JPS58151559A - ヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト絨毛性ゴナドトロピン（以下、１’−ｈＣ
ＧＪと略称することもある）の酵素免疫測定法（以下、
ｒＥＩム」と略称することもある）に関するものである
。

従来、ｈＣＧのＥＩムについては次の２法が提案されて
いる。

１）競合法：酵素で標識した一定量のｈｃｏを含有する
物質と、未知量のｈＣＧを含有する物質とを抗ｈＣＧ抗
体に対して競合的に結合させ、抗体と結合した酵素の酵
素活性もしくは抗体と結合しなかった酵素の酵素活性を
測定し、その測定結果を、予め既知量のｈＣＧにおいて
同様にして得られ九結果と対比することにょ夛定量を行
う方法。

２）サンドイッチ法：未知量のｈＣＧを含有する物質を
、抗１１０Ｇ抗体を用いて固定し、これに酵素で標識し
た抗体を結合させて、その酵素活性を測定し定量する方
法。

本発明者らは、上記１）の競合法においては特定のβ−
Ｄ−ガフクトシダーゼ標繊体と特定の抗体とを用いると
高感度で高特異性の微量定量が可能であることを見出し
た（特開昭５６−１３８２４８号公報参１［）。を九上
記２）のサンドイツチ法においては、担体上に保時され
た抗体、抗原および標識剤を結合させた抗体を用いるＫ
ＩＡにおいて、担体上に保持される抗体と標識剤を結合
する抗体とが互いに抗原決定部位を重複しない２種の抗
体でＴｏ夛、該抗体のうち一方がｈＣＧに特異的に反応
する抗体であることを特徴とするｈＣＧのΣ工Ａが高感
度、高精度、高特異性であることを鬼出した（特願昭５
５−１４４６８９）。

しかしながらこれらの方法においてもなお、約０、１−
２　ｍｅ工Ｕ以下の微量ｈＣＧを精度よく測定すること
は難しく、悪性腫瘍のよプ確かな診断と経過観察あるい
は正常人におけるその生理学的意義を決定する上では、
更に感度の高い測定法が必要とされた。

本発明者らは上記の事情に鑑み、更に検討を電ねたとこ
ろ、上記特異抗体を用いるサンドイツチ法によるＫＩＡ
において、抗ｈＣＧ抗体畑ｉｋ用いてβ−Ｄ−ガフクト
シダーゼと結合させることにより得られる抗体−酵素標
識体が高感度、高精度の微量定量を可能にすることを見
出した。これに基づいてさらに研究をした結果、本発明
を完成した。

本発明は、（１）担体上に保持された抗体、抗原および
標識剤を結合させた抗体を用いる免疫化学的測定方法に
おいて、担体上に保持される抗体と標識ｌｌ１ｉｌを結
合させる抗体とが互いに抗原決定部位を重複しない２種
の抗体であ）、担体上に保持される抗体がヒト絨毛性ゴ
ナドトロピンに特異的に反応する抗体であシ、標識剤と
してβ−Ｄ−ガフクトＶダーゼ會用いこれと抗体とをＮ
、Ｎ’−０−フェニレンジマレイミドで結合させたもの
を用いることを特徴とするヒト絨毛性ゴナドトロピンの
免疫化学的測定法および（２）　　■β−Ｄ−ガフクト
シダーゼと抗体とをＮ、Ｎ’−０−フェニレンジマレイ
ミドで結合させたもの、および ■β−Ｄ−ガフクトシダーゼに結合させる抗体と互いに
抗原決定部位を重複せずヒト絨毛性ゴナドトロピンに特
異的に反応する抗体を担体上に保持したものを含有する
ヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定試薬 である。

本発明において用いられる担体上に保持され九担体にお
ける担体としては、たとえば、ゲル粒子（例、アガロー
スゲル〔例、セファロース４Ｂ。

セファロース６Ｂ〔ファルマシア・ファインケミカル社
（スエーデン）製〕、デキヌトフンゲル〔例、セファデ
ックスＧ７５　、セファデックスＧ１００、セファデッ
クスＧ２００（ファルマシア轡ファインケミカル社製）
〕、ポリアクリルアミトゲ〃〔例、パイオゲＡ／Ｐ３０
．パイオゲ／Ｉ／Ｐ６０、バイオゲ／Ｌ’Ｐ１００（バ
イオラッド・ラボラトリーズ社（米国））〕、セルロー
ス粒子〔例、アビセｐｖ＜脆化成製）、イオン交換セル
ロース（例、ジエチルアミノエチルセルロース、カルボ
キシメチμセ〜ロース）〕、物理的吸着剤〔例、ガラス
（例、ガラス球、ガラスロンド、アミノアルキルガフス
球、アミノアルキルガラスロッド）。

シリコン片、スチレン系樹脂（例、ポリスチレンＩｓリ
スチレン粒子）〕、イオン交換樹脂（例、弱酸性陽イオ
ン交換樹脂〔例、アンバーライト■ＰＣ−５０（ローム
・ハース社（米国）製）、ゼＲ−４Ｂ　、ダウエックス
３（ダウケミカル社（米国）製）〕）などが挙げられる
。

本発明における担体上に保持された担体における抗体は
、標識剤を結合させた抗体における抗体と互いに抗原決
定部位を重複しない２１ｍの抗体であシ、担体上に保持
される抗体における抗体および標識剤を結合させる抗体
における抗体としては、その第１がｈｃｏＫ特異的に反
応する抗体であればよい。

該ｈＣＧに特異的に反応する抗体としては、たとえば■
エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｏｒｉｎｏｌｏｇｙ）。

第１０４巻（１９７９年）、第３９６頁に記載されてい
るような抗体が挙げられる。即ち、ｈＣＧ−β鎖のＣ索
端側のｈｃＧ［特異的なペプチドと牛アルグミンや牛チ
ログロブリンなどキャリアー用タンパクとを１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
など水溶性力μポジイミドを用いて得た縮合物をフロイ
ントの完全アジュバントもしくは不完全アジュバントと
共に人以外の溢血動物たとえばウサギに頻回接種して抗
体を形成せしめ、これを採取することによりｈｃＧＫ特
異的に反応する抗血清を得ることができる。

■　特開昭５６−１３８２４８に記載されえｈＣＧに特
異的に反応する抗ｈＣＧ抗体、すなわち担体上に不溶化
し九一般式（Ｉ） Ｈ−Ｒ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−工
１ｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−ＯＨ（Ｉ） １２　　　３４５６’／ 〔式中、ＲはＡｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｐ−Ｂｏ　
ｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ　−８ｅ　ｒ−Ｐｒｏ−Ｂｅ　ｒ−
ＡｒＢ−Ｌｅ　ｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙで示されるペプチド
の１４位のＧｌｙを含む１〜１４個の部分ペプチド鎖を
表わす。〕で表わされるぺ１チドに抗ｈＣＧ抗体を含有
する体液を接触させ、ついで特異的に吸収され九抗ｈＣ
Ｇ抗体を溶出することによシ得られた抗ｈＣＧ抗体が挙
げられる。

該ｈＣＧに特異的に反応する抗体としては、さらに、■
　前記一般式ＣＩ）で表わされるペプチドとキャリア用
タンパクと會グμタルアルデヒド（ｒＧＬＡＪと略称す
ることもある。）の存在下に縮合せしめた縮合生成物を
人以外の溢血動物に接種して抗体を形成せしめ、これを
採取することによシ得られた抗体が挙げられる。

ここにおいてキャリア用タンパクとは、単独では抗体産
生を誘導することができないベプタイドなどハプテン（
低分子量物質）に対する抗体を産生させる丸めにハプテ
ンと結合させて用いられるものをいい、その例としては
たとえば牛血清アルブミン、牛ガンマグロブリン、牛チ
ログロブリン。

破傷風トキソイド、ヘモシアニンおよびポリアミノ酸な
どが挙げられる。

一般式ＣＩ）で表わされるペプチドとキャリア用タンパ
クとｔＧＬＡの存在下に結合させるＫは、公知の方法〔
例、ホルモン・アンド・メタポリツク拳リサーチ（Ｈｏ
ｒｍｏｎｅ　　ａｎｄ　　Ｍｓｔａ’ｂｏｌｉ。

Ｒｅ５ｅａｒｏｈ　）　、第８巻（１９７６年）、第２
４１頁〕によって実施し得る。一般式ＣＩ）で表わされ
るペプチドとキャリア用タンパクの使用量比は１対１な
いし２対１が適当であシ、反応ｐＨは７．３前後が良好
な結果を与える場合が多い。を九反応に要する時間は２
〜６時間がよい場合が多いが、特に３時間が適当である
。この様にして作成した縮合生成物は常套手段で４℃前
後で水に対して透析し、凍結乾燥して保存することがで
きる。

以上の様にして製造した縮合生成物は人以外の温血動物
に接種される。

上記ｈＣＧに特異的に反応する抗体の製造に用いられる
人以外の温血動物としては、九とえば哺乳温血動物（例
、ウサギ、ヒツジ、ラット、マウス、モルモット、つＶ
１ウマ、ブタ）、鳥ＩＩ（例、ニワトリ、ハト、アヒル
、ガチツク、ウズラ）などが挙げられる。

該縮合生成物を人以外の温血動物に接種する方法として
は、動物に接種する縮合生成物は抗体産生ずるに有効な
量でよく、たとえばウサギに１回２１１１を等春量（１
−）の生理食塩水およびフロイントの完全アジュバント
で乳化して、背部ならびに後肢率皮下に４週問おきに５
回接種すると抗体を産生させ得る場合が多い。

このようにして、溢血動物中に形成された抗体を採取す
る方法としては、たとえばウサギでは、通常最終接種後
７日から１２日の関に耳静脈からａｍし、遠心分離して
血清として得られる。

ｂｃＧの特異抗体の製造に用いられる担体上に保持され
九抗雁における担体としては、前記したを応用し得るが
、たとえば“代＠ｓ、第８巻（１９７１年）、第６９６
頁に記載されているブロムシアン法、ＧＬＡ法などが挙
げられる。また、よシ簡易な方法として鵠伸啼物理的に
担体表向に吸着させて屯よい。

前記一般式ＣＩ）で表わされるペプチドの具体例として
は九とえばｈＣＧ−βのＣ末端ペプチド（Ｉ　）　（１
２３−ｉ　４５　）　（Ｈ−Ａｉａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ　
−Ｐｒｏ−８ｏｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−１９ｅｒ−Ｐｒｏ
−＝Ｓｏｒ−Ａｒｇ−Ｌ＠ｕ　−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒ
ｏ−８ｏｒ−ム８ｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−工１ｅ−Ｌｅｕ
−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−ＯＨ）が挙げられ、これはたとえば
−間開５６−１３８２４８号公報に記載の方法によシ製
造することができる。

本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護基、活性
基、その他に関し略号で表示する場合、それらは工ＵＰ
ＡＣ−ＩＵＢ　　Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ　ｏｎ　　Ｂｉ
ｏｌｏ　−ｇｉｏａｌ　　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅに
よる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくも
のであシ、その例を次に挙げる。また、アミノ酸などに
関し光学異性体がＴｏ夛うる場合は、特に明示しなけれ
ばＬ体を示す亀のとする。

Ａｈａ　：　　アラニン Ｐｒｏ　：　　プロリン ３ｅｒ　：　　セリン Ｌ＠ｕ：　　ロイシン Ａｒｇ　：　　アルギニン Ｑｌｙ　：　　グリシン Ａｓｐ　：　　アスパラギン酸 ’［’ｈｒ　：　　スレオニン １１ｅ　：　　イソロイシン Ｑｌｎ　：　　グルタミン 本発明で用いられる種々のペプチドは、べ１チド合成の
公知の常套手段で製造しうる。固相合成法、液相合成法
のいずれによってもよいが、液相合成法が有祠な場合が
多い。そのようなべ１チド合成の手段としては、たとえ
ば“ＴｈθＰθｐｔｉｄ０８″、第１巻（１９６６）、
８ａｈｒ８ｄｅｒ　ｏｎ４　　Ｌｕｂｋｅ著、Ａｏａｄ
ｅｍｉｏ　　ｇｒ＠ｔｅ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｕ、
８．Ａ、　　あるいは“ペプチド合成”、東屋ら督、丸
善株式会社（１９７５年）に記載された方法、たとえば
アジド法、クロフィト法、酸無水物法、混合無水物法、
ＤＣＣ法、活性エステル法、ウッドワード試薬Ｘを用い
る方法、力〃ポジイミダゾール法、酸化還元法、ＤＣＣ
／７デイテイプ（例、ＨＯＮＢ、　ＨＯＢｔ。

ＨＯ８ｕ　）法などがあげられる。

本発明で用いられる標識剤を結合させた抗体における抗
体は、ｈＣＧに非特異的に反応するものであって、前記
担体上に保持された抗体と互いに抗原決定部位を重複し
ないものが用いられる。

該ｈＣＧに非特異的に反応する抗体の例としては、たと
えば、人尿より公知の方法で精製したｈＣＧｆ：、人以
外の溢血動物に接種し’ｊｈｃＧＫｊｉｔする抗体を形
成せしめ、さらに塩析によシ得たγ−グロブリンー分を
ｈＣＧ−βのＣ末端べ１チドを結合させた固相を充てん
したカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィー
にかけて素通シ画分を得、さらにｈＣＧを結合させた固
相を充てんしたカラムを用いるアフィニティークロマト
グツフィーで精製して得られた、ＡＬＨなど類似の構造
を有する蛋白ホルモンとも交叉反応を示す抗体などが挙
げられる。

標識剤であるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼと抗体との結合
においては、Ｎ　、　Ｎ’−０−フェニレンジマレイミ
ド（以下、Ｐ’ＤＭと略称することもある。）を用いて
結合させる。

結合させる方法としては、たとえば加藤らの方法〔ザ・
ジャーナル・オプ・イムノロジ（ＴｈθＪｏｕｒｎａｌ
　　ｏｆ’　Ｉ＋＋ｍｕｎｏｌｏｇｙ　）第１１６巻（
１９７６年）、＋　５５４頁〕によシ得られた抗体ｉ’
ａｂ’　フフグメントとＰＤＭとをｐＨ約５ないし８の
緩衝液中で約０℃ないし４０℃の温度で約１０分ないし
２４時間反応させる。該緩衝液としては０．１Ｍ酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５，Ｑ　）　。

０、１　Ｍ　！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ５，８）などが挙け
られる。

このようにして得られたマレイミド化抗体Ｆａｂ’にβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼを反応させるには両者を緩衝液
中で約０℃ないし４０℃の温度でｒＪ１０分ないし４８
時間反応させることによって行なうことができる。該緩
衝液としてｐＨ６，５の１ｍＭエチレンジアミン四酢酸
ナトリウム塩を含む０．１輩リン酸緩衝液などが挙げら
れる。

β−Ｄ−ガラクトシダーゼと抗体とｔ−Ｎ、Ｎ’−０−
フェニレンジマレイミドを用いて結合させる具体例を以
下に述べる。

抗１ｃＧ抗体１ｇＧ！５るいはペプシン分解後、得られ
たＦ（ａ’ｂ’）２画分をメμカプトエチμアミン類の
存在下で還元し、ゲ／Ｉ／濾過によって未反応物質を除
去する。こうして得られた抗ｈＣＧ抗体工ｇＧもしくは
Ｆａ　ｂ’にＩＮ　、　Ｎ’−〇−フェニレンジマレイ
ミドを反応させ、次いでゲル濾過によって低分子量物質
を除去したのち、得られたマレイミド型抗体にβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼを反応させる。

こうして得られた反応生成物をゲル濾過によって精製し
、β−Ｄ−ガヲクトシダーゼと抗ｈＣＧ抗体１５Ｇもし
くはＴａｂ’の結合物を得る。

本発明の測定方法を以下に具体的に説明する。

まず、■：担体に保持された抗体に、測定すべきｈＣＧ
含有の分析対象物を加えて抗原抗体反応を行った後これ
に前記で得られ九β−Ｄ−ガラクトシダーゼと抗ｈＣＧ
抗体ＩｇＧもしくはｐａｂ’との結合物を加えて反応さ
せる。

本発明の酵素免疫測定法において測定対象となるｈｃＧ
ｆｔ含む被検試料としては、尿、血清、血漿、髄液ある
いは各種臓器抽出物等が挙げられ、とりわけ尿、血清お
よび血漿が輪周される。

■：■で得られた反応生成物にβ−Ｄ−ガフクトシダー
ゼの基質として４−メチルクンペリフェリ〜−β−Ｄ−
ガラクトシドなどを加えて、遊離した４−メチルウンベ
リフェロンなどを螢光光度計で測定することによシ上記
の反応生成物の酵素活性を知る。

■：上上記−■の操作を既知量のｈｃＧの標準溶液に対
し予め行い、ｈＣＧ量と上記の螢光強度との関係を標準
曲線として作成しておく。

■：未知量のｈＣＧｔ−含む分析対象物について得られ
九螢光強度を標準曲線にあてはめ、分析対象物中のｈ　
ＣＧ−含量を測定する。

本発明のサンドイツチ法によるｈＣＧの免疫化学的測定
法に用いられる定量用キットとしては、主として （１）　　担体上に保持された抗体 （２）　　β−Ｄ−ガフクトシダーゼ標識された抗体（
３）約０ないし１０工Ｕの標準ｈＣＧ（４）上記（２）
〜（３）の試薬および被検試料の希釈に用いる緩衝液（
該試薬および該被検試料の希釈に用いることができる緩
衝剤であればいずれでもよいが、その−例としてはｐＨ
約６ないし９のリン酸緩衝液ま六はグリシン緩衝液が挙
げられる。） （５）インキュベーシミン後、担体の洗浄に用いる緩衝
液（該担体の洗浄に用いることができる緩衝剤であれば
いずれでもよいが、その−例としてはリン酸緩衝液また
はグリシン緩衝液が挙げられる。） （６）　　酵素基質（好ましくは４−メチルウンベリフ
エリμｍβ−Ｄ−ガラクトシドまたはオμトニトロフエ
ニμ−β−Ｄ−ガラクトシド。

バフニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド入酵素基質
の溶解に用いる緩衝液（好ましくはリン酸Ｍ衝液）およ
び酵素反応停止に用いる緩衝液（好ましくは次酸緩衝液
ま九はグリシン緩衝液）が挙げられる。

上記のキットはたとえば下記の方法によシ使用するのが
好ましい。

標準ｈＣＧもしくは被検液約１０ないし２００μｌ　に
試薬（４）ｔ−加えて希釈し、一定量の試薬（１）を加
えて約０ないし４０℃で約１ないし２４時間反応させる
。試薬（５）で担体の洗浄後、試薬（２うの約１０ない
し３００１ｔｌを加えたのち、約０ないし４０℃で反応
させる。約１ないし２４時間反応後、試薬（５）で洗浄
し担体上に結合しているβ−ｂ−ガラクトシダーゼの活
性を測定する。すなわち酵紫基質液約１０ないし１００
０μｍを加えて約２０ないし４０℃で約０．５ないし２
４時間反応させたのち、酵素反応を停止させ、反応液中
の吸光度もしくは螢光強度を測定する。

本発明の測定法によると、高感度でｈＣＧｉ特異的に測
定することができる。

本発明によシ、他の類似したホルモン（たとえばヒト黄
体形成ホルモン）からの妨害を受けることなく高感度か
つ正確に測定できるので、絨毛性腫瘍やその他のｈＣＧ
産生腫瘍などの参断、予後管理に極めて有用な手段を提
供するものであ・る。

以下に、参考例および実施例を挙げて、本発明をさらに
具体的に説明する。

参考例１ 抗体の製造 人尿より公知の方法で精製した約１０，０００工ＵＡの
ｈｃｏ１ダを生理食塩水１耐に溶解し、これにフロイン
トの完全アジュバン）　　（Ｆｒｅｕｎｄ’ｅｃｏｍｐ
１．ｅｔｅ　　ａｄｊｕｖａｎｔ　、″免疫の生化学”
、橘ら著、共立出版株式会社（１９６７年））１ｄを加
えてよく混和し乳剤を作り、これをウサギの両大腿部筋
内円および背部及下数箇所に注射する。

以上の操作’ｔ−３週毎に５回行ない最終免疫後１週間
で採血しパイロットアツセイヲ実施する。その結果、ｈ
ＣＧ−βのＣ末端べ１チド（Ｉ）にも親和性をもつ抗血
清Ｎ３０５Ｂを得た。

参考例２ 特異抗ｈｃＧ抗体の製造 ｂ　ＣＧ−βのＣ末端ペプチド（１）５ダを０．５Ｍ　
ＮａＣ１ｆ含む０．１　Ｍ　１ｉａＨｃＯ３８ｍＫｌ＃
解し、予めＮ　／　１　、０００　ＨＣＩで゛洗浄した
ブロムシアン活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア・
ファイン・ケミカルズ社製）ｉｌｌに加え、５℃で一夜
攪拌した。反応終了後同じ０．５　Ｍ　ＮａＣ１を含む
０．ＩＭＮａＨＣＯ３で十分に洗浄し、次いでＭＣＩで
ｐＨ８に調整した０、５Ｍエタノールアミン１０−を添
加シて室温で１時間反応させ友後、（１）　Ｉ　Ｍ　Ｉ
Ｊａｃｌ　１に含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）
　、　（２）　ｌ　Ｍ　ＮａＣ１′ｆｔ含む０．ＩＭホ
ウ酸ｉｌ衝液（ｐＨ３，０）および（３）Ｑ、１５Ｍ　
ＮａＣ１を含む０．０２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０）
で順次洗浄しカラムに充填した。

参考例１で得られた抗血清ａ３０５Ｂ８ｍを１．５１の
無水硫酸ナトリウムを用いて塩析沈澱させ、得られたγ
−グロブリン画分を１紀のペプチド（Ｉ）結合セフ７ａ
−ヌ４Ｂカラム（０，９ｘ４ｃ１１）に付した。

した。次いで０．１７Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐｉ（
２，３）で溶出することＫよってｈＣＧ−βのＣ末端ペ
プチド（１）と強い親和性をもつ特異抗体−Ｎ３０５Ｂ
Ｓを得た（蛋白量１．２ダ）。

参考例３ 抗ｈＣＧ−βのＣ末端べ１チド（Ｉ）抗体の製造 ｈＣＧ−βのＣ末端ペプチド（Ｉ）２５ＩＩｇおよび牛
チログロブリン（Ｂ’ｌ’Ｇと略称する）５０１ｆを０
，２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，３）４＠ｔに溶解し、５
％ＧＬＡ水溶液４−を加えて室温で３時間攪拌後、４℃
で透析（水２Ａ’Ｘ４　）　Ｌ、凍結乾燥して免疫原を
得た。このｈＣＧ−βのＣ末端ペプチド（Ｉ　）−ＢＴ
Ｇ縮金物１．５■を生理食塩水０．７５１に溶解し、こ
れにフロイントの完全アジュバン）　　（Ｆｒｅｕｎど
ｓ　　　　ｏｏｍｐｌｅｔｅ　　　　ａｄｊｕｖａｎｔ
　　　）　　Ｑ、７　５ｍｌを加えてよく混和し、乳剤
を作シ、これをウサギの両大腿部筋内円および背部皮下
数ケ所に注射した。以上の操作を４遍おきに４回行ない
蟻終免疫後１週間で採血し、遠心分離して抗血清を採取
し抗ｈｃＧ−βのＣ末端ペプチド（Ｉ）に対する抗血清
１ｆ３１３Ｂｔ得た。

次いで抗血清Ｎ３１３Ｂを常法によ）硫酸アンモニウム
で塩析させて得たγ−グロブリンー分を２１１１１ｔＤ
ｂｃａ（結合させたセファロース４Ｂカラム（直径Ｑ、
　９　ｅｓ　、長さ４３）に付した。

０、１５Ｍ　ＮａＴ：’ｌを含む０．０２Ｍホウ酸験衝
液（ｐＨ８，０）でカラムを洗浄し、次いで０．１７Ｍ
グリシン−塩酸ｉ１！衝液（ＤＨ２，３）で溶出するこ
とによって、ｈｃｏＫｉ！和性の高い特異抗体Ｎ３１３
Ｂｓｙ調製した。

参考例４ 非特異抗ｈＣＧ抗体の製造 参考例１で得られた抗血清Ｎ３０５Ｂについて硫酸アン
モニウム塩析し、５ダのｈＣＧ−βのＣ末端ペプチド（
Ｉ）ｉ−結合させたセファロース４Ｂカラム（直径０．
９ｃｌＩ、Ｊｌさ４α）のアフィニティークロマトグラ
フィーで素ｉ１１！０する抗体画分を調製した。次いで
この抗体画分ｔ２１ｖのｈＣＧ’ｉ結合させたセファロ
ース４Ｂカラム（直径ｏ、９ＣＭ、長さ４１）に付した
。０．１５　Ｍ　ＮａＣ１１含む０．０２Ｍホウ酸緩衝
液（ｐＨ８，０）でカラムを洗浄し、次いで５　Ｍ　Ｍ
ｇＣｌ２で溶出することによってｆｉｃＧに親和性の高
い非特異抗体Ｎ３０５ＢＧを調製した。

参考例５ 抗体結合固相の調製 ポリスチレンボール（直径３．２　ｍ　、　Ｐｒｅｏｉ
ｓｌｏｎｐｌａｓｔｉｃｓ　　　Ｂａ１ｌ’　　Ｃｏ、
、　　Ｃｈｉｏａｇｏ、　　Ｕ、８．Ａ、）１５００個
に、参考例２ないし４に記載の抗体Ｎ３０５ＢＳ、Ｎ３
１３ＢＳあるいはＮ３０５　’ｂ　ａの３０μｓ／ｇ／
　　ｏ、ｏ　ＩＭ　　ＮａＣ１−０，０１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ８，０）　３０１ｔを加え５℃で一夜インキユ
ベートシた。０，１％ＢＡＡを含む０．０５Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）で洗浄したのち、用時まで冷所保存
した。

実施例１ β−Ｄ−ガヲクトＶダーゼと抗ｈＣＧウサギ抗体Ｎ３０
５ＢＧ（Ｆａｂ’）との結合物によるｈＣＧの測定 （１）β−Ｄ−ガラクトシダーゼー抗ｈＣＧウサギ抗体
Ｎ３０５ＢＧ（Ｆａｂ’）結合物の製造参考例４で得ら
れた抗体Ｎ３０５ＢＧ　　５ダに０．１岬のペプシンを
加え３０℃で一夜反応後、セファデックスＧ−１５０カ
ラム（直径’ｌ、　５　ａｍ　、長さ５５ｃＩＩ）でＭ
ａｌした。得られた抗体Ｆ（ａν）２両分をβ−メルカ
プトエチルアミンで還元後、セファデックスＧ−２５カ
ラム（直径０．９（１ｍ、長さ５５３）に供し過剰の試
薬を除去した。次にＰＤＭ飽和溶液２　ｍｌを添加し３
０℃で３０分反応させたのち、反応混合液をセファデッ
クスＧ−２５カラム（直径２．５ｆｆｉ、長さ５５１）
で精製し九。得られたマレイミド化Ｆａｂにβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ溶液（５■／ｇ＋／）５０μｉｋ添加し
５℃で一夜反応させた。反応終了後、０゜１襲牛血消（
以下、ＢＳＡと略称することもある。）、０．１％Ｎａ
Ｎ３゜１　！Ｉｔ　Ｍ　Ｍ３Ｃ１２および０．　ｌ　Ｍ
　ＮａＣ１ｔ−含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，
５）を用いるセファロース６Ｂのカラムクロマトグラフ
ィーで精製し、酵素粘性ならびに抗体活性を有するフフ
クＳ／Ｂンを分取し、β−Ｄ−ガフクトシダーゼー抗ｈ
ＣＧ抗体Ｎ３０５ＢＧ（Ｔａｂ’）結合物を得た。

以下、本結合物の物性について述べる。

■本結合物はＥ工Ａで用いる合成基質４−メチルウンベ
リフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドやオルトニトロフェ
ニル−β−Ｄ−ガヲクトシド、パフニトロフェニル−β
−Ｄ−ガフクトシドを分解し、それぞれ４−メチルウン
ベリフエロンヤオμトニトロフェノール、バラニトロフ
ェノ−／Ｉ／ｌ−遊離する。

■合成Ｍ　質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガ
ラクトシドを用いる時、本結合物のミカエリス定数はも
とのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼと同じ値を示す。

■酵素活性の至適ｐＨは６，５〜７，３である。

■酵素活性を有する本結合物の約９０％以上がｈＣＧと
の反応性を有し、その抗体活性は酵素活性と共に冷蔵保
存で６ダ月以上安定である。

■分子量は約６５万で抗体Ｆａｂ７’酵素の七μ比は約
２．０である。

■ｐＨ５−９の水性溶媒に易溶である。

■紫外吸収スペクト〃を第１図に示す。

■アミノ酸分析値を第１表に示す。

第１表 Ｌｙ８（リジン）　　　　　　　　　　　　　　１１１
Ａｒｇ　　　　　　　　　　　９４ Ａ８Ｅｌ　　　　　　　　　　　１６６Ｔｈｒ　　　　
　　　　　　　１１９ Ｓθｒ１１０ Ｇｌｕ（グルレグミン龜綻）　　　　　　　　　　　　
　　　　　２１５ｐｒｏ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　８　７Ｇ１ｙ　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１　０　０＊１ａ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　１　３　３Ｖａｌ　（バリ
ン）　　　　　　　　　　　　１１４Ｉ−Ｌｅｕ５２ Ｌθｕ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１５９Ｔｙｒ（チロシン）３９ ｐｈｅ（フェニルアラニン）６９ （注）Ｇｌｙｏｌｎｅ　　ＩＱＱモル当）の各アミノ酸
の七〃数（２）β−Ｄ−ガフクトンダーゼー抗ｈＣＧウ
サギ抗体Ｎ　３０５　Ｂ　Ｇ　（Ｆａｂ’　）結合物を
用いたｈＣＧの定量 緩衝液Ａ　Ｃ０，Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＭｇＣｌ
２．　　Ｏ，１％牛血清アルブミン（ＢＳＡと略称する
こともある。）。

０．１％Ｎａ　Ｎ３　を含む０．０２Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７，０）　）　１５０μｌにｈＣＧ含有
液５０ｔｔｌを加え、更にポリスチレンボーμｍｈＣＧ
特異抗体Ｎ３０５ＢＳ結合物を１個加えて室温で一夜反
応させた。反応終了後、０．０ＩＭ！Ｊン酸食填緩衝液
（ｐＨ７，０）でポリスチレンポーμをよく洗浄し、次
に緩衝液Ａで希釈したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼー抗ｈ
ＣＧウサギ抗体Ｎ　３０５　Ｂ　Ｇ　（Ｆａｂ’　）結
合物２００μｌを加えて３７℃で３時間反応させた。

反応終了後、再び０．０１Ｍ！Ｊン酸食塩緩衝液（ｐＨ
７，０）でポリスチレンボ−Ａ／’ｉよく洗浄し、ポリ
スチレンボーμに結合しているβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ活性を測定した。結果は、第２図の一〇−で示される
。

ｊｌ−１例６ β−Ｄ−ガフクトシダーゼと抗ｈｃＧウサギ抗体Ｈ３Ｏ
５ＢＢＣ工Ｆ５Ｇ）との結合物によるｈＣＧの測定 （１）β−Ｄ−ガラクトシダーゼー抗ｈＣＧウサギ抗体
Ｎ５Ｑ５ＢＳ（工ｇＧ）結合物の製造参考例２で得られ
た特異抗体Ｎ３０５Ｂ８　２岬を１５！ＩＩＭのβ−メ
ルカプトエチ〃アミンで還元後、セファデックスＧ−２
５カラム（直径９．９ｃ＊。

長さ５５３）に供し、過剰のβ−メルカ１トエチルアミ
ンを除去した。次ＫＰＤＭ飽和溶液１．５膠ｔを添加し
３０℃で３０分反応させたのち、反応混合液をセファデ
ックスＧ−２５カラム（直径０．９α、長さ５５画）に
供し、過剰のＰＤＭを除去した。得られたマンイミド化
抗体工ｇＧにβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ溶液（５”ｌ／
ｍｌ　）　３０μ！を添加。

し、５℃で３６時間反応させた。反応終了後、０．１％
ＢＳＡ、０．１％ＭｈＮ３＋　ｌ　”Ｍ　　ＭｇＣｌ２
および０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１を含む０．０２Ｍリン酸
緩衝液（ｐ［（６，５）を用いるセファロース６Ｂのカ
ラムクロマトグラフィーで精製し、酵素活性ならびに抗
体活性を有するフフクションを分取し、β−Ｄ−ガヲク
トシダーゼー抗ｈＣＧ抗体Ｎ　３０５　Ｂ　Ｓ（Ｉ＄Ｇ
）結合物を得た。

本結合物の物性は次の項目（■および■）を除き、実施
例１で得られた結合物の物性（■、■。

■、■、■および■）と同一である。

■分子量は約８０万で抗体工ｇＧ／＃素のモル比は約１
．９である。

■アミノ酸分析値を第２表に示す。

（以下余白） 第２表 Ｌ７Ｂ（リジン）　　　　　　　　　　１１０１Ａｒ　
　　　　　　　　　　　８３ Ａｓｐ　　　　　　　　　　　ｌ　５１Ｔｈｒ　　　　
　　　　　　　１２５ Ｓθｒ　　　　　　　　　　１１３ Ｇｌｕ（グ）レクミ：／Ｉｎ）　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　１９５Ｐｒｏ　　　　　　　　　
　　　９５ Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　１００ Ａｌａ　　　　　　　　　　　１１５ ７ａｌ（バリン）　　　　　　　　１１４Ｉ−Ｌθｕ　
　　　　　　　　　　５２Ｌｅｕ　　　　　　　　　　
　１４２ Ｔｙｒ（チロリン）４２ Ｐｂｅ（７ｇ＝Ｗ了ン二ン）６２ （注）　Ｇｌｙｏｉｎ８１００モル当夛０各アミノ酸の
モル数（２）β−Ｄ−ガラクトシダーゼー抗ｈＣＧウサ
ギ抗体Ｎ３０５ＢＳ（ＩｇＧ）結合物を用いたｈＣＧの
定量 実施例１−（２）記載のポリスチレンボーＡ’−ｈ　Ｃ
Ｇ特異抗体Ｎ３０５ＢＳ結合物およびβ−Ｄ−ガフクト
シダーゼー抗ｈｃＧウサギ抗体Ｎ３０５ＢＧ（Ｆａ’ｂ
’　）結合物の代りに、それぞれポリスチレンボール−
ｈＣＧ非特異抗体Ｎ５Ｑ５ＢＧ結合物およびβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼー抗ｈＣＧウサギ抗体Ｎ３０５ＢＳ（工
ｇＧ）結合物を用いて、実施例１−（２）と同様に処理
して測定した。結果は第２図の−一で示される。

参考例７ β−Ｄ−ガヲクトシダーゼと抗ｈＣＧウサギ抗体Ｎ３１
３ＢＳ（工ｇＧ）との結合物によるｈＣＧの測定 （１）β−Ｄ−ガフクトシダーゼー抗ｈＣＧウサギ抗体
Ｎ３１３Ｂ８（ＩｇＧ）結合物の製造墾考例Ｇ−（１）
におけるＮ５（１５ＢＳの代シＫ、参考例３で得られた
Ｎ３１３ＢＳを用いて、参考４Ｂ　６−　（１）と同様
に処理してβ−Ｄ−ガフクトシダーゼー抗ｈＣＧウサギ
抗体Ｎ３１３ＢＳ　（ＩｇＧ）結合物を得た。

本結合物の物性は次の項目（■および■）を除き、実施
例１で得られた結合物の物性（■、ｑ）。

■、■、■および■）と同一である。

■分子量は約８０万で抗体ｒｇｏ／酵素のモル比は約１
．６である。

■アミノ酸分析値は第３表に示される。

（以下余白） 第３表 ＩＪ８（リジン）　　　　　　　　　　１０５ｒｇ８４ Ａｓｐ　　　　　　　　　　　１５５ ’ｌ”ｈｒ　　　　　　　　　　　１２２Ｓｅｒ　　　
　　　　　　　　１１５ Ｑｌｕ（ダｉＶ７ｚ）ｍ＞　　　　　　　　　　　　　
　　　　１９２Ｐｒｏ　　　　　　　　　　　　８８ Ｇｘｙ　　　　　　　　　　　１００ 、Ａｌａ　　　　　　　　　　　ｌ　１５Ｖａｌ　（バ
リン）　　　　　　　　　１１４■−Ｌθｕ　　　　　
　　　　　　５３、ｌ、ｅｕ　　　　　　　　　　　１
４０’Ｉ’ｙｒ　（チロシン）４１ ｐｈθ（フェニμアラニン）６０ （注）Ｇｌｙｃｉｎｅ　　１００モル当りの各アミノ酸
のモル数（２）　　β−Ｄ−ガフクトシダーゼー抗ｋｌ
ｃＧウサギ抗体Ｎ３１Ｎ３１３ＢＳ（Ｉ結合物を用い九
ｈＣＧの定量 賽才例６−（２）記載のβ−Ｄ−ガヲクトシダーゼー抗
ｈＣＧウサギ抗体Ｎ３０Ｎ３０５ＢＳ（Ｉ結合物の代り
に、β−Ｄ−ガラクトシダーゼー抗ｈＣＧウサギ抗体Ｎ
３１Ｎ３１３ＢＳ（Ｉ結合物を用いて、実施例１−（２
）と同様に処理して第２図の結果を得た（−・−又゛爪
コバる）。

【図面の簡単な説明】

第１図および第３図はそれぞれ抗ｈＣＧ抗体ｐａｂ’−
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ結合物および抗ｈＣＧ抗体Ｉ
ｇＧ−β−Ｄ−ガヲクトシダーゼ結合物の紫外吸収スベ
ク）／Ｌ”を表わす。第２図はｈＣＧの標準曲線を表わ
し、−〇−は抗ｆｉ　Ｃに抗体Ｎ３０５ＢＧ（Ｆａｂ’
）−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ結合結合用いた実施例１
の結果を、−−は抗ｈＣＧ抗体Ｎ３０５ＢＳ（工ｇＧ）
−β−Ｄ−ガフクトシダーゼ結合結合用いたｔＰ考例６
の結果を、−・−は抗ｈＣＧ抗体Ｎ３１３ＢＳ（工ｇＧ
）−β−Ｄ−４フクトンダーゼ結合物を用い九事専例７
の結果をそれぞれ表わす。 光 炙 竿　１　凶 淡天（ｎｍ） ｈｃＧ　　（ｍｌＵ　） 灰養（ｎｍ）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）担体上に保持された抗体、抗原および標識剤を結
   合させた抗体を用いる免疫化学的測定方法において、担
   体上に保持される抗体と標識剤を結合させる抗体とが互
   いに抗原決定部位を重複しない２種の抗体であシ、担体
   上に保持される抗体がヒト絨毛性ゴナドトロピンに特異
   的に反応する抗体でｌ）、標識剤としてＢ−Ｄ−ガフク
   トシダーゼを用い、これと抗体と１ｋＨ、Ｎ’−０−フ
   ェニレンジマレイミドで結合させ九ものを用いること全
   特徴とするヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定
   法。
2. （２）■β−Ｄ−ガフクトシダーゼと抗体とをＮ。 Ｎ′−〇−フェニレンジマレイミドで結合させ友もの、
   および ■β−Ｄ−ガラクトシダーゼに結合させる抗体と互いに
   抗原決定部位を重複せずヒト絨毛性ゴナドトロピンに特
   異的に反応する抗体を担体上に保持し友ものを含有する
   ヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定試薬。