JPH0239747B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はいわゆる「サンドイツチ原理」による
酵素−免疫過程に関する。この原理によれば、測
定すべき物質（これは抗原でも、抗体でも、ある
いはハプテンでもよい）を二つの免疫学的に活性
な反応の相手と反応させる。普通には、これら免
疫学的に活性な反応の相手を水不溶性担体に結合
させ、一方他は適当な酵素でしるしをつける。実
際には測定すべき物質を、担体に結合させた反応
の相手と最初に反応させ、それから相分離および
洗浄後、担体に免疫学的に結合した物質を第二の
酵素でしるしをつけた反応の相手と反応させる。
再び始めた相分離後、測定すべき物質の定量的検
出のための酵素反応を固相または液相何れかで行
なう。 酵素−免疫法の場合、測定すべき物質の免疫学
的反応は二つの対応する免疫学的に活性な反応相
手を用いて第一および第二の反応工程で順次行な
わねばならないことがこれまでの見解であつた。 本発明の範囲内で、従来存在している説とは反
対に、事実上「ワン−ポツト法」で処理できるこ
とがここに意外にも発見され、そしてこの方法は
測定すべき物質を単一インキユベーシヨン中免疫
学的に活性な両方の反応相手と同時に反応させ
る。 従つて本発明は酵素でしるしをつけた免疫学的
に活性な反応の相手ならびに水不溶性担体に結合
させた、あるいは結合させようとする免疫学的に
活性な反応の相手を用いて、測定すべき物質をこ
れら免疫学的に活性な反応相手とインキユベーシ
ヨンし、、その後固相および液相を分離し、固相
あるいは液相何れかにおける酵素のしるしの程度
を、測定すべき物質量の程度として測定する、物
質の検出および測定のための酵素−免疫法に関す
る。 本発明により少なくとも２つの免疫学的に活性
な部位を有する物質を測定するための免疫分析方
法であつて、 ａ (i) 少なくとも２つの免疫学的に活性な部位
またはエピトープを有する物質、 (ii) 酵素標識を有する免疫学的に活性な反応相
手、および (iii) 水不溶性担体に結合しているか、または結
合する免疫学的に活性な反応相手、 の混合物を作り； ｂ この混合物を一度だけインキユーベートし
て、上記反応相手を上記物質と反応させ； ｃ 固体相と液体相とを分離し；次いで ｄ 固体相または液体相中の酵素標識の程度を測
定することにより、物質の量を決定する、 ことからなり、この方法で、上記免疫学的に活性
な反応相手の１つが上記エピトープの１つと反応
するモノクロナル抗体であり；免疫学的に活性な
反応相手のもう１つが上記エピトープのもう１つ
と反応性であつて、異なるモノクロナル抗体であ
るかまたは異なる動物種からの抗体である方法が
提供される。 測定すべき物質は、免疫学的反応の相手が存在
する、あるいは形成させることができる、そして
二つまたはそれ以上の免疫学的に活性な部位を有
する生理学的流体、細胞抽出物または組織抽出物
中のどんな構成成分でもよい。このような物質に
はペプチド、タンパク質、リポタンパク、糖タン
パク、ステロール、ステロイド、類脂質、核酸、
酵素、ホルモン、多糖類およびアルカロイドが含
まれる。特に適当な免疫学的活性物質は天然抗
原、例えばホルモン、酵素、器官特異的抗原、結
合組織成分、血球抗原、血漿タンパク質、および
病理学的グロブリンである。特に好ましい物質は
癌胚抗原（CEA）ならびにヒトの絨毛膜ゴナド
トロピン（HCG）である。 本発明による方法において、酵素でしるしをつ
けた免疫学的に活性な反応相手は免疫反応の指示
薬として役立つ。特に適当な酵素はアルカリ性ホ
スフアターゼ、リンゴ酸塩デヒドロゲナーゼ、ブ
ドウ糖−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ糖
オキシダーゼ、グルコアミラーゼ、ガラクトシダ
ーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼであ
る。西洋わさびから得られるペルオキシダーゼは
特に適当な酵素標識である。 免疫学的反応の指示薬としての酵素は液相で、
あるいはなるべく固相で公知の方法により測定さ
れ、測定すべき物質の量に対する尺度となる。標
識が西洋わさびからのペルオキシダーゼである場
合、酵素の量は存在する触媒活性に基づいて測定
するのがよく、そしてこれは過酸化水素および酸
化還元指示薬としてのｏ−フエニレンジアヨンの
助けにより測定される。この場合、30分間続く接
触反応後酸化されたレドツクス指示薬の呈色強度
を光度測定する。 第二の免疫学的に活性な反応相手は分析試料か
らの測定すべき物質の分離に役立つ。この分離段
階のため、第二の免疫学的に活性な反応相手を最
初から水不溶性担体に結合することができ、ある
いは免疫学的反応の間あるいは後でかかる担体に
結合させることができる。 第二の免疫学的に活性な反応相手に適した水不
溶性担体は有機および無機重合体（アミラーゼ、
デキストラン、天然および変性セルロース、ポリ
アクリルアミド、アガロース、磁鉄鉱、多孔質ガ
ラス粉末、ポリフツ化ビニリデン〔Kynar（これ
は登録商品名である）およびラテツクス）、試験
容器の内壁（試験官、タイタープレート、または
ガラスあるいは人工材料のセル）ならびに固体物
体の表面（ガラスおよび人工材料の棒、末端を太
くした棒、末端に丸い突起をつけた棒あるいは薄
板状にした棒）である。ガラスおよび人工材料の
球は本発明方法に特に適した担体である。 第二の免疫学的に活性な反応相手は水不溶性担
体に物理的に（吸着的に）あるいは化学的に、あ
るいはもう一つの反応相手（そしてこのものを担
体に結合させる）の助けにより結合させることが
できる。 本発明方法に対しては、測定すべき物質が少な
くとも二つの免疫学的に活性な部位（エピトー
プ）を有することが絶対必要であり、そしてこれ
は二つの免疫学的に活性な反応相手、即ち担体に
結合された反応相手と酵素でしるし付けられた反
応相手、により識別されそして反応することがで
きるものである。免疫学的に活性な反応相手とし
ては、異なるクローンの抗体またはモノクロナル
抗体と異なる動物種からの抗体との組合せが使用
される。測定しようとする物質と両方共に確実に
反応する２種の異なる成分の各々が異なる免疫学
的活性部位に対するものであると好ましい。 免疫学的反応に対しては、測定するべき物質を
有する試料を直接用いることができ、あるいは適
当な仕方で前希釈あるいは前処理することもでき
る。前処理のためには、測定すべき物質を単離す
るか濃縮するか、あるいは扱いにくい成分を除去
することができる。 本発明方法によると、測定すべき物質を酵素で
しるしをつけた免疫学的に活性な反応相手と担体
に結合させた免疫学的に活性な反応相手とを同時
に反応させる。試薬を加える順序は選ばれた担体
系の型により支配される。感作したプラスチツク
球を用いる場合、酵素でしるしをつけた反応相手
および測定すべき物質を最初に適当な試験管中に
一緒に入れ、その後他の反応相手で感作した球体
を加える。 免疫学的反応相手は最適PH値（これは４と９と
の間にありうる）を保つように適当な緩衝系で行
なう。特に適当な緩衝剤は、例えば酢酸塩緩衝
剤、クエン酸塩緩衝剤、リン酸塩緩衝剤、トリス
バツフアー、トリエタノールアミン緩衝剤、ホウ
酸塩緩衝剤またはグリシン緩衝剤でる。緩衝剤混
合物も使用できる。 免疫学的反応は０℃と55℃との間の温度で行な
うのがよい。通常は、免疫学的反応の速度は温度
をより高くする程増加し、それにより他の点では
同様な試験条件下で、より迅速に平衡に達する。 酵素でしるしをつけた反応相手および担体に結
合させた反応相手と測定すべき物質とのインキユ
ベーシヨンは平衡に達するまで行なうことができ
る。しかし、免疫学的反応はもつと早い時点で限
定されたインキユベーシヨン時間後に固相と液相
を分離し、液相または固相何れかにおける酵素の
しるしの程度を測ることによつて、止めることが
できる。 免疫学的反応においては、反応の相手、測定す
べき物質ならびに酵素の免疫学的活性を安定化す
るよう予防手段を講じることができる。更に、非
特異的反応を除去し、阻害的影響を減らし、また
は活性化を高めるためにタンパク質および洗剤と
いつた成分をインキユベーシヨン溶液へ加えるこ
とができる。 本発明による新規方法は異常な程敏感であり、
操作上の単純さにより区別される。 下記の例により本発明を説明する。 例 １ モノクロナールCEA抗体および通常のCEA抗
体（ヤギ）を用いる患者血漿中のCEAの定量 必要量の試験管（10×75mm）中に、各場合にお
いて、試験溶液（NaH₂PO₄／Na₂HPO₄0.2モ
ル／、ウシ血清アルブミン２ｇ／、PH6.5、
正常なヤギ血清20重量／重量％およびヤギ−抗−
CEA−ペルオキシターゼ結合体0.2μｇ／ml）0.2
mlをピペツトで計り入れ、分析しようとする患者
血漿あるいはCEA標準液（CEA 0nｇ／ml、
CEA2.5nｇ／ml、CEA10nｇ／ml、および
CEA20nｇ／ml）0.050mlおよびCEA対照血清
（CEA5.0nｇ／ml±1.0nｇ／ml）0.050mlを混合
し、各場合ともモノクロナールマウス抗−CEA
＊で感作したポリスチレン球（φ＝6.5mm）を加
え、混合物を37℃で16時間インキユベーシヨンす
る。その後ポリスチレン球を各場合とも２〜５ml
の蒸留水で三回洗浄し、各場合ともペルオキシダ
ーゼ活性の測定のため基質緩衝液（PH5.0のクエ
ン酸カリウム緩衝剤0.1モル／に過酸化水素６
ミリモル／およびｏ−フエニレンジアミン20ミ
リモル／を含有）0.5ml中に移し、室温（22℃）
で30分間インキユーベーシヨンする。過酸化物の
活性を止めそして色強度を強めるため1N塩酸2.0
mlを混合し、30分以内に波長492nmにおいて吸光
度を光度測定する。CEA測定値を表に収集し、
ROCHEの放射線免疫検定で得られた値と比較す
る。 ＊モノクロナールマウス抗−CEAの調製は
Journal of Immunological Methods，32（1980）
297〜304に記述された方法と同様に行なうが、融
合のための出発細胞系列として、ATCCにNO.
CRL8006として寄託されている。骨髄細胞腫系
列Sp2／0.1−AGを使用する。融合はCEAで免疫
化されたマウスの脾臓細胞を用いて行なう。マウ
スの免疫化は上記発行物の表と同様に行ない、
最初の二つの免疫化は各場合ともCEA50μｇを用
いて行ない、免疫化３と４は省き、免疫化５は
CEA80μｇで行ない、免疫化６〜８は各場合
CEA200μｇで行なう。

【表】 CEA2.5nｇ／ml以下の値は正常な範囲に入る
が、2.5nｇ／mlより上の値は病理学的範囲に入
る。 例 ２ 二つの異なるクローンからのモノクロナール
CEA抗体を用いる患者血漿中のCEAの定量 必要数の試験管（10×75mm）の中に各場合とも
試験溶液（NaH₂PO₄／Na₂HPO₄0.2モル／、
PH6.5、ウシ血清アルブミン２ｇ／、正常なヤ
ギ血清20重量／重量％、およびモノクロナールマ
ウス−抗−CEAペルオキシダーゼ結合体＊0.15μ
ｇ／ml含有）0.2mlをピペツトで計り入れ、分析
しようとする患者の血漿あるいはCEA標準液
（CEA0nｇ／ml、CEA2.5nｇ／ml、CEA10nｇ／
ml、およびCEA20nｇ／ml）0.050mlおよびCEA
対照血清（CEA5.0nｇ／ml±1.0nｇ／ml）を混合
し、各場合ともモノクロナールマウス−抗−
CEA＊で感作したポリスチレン球（φ＝6.5mm）
を加え、混合物を37℃で16時間インキユベーシヨ
ンする。その後、ポリスチレン球を各場合とも２
〜５mlの蒸留水で三回洗浄し、各場合ともペルオ
キシダーゼの測定のため基質緩衝液（過酸化水素
６ミリモル／およびｏ−フエニレンジアミン20
ミリモル／を含有するPH5.0のクエン酸カリウ
ム緩衝剤0.1モル／）0.5ml中に移し、室温（22
℃）で30分間インキユベーシヨンする。過酸化物
活性を止めかつ色強度を強化するため、2.0mlの
1N塩酸を混合し、30分以内に波長492nmにおい
て吸光度を光度測定する。CEA測定値を表に
収集し、ROCHEの放射線免疫検定で得られた値
と比較する。 ＊モノクロナールマウス抗−CEAの調製は
Journal of Immunological Methods、32（1980）
297〜304に記述された方法と同様に行なうが、融
合のための出発細胞系列としてATCCにNo.
CRL8006として寄託されている骨髄細胞腫系列
Sp2／0.1−A_Gを使用する。融合はCEAで免疫化
したマウスの脾臓細胞を用いて行なう。マウスの
免疫化は上記発行物の表と同様に行なうが、最
初の二つの免疫化は各場合とも50μgのCEAを用
いて行ない、免疫化３と４は省略し、免疫化５は
50μｇのCEAを用いて行ない、免疫化６〜８は各
場合とも200μｇのCEAを用いて行なう。CEA抗
原の異なるエピトープに対して向けられる二つの
異なる適当なモノクロナール抗体を使用する。

【表】

【表】 CEA2.5nｇ／ml以下の値は正常範囲に入るが、
2.5nｇ／mlより上の値は病理学的範囲に入る。 例 ３ 血清／血漿／尿中のHCGの定量 必要数の試験管（10×75mm）の中に各場合とも
試験溶液（NaH₂PO₄／Na₂HPO₄0.1モル／、
PH7.0、ウシ血清アルブミン２ｇ／、およびモ
ノクロナールマウス−抗−HCG−ペルオキシダ
ーゼ結合体＊1.0μｇ／mlを含有）0.2mlをピペツ
トで計り入れ、分析しようとする患者の血漿ある
いはHCG標準液（HCG0、25、50、100および
250mIU／ml）0.050mlを混合し、各場合とも家兎
−抗−HCGで感作したポリスチレン球（φ＝6.5
mm）を加え、混合物を水で飽和された雰囲気中室
温で16時間インキユベーシヨンする。その後、ポ
リスチレン球を各場合２〜５mlの蒸留水で三回洗
浄し、各場合ペルオキシダーゼ活性測定のため
0.5mlの基質緩衝液（過酸化水素６ミリモル／
およびｏ−フエニレンジアミン20ミリモル／を
含有するPH5.0のクエン酸カリウム緩衝剤0.1モ
ル／）中に移し、室温（16〜30℃）で30分間イ
ンキユベーシヨンする。過酸化物活性を止め色強
度を強めるため2.0mlの1N塩酸を混合し、30分以
内に波長492nmにおいて吸光度を光度測定する。
血清および尿中のHCG測定値を次の表に集めた。 ＊モノクロナール抗−HCGの調製はJournal
of Immunolosical Methods，32（1980）297〜
304に記述された方法の一つによる行ないうる。 血清および尿中のHCG定量

【表】

【表】 例 ４ 二つの異なるクローンからモノクロナール
HCG抗体を用いる血清中のHCGの定量 必要数の試験管（10×75mm）中に各場合とも
0.2mlの試験溶液（NaH₂PO₄／Na₂HPO₄0.1モ
ル／、PH7.0、ウシ血清アルブミン２ｇ／お
よびモノクロナール抗体マウス抗−HCG−ペル
オキシダーゼ結合体＊1.0μｇ／mlを含有）をピペ
ツトで計り入れ、分析しようとする患者の血漿あ
るいはHCG標準液（HCG0，24，50，100および
200mIU／ml）0.050mlを混合し、各場合ともモノ
クロナールマウス−抗−HCG＊で感作したポリ
スチレン球（φ＝6.5mm）を加え、混合物を例え
ば37℃で２時間インキユベーシヨンする。その
後、ポリスチレン球を各場合とも２〜５mlの蒸留
水で三回洗浄し、各場合ともペルオキシダーゼ活
性測定のため、0.5mlの基質緩衝液（過酸化水素
６ミリモル／およびｏ−フエニレンジアミン20
ミリモル／を含有するPH5.0のクエン酸カリウ
ム緩衝剤0.1モル／）に移し、室温（16〜30℃）
で30分間インキユーベーシヨンする。過酸化物活
性を止めかつ色強度を強めるため1.0mlの2N塩酸
を混合し、30分以内に吸光度を波長492nmで光度
測定する。血清中のHCG測定値を次の表に収集
すた。 ＊モノクロナールマウスHCG抗体の調製は
Journal of Immunological Methods，32（1980）
297〜304に記載の方法による行う。HCG抗原の
異なるエピトープに対して向けられる二つの異な
る適当なモノクロナール抗体を用いる。 ヒト血清中のHCG定量（重復測定からの平均値）

【表】 下に集められた患者血清の例のHCG値は標準
曲線１）から読み取つた。標準曲線２，３）およ
び４）は別の日に新しいHCG標準液を用いて確
定した。

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 少なくとも２つの免疫学的に活性な部位を有
   する物質を測定するための免疫分析方法であつ
   て、 ａ (i) 少なくとも２つの免疫学的に活性な部位
   またはエピトープを有する物質、 (ii) 酵素標識を有する免疫学的に活性な反応相
   手、および (iii) 水不溶性担体に結合しているか、または結
   合する免疫学的に活性な反応相手、 の混合物を作り； ｂ この混合物を一度だけインキユベートして、
   上記反応相手を上記物質と反応させ； ｃ 固体相と液体相とを分離し；次いで ｄ 固体相または液体相中の酵素標識の程度を測
   定することにより物質の量を決定することから
   なり、この方法で上記免疫学的に活性な反応相
   手の１つが上記エピトープの１つと反応するモ
   ノクロナル抗体であり；免疫学的に活性な反応
   相手の他の１つが上記エピトープのもう１つと
   反応する異なるモノクロナル抗体であるかまた
   は異なる動物種からの抗体であることを特徴と
   する上記免疫分析方法。 ２ 測定しようとする物質が抗原である特許請求
   の範囲第１項の方法。 ３ 測定しようとする物質がCEAである特許請
   求の範囲第２項の方法。 ４ 水不溶性担体に結合している免疫学的に活性
   な反応相手がモノクロナル マウス−抗CEAで
   ある特許請求の範囲第３項の方法。 ５ 酵素標識を有する免疫学的に活性な反応相手
   が酵素で標識したもう１つのモノクロナル マウ
   ス−抗CEAである特許請求の範囲第３項または
   第４項のいずれか一つの方法。 ６ 酵素標識を有する免疫学的に活性な反応相手
   が酵素で標識したヤギ−抗CEAである特許請求
   の範囲第３項または第４項のいずれか一つの方
   法。 ７ 抗原がHCGである特許請求の範囲第２項の
   方法。 ８ 水に不溶性の担体に結合している免疫学的に
   活性な反応相手がウサギ−抗HCGである特許請
   求の範囲第７項の方法。 ９ 酵素標識を有する免疫学的に活性な反応相手
   が酵素で標識したモノクロナル マウス−抗
   HCGである特許請求の範囲第７項または第８項
   のいずれか一つの方法。 １０ 酵素がペルオキシダーゼである特許請求の
   範囲第５項、第６項または第９項のいずれか一つ
   の方法。