JPS6385358A

JPS6385358A - 血中遊離型トリヨ−ドサイロニンの酵素免疫測定法

Info

Publication number: JPS6385358A
Application number: JP23092586A
Authority: JP
Inventors: Kiyoshi Miyai; 宮井　潔; Naonari Hata; 畑　直成
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 1986-09-29
Filing date: 1986-09-29
Publication date: 1988-04-15

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は血中遊離型トリヨードサイロニンの酵素免疫測
定法（ＥＩＡ法）に関し、詳細には試料中に共存するサ
イロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）及びアルブミン等
の影響を受けることなく血中ｆ２１ＩＩｆｆ型トリヨー
ドサイロニンを特異的に且つ正確に測定する方法に関す
るものである。

［従来の技術］甲状腺ホルモンであるトリヨードサイロニン（以下、Ｔ
、と略称することがある）は血中に存在する場合、その
大部分はＴＢＧあるいはアルブミンなどの甲状腺ホルモ
ン結合タンパクと結合し生理的に不活性な状態で存在し
、その状態での総Ｔ３の血中濃度は甲状腺機能が正常で
ありても（７３分泌・生成量に変動がなくとも）、種々
の生理的・病的状態による甲状腺ホルモン結合タンパク
量の変動に伴なって変化する。従ってこのような影響を
受けずに生理活性のある遊離型Ｔ３濃度を正確に測定す
ることは甲状腺機能の現況を知る上で重要な意義がある
。

遊離型Ｔ、の測定法に関しては種々開発されており、夫
々一長一短を有している。従来法としては例えば平衡透
析法、限外濾過法、セファデックスゲル濾過法、ガスク
ロマトグラフィー法、カラム吸着クロマトグラフィー法
等が知られているが、いずれも技術的に複雑であり、ま
た臨床への適応性においても限られたものであった。

［発明が解決しようとする問題点］この様な状況のもとで、近年、ＴＢＧと結合しない性質
を有する放射性ＴｓＭ導体を用いて遊離型Ｔ、の測定を
行なうといった比較的簡単な放射免疫測定法（ＲＩＡ法
）も開発されるに至った（Ａｎｎａｌｅｓ　ｄ’　Ｅｎ
ｄｏｃｒ：ｎｏｌｏｇｉｅ　１９８２；４３：４１Ａ）
。

しかしながらこの方法においても、試料中に共存するア
ルブミンの濃度によって遊離型Ｔ、測定値が影響を受け
るという欠点は解消しきれていない、また放射性物質を
用いなければならないという繁雑さもある。

このように従来から使用されている遊離型Ｔ３測定法は
、操作上の簡便さ、あるいは特異性のいずれかにおいて
完全とはいいがたい面を有しているのが実情である。即
ち甲状腺機能異常の診断においては、理論的には血中の
総Ｔ、濃度を測定するよりも遊離型Ｔ、を測定する方が
臨床診断上の価値が高いといわれながらも血中遊離型Ｔ
、測測定血中総Ｔ、測定にとりで代るほど浸透しない原
因となっていた。

本発明者らはこのような現状を憂慮し、現在量も汎用さ
れている「放射性Ｔ、誘導体を標識抗原とする遊離型Ｔ
３の測定法」において、ＴＢＧにもアルブミンにも結合
しない非放射性Ｔ３誘導体を用いれば試料中に共存する
ＴＢＧやアルブミンの影響を受けることのない簡便な遊
離型Ｔ、測定法を確立できるのではないかと考え、多数
の基礎実験を繰り返し、ここに本発明を完成するに至っ
た。

即ち本発明は上記従来方法における技術的課題点を解決
するためになされたものであり、その目的とするところ
は、簡便迅速で且つ特異性のある血中遊離型Ｔ、の測定
法を提供することにある。

［問題点を解決する為の手段］上記目的を達成し得た本発明方法とは、トリヨードサイ
ロニンとβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の酵素との結合体
よりなり、血液中のサイロキシン結合グロブリン（ＴＢ
Ｇ）＆びアルブミンに対して不活性な標識抗原を使用し
、血中に存在する遊離型トリヨードサイロニンを測定す
る点に要旨を有する血中遊離型トリヨードサイロニンの
酵素免疫測定法である。

［作用］本発明は上述の如く構成されるが、要はトリヨードサイ
ロニン（Ｔ、）と大分子量タンパクとの結合体を作製し
、該結合体を、抗Ｔ、抗体とは結合反応するが試料中に
共存するＴＢＧ及びアルブミンとは結合反応を起こさな
い標識抗原として用いるものである。即ちＴ３を大分子
量の酵素と結合させれば、そのまま酵素標識抗原として
ＥＩＡ法に用いることが可能である。例えばＴ３と大分
子量タンパクであるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼをマレイ
ミド法で結合させたＴ３−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ結
合体は、抗Ｔ、抗体との間に抗原抗体反応を起こすが、
ＴＢＧ１びアルブミンとは結合反応を起こさず、しかも
それ自体が酵素で標識されていることから、該結合体を
標識抗原として用いることによって、ＴＢＧ及びアルブ
ミンに影響されない遊離型Ｔ、のＥＩＡ法を確立するこ
とがで診る。

尚Ｔ３と結合させる酵素としては前記β−Ｄ−ガラクト
シダーゼに限らず、その他の酵素であってもグルタルア
ルデヒド等の架橋剤による結合に際し大分子量Ｔ３−酵
素結合体を形成するものであれば用いることができ、こ
れによりＴＢＧにもアルブミンにも結合しない標識抗原
を作製することができる。

［実施例］以下、本発明を実施例によって更に詳細に説明するが、
下記実施例は本発明を限定するものではなく、前後記の
趣旨に徴して変更を加えることは、いずれも本発明の技
術的範囲に含まれるものである。

（Ｉ）Ｔ３−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ結合体（Ｔ３−
ガラクトシダーゼ結合体）の作製５０μｇのＴ３を溶解
させたジメチルホルムアミド溶を夜５０μｍと、１０μ
ｇの４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カ
ルボン酸サクシンイミドエステルを溶解させたジメチル
ホルムアミド溶液５０μｍとを混合し、３０℃で９０分
間インキュベート（５分毎に攪拌）した。次に、１ｍｏ
Ｉｌ／４２のグリシン溶液１０μ皿を加え、Ｔ３−マレ
イミドを生成した。

一方、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ溶液（０，２ｍｇ／４
０ＩＬ）を２０００ｇで５分間遠心分離し、生じたベレ
ットを、１　ｍ　ｍｏｌ／ｉ、のＭｇＣｌ２を含む０．
１　ｍｏｌ／ｊ！リン酸Ｍ街液（ｐＨ７，０）　０．８
ａｌに溶解させた。この溶液に前記Ｔ３−マレイミド溶
液１５０μ立を加えた後、３０℃で３０分間インキュベ
ートし、更にその全量を、１　ｍ　ｍｏｌ／ＪＺのＭ　
ｇ　Ｃ１２とメルカプトエタノールを含むリン酸緩衝液
で平衡化したＳ　ｅｐｈａｃｒｙｌ　　Ｓ　−３００（
１，５ｘ　４５　ｃｍ）カラムに通し、次いで同一緩衝
液で溶出して溶出液を１　ｍ℃ずつ分画した。各分画液
（水で１５０倍希釈）５０μｍに、抗Ｔ３抗血清溶液（
１０ｍ３．／Ｑの家兎ＩｇＧ１液にて８０００倍に希釈
したもの）を加え、４℃で一夜放置した。そして抗家兎
γ−グロブリン山羊抗血清を加えることによって、結合
型と遊離型とに分け、生じた沈殿物における酵素活性を
後述する分析手順で測定した。ピークの酵素活性を含む
６つの分画を集めてアジ化ナトリウムを加えたく最終的
な濃度；Ｉｇ／ｊ２）。この様にして得られたＴ、−ガ
ラクトシダーゼ結合体は、４℃の保存で少なくとも１年
間は使用可能であった。

（ＴＩ）遊離型Ｔ、標準液正常なヒト血清を活性炭処理して遊離型Ｔ、を含まない
血清を作製しくＡｍｅｒｌａｘ　　Ｆ　Ｔ３　ＲＩ　Ａ
キットで確認）、この血清に異なった量のＴ３を溶かし
て遊離型Ｔ、標準液を作製した。尚遊離型Ｔ３濃度は平
衡透析法によって検定した。

（ＩＩＩ）測定手順（１）血中遊離型Ｔ、の酵素免疫測定法試料は希釈液で
希釈した。用いた希釈液はリン酸緩衝液（０，１ｍｏｌ
／　Ａ　、ｐＨ７，０）であり、この緩衝を夜には１２
当たり各々１　ｍ　ｍｏｌのＭｇＣ１□とメルカプトエ
タノール及び１ｇのゼラチンを含んでいる。そして標準
又は試験用の血清１０μλに、Ｔ３−ガラクトシダーゼ
結合体溶液（５０倍に希釈したもの）５０μｍ、固定化
抗Ｔ３抗体の懸濁液（抗Ｔ、抗血清をポリスチレン微粒
子に吸着させたもの）５０μ℃及び希釈液５０μｍを混
合した。そして試料を室温（約１５〜２２℃程度）で１
６時間インキュベートした。更に洗浄液（リン酸緩衝液
にＴｗｅｅｎ２０　、　１　ｇ／ＪＺ含ませたもの）を
加え、混合物を１０００ｇで１５分間遠心分離した。沈
殿物中におけるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性はシフ
リン（Ｓ　ｈｉｆｒｉｎ）等の方法（Ａ　ｒｃｈ、　　
Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　１９６９）
とほぼ同じ方法によって決定した。

生じた沈殿物は洗浄液で２度洗浄した後、ＩＪ：Ｌ当た
り５０μλのメタノールを含んだ０−ニトロフェニル−
β−Ｄ−ガラクトピラノジッドの１ｇ／！ｌ溶液を１　
　ｍＪ２加え、懸濁させた。３７℃で２時間インキュベ
ートした後、１０００ｇで１５分間遠心分離し、上澄液
における４０５ｎｍでの吸光度を測定した。

（２）Ｔ３−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ結合体のＴＢＧ
及びアルブミンに対する結合能正常なヒト血清２０μｋに標識Ｔ、（＋２ｓ工標識Ｔ３
又はＴ３−ガラクトシダーゼ結合体或は＋’ｓＩｉ識Ｔ
ｓ　８４体）　ｌｔ　１２＋ＩＩ　１ｍ識Ｔ　Ｂ　ｃｒ
ヲ２００μｍ添加し、室温で２０時間インキュベートし
た。次に抗ＴＢＧ抗血清（１２０倍に希釈したもの）を
２００μｍ加えた。次いで第２抗体を加えることにより
結合型と遊離型に分け、沈殿物における酵素活性度及び
放射活性度を測定した。標識Ｔ３のＴＢＧに対する結合
能（％）は、＋２Ｊｉ識ＴＢＧの沈殿率（％）から明ら
かにされる沈殿比率（４０／１００）を補正して算定し
た。

Ｔ３−ガラクトシダーゼ結合体、　１′Ｉ標識Ｔ３又は
＋２４１　　工標識誘導体に種々な量のアルブミンを加
えた後、固定化Ｔ、抗体の懸濁液に混合し、沈殿物の酵
素活性又は放射活性を測定した。

（３）放射免疫測定法遊離型Ｔ３の放射免疫測定は、アマレックス（Ａｍｅｒ
ｌｅｘ）　Ｆ　Ｔ３　ＲＩ　Ａキットによった。

（４）平衡透析法平衡透析法による遊離型Ｔ３分画液の測定は、ニューマ
ン等の方法（Ｊ　、　ＣＨｎ、　Ｉ　ｎｖｅｓｔ、１９
６７　；４６　：　１３４６−５５）及びイングバール
等の方法（Ｊ　、　　ＣＩｉｎ、　Ｉ　ｎｖｅｓｔ、１
９６５　；　４４　：　１６７９−８９）に準じて行な
った。Ｔ、のＲＩＡキットによって測定された総Ｔ３濃
度に、遊離型Ｔ３比率を乗じて遊離型Ｔ３濃度を測定し
た。

（５）アルブミンの測定法血清アルブミン濃度は、ＴＢＡ−８Ｏ３分析装置（東芝
製）を用い、ブロモクレゾール緑色染色法によって測定
した。

（ＴＶ）被験者・４７人の患者から静脈血を採取した。内訳は１８人が
甲状腺機能先進症、１７人が甲状腺機能低下症、９人が
先天性ＴＢＧ減少症、３人が先天性ＴＢＧ増加症であっ
た。試料は、その他３０人の正常な妊婦（年齢２３〜２
９才）と３１人の健常人（年齢２２〜５２才）から集め
た。尚上記３０人の妊婦の内訳は、妊娠初期（第−期）
、中期（第二期）及び後期（第三期）の夫々に各１０人
ずつであった。

（Ｖ）測定結果（１）Ｔ３−ガラクトシダーゼ結合体におけるＴＢＧ及
びアルブミンに対する結合能１２ｓ！標識Ｔ３におけるＴＢＧに対する結合能は１５
．４±０．３（平均値上標準偏差）％と算定される。こ
れに対して　１２ＳＩ標識Ｔ３誘導体及びＴ、−ガラク
トシダーゼ結合体のＴＢＧに対する結合能は、夫々０．
１±０．１％及び０．２±０．１％にすぎなかった。

アルブミンの最終濃度が３５〜Ｂｏｇ／ｊ２（正常の範
囲、後記第１図中破線で示す）となる様に加えたときに
は、１２８　Ｉ標識Ｔ３及び１２Ｂ　１標識Ｔ、誘導体
の抗Ｔ、抗体に対する結合能の相違はいずれも８．０％
であった。これとは対照的に、Ｔ、−ガラクトシダーゼ
結合体の抗Ｔ３抗体に対する結合能の相違は、上記と同
様のアルブミン濃度の範囲で、１．６％に過ぎないこと
が分かった。

この結果を第１図に示す、尚第１図中日はアルブミン各
濃度に対応する抗体結合率、Ｂｏはアルブミン乎濃度の
時の抗体結合率をあられし、縦軸はその比Ｂ　／　Ｂ　
ｏをとっている。

（２）標準曲線第２図に典型的な標準曲線を示す。即ち第２図は遊離型
ＴｓｖＡ度と吸光度（４ｏｓｎｍ）との関係を表わすグ
ラフである。６回の測定を繰り返し、零における吸光度
が９５％の信頼限界で標準曲線と交差する点から求めら
れる最小検出濃度は０．７ｎｇ／ＩＬ（チューブ当たり
７　ｆｇ）であると計算された。この標準曲線によって
、血清中の遊離型Ｔ３の測定が０．７〜２６ｎｇ／λの
範囲で可能であった。

（３）　Ｐｉｉ度下記第１表に示す様に、血中遊離型Ｔ、を末法で測定し
た時の測定内における変動係数（ＣＶ）は４．０〜９．
０（平均６．１）％であり、測定間におけるＣＶは７．
５〜１１．５　（平均９．５）％であった。

第　　　１　　　表（４）他の方法との比較本発明方法の酵素免疫測定法によフて測定される各種血
清中の遊離型Ｔ、濃度は、第３図（１）に示す様に平衡
透析法によって測定される遊離型Ｔ、濃度と良好な相間
々係が認められた。又本発明の酵素免疫測定と放射免疫
測定法（Ａ　ｍｅｒｌｅｘのＴ、測定キットによる）と
による遊離型Ｔ３濃度の相間々係においても、第３図（
２）に示す様に同様の傾向が認められた。

（５）各種被験者における遊離型Ｔ、濃度第４図は、各
種被験者における血清中の遊離型Ｔ３濃度を示すグラフ
である。３１人の健常人から得られた血清中における、
酵素免疫測定法による平均遊離型Ｔ３濃度は５．４ｎｇ
／ｕであり、正常範囲は１．９〜８．９Ｂ／ＪＺであっ
た。第４図から明らかであるが、１８人の甲状腺機能先
進症患者における血清中の遊離型Ｔ３濃度は、１１．５
〜２６　ｎｇ／　１１以上と高い値を示している。また
１７人の甲状腺機能低下症患者における血清中の遊離型
Ｔ３濃度は、０．７〜４．７ｎｇ／ｕを示し、正常値と
同じ程度かいくらか低い値を示していた。更に、９人の
先天性ＴＢＧ減少症患者及び３人の先天性ＴＢＧ増加症
患者における血清中の遊離Ｔ３ｔ１４度は、夫々２．４
〜７．６ｎｇ＃ｌ及び４．２〜［ｉ、ｔｉｎｇ／ｆＬの
値を示し、正常値の範囲内であった。一方３０人の正常
な妊婦における遊離Ｔ、濃度は正常値の範囲内（３，２
〜７．２ｎｇ／ｕ　）であった。

（６）正常な妊婦における遊離型Ｔ、及びアルブミンの
濃度下記第２表から明らかな様に、（表中の数値は平均値主
標準偏差を示す）、放射免疫測定法によって測定された
遊離型Ｔ、濃度は妊娠の進行につれて低くなっているの
がよく分かる。これに対し、酵素免疫測定法又は平衡透
析法によって測定した場合には、妊娠期間中を通して遊
離型Ｔｓｆａ度に何らの変化は認められなかった。さて
血清アルブミン濃度をみると、妊娠の進行につれて低く
なってゆくのが明らかである。

放射免疫測定法によって測定された遊離型Ｔ３濃度は、
第５図（１）に示す様に血清アルブミン濃度と強い相間
々係があった。しかしながら、対照的に、酵素免疫測定
法や平衡透析法によって求められた遊離型Ｔ３濃度は、
夫々第５図（２）　、　（３）に示す様に、血清アルブ
ミン濃度とはほとんど関係がなかった。

［発明の効果］上述のように本発明の血中遊離型トリヨードサイロニン
の測定法は、トリヨードサイロニンとβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼ等の酵素との結合体よりなり、血液中のサイロ
キシン結合グロブリンおよびアルブミンに結合しない標
識抗原を使用して酵素免疫法により血液中の遊離型トリ
ヨードサイロニンを測定する方法であるため、試料中の
共存成分の影響を受けることなく、また特別な熟練を必
要とせず、簡便迅速で且つ感度良く測定することができ
、甲状腺機能の正確な判定に効果がある。

【図面の簡単な説明】

第１図はアルブミン濃度と抗体結合Ｔ、との関係を従来
法及び本発明方法について示したグラフ、第２図は遊離
型Ｔ、濃度と吸光度との関係を示す標準曲線のグラフ、
第３図（１）は酵素免疫測定法と平衡透析法によって測
定される遊離型Ｔ３の相間々係を示すグラフ、第３図（
２）は酵素免疫測定法と放射免疫測定法の夫々によって
測定される遊離型Ｔ３濃度の相間々係を示すグラフ、第
４図は各種被験者の血中遊離型Ｔ３濃度を示すグラフ、
第５図は各種測定法によって測定された遊離型Ｔ３濃度
と血清中のアルブミン濃度との関係を示すグラフである
。第１図アルブミン濃度Ｃｇ／ｅ）

Claims

【特許請求の範囲】

トリヨードサイロニンとβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の
酵素との結合体よりなり、血液中のサイロキシン結合グ
ロブリン及びアルブミンに対して不活性な標識抗原を使
用し、血中に存在する遊離型トリヨードサイロニンを測
定することを特徴とする血中遊離型トリヨードサイロニ
ンの酵素免疫測定法。