JPS61186855A - チロキシンを形成するグロブリンの結合能力を測定する方法 - Google Patents
チロキシンを形成するグロブリンの結合能力を測定する方法Info
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- JPS61186855A JPS61186855A JP61024262A JP2426286A JPS61186855A JP S61186855 A JPS61186855 A JP S61186855A JP 61024262 A JP61024262 A JP 61024262A JP 2426286 A JP2426286 A JP 2426286A JP S61186855 A JPS61186855 A JP S61186855A
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/78—Thyroid gland hormones, e.g. T3, T4, TBH, TBG or their receptors
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野：
本発明は、チロキシン全形成するグロブリン（ＴＢＧ）
の結合能力（Ｔ−アップティクとも呼はれる）全異質酵
素免役検定の原理により測定する方法に関する。
の結合能力（Ｔ−アップティクとも呼はれる）全異質酵
素免役検定の原理により測定する方法に関する。
従米枝術：
甲状腺ホルモンは、血中に十分に蛋白質結合形で存在す
る。この場合、チロキシン（Ｔ４）は、殊にチロキシン
を結合するグロブリン（ＴＢＧ）に結合する。ＴＢＧの
結合能力を測定することは、甲状腺診断の範囲内で特に
に賛である。丈に、多（の場合に全−Ｔ４−濃度と１／
ＴＢＧとからの積は、ＦＴ４−濃度と相関関係にある。
る。この場合、チロキシン（Ｔ４）は、殊にチロキシン
を結合するグロブリン（ＴＢＧ）に結合する。ＴＢＧの
結合能力を測定することは、甲状腺診断の範囲内で特に
に賛である。丈に、多（の場合に全−Ｔ４−濃度と１／
ＴＢＧとからの積は、ＦＴ４−濃度と相関関係にある。
〔ライブ−スプーン（Ｌ、Ｒ，Ｗｉｔｈｅｒｓｐｏｏｎ
） 、”ジャーナル・オブ・クリニカル・イム）アッ
セイ（Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｃ１１ｎｉｃａｌ Ｉｍ
ｍｕｎｏａｓｓａｙ ） ’ 、第７巻、（１９８４年
）〕。
） 、”ジャーナル・オブ・クリニカル・イム）アッ
セイ（Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｃ１１ｎｉｃａｌ Ｉｍ
ｍｕｎｏａｓｓａｙ ） ’ 、第７巻、（１９８４年
）〕。
ＴＢＧ−結合能力全測定する公知方法は、西ドイツ国特
許公開公Ｎｉ２８２５６５０号に記載されている。この
公知方法の欠点は、放射性標疏會便冷しなけれはならす
及び／又は長い恒温保持時間（例えは、２時間）を認容
しなければならないことにある。西ドイツ国特許公開公
報第２８２５５６０号の方法は、同様に、競仕的方法が
Ｎ賛であシかつＴ４もＴ４−酵素接合体も拳加しなけれ
はならないということに基づいてなお一定の欠点を示す
。
許公開公Ｎｉ２８２５６５０号に記載されている。この
公知方法の欠点は、放射性標疏會便冷しなけれはならす
及び／又は長い恒温保持時間（例えは、２時間）を認容
しなければならないことにある。西ドイツ国特許公開公
報第２８２５５６０号の方法は、同様に、競仕的方法が
Ｎ賛であシかつＴ４もＴ４−酵素接合体も拳加しなけれ
はならないということに基づいてなお一定の欠点を示す
。
発明が解決しようとする問題点：
従って、本発明の課題は、１１１ｊ！當市に進行せす、
放射性物質なしで間に甘い、短時間のみを必要とし、か
つ最も簡単な試験の実施で高い精度金示す方法を得るこ
とである。
放射性物質なしで間に甘い、短時間のみを必要とし、か
つ最も簡単な試験の実施で高い精度金示す方法を得るこ
とである。
問題点全解決するだめの手段：
この蛛組は、本発明によれは、チロキシンを結合するグ
ロブリン（ＴＢＧ）の帖せ能力會異餡酵素兜疫検定の原
理により測定する方法によって解決され、この方法は、
試験すべき血清試料を酵ＩＡ標識したＴ４又ｒよＴＢ及
びＴＢＧ又はＴ４に対して非動性化した抗体と一緒に恒
温保持し、相を分離し、標識化＃索を相の１つの相中で
測定することｔ％徴とする。
ロブリン（ＴＢＧ）の帖せ能力會異餡酵素兜疫検定の原
理により測定する方法によって解決され、この方法は、
試験すべき血清試料を酵ＩＡ標識したＴ４又ｒよＴＢ及
びＴＢＧ又はＴ４に対して非動性化した抗体と一緒に恒
温保持し、相を分離し、標識化＃索を相の１つの相中で
測定することｔ％徴とする。
本）ｊコ明による方法は、最も簡単な試験の実施で短時
間で鼓大１５分間の恒温保持時間で実施することができ
る。
間で鼓大１５分間の恒温保持時間で実施することができ
る。
非動性化した抗−Ｔ４−抗体を用いて作条するので、実
施の際にＴＢ（）ないしは抗−Ｔ４＝抗体がＴ４ないし
はＴ４−接合体と競合する、ＴＢＧの結合能力を異質酵
素免疫検定の原理により測定する全ての公知の方法とは
異なシ、不発明による方法の好ましい実７［！ｉ悪態様
、非動性化した仇−ＴＢＣ）−抗体を用いて作業する。
施の際にＴＢ（）ないしは抗−Ｔ４＝抗体がＴ４ないし
はＴ４−接合体と競合する、ＴＢＧの結合能力を異質酵
素免疫検定の原理により測定する全ての公知の方法とは
異なシ、不発明による方法の好ましい実７［！ｉ悪態様
、非動性化した仇−ＴＢＣ）−抗体を用いて作業する。
また、本発明方法を実施する場合に正確な結果が得られ
ることハ、極めて鳥異的なことと児な１゛ことができる
。それというのも、酵素標識したＴＢ又は′１゛４が血
清蛋白餉（ＴＢＧ）によって結合されないことは、公知
であったからである。フランス国特計公囲公報ｉ８１１
７９９７号〔コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ ） ）にも
西ドイツ国特許公開公報第２８２５６５０号にも記載さ
れた方法４、前記の特殊な性迎に基つくものである。
ることハ、極めて鳥異的なことと児な１゛ことができる
。それというのも、酵素標識したＴＢ又は′１゛４が血
清蛋白餉（ＴＢＧ）によって結合されないことは、公知
であったからである。フランス国特計公囲公報ｉ８１１
７９９７号〔コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ ） ）にも
西ドイツ国特許公開公報第２８２５６５０号にも記載さ
れた方法４、前記の特殊な性迎に基つくものである。
Ｔ３又ｔ’；ＬＴ４に対する酵素標識としては、当朶者
に数多く知られているように全てのこのために適した、
容易に測定しつる＃索を使用することができる。このた
めに１利な例は、Ｋルオキシダーゼ及び！−ガラクトシ
ダーゼである。特に、酵素は、距離断片（スペーサー〕
を介してホルモンにｉ曾され、この場合この距離の長さ
はＣ−原子数３〜８、特にＣ−原子数４〜５でなければ
ならない。結合は、例えはホルモン又はホルモン誘導体
の活性エステルを弁して行なわｔしる。Ｔ４ないしはＴ
Ｂとｋｍ化酵素との結合のためのスペーサーとしては、
符に弔詞にアミノ酪鼓又はグリシルグリシンが使用され
、５！Ｉ：際に好ましくハ、そのヒーロキシスクシンイ
ミドエステルの形で使用される。
に数多く知られているように全てのこのために適した、
容易に測定しつる＃索を使用することができる。このた
めに１利な例は、Ｋルオキシダーゼ及び！−ガラクトシ
ダーゼである。特に、酵素は、距離断片（スペーサー〕
を介してホルモンにｉ曾され、この場合この距離の長さ
はＣ−原子数３〜８、特にＣ−原子数４〜５でなければ
ならない。結合は、例えはホルモン又はホルモン誘導体
の活性エステルを弁して行なわｔしる。Ｔ４ないしはＴ
Ｂとｋｍ化酵素との結合のためのスペーサーとしては、
符に弔詞にアミノ酪鼓又はグリシルグリシンが使用され
、５！Ｉ：際に好ましくハ、そのヒーロキシスクシンイ
ミドエステルの形で使用される。
酵素標疏したＴ４又はＴＢ （以下、接合体と呼ぶ）は
、本発明による方法の場合、Ｔ４が血清中に存在するＴ
ＢＧ−Ｔ、−９体から殆んど追出されないような濃度で
使用される。従って、接合体は、予想すべきＴＢＧ−全
濃度に比して不足督″で使用するのが好ましい。
、本発明による方法の場合、Ｔ４が血清中に存在するＴ
ＢＧ−Ｔ、−９体から殆んど追出されないような濃度で
使用される。従って、接合体は、予想すべきＴＢＧ−全
濃度に比して不足督″で使用するのが好ましい。
接合体としては、Ｔ４ないしはＴ３と、殊にβ−ガラク
トシダーゼのようなｇＬｓ化酵素との分子比が１〜５：
１であるようなものが使用される。
トシダーゼのようなｇＬｓ化酵素との分子比が１〜５：
１であるようなものが使用される。
この接合体の大きい結合能力のために、本発明による方
法の場合、弔詞にＴ、−含壱接合体を用いて作業され、
このことは、良好な感度を導く。しかし、本発明は、同
様にＴ３−接合体を用いても実施することができる。
法の場合、弔詞にＴ、−含壱接合体を用いて作業され、
このことは、良好な感度を導く。しかし、本発明は、同
様にＴ３−接合体を用いても実施することができる。
仇−ＴＢＧ−抗体としては、ポリクロナール抗体ならひ
にモノクロナール抗体が使用され、この揚台にはモノク
ロナール抗体が好ましく、或いはこのような抗体の断片
が使用される。抗体ケ不動性化することは、公知方法で
、抗体全１接に担体に粘合させるか又はその免疫学的結
会能力の利用下に非動性化した抗−抗体又は抗−抗体の
断片を介して固定させるように行なうことかできる。固
体用に結付した抗−抗体又はその断片を介して抗−ＴＢ
Ｇ−抗体を非動性化することに、連安な抗−Ｔｌ２Ｏ−
抗体？ｌｌ−実際に１００％活性で結付させ、ひいては
常にある程度の活性損失と結ひ付いている直接の固定化
の場合よりも少ないｌ”で使用することができるという
大きな利点を肩する。
にモノクロナール抗体が使用され、この揚台にはモノク
ロナール抗体が好ましく、或いはこのような抗体の断片
が使用される。抗体ケ不動性化することは、公知方法で
、抗体全１接に担体に粘合させるか又はその免疫学的結
会能力の利用下に非動性化した抗−抗体又は抗−抗体の
断片を介して固定させるように行なうことかできる。固
体用に結付した抗−抗体又はその断片を介して抗−ＴＢ
Ｇ−抗体を非動性化することに、連安な抗−Ｔｌ２Ｏ−
抗体？ｌｌ−実際に１００％活性で結付させ、ひいては
常にある程度の活性損失と結ひ付いている直接の固定化
の場合よりも少ないｌ”で使用することができるという
大きな利点を肩する。
この場合、特に好ましいのは、抗−ＴＢ（）−抗体のＦ
ｃ一部分の方向に向いた非動性化した抗体全使用し、こ
の抗体を溶解した抗−ＴＢ（）−抗体と、この抗−ＴＢ
Ｇ−抗体の固定下に反応させるような１つの灸施態様で
ある。上述の実施態様は、抗−ＴＢＧ−抗体の代りに抗
−Ｔ４−抗体を使用する場合とＰ１様のものに該当する
。
ｃ一部分の方向に向いた非動性化した抗体全使用し、こ
の抗体を溶解した抗−ＴＢ（）−抗体と、この抗−ＴＢ
Ｇ−抗体の固定下に反応させるような１つの灸施態様で
ある。上述の実施態様は、抗−ＴＢＧ−抗体の代りに抗
−Ｔ４−抗体を使用する場合とＰ１様のものに該当する
。
本発明の方法は、２工程で実施することができ、この揚
台には、第１工程で試料を接合体と一緒に恒温保持し、
次に第２工程でＴＢＧ又はＴ４に対して不動性化した抗
体と一緒艮恒温保持する。その除、抗−Ｔ４−抗体全使
用する場合には、第２の恒温保持は、有利に５分間以下
、符に０．５〜２分間実施される。その際、第２の恒温
保持會継続させると、精度を低下させる競合反応が起こ
りつる。
台には、第１工程で試料を接合体と一緒に恒温保持し、
次に第２工程でＴＢＧ又はＴ４に対して不動性化した抗
体と一緒艮恒温保持する。その除、抗−Ｔ４−抗体全使
用する場合には、第２の恒温保持は、有利に５分間以下
、符に０．５〜２分間実施される。その際、第２の恒温
保持會継続させると、精度を低下させる競合反応が起こ
りつる。
Ｔ２Ｃに対する抗体を使用する場合、本方法は、全部の
成分、また固体相會同時に一緒に供給するようにして弔
詞に１工程でも実施される。
成分、また固体相會同時に一緒に供給するようにして弔
詞に１工程でも実施される。
実施例：
矢に、本発明全実施例ＶＣつき添付図面と関連させて詳
説する： 例 １ １、試薬： ａ）緩衝液： ヘペス（Ｈｅｐｅｓ） １００ミリモル／ｌＭｇ−ア
スパルイン酸塩 ２ミリモル／１Ｒ８Ａ １％ ＮａＣ２０、９％ 界！ＩＩＩ活性剤〔トウイーン（’、［’ｗｅｅｎ））
２０１０゜を１４＝ ７．２５ （３７”０）ｂ ） Ｔ４−β−ガラクトシダーゼ：ｆＪｉ＊’ｌＱｉ
６００ｍＵ／ｄＣ）モノクロナール抗体（ＴＢＧ
の方向に向い７’Ｃ）；１８０μ：ｙ／ＩＩＩｅ （モノクロナール抗体の形成は、ケーラー（Ｋδｈｌｅ
ｒ ）及びミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ）の方
法〔１ニア・ジエイ・イミュナル（Ｆ＋ｕｒ。
説する： 例 １ １、試薬： ａ）緩衝液： ヘペス（Ｈｅｐｅｓ） １００ミリモル／ｌＭｇ−ア
スパルイン酸塩 ２ミリモル／１Ｒ８Ａ １％ ＮａＣ２０、９％ 界！ＩＩＩ活性剤〔トウイーン（’、［’ｗｅｅｎ））
２０１０゜を１４＝ ７．２５ （３７”０）ｂ ） Ｔ４−β−ガラクトシダーゼ：ｆＪｉ＊’ｌＱｉ
６００ｍＵ／ｄＣ）モノクロナール抗体（ＴＢＧ
の方向に向い７’Ｃ）；１８０μ：ｙ／ＩＩＩｅ （モノクロナール抗体の形成は、ケーラー（Ｋδｈｌｅ
ｒ ）及びミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ）の方
法〔１ニア・ジエイ・イミュナル（Ｆ＋ｕｒ。
Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 ） ”、第６巻、第２９２頁
以降（１９７６年）〕により行なわれ、免疫原としてＴ
ＢＧが使用さ才した）。
以降（１９７６年）〕により行なわれ、免疫原としてＴ
ＢＧが使用さ才した）。
ｄ）非動性化した抗体（モノクロナール抗体のＦｃ一部
分の方向に向いた）。
分の方向に向いた）。
抗体を、ヒツジ全マウス−免役グロブリンのＦｃ一部分
で免疫することによって常法により倫だ。抗血清を硫酸
アンモニウム沈殿及びＤＥ旭−セルロースでのクロマト
グラフィーにより精製した。
で免疫することによって常法により倫だ。抗血清を硫酸
アンモニウム沈殿及びＤＥ旭−セルロースでのクロマト
グラフィーにより精製した。
抗体を濾紙上に固定することは、デマイナー（Ｐ、 Ｇ
ｅｍｅｉｎｅｒ ）及びパステカ（Ｍ、 Ｐａ５ｔｅｋ
ａ ）によって１アゾライド・バイオケミストリー・ア
ンド・バイオテクノロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ−
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ ） ’、１ＪＪ８巻、第６８１頁〜第３９６貞（
１９８３年）に記載された、蛋白質−セルロース−接合
体の製造法により過沃索酸堪岐化したセルロースを還元
アルキル化することによって行なわれる。紙１ｇ当り精
製した抗体１５１＋１１１与えた。
ｅｍｅｉｎｅｒ ）及びパステカ（Ｍ、 Ｐａ５ｔｅｋ
ａ ）によって１アゾライド・バイオケミストリー・ア
ンド・バイオテクノロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ−
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ ） ’、１ＪＪ８巻、第６８１頁〜第３９６貞（
１９８３年）に記載された、蛋白質−セルロース−接合
体の製造法により過沃索酸堪岐化したセルロースを還元
アルキル化することによって行なわれる。紙１ｇ当り精
製した抗体１５１＋１１１与えた。
結＠後、この紙全Ｈ２〇八ひＲ８Ａ−含壱燐酸塩緩衝液
で洗浄し、６５°Ｃで乾燥した。
で洗浄し、６５°Ｃで乾燥した。
ｅ） クロルフェノールロートガラクトシド（ＣＰＲ
Ｇ）−フリース： 西ドイツ国％肝公開公報第３３４５７４８号の記載によ
り得られｆｃｏ、２５μモル／紙（５〜）。
Ｇ）−フリース： 西ドイツ国％肝公開公報第３３４５７４８号の記載によ
り得られｆｃｏ、２５μモル／紙（５〜）。
試飲の実施：
血清を１ニア５の答酋比で次の混合物で希釈する：
緩衝液 １７２μｔ
Ｔ４−β−ガラクトシダーゼ浴液 ３０μｔＭＡＸ ＜
ＴＢＧ ＞−浴液（ＴＢＧ ＶＬ対するモノクロナー
ル抗体） ２０μｔ６７′Ｃで５
分間の恒温保持ｉ、ｄ）により得られた結合−紙１０ｍ
Ｉ２の混合物５０μｔを吸収し、さらに６７゛Ｃで５分
間恒温保持てる。引続き、遠心分離することによって、
Ｔ４−β−ガラクトシダーゼに結合してない含分ヲ百セ
する液体を紙と分離し、クロルフェノールロートガラク
トシド−フリース上に導き、酵素反応速度（ｍＥ ／
ｍｉｎ ） ｋ ３７ ’Ｃ及び５７８ ｎｍで２７ｐ
Ｌの充填容量及び０．６ ｃｌｎの層厚を有するマイク
ロキュベツト中で測定する。
ＴＢＧ ＞−浴液（ＴＢＧ ＶＬ対するモノクロナー
ル抗体） ２０μｔ６７′Ｃで５
分間の恒温保持ｉ、ｄ）により得られた結合−紙１０ｍ
Ｉ２の混合物５０μｔを吸収し、さらに６７゛Ｃで５分
間恒温保持てる。引続き、遠心分離することによって、
Ｔ４−β−ガラクトシダーゼに結合してない含分ヲ百セ
する液体を紙と分離し、クロルフェノールロートガラク
トシド−フリース上に導き、酵素反応速度（ｍＥ ／
ｍｉｎ ） ｋ ３７ ’Ｃ及び５７８ ｎｍで２７ｐ
Ｌの充填容量及び０．６ ｃｌｎの層厚を有するマイク
ロキュベツト中で測定する。
測定信号をＴＢＧ−結合能刃組に換算することｆｉ、Ｔ
ＢＧ−値が知られている試料を用いて得られた較正［ｌ
ｌ（線により行なわれる（第１図）。
ＢＧ−値が知られている試料を用いて得られた較正［ｌ
ｌ（線により行なわれる（第１図）。
第２図は、方法の比較全示す：
横座標ニラジオアッセイで得られた、血清中のチロキシ
ン−結合能力（％） 縦座標：実施例により鞠られた、ＴＢＧ−結合能力（％
）。
ン−結合能力（％） 縦座標：実施例により鞠られた、ＴＢＧ−結合能力（％
）。
標準主成分分析：
ｙ−１，３２５＋１．０４９Ｘ相関係数二〇。９６４゜
２、スペーサ二としてのアミノ酪ｍｔ用いるＴ４−β−
ガラクトシダーゼ−接合体の製造Ｎ−第三プチルオキシ
カルボニル−チロキシン（ＢＯＣ−Ｔ４ ）をチロキシ
ン−Ｎａ塩及びジー第三プチルゾカルボネートから欧州
特許公開公報第０１０８４００号に記載の方法と同様に
して得る。
ガラクトシダーゼ−接合体の製造Ｎ−第三プチルオキシ
カルボニル−チロキシン（ＢＯＣ−Ｔ４ ）をチロキシ
ン−Ｎａ塩及びジー第三プチルゾカルボネートから欧州
特許公開公報第０１０８４００号に記載の方法と同様に
して得る。
Ｎ−第三ブチルオキシカルボニルーチロキシニル−ヒド
ロキシスクシンイミドエステル（８０Ｃ−Ｔ４−０８ｕ
） ｔ” ＢＯＣ−Ｔ４０−５ミリモル、Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミド６．６ミリモル及びジシクロへキシ
ルジイミド６．６ミリモルからＢＯＣ−フェニルアラニ
ン−０８ｕの製造法と同様にして刊Ｉる〔ツーベン−ワ
イル（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ ）、”メト−テン・デ
ア・アンオルガニツシエン・ヒエミー（〜イｅｔｈｏｄ
ｅｎ ｄｅｒ ａｎｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎＣｈｅｍｉ
ｅ ） ” 、第ＸＶ／２巻、第７４号、第１５０員、
参照〕。
ロキシスクシンイミドエステル（８０Ｃ−Ｔ４−０８ｕ
） ｔ” ＢＯＣ−Ｔ４０−５ミリモル、Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミド６．６ミリモル及びジシクロへキシ
ルジイミド６．６ミリモルからＢＯＣ−フェニルアラニ
ン−０８ｕの製造法と同様にして刊Ｉる〔ツーベン−ワ
イル（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ ）、”メト−テン・デ
ア・アンオルガニツシエン・ヒエミー（〜イｅｔｈｏｄ
ｅｎ ｄｅｒ ａｎｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎＣｈｅｍｉ
ｅ ） ” 、第ＸＶ／２巻、第７４号、第１５０員、
参照〕。
蒸発映縮後に得られた残滓を酢酸エステルに浴解し、こ
の浴液全石油エーテルの冷加によって沈殿させる。
の浴液全石油エーテルの冷加によって沈殿させる。
Ｎ−第三ブチルオキシカルボニル−テロキシニル−アミ
ノ酪酸−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（ＢＯＣ
−Ｔ４−Ａｂｓ−０８ｕ ） ’（次のようにして製造
するニ ジオキサン８１中のＢＯＣ−Ｔ４−０８ｕ Ｏ，５＆の
浴液に０゜１モルの燐除塩緩衝液０．５Ｒｂｐ！４８．
５中のアミノ醋酸０．２７ ＆の浴液を滴加する。２時
間の反応時間後、酸性にし、酢酸エステルと一緒に振出
する。酢酸エステル相ｉ Ｈ２Ｏで洗浄し、乾燥し、か
つ蒸発濃縮する。
ノ酪酸−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（ＢＯＣ
−Ｔ４−Ａｂｓ−０８ｕ ） ’（次のようにして製造
するニ ジオキサン８１中のＢＯＣ−Ｔ４−０８ｕ Ｏ，５＆の
浴液に０゜１モルの燐除塩緩衝液０．５Ｒｂｐ！４８．
５中のアミノ醋酸０．２７ ＆の浴液を滴加する。２時
間の反応時間後、酸性にし、酢酸エステルと一緒に振出
する。酢酸エステル相ｉ Ｈ２Ｏで洗浄し、乾燥し、か
つ蒸発濃縮する。
この残滓をエチレングリコールジメチルエーテル２０成
に浴解し、この浴液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド０
．０７．９及びジシクロヘキシルカルボジイミド０．１
２ Ｎ ｋ添加する。１２時曲の反応時１’Ｍ鎌、濾別
する。浴剤全蒸発させ、残滓を酢酸エステルに浴解し、
ＢＯＣＴ４ Ａｂｓ Ｏ加を石油エーテルで沈殿させる
。
に浴解し、この浴液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド０
．０７．９及びジシクロヘキシルカルボジイミド０．１
２ Ｎ ｋ添加する。１２時曲の反応時１’Ｍ鎌、濾別
する。浴剤全蒸発させ、残滓を酢酸エステルに浴解し、
ＢＯＣＴ４ Ａｂｓ Ｏ加を石油エーテルで沈殿させる
。
ＤＣ（ＨＰＴＬＣ，ＲＰ １８ ；流展斉り：ニトロメ
タン／エメノール９ ： １ ） Ｒｆ： ０．７７
ｌＨ−ＮＭＲ（ｄ６−シメチルスルホキシド）、 δ（ｐｐｍ） ： １．３２（ｓ 、 ９Ｈ）、１．７
７（ｍ。
タン／エメノール９ ： １ ） Ｒｆ： ０．７７
ｌＨ−ＮＭＲ（ｄ６−シメチルスルホキシド）、 δ（ｐｐｍ） ： １．３２（ｓ 、 ９Ｈ）、１．７
７（ｍ。
４Ｈ）、 ２．８０（ｓ、 ４Ｈ）、７．０３（Ｓ、
２Ｈ）、７．７９ （ｓ 、２Ｈ）。
２Ｈ）、７．７９ （ｓ 、２Ｈ）。
Ｉ−ガラクトシダーゼ１５．８ηを０，０１モルの燐酸
塩緩衝液２．５叡、ｐｉを７，０に溶解する。
塩緩衝液２．５叡、ｐｉを７，０に溶解する。
氷冷却下にＢＯＣ−Ｔ４−Ａｂｓ−Ｏ８ｕの０．１チの
溶液０．３０７ ａｔを冷加する。得られる接台・体を
デル卿過により脱地し、スフエロシルを介して結合した
ＴＢＧ ’ｉアフイニテイクロマトグラフイーにより精
製する。
溶液０．３０７ ａｔを冷加する。得られる接台・体を
デル卿過により脱地し、スフエロシルを介して結合した
ＴＢＧ ’ｉアフイニテイクロマトグラフイーにより精
製する。
例 ２
ａ）緩倫液：ヘベス（Ｈｅｐｅｓ ） １１０ミリモル
／Ｌ、Ｍｇ−アスパラギン酸塩、Ｒ８Ａ１％、ＮａＣｔ
Ｏ−９％、） ’ｙイー７ （Ｔｗｅｅｎ ） ２ ｏ
１００％ｐｉ−１＝７．２５（３７℃） ｂ）Ｔ３−β−ガラクトシダーゼ：１２５ｍＵ／緩衝液
（ｔｕ ） ｃ） ＴＢＧの方向に向いた、紙上に非動性化した抗
体 抗体を、ヒツジｉ ＴＢＧで免疫することによって常法
により得た。抗体を硫酸アンモニウム沈殿及びＤＥＡｇ
−セルロース−クロマトグラフィーの後に付加的にスフ
エロシルに結合したＴＢＧにより免疫収増で精製した。
／Ｌ、Ｍｇ−アスパラギン酸塩、Ｒ８Ａ１％、ＮａＣｔ
Ｏ−９％、） ’ｙイー７ （Ｔｗｅｅｎ ） ２ ｏ
１００％ｐｉ−１＝７．２５（３７℃） ｂ）Ｔ３−β−ガラクトシダーゼ：１２５ｍＵ／緩衝液
（ｔｕ ） ｃ） ＴＢＧの方向に向いた、紙上に非動性化した抗
体 抗体を、ヒツジｉ ＴＢＧで免疫することによって常法
により得た。抗体を硫酸アンモニウム沈殿及びＤＥＡｇ
−セルロース−クロマトグラフィーの後に付加的にスフ
エロシルに結合したＴＢＧにより免疫収増で精製した。
抗体を紙に固定することは、例１の記載と同様にして行
なわれた。
なわれた。
紙１ｇ当シ梢製した抗体２０ＩｒｖＪが与えられた。
ｄ）クロルフェノールロートガラクトシド溶液（５ミ
リ モ ル ／１） 緩備液：ヘベス（Ｈｅｐｅｓ ） １００ミリモ／ｌ／
／ ｔ。
リ モ ル ／１） 緩備液：ヘベス（Ｈｅｐｅｓ ） １００ミリモ／ｌ／
／ ｔ。
ｌＪｇ−アスパラギン酸塩２ミリモル／ ４％ Ｒｂ
ＡＯ−５’Ｉｓ 、ＮａＣ２３，９％、トウィーン（Ｔ
ｗｅｅｎ ）２°１０００ 試験の実施： 血清を１：１０の容量比でＴ３−β−ガラクトシダーゼ
俗液で希釈した。この混合物５０μｔをＴＡＧ−抗体を
市゛する紙１０■によって吸収し、６７°Ｃで１０分間
恒温保持する。結合してないＴ３−β−ガラクトシダー
ゼを除去するために、紙を６（２）緩衝液１００μを宛
で洗浄し、この場合には、全ての洗浄過程後に洗浄液を
遠心分離によって除去する。引続き、紙をクロルフェノ
ールロートガラクトシド溶液５０μｔで宮没する。６７
°０で５分間の恒温保持後、形成された染料溶液全遠心
分離によって紙と分離し、かつ２７μｔの光横容倉及び
Ｏ０６αの層厚を有するマイクロキュベツト中で５７８
ｎｍの波長で測定する。
ＡＯ−５’Ｉｓ 、ＮａＣ２３，９％、トウィーン（Ｔ
ｗｅｅｎ ）２°１０００ 試験の実施： 血清を１：１０の容量比でＴ３−β−ガラクトシダーゼ
俗液で希釈した。この混合物５０μｔをＴＡＧ−抗体を
市゛する紙１０■によって吸収し、６７°Ｃで１０分間
恒温保持する。結合してないＴ３−β−ガラクトシダー
ゼを除去するために、紙を６（２）緩衝液１００μを宛
で洗浄し、この場合には、全ての洗浄過程後に洗浄液を
遠心分離によって除去する。引続き、紙をクロルフェノ
ールロートガラクトシド溶液５０μｔで宮没する。６７
°０で５分間の恒温保持後、形成された染料溶液全遠心
分離によって紙と分離し、かつ２７μｔの光横容倉及び
Ｏ０６αの層厚を有するマイクロキュベツト中で５７８
ｎｍの波長で測定する。
測定した吸光度は、試料の結合能力と比例する。
低い結合能力を有する
血ｆｆ＋ ３５７ ｍ
ＥＴ３Ｕ Ｃラジオアッセイ）＝５９チ ＴＢ（）＜２μｙ／九 標準の結合能力を肩する 血＠ １３５１ ｍＥＴ３
Ｕ ： ２８％ ＴＢＧ ： １６ μｌｌ／ｒｔｔｔ Ｔ３− ／’−ガラクトシダーゼ接合体の製造Ｎ−ｉ三
ブチルオキシカルボニルートリョードチロニン（ＢＯＣ
−Ｔ３ ）及びＮ−第三ブチルオキシ力ルポニルートリ
ョードテロニンーヒトロキシスクシンイミドエステル（
ＢＯＣ−Ｔ３−Ｏ８ｕ ）の製造は、例１の記載と同様
にして行なわれる。
ＥＴ３Ｕ Ｃラジオアッセイ）＝５９チ ＴＢ（）＜２μｙ／九 標準の結合能力を肩する 血＠ １３５１ ｍＥＴ３
Ｕ ： ２８％ ＴＢＧ ： １６ μｌｌ／ｒｔｔｔ Ｔ３− ／’−ガラクトシダーゼ接合体の製造Ｎ−ｉ三
ブチルオキシカルボニルートリョードチロニン（ＢＯＣ
−Ｔ３ ）及びＮ−第三ブチルオキシ力ルポニルートリ
ョードテロニンーヒトロキシスクシンイミドエステル（
ＢＯＣ−Ｔ３−Ｏ８ｕ ）の製造は、例１の記載と同様
にして行なわれる。
ＢＯＣ−Ｔ３−Ｏ８ｕ ： ＤＣ（ＨＰＴＬＣ％ ＲＰ
ｌ ８ 、流展剤：ニトロメタン／エタノール９： １）Ｒｆ−０，６ Ｉ−ガラクトシダーゼとＢＯＣ−Ｔ３−Ｏ８ｕとの反応
及び引続く精製は、例１の場合と同様に実施される。
ｌ ８ 、流展剤：ニトロメタン／エタノール９： １）Ｒｆ−０，６ Ｉ−ガラクトシダーゼとＢＯＣ−Ｔ３−Ｏ８ｕとの反応
及び引続く精製は、例１の場合と同様に実施される。
例 ６
試薬：
ａ）緩衝液：ヘペス（Ｈｅｐｅｓ １００ミリモル／ｌ
Ｍｇ−アスパラキ゛ンｍ塩 ２ ミ リ モ ル ／ ｔ Ｒ８Ａ （牛血清アルブミン） １％ ＮａＣＬ Ｏ，９％ トウイーン（Ｔｗｅｅｎ ）、ｐｌｉ −７，２５（６
７℃） ２°１０゜ ｂ） Ｔ４−β−ガラクトシダーゼ： １７０ ｍＵ
／緩ｇｉＪ液（例１により製造）（紅） Ｃ）紙上に非動性化した抗−Ｔ４−抗体（Ｓ＜Ｔ４＞−
紙）。
Ｍｇ−アスパラキ゛ンｍ塩 ２ ミ リ モ ル ／ ｔ Ｒ８Ａ （牛血清アルブミン） １％ ＮａＣＬ Ｏ，９％ トウイーン（Ｔｗｅｅｎ ）、ｐｌｉ −７，２５（６
７℃） ２°１０゜ ｂ） Ｔ４−β−ガラクトシダーゼ： １７０ ｍＵ
／緩ｇｉＪ液（例１により製造）（紅） Ｃ）紙上に非動性化した抗−Ｔ４−抗体（Ｓ＜Ｔ４＞−
紙）。
抗体を、ヒツジをグルタルジアルデヒドを介して牛血清
アルブミンに結付しているＴ４で免役することによって
常法により得た。
アルブミンに結付しているＴ４で免役することによって
常法により得た。
抗血清に＃Ｌ酸アンモニウム沈殿及びＤＢＡＥ −セル
ロースでのクロマトグラフィーによりｈ製した。
ロースでのクロマトグラフィーによりｈ製した。
抗体全紙に固定することは、例１の記載と同様咳して行
なわれた。紙１１当シ精製した抗体１０−全便用した。
なわれた。紙１１当シ精製した抗体１０−全便用した。
ｄ）クロルフェノールロートガラクトシド、（ＣＰＲＧ
）−７リース： ０．２５μモル／紙（例１の場合と
同じもの）（５Ｉｎ９） 試験の実施： 国情に１：２０の容量比で次の混合物で希釈する： 緩衝赦ａ） １４０μｔ Ｔ４−β−ガラクトシダーゼ浴液ｂ） ５０μｔ６７
゛Ｃで５分間の恒温保持後、Ｓ ＜ Ｔ、 ＞ −紙ｃ
）１０ｍ９の混合物５０μを全吸収し、さらに３７℃で
５分間恒温保持する。引続く遠心分離によって、ＴＢＧ
とＴ４−／’−ガラクトシダーゼからの錯体を含南する
液体を紙と分離し、クロルフェノールロートガラクトシ
ド−フリースｄ）上に導き、酵素反応運度（ｍＶｍｉｎ
）を６７℃及び５７８ ｎｍで２７ ｌｉｔの光ＪＪ
ｌｌｉｔ及び０．６σの膚浮ヲ有するマイクロキュベツ
ト中で測定する。
）−７リース： ０．２５μモル／紙（例１の場合と
同じもの）（５Ｉｎ９） 試験の実施： 国情に１：２０の容量比で次の混合物で希釈する： 緩衝赦ａ） １４０μｔ Ｔ４−β−ガラクトシダーゼ浴液ｂ） ５０μｔ６７
゛Ｃで５分間の恒温保持後、Ｓ ＜ Ｔ、 ＞ −紙ｃ
）１０ｍ９の混合物５０μを全吸収し、さらに３７℃で
５分間恒温保持する。引続く遠心分離によって、ＴＢＧ
とＴ４−／’−ガラクトシダーゼからの錯体を含南する
液体を紙と分離し、クロルフェノールロートガラクトシ
ド−フリースｄ）上に導き、酵素反応運度（ｍＶｍｉｎ
）を６７℃及び５７８ ｎｍで２７ ｌｉｔの光ＪＪ
ｌｌｉｔ及び０．６σの膚浮ヲ有するマイクロキュベツ
ト中で測定する。
測定信号をＴ−プツプテイク値に換算することは、アッ
プティク１１１Ｌが知られている試料で得らオしる較正
曲線により行なわれる。
プティク１１１Ｌが知られている試料で得らオしる較正
曲線により行なわれる。
第１図は、不発明方法によりＴ１３Ｇ−結合能力が知ら
れている試料で得られた較正曲線を示す線図であり、第
２図は、不発明により得られた１直（縦座標）と公知方
法の値（横座標）との比較を示す１１Ｍ図である。 ＦＩＧ、１
れている試料で得られた較正曲線を示す線図であり、第
２図は、不発明により得られた１直（縦座標）と公知方
法の値（横座標）との比較を示す１１Ｍ図である。 ＦＩＧ、１
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、チロキシンを形成するグロブリン（ＴＢＧ）の結合
能力を異質酵素免疫検定の原理により測定する方法にお
いて、試験すべき血清試料を酵素標識したＴ＿４又はＴ
＿３及びＴＢＧ又はＴ＿４に対して非動性化した抗体と
一緒に恒温保持し、相を分離し、標識化酵素を相の１つ
の相中で測定することを特徴とする、チロキシンを形成
するグロブリンの結合能力を測定する方法。 ２、モノクロナール抗−ＴＢＧ−抗体を使用する、特許
請求の範囲第１項記載の方法。 ３、ＴＢＧ又はＴ＿４に対して溶解した抗体及びＴＢＧ
又はＴ＿４に対する抗体に対して非動性化した抗体を使
用する、特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の方法
。 ４、Ｔ＿４ないしはＴ＿３と酵素がスペーサーを介して
結合しているようなＴ＿４−又はＴ＿３−酵素接合体を
使用する、特許請求の範囲第１項から第３項までのいず
れか１項に記載の方法。 ５、Ｃ−原子数３〜８の長さを有するスペーサーを使用
する、特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６、方法を２工程で実施し、第１工程で試料を酵素標識
したＴ＿３又はＴ＿４と一緒に恒温保持し、第２工程で
Ｔ＿４又はＴＢＧに対して非動性化した抗体と一緒に恒
温保持する、特許請求の範囲第１項から第５項までのい
ずれか１項に記載の方法。 ７、抗−Ｔ＿４−抗体を使用する場合、第２の恒温保持
工程を５分以内で実施する、特許請求の範囲第６項記載
の方法。 ８、アミノ酪酸又はグリシルグリシンをスペーサーとし
て使用する、特許請求の範囲第５項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853504406 DE3504406A1 (de) | 1985-02-08 | 1985-02-08 | Verfahren zur bestimmung der bindungskapazitaet des thyroxin bindenden globulins |
| DE3504406.3 | 1985-02-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61186855A true JPS61186855A (ja) | 1986-08-20 |
Family
ID=6262061
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61024262A Pending JPS61186855A (ja) | 1985-02-08 | 1986-02-07 | チロキシンを形成するグロブリンの結合能力を測定する方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0190765B1 (ja) |
| JP (1) | JPS61186855A (ja) |
| AT (1) | ATE54373T1 (ja) |
| DE (2) | DE3504406A1 (ja) |
| ES (1) | ES8701990A1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01257262A (ja) * | 1987-10-02 | 1989-10-13 | Microgenics Corp | 均質なｔ−４取込み分析法 |
| JPH01305358A (ja) * | 1988-04-15 | 1989-12-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | チロキシン結合能の測定法及びこれに好適な標準溶液 |
| US8449349B2 (en) | 2004-03-15 | 2013-05-28 | Otis Elevator Company | Elevator load bearing member having a jacket with at least one rough exterior surface |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3628795A1 (de) * | 1986-08-25 | 1988-03-03 | Hoechst Ag | Neue thyroninderivate |
| US4824777A (en) * | 1987-07-08 | 1989-04-25 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Method for determining thyroxine uptake |
| EP0649533B1 (en) * | 1992-03-30 | 2000-05-10 | Abbott Laboratories | Reagents and methods for the detection and quantification of thyroxine in fluid samples |
| NL1014927C2 (nl) * | 2000-04-12 | 2001-10-15 | Petronella Mariette Meulenberg | Werkwijze voor de bepaling van een hormonenverstorende activiteit van milieuverontreinigende stoffen. |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS533519A (en) * | 1976-06-26 | 1978-01-13 | Nippon Nohyaku Co Ltd | Preventives for viral blight of plant |
| JPS551590A (en) * | 1978-06-12 | 1980-01-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Measuring serum thyroxine combination index and measuring test kit |
| JPS5515094A (en) * | 1978-07-12 | 1980-02-01 | Becton Dickinson Co | Calibrating of thyroid hormone binding capacity |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4040907A (en) * | 1974-06-20 | 1977-08-09 | Syva Company | Iodothyronine enzyme conjugates |
| US4410633A (en) * | 1980-09-25 | 1983-10-18 | Corning Glass Works | Method for the measurement of free thyroxine or 3,5,3'-triiodothyronine in a liquid sample |
| US4481298A (en) * | 1981-04-13 | 1984-11-06 | Amf Incorporated | Pre-precipitated double antibody immunoassay method |
-
1985
- 1985-02-08 DE DE19853504406 patent/DE3504406A1/de not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-02-07 DE DE8686101607T patent/DE3672356D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-02-07 JP JP61024262A patent/JPS61186855A/ja active Pending
- 1986-02-07 ES ES551762A patent/ES8701990A1/es not_active Expired
- 1986-02-07 EP EP86101607A patent/EP0190765B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-02-07 AT AT86101607T patent/ATE54373T1/de not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS533519A (en) * | 1976-06-26 | 1978-01-13 | Nippon Nohyaku Co Ltd | Preventives for viral blight of plant |
| JPS551590A (en) * | 1978-06-12 | 1980-01-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Measuring serum thyroxine combination index and measuring test kit |
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| JPH01257262A (ja) * | 1987-10-02 | 1989-10-13 | Microgenics Corp | 均質なｔ−４取込み分析法 |
| JPH01305358A (ja) * | 1988-04-15 | 1989-12-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | チロキシン結合能の測定法及びこれに好適な標準溶液 |
| US8449349B2 (en) | 2004-03-15 | 2013-05-28 | Otis Elevator Company | Elevator load bearing member having a jacket with at least one rough exterior surface |
| US8734203B2 (en) | 2004-03-15 | 2014-05-27 | Otis Elevator Company | Elevator load bearing member having a jacket with at least one rough exterior surface |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES551762A0 (es) | 1986-12-16 |
| ES8701990A1 (es) | 1986-12-16 |
| EP0190765A1 (de) | 1986-08-13 |
| ATE54373T1 (de) | 1990-07-15 |
| DE3672356D1 (de) | 1990-08-09 |
| DE3504406A1 (de) | 1986-08-14 |
| EP0190765B1 (de) | 1990-07-04 |
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