、測定値の約１０％がＮ1 −アセチルス
ペルミジンに由来するものとなり、ジアセチルスペルミ
ンの測定法としては好ましいことではない。しかしなが
ら、酵素によりＮ1 −アセチルスペルミジンを修飾すれ
ば、抗体との交差反応性は１０００分の１以下にするこ
とも可能であり、抗体をアフィニティ精製することなし
に、十分な特異性を持つ測定系を提供することが初めて
可能となったのである。
を使用した場合、たとえば、イムノアッセイで使用する
抗ジアセチルスペルミン抗体のＮ1 −アセチルスペルミ
ジンに対する交差反応性がジアセチルスペルミンの３０
０分の１程度であっても、健常人の尿中には、ジアセチ
ルスペルミンの約３０倍のＮ1 −アセチルスペルミジン
が存在するため、測定値の約１０％がＮ1 −アセチルス
ペルミジンに由来するものとなり、ジアセチルスペルミ
ンの測定法としては好ましいことではない。しかしなが
ら、酵素によりＮ1 −アセチルスペルミジンを修飾すれ
ば、抗体との交差反応性は１０００分の１以下にするこ
とも可能であり、抗体をアフィニティ精製することなし
に、十分な特異性を持つ測定系を提供することが初めて
可能となったのである。
【００２１】同様に、ジアセチルスペルミジンに対する
抗体ではＮ8 −アセチルスペルミジンに対する交差反応
性が２０分の１あった。健常人の尿中には、ジアセチル
スペルミジンのおよそ８倍のＮ8 −アセチルスペルミジ
ンが存在するため、測定値の約４０％がＮ8 −アセチル
スペルミジンに由来するものとなり好ましくなかった
が、酵素によりＮ8 −アセチルスペルミジンを修飾すれ
ば、抗体との交差反応性は１００分の１以下にすること
も可能であり、抗体をアフィニティ精製することなし
に、十分な特異性を持つ測定系を提供することが初めて
可能となった。
抗体ではＮ8 −アセチルスペルミジンに対する交差反応
性が２０分の１あった。健常人の尿中には、ジアセチル
スペルミジンのおよそ８倍のＮ8 −アセチルスペルミジ
ンが存在するため、測定値の約４０％がＮ8 −アセチル
スペルミジンに由来するものとなり好ましくなかった
が、酵素によりＮ8 −アセチルスペルミジンを修飾すれ
ば、抗体との交差反応性は１００分の１以下にすること
も可能であり、抗体をアフィニティ精製することなし
に、十分な特異性を持つ測定系を提供することが初めて
可能となった。
【００２２】
【実施例】以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明
するが、これにより本発明は何等限定されるものではな
い。 実施例１ ＜方法＞ （１）抗ジアセチルスペルミン抗体および抗ジアセチル
スペルミジン抗体の調製 ＳＡＴＡ（N-succinimidyl-S-acetylthioacetate）とヒ
ドロキシルアミンによりスルフヒドリル基を導入したＢ
ＳＡと、ＥＭＣＳ（N-（ε-maleimidocaproyloxy)succi
nimide）によりマレイミド基を導入したモノアセチルス
ペルミンをコンジュゲートしたものを免疫原として使用
し、常法によりマウスに免疫した。この方法でコンジュ
ゲートすると、モノアセチルスペルミンの一級アミノ基
の部分が酸アミド結合となり、構造的にジアセチル体に
近似する。２週間おきに４〜６回追加免疫を行い、摘出
したマウスの脾細胞とミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ
８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）を細胞融合
し、得られたハイブリドーマよりジアセチルスペルミン
を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマ９Ｇ９を選出した。また、モノアセチルスペ
ルミンの代わりに、Ｎ8 −アセチルスペルミジンを用い
て免疫源を作製し、ジアセチルスペルミジンを認識する
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ１Ｄ８を
選出した。得られたハイブリドーマから常法によりモノ
クローナル抗体を産生させ、各種クロマトグラフィー法
で精製し、以下の実験に供した。
するが、これにより本発明は何等限定されるものではな
い。 実施例１ ＜方法＞ （１）抗ジアセチルスペルミン抗体および抗ジアセチル
スペルミジン抗体の調製 ＳＡＴＡ（N-succinimidyl-S-acetylthioacetate）とヒ
ドロキシルアミンによりスルフヒドリル基を導入したＢ
ＳＡと、ＥＭＣＳ（N-（ε-maleimidocaproyloxy)succi
nimide）によりマレイミド基を導入したモノアセチルス
ペルミンをコンジュゲートしたものを免疫原として使用
し、常法によりマウスに免疫した。この方法でコンジュ
ゲートすると、モノアセチルスペルミンの一級アミノ基
の部分が酸アミド結合となり、構造的にジアセチル体に
近似する。２週間おきに４〜６回追加免疫を行い、摘出
したマウスの脾細胞とミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ
８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）を細胞融合
し、得られたハイブリドーマよりジアセチルスペルミン
を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマ９Ｇ９を選出した。また、モノアセチルスペ
ルミンの代わりに、Ｎ8 −アセチルスペルミジンを用い
て免疫源を作製し、ジアセチルスペルミジンを認識する
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ１Ｄ８を
選出した。得られたハイブリドーマから常法によりモノ
クローナル抗体を産生させ、各種クロマトグラフィー法
で精製し、以下の実験に供した。
【００２３】（２）西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化
モノアセチルスペルミン及び西洋ワサビペルオキシダー
ゼ標識化モノアセチルスペルミジンの調製 上記の免疫原の調製法と同様の方法で西洋ワサビペルオ
キシダーゼとモノアセチルスペルミンあるいはＮ8 −ア
セチルスペルミジンをコンジュゲートし、以下の実験に
供した。 （３）一級アミン修飾用酵素溶液の調製 夾雑する交差反応性物質を修飾する酵素として、ウシ血
清アミンオキシダーゼを利用することとし、ウシ血清９
容量に対し、１Ｍトリシン水酸化ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ８．８）１容量を加え、一級アミン修飾用酵素溶液と
した。また、本溶液にウシ血清アミンオキシダーゼの阻
害剤であるセミカルバジドを１０ｍＭになるように加え
て本酵素を失活させたもの（対照実験用失活酵素溶液）
を対照実験用として用い、以下の実験に供した。
モノアセチルスペルミン及び西洋ワサビペルオキシダー
ゼ標識化モノアセチルスペルミジンの調製 上記の免疫原の調製法と同様の方法で西洋ワサビペルオ
キシダーゼとモノアセチルスペルミンあるいはＮ8 −ア
セチルスペルミジンをコンジュゲートし、以下の実験に
供した。 （３）一級アミン修飾用酵素溶液の調製 夾雑する交差反応性物質を修飾する酵素として、ウシ血
清アミンオキシダーゼを利用することとし、ウシ血清９
容量に対し、１Ｍトリシン水酸化ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ８．８）１容量を加え、一級アミン修飾用酵素溶液と
した。また、本溶液にウシ血清アミンオキシダーゼの阻
害剤であるセミカルバジドを１０ｍＭになるように加え
て本酵素を失活させたもの（対照実験用失活酵素溶液）
を対照実験用として用い、以下の実験に供した。
【００２４】（４）抗体の固相化とブロッキング ９Ｇ９抗体溶液あるいは１Ｄ８抗体溶液（１０μｇ／ｍ
ｌ：リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で調製）を９
６穴プレート（NUNC Immuno module C8 Maxisorp）に１
００μｌ／ウエル分注し、４℃で一晩反応させた。抗体
液を吸引除去後、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）
で洗浄し、ブロッキング溶液（５％シュクロース−０．
５％スキムミルク（Ｄｉｆｃｏ））を３００μｌ／ウエ
ル分注し、室温で１時間インキュベート後、ブロッキン
グ溶液を除去し、乾燥させて以下の実験に供した。
ｌ：リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で調製）を９
６穴プレート（NUNC Immuno module C8 Maxisorp）に１
００μｌ／ウエル分注し、４℃で一晩反応させた。抗体
液を吸引除去後、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）
で洗浄し、ブロッキング溶液（５％シュクロース−０．
５％スキムミルク（Ｄｉｆｃｏ））を３００μｌ／ウエ
ル分注し、室温で１時間インキュベート後、ブロッキン
グ溶液を除去し、乾燥させて以下の実験に供した。
【００２５】（５）測定手順 上記（４）で調製した抗体固相化プレートに、測定用サ
ンプルを５０μｌ／ウエル分注する。次に上記（３）で
調製した一級アミン修飾用酵素溶液あるいは対照実験用
失活酵素溶液に、９Ｇ９抗体固相化プレートについては
（２）で調製した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化モ
ノアセチルスペルミンを４０ｎｇ／ｍｌ、１Ｄ８抗体固
相化プレートについては（２）で調製した西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ標識化Ｎ8 −アセチルスペルミジンを４
００ｎｇ／ｍｌになるように加えた溶液を１００μｌ／
ウエル分注して、撹拌しながら室温で２時間反応させ
る。反応後リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）にてウ
エルを洗浄し、ＴＭＢＺ（3,3',5,5',-Tetramethyl-ben
zidine）溶液を１００μｌ／ウエル分注して発色させ
る。最後に、１Ｎ硫酸を１００μｌ／ウエル分注して反
応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定する。
ンプルを５０μｌ／ウエル分注する。次に上記（３）で
調製した一級アミン修飾用酵素溶液あるいは対照実験用
失活酵素溶液に、９Ｇ９抗体固相化プレートについては
（２）で調製した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化モ
ノアセチルスペルミンを４０ｎｇ／ｍｌ、１Ｄ８抗体固
相化プレートについては（２）で調製した西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ標識化Ｎ8 −アセチルスペルミジンを４
００ｎｇ／ｍｌになるように加えた溶液を１００μｌ／
ウエル分注して、撹拌しながら室温で２時間反応させ
る。反応後リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）にてウ
エルを洗浄し、ＴＭＢＺ（3,3',5,5',-Tetramethyl-ben
zidine）溶液を１００μｌ／ウエル分注して発色させ
る。最後に、１Ｎ硫酸を１００μｌ／ウエル分注して反
応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定する。
【００２６】＜結果＞ （１）反応曲線 上記測定手順に従い、各種ポリアミン溶液を用いて反応
曲線を作成した。９Ｇ９固相化プレートについての結果
は図１に、１Ｄ８固相化プレートについての結果は図３
に示す。また、対照実験としてウシ血清アミンオキシダ
ーゼを失活させた対照実験用失活酵素溶液を用いて作成
したそれぞれの反応曲線を図２と図４に示す。なお、略
号は以下の通りである。 ＤＡＳＰＭ：ジアセチルスペルミン ＡｃＳＰＭ：アセチルスペルミン ＡｃＰＵＴ：アセチルプトレッシン Ｎ１ＳＰＤ：Ｎ1 −アセチルスペルミジン Ｎ８ＳＰＤ：Ｎ8 −アセチルスペルミジン ＳＰＭ ：スペルミン
曲線を作成した。９Ｇ９固相化プレートについての結果
は図１に、１Ｄ８固相化プレートについての結果は図３
に示す。また、対照実験としてウシ血清アミンオキシダ
ーゼを失活させた対照実験用失活酵素溶液を用いて作成
したそれぞれの反応曲線を図２と図４に示す。なお、略
号は以下の通りである。 ＤＡＳＰＭ：ジアセチルスペルミン ＡｃＳＰＭ：アセチルスペルミン ＡｃＰＵＴ：アセチルプトレッシン Ｎ１ＳＰＤ：Ｎ1 −アセチルスペルミジン Ｎ８ＳＰＤ：Ｎ8 −アセチルスペルミジン ＳＰＭ ：スペルミン
【００２７】（２）交差反応性 図１から図２の結果より、ジアセチルスペルミンに対す
る反応性を１００％とした場合の各種ポリアミンの交差
反応性と特異性改善倍率を表１に示す。この結果から、
ウシ血清アミンオキシダーゼで処理することによりジア
セチルスペルミン以外のポリアミン類の抗体との交差反
応性が低下し、特異性の高いジアセチルスペルミンの測
定系を提供できることが明きらかとなった。同様に図３
から図４の結果より、ジアセチルスペルミジンに対する
反応性を１００％とした場合の各種ポリアミンの交差反
応性と特異性改善倍率を表２に示す。この結果から、ウ
シ血清アミンオキシダーゼで処理することによりジアセ
チルスペルミジン以外のポリアミン類の抗体との交差反
応性が低下し、特異性の高いジアセチルスペルミジンの
測定系を提供できることが明きらかとなった。なお、特
異性改善倍率は以下のように計算した。 特異性改善倍率＝Ａ／Ｂ Ａ：セミカルバジド非存在下での交差反応性の逆数 Ｂ：セミカルバジド存在下での交差反応性の逆数
る反応性を１００％とした場合の各種ポリアミンの交差
反応性と特異性改善倍率を表１に示す。この結果から、
ウシ血清アミンオキシダーゼで処理することによりジア
セチルスペルミン以外のポリアミン類の抗体との交差反
応性が低下し、特異性の高いジアセチルスペルミンの測
定系を提供できることが明きらかとなった。同様に図３
から図４の結果より、ジアセチルスペルミジンに対する
反応性を１００％とした場合の各種ポリアミンの交差反
応性と特異性改善倍率を表２に示す。この結果から、ウ
シ血清アミンオキシダーゼで処理することによりジアセ
チルスペルミジン以外のポリアミン類の抗体との交差反
応性が低下し、特異性の高いジアセチルスペルミジンの
測定系を提供できることが明きらかとなった。なお、特
異性改善倍率は以下のように計算した。 特異性改善倍率＝Ａ／Ｂ Ａ：セミカルバジド非存在下での交差反応性の逆数 Ｂ：セミカルバジド存在下での交差反応性の逆数
【００２８】
【表１】 DASPM ：ジアセチルスペルミン AcSPM ：アセチルスペルミン N1SPD ：Ｎ１アセチルスペルミジン N8SPD ：Ｎ８アセチルスペルミジン SPM ：スペルミン
【表２】 DASPD ：ジアセチルスペルミジン AcPUT ：アセチルプトレッシン N8SPD ：Ｎ８アセチルスペルミジン
【図１】図１は、ウシ血清アミンオキシダーゼの活性が
ある酵素溶液と９Ｇ９固相化プレートおよび西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ標識化モノアセチルスペルミンを用い
て行ったイムノアッセイにおける各種ポリアミンに対す
る反応曲線を示したものである。
ある酵素溶液と９Ｇ９固相化プレートおよび西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ標識化モノアセチルスペルミンを用い
て行ったイムノアッセイにおける各種ポリアミンに対す
る反応曲線を示したものである。
【図２】図２は、ウシ血清アミンオキシダーゼの活性が
ない酵素溶液と９Ｇ９固相化プレートおよび西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ標識化モノアセチルスペルミンを用い
て行ったイムノアッセイにおける各種ポリアミンに対す
る反応曲線を示したものである。
ない酵素溶液と９Ｇ９固相化プレートおよび西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ標識化モノアセチルスペルミンを用い
て行ったイムノアッセイにおける各種ポリアミンに対す
る反応曲線を示したものである。
【図３】図３は、ウシ血清アミンオキシダーゼの活性が
ある酵素溶液と１Ｄ８固相化プレートおよび西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ標識化Ｎ8 −アセチルスペルミジンを
用いて行ったイムノアッセイにおける各種ポリアミンに
対する反応曲線を示したものである。
ある酵素溶液と１Ｄ８固相化プレートおよび西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ標識化Ｎ8 −アセチルスペルミジンを
用いて行ったイムノアッセイにおける各種ポリアミンに
対する反応曲線を示したものである。
【図４】図４は、ウシ血清アミンオキシダーゼの活性が
ない酵素溶液と１Ｄ８固相化プレートおよび西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ標識化Ｎ8 −アセチルスペルミジンを
用いて行ったイムノアッセイにおける各種ポリアミンに
対する反応曲線を示したものである。
ない酵素溶液と１Ｄ８固相化プレートおよび西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ標識化Ｎ8 −アセチルスペルミジンを
用いて行ったイムノアッセイにおける各種ポリアミンに
対する反応曲線を示したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 平松 恭子 東京都文京区本駒込３丁目18番22号 財団 法人 東京都臨床医学総合研究所内 Ｆターム(参考） 2G045 AA01 AA16 AA26 BA01 CA26 CB02 CB03 DA19 FA11 FA29 FB01 FB03 FB07 FB08
Claims (10)
- 【請求項１】 サンプル中のジアセチルポリアミンをイ
ムノアッセイにより測定する方法において、測定に供す
るサンプルとして一級アミンを修飾できる酵素を用いて
処理したサンプルを使用することを特徴とする、ジアセ
チルポリアミンの測定法。 - 【請求項２】 ジアセチルポリアミンがジアセチルスペ
ルミンおよび／またはジアセチルスペルミジンである、
請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 一級アミンを修飾できる酵素がアミンオ
キシダーゼ、アミノトランスフェラーゼおよび／または
デヒドロゲナーゼである、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 一級アミンを修飾できる酵素が動物血清
由来のアミンオキシダーゼである、請求項１記載の方
法。 - 【請求項５】 サンプルを動物血清とインキュベーショ
ンする、請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 少なくとも、抗ジアセチルポリアミン抗
体と一級アミンを修飾できる酵素を構成試薬として含有
する、請求項１記載の方法を実施するためのキット。 - 【請求項７】 一級アミンを修飾できる酵素がアミンオ
キシダーゼ、アミノトランスフェラーゼおよび／または
デヒドロゲナーゼである、請求項６記載のキット。 - 【請求項８】 一級アミンを修飾できる酵素が動物血清
由来のアミンオキシダーゼである、請求項６記載のキッ
ト。 - 【請求項９】 酵素が精製酵素の形態で供給される、請
求項６記載のキット。 - 【請求項１０】 酵素が動物血清の形態で供給される、
請求項６記載のキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24200998A JP3709078B2 (ja) | 1998-08-27 | 1998-08-27 | ジアセチルポリアミンの測定法及びキット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24200998A JP3709078B2 (ja) | 1998-08-27 | 1998-08-27 | ジアセチルポリアミンの測定法及びキット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000074917A true JP2000074917A (ja) | 2000-03-14 |
| JP3709078B2 JP3709078B2 (ja) | 2005-10-19 |
Family
ID=17082913
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24200998A Expired - Fee Related JP3709078B2 (ja) | 1998-08-27 | 1998-08-27 | ジアセチルポリアミンの測定法及びキット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3709078B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009236789A (ja) * | 2008-03-28 | 2009-10-15 | Yamasa Shoyu Co Ltd | ジアセチルポリアミンの分解防止法 |
| JP2012051912A (ja) * | 2005-09-30 | 2012-03-15 | Transgenic Inc | Ｎ１，ｎ８−ジアセチルスペルミジンに対する高特異性モノクローナル抗体 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7687231B2 (en) * | 2006-01-30 | 2010-03-30 | Yamasa Corporation | Method for determining degree of negative effect of macrophages on vertebrate |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58146297A (ja) * | 1982-02-25 | 1983-08-31 | Meito Sangyo Kk | ポリアミンの定量方法 |
| JPS5948097A (ja) * | 1982-09-14 | 1984-03-19 | Amano Pharmaceut Co Ltd | ポリアミン及びアセチルポリアミンの分別定量方法 |
| JPS6324899A (ja) * | 1986-07-17 | 1988-02-02 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | ポリアミン測定試薬 |
| JPH0662896A (ja) * | 1992-04-28 | 1994-03-08 | Health Res Inc | スペルミジン／スペルミンｎ１−アセチルトランスフェラーゼの、予後インジケータ及び／又は腫瘍応答マーカーとしての使用方法 |
| JPH1175839A (ja) * | 1997-07-09 | 1999-03-23 | Nippon Kayaku Co Ltd | モノクローナル抗体、細胞株及びｎ１，ｎ１２−ジアセチルスペルミンの測定法 |
-
1998
- 1998-08-27 JP JP24200998A patent/JP3709078B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58146297A (ja) * | 1982-02-25 | 1983-08-31 | Meito Sangyo Kk | ポリアミンの定量方法 |
| JPS5948097A (ja) * | 1982-09-14 | 1984-03-19 | Amano Pharmaceut Co Ltd | ポリアミン及びアセチルポリアミンの分別定量方法 |
| JPS6324899A (ja) * | 1986-07-17 | 1988-02-02 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | ポリアミン測定試薬 |
| JPH0662896A (ja) * | 1992-04-28 | 1994-03-08 | Health Res Inc | スペルミジン／スペルミンｎ１−アセチルトランスフェラーゼの、予後インジケータ及び／又は腫瘍応答マーカーとしての使用方法 |
| JPH1175839A (ja) * | 1997-07-09 | 1999-03-23 | Nippon Kayaku Co Ltd | モノクローナル抗体、細胞株及びｎ１，ｎ１２−ジアセチルスペルミンの測定法 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012051912A (ja) * | 2005-09-30 | 2012-03-15 | Transgenic Inc | Ｎ１，ｎ８−ジアセチルスペルミジンに対する高特異性モノクローナル抗体 |
| JP2009236789A (ja) * | 2008-03-28 | 2009-10-15 | Yamasa Shoyu Co Ltd | ジアセチルポリアミンの分解防止法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3709078B2 (ja) | 2005-10-19 |
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